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[硕士论文] 郭宵
发酵工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:小麦芽富含阿拉伯木聚糖(AX),AX及酶解产物分子大小及结构会对麦汁及啤酒的粘度、浊度、过滤速度等产生重要影响,还具有抗肿瘤、提高免疫力等保健作用。β-1,4-木聚糖内切酶是降解AX主链改变AX溶解度、粘度、浊度等特性的关键酶。本文对小麦芽中β-1,4-木聚糖内切酶进行了分离纯化,并研究了β-1,4-木聚糖内切酶对植物源阿拉伯木聚糖的降解作用。主要研究结果如下:
  (1)经硫酸铵沉淀(ASI)、阴离子交换层析、疏水交换层析(HICIII)、凝胶过滤层析,获得了分子量为27.8 kDa,SDS-PAGE电泳条带单一的β-1,4-木聚糖内切酶(E-WMA)。纯化倍数为12.08倍,比活力为4.47 u/mg,回收率为1.45%。
  (2)液相串联质谱分析发现分子量为14.0 kDa的 SDS-PAGE电泳条带也存在与β-1,4-木聚糖内切酶相匹配的肽段,小麦芽中可能存在分子量为14.0 kDa的β-1,4-木聚糖内切酶。
  (3)在40 ℃将硫酸铵沉淀后的β-1,4-木聚糖内切酶(简称ASI)作用于纯小麦芽麦醪,与对照相比,麦汁浊度明显降低,在30 min、90 min、120 min分别降低了7.16%、38.01%和22.22%;水溶性阿拉伯木聚糖(WEAX)含量增高;重均分子量为1.85×103 Da的组分含量变化最显著,作用时间低于30 min时将水不溶的阿拉伯木聚糖(WUAX)转化为重均分子量为1.85×103 Da的WEAX的速率占主导,高于30 min降解1.85×103 Da的WEAX的速率占主导作用。
  (4)在纯小麦芽协定糖化初始阶段加入 ASI,降低了终麦汁过滤时间;但麦汁粘度没有明显变化;ASI使浊度降低30.36%~50.00%。ASI添加量低于0.9 mg/mL时,将WUAX转化为重均分子量1.92×103 Da的WEAX的速率占主导;添加量高于0.9 mg/mL时,降解1.92×103 Da的WEAX的速率占主导。
  (5)疏水层析后得到的β-1,4-木聚糖内切酶(简称HICIII)可将玉米芯中WUAX转化成WEAX,主要产物分子量为1.54×106 Da。HICIII对甘蔗渣中AX有显著降解作用,可将甘蔗渣中WUAX转化为WEAX,还可将WEAX中组分1.20×106 Da降解为组分2.81×104 Da和组分2.18×103 Da。
  (6)E-WMA对低中高粘度的小麦源WEAX都有降解作用,对高粘度的WEAX降解效果最为显著。三种WEAX溶液的浓度为2 mg/mL,高粘度WEAX粘度为2.42 mPa·s,酶解后粘度下降9.92%,Mw由2.07×106 Da的组分降解为3.37×105 Da的组分;低粘度和高粘度WEAX粘度分别为1.77 mPa·s和2.09 mPa·s,酶解后粘度分别下降了5.65%和8.13%。此外,E-WMA可将小麦源的WUAX转化成WEAX,体系粘度增高了1.89%;E-WMA还可以将转化成的WEAX进一步降解,其Mw下降20.77%。
[博士论文] 张欣
化学工程与技术 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:油脂资源绿色可再生,天然产量丰富,是生物质资源的重要组成部分。生物催化在区域选择性、副反应控制等方面具有传统的油脂加工工艺不可比拟的优势,因而成为近年来的研究热点。然而,生物催化剂高昂的市场售价,限制了该类技术的应用与发展。本课题组开发的Candida sp.99-125脂肪酶系列产品具有成本低,比酶活高,稳定性良好等优点,性价比优于同类国外产品。目前,以Candida sp.99-125脂肪酶为核心的绿色催化平台技术日渐成熟,并已成功应用于多类脂肪酸酯类化合物的合成与生产。但Candida sp.99-125脂肪酶针对于结构型酯类化合物(糖醇酯,甘油结构酯等)的催化特性及催化区域选择性尚有深入挖掘潜力,相关工艺尚未系统性开发并进一步优化。另外,近年来脂肪酶催化的不饱和双键环氧化反应也逐渐成为油脂改造的研究热点之一,Candida sp.99-125脂肪酶在该方面的应用尚需发展。
  为进一步完善以Candida sp.99-125脂肪酶为基础的绿色平台催化技术,本论文针对结构型类化合物产品及环氧油脂类产品,分别选取具有产品代表性的木糖醇脂肪酸酯、人乳脂肪替代结构酯(HumanMilk Fat Substitutes,HMFS)、环氧脂肪酸为目标产物,进行了合成过程分析及工艺开发的研究。论文通过探讨Candida sp.99-125脂肪酶的催化区域选择性;优化反应水含量及底物摩尔比等参数,构建合理的反应微环境;结合过程反应机理及副反应进程,调控反应温度、过程传质等参数;最终设计开发了Candida sp.99-125脂肪酶针对于相应产品的高效催化工艺。具体研究内容如下:
  1.Candida sp.99-125脂肪酶催化木糖醇脂肪酸酯合成中,首先建立了叔丁醇溶剂催化反应体系。通过预加热处理制备木糖醇-叔丁醇过饱和溶液,有效地提高反应体系中木糖醇浓度,从而提高木糖醇脂肪酸酯的转化率。在该体系中反应6h后,木糖醇转化率约为70%,产品中1(5)-O-木糖醇单脂肪酸酯含量约95%.在此基础上,本研究建立了更为绿色的木糖醇酯无溶剂反应体系。通过木糖醇等摩尔分批5次加入,解决反应底物溶解问题。反应120 h后,糖醇酯的转化率为70%。其中1(5)-O-木糖醇癸酸单酯相对含量为16%,1,5-O-木糖醇癸酸二酯相对含量为60%,木糖醇1,2,5-O-癸酸三酯与1,3,5-O-木糖醇癸酸三酯相对含量为24%.同时发现,体系最终产品构型同脂肪酶的催化选择性无关,反应能量壁垒和体系热力学特性决定了最终产品的构型和组成。
  2.母乳脂肪中甘油三酯具有特定结构,其从头合成对催化选择性及反应过程控制要求较高,极具挑战性。本研究结合酶催化过程中酰基转移副反应的机理实现了对反应过程进行调控,并有效控制了催化过程的位置选择性,得到了针对Candida sp.99-125脂肪酶催化合成HMFS的最佳工艺条件。催化得到的产品经分离纯化后,产品的酸价为2 mgKOH/g,甘油三酯中sn-2位棕榈酸占总棕榈酸比例的含量为52%-55%,棕榈酸甘油三酯在总甘油三酯中的含量为8.4%-9.6%,目标产品型甘油三酯含量为55-59%,产品过氧化值1.41-1.89meq/g,产品的各项指标均可满足并超过国家标准要求。
  3.不饱和脂肪酸的环氧化过程中,由于游离羧基的作用,使得该反应过程相对于脂肪酸酯的环氧化更加复杂,副反应更难于控制。本研究首先针对化学催化脂肪酸环氧化过程中,环氧基团开环副反应严重的问题,通过过程分析与优化,建立了过程动力学模型,通过分析各反应的速率及能量问题,得到了化学催化过程各类开环反应难以避免的结论。在化学催化研究的基础上,设计并优化了Candida sp.99-125脂肪酶催化的不饱和脂肪酸环氧化反应体系。以油酸为底物,在30℃条件下,反应10h后,产物环氧值可达4.12%,环氧转化率76.58%,环氧化选择性0.98。以无患子油混合脂肪酸为原料,验证了该催化工艺的稳定性和可靠性。最终,从反应条件、反应机理、反应动力学方面,对比了化学催化甲酸原位环氧化和Candida sp.99-125脂肪酶催化环氧化过程的区别,讨论了两种方法的优缺点。
  综上所述,论文通过研究Candida sp.99-125脂肪酶在结构型酯类化合物产品催化转化过程中,酰基转移副反应的机理、历程、相关调控措施、策略;以及不饱和脂肪酸环氧化过程中开环副反应的影响及控制技术,过氧化物对脂肪酶的毒性问题及其解决方案;进一步完善了以Candida sp.99-125脂肪酶为基础的绿色生物催化平台技术,有利于提高生物催化技术在工业生产应用中的竞争力。
[博士论文] 曹浩
化学工程与技术 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:随着信息技术在硬件、软件和机器深度学习等方面的飞速进步,以及人们对于生命本质的不断深入理解,作为广义生物学重要组成部分的生物信息学也得到了快速发展。生物信息学现已普遍应用于分子生物学、基因组学、蛋白组学和结构生物学等学科的研究中。核酸数据库、蛋白数据库、结构数据库的不断扩容,为生物信息学的科学性分析提供了可靠的数据依托;分子力学、分子动力学、量子力学算法及相应计算软件的不断优化,为生物信息学的精确运算提供了理论层面的支持。
  蛋白质是基因表达的最终形式,承载着生命的活力。生物信息学不仅可以用于理解蛋白质起源、进化、结构、功能之间的关系,甚至可以指导设计和改造蛋白质,以得到新型的生物活力分子。酶通常为蛋白质,它也是生物催化的技术核心。然而,随着生物催化技术逐步被应用于更为广阔的行业领域,天然酶的催化性能已经不再能满足生物反应对于更为稳定高效的催化过程,更为丰富的催化产品,和更为低廉的应用成本等方面的应用需求。
  本论文基于酶的进化、结构与催化性能之间的规律,以生物信息学手段实施酶催化性能的优化和改造,建立了酶定向进化策略中DNA重组智能文库(Smart library)的选点模型,有效降低了基因进化文库中重组突变体的致死率;建立了酶与底物相互作用关系的分子力学模型,理性改造了一种多聚磷酸激酶的底物选择性;建立了酶与表面修饰分子构象构效关系的分子动力学模型,阐释了糖类化合物修饰酶分子表面的作用机理。研究内容如下:
  1、冗杂的基因突变文库是限制酶定向进化策略高效实施的关键问题。本研究以计算预测的突变体解旋自由能(△G)入手,基于蛋白序列-结构-功能之间关系的规律,建立了定向进化策略中DNA重组智能文库(Smartlibrary)的选点模型。该选点模型具有降低定向进化DNA重组文库中突变体致死率的特点,通常可降低80%的致死率。基于该选点模型,本研究选取了脂肪酶(Bacillus subtilisl ipase A-B SLA)的13个突变位点,探索性建立了该酶的离子液体([BMIM][Cl])抗性重组突变体的虚拟定向进化策略。实验表明,采用本研究的虚拟定向进化策略筛选获得的最佳抗性突变体(F17S-V54K-D64N-D91E)与传统实验中单点叠加突变获得的最佳抗性突变体具有一致性,并与实验定向进化策略中获得的最佳抗性突变体在F17和V54位点上的氨基酸替代种类一致。
  2、揭示酶与底物相互作用关系是理性设计改造酶底物特异性的重要依据。本研究利用生物信息学的分子对接技术,通过计算酶与底物间的结合能,建立了多聚磷酸激酶与底物分子相互作用关系的分子力学模型。发现了多聚磷酸激酶(Corynebacteriumglutamicum polyphosphatekinase-PPK2(NCgl2620))的双亚基结构具有功能性空腔,可形成新的ADP底物结合口袋,并具有利用低聚磷酸(PolyP(4))分子催化生成ATP的功能;基于以上发现,重构了(Sinorhizobium meliloti polyphosphatekinase-PPK2(SMc02148))多聚磷酸激酶的底物结合位点,发现其突变体PPK2(SMc02148-KET)具备了利用低聚磷酸(PolyP(4))作为磷酸供体,体外催化再生ATP的能力,并构建了谷胱甘肽双功能连接酶和己糖激酶的多酶催化体系,得到了谷胱甘肽(产物浓度:38.79 mM)和葡萄糖-6-磷酸(产物浓度:87.35 mM)。结果表明,理性设计的多聚磷酸激酶SMc02148-KET可实现体外再生ATP。
  3、本研究利用分子动力学模拟技术,建立了溶剂环境中酶分子与表面修饰功能性分子作用关系的计算分析模型。应用上述计算分析模型,阐述了脂肪酶(Yarrowia lipolytica Lipase2-YLLIP2)的热失活和极性有机溶剂失活机理;进而发现了脂肪酶表面极性氨基酸残基与β-环糊精外环羟基相互作用时,酶与β-环糊精形成的超分子构象可有效改善酶的温度和溶剂耐受性。基于此结论,进一步研究了葡萄糖分子表面修饰脂肪酶(YLLIP2)所形成的糖-酶超分子在甲醇溶液中的构象构效关系,解释了在脂肪酶(YLLIP2)催化生物柴油的生产过程中葡萄糖作为添加剂对生物柴油(脂肪酸甲酯)转化率的促进作用机制。
[硕士论文] 刘恒嘉
微生物学 广西大学 2017(学位年度)
摘要:木聚糖酶是一类降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶系,主要包括内切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切β-1,4-木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1,4-木糖苷键,其主要水解产物为低聚木糖和少量木糖。不同来源木聚糖酶酶学特性存在明显的差异,其水解产物的特性也不完全相同,可广泛用于再生能源、啤酒酿造、饲料、食品、造纸等工业。
  本课题从实验室已筛选鉴定的一株产木聚糖酶的纤维微菌属(Cellulosimicrobium sp.XM-8)菌株出发,通过逐步的分离纯化其野生酶,最终得到一条具有木聚糖酶活性的蛋白条带命名为Xyn-8,并对该野生酶的酶学性质进行分析测定。结果表明该野生酶的最适温度60℃,最适pH值为5.0,其拥有良好的温度稳定性及pH稳定性;在50℃及以下温度条件中处理8h后仍剩余70%以上的酶活力,在pH4-10之间处理12h后仍具有80%以上的酶活力;该酶具有很强的底物特异性,只对木聚糖底物有酶活力;5mM的Na+、Mg2+和Ba2+对酶活性有轻微的激活作用,Ag+、Hg2+及化学试剂SDS对其有强烈的抑制作用,使其酶活几乎完全丧失。在最适条件下,测定可溶性底物Beechwood木聚糖的Km和Vmax为2.167±0.18g/L,740.6±15.77μmol/min·mg-1,以蔗渣木聚糖为不可溶性底物时Km和Vmax分别为7.91±0.56 g/L和806.8±21.34μmol/min·mg-1。
  通过序列对比后设计简并引物克隆得到该木聚糖酶完整基因,该基因存在一个10家族的催化功能与和两个碳水化合物结合域,通过利用大肠杆菌系统进行表达时发现大量的目的蛋白以不可溶性的包涵体形式存在。结构域的分析表明该酶包含一个10家族的催化功能域与和两个碳水化合物结合域,为了获得大量可溶性表达以及探索碳水化合物结合域对热稳定性及其它酶学性质的影响,本实验将已克隆的完整基因Xyn-8a和去除碳水化合物结合域的基因Xyn-8c连接pPIC9K载体导入毕赤酵母GS115细胞中进行高密度发酵表达。实验结果表明Xyn-8a和Xyn-8c在毕赤酵母表达系统中获得了良好的可溶性表达。基因Xyn-8c在P.Pastoris GS115中表达时比在大肠杆菌中表达,热稳定性有很大的提高,最适温度提高了10℃,温度稳定性由45℃处理0.5h后残留50%酶活力,提高至55℃处理8h仍有接近40%的酶活力。结果表明重组酶与底物的亲和力减小,而去除碳水化合物的重组酶最适温度及热稳定性有了很大的提高,推测可能是由于酵母表达系统中密码子亲和性以及进行的N-糖基化结构修饰不同于大肠杆菌表达系统,因此对酶学性质造成了影响。
[硕士论文] 吴健
化学工艺 广西大学 2017(学位年度)
摘要:脂肪酶(EC3.1.1)具有高度选择性和特异性,催化效率高、反应条件温和,低能耗、无污染等优点而获得广泛应用。通常采用固定化策略来提高酶在非天然反应体系中的稳定性及重复使用率。一般认为载体的特性对于固定化酶的催化特性有影响。本文以廉价易得的膨润土为酶固定化材料,采用表面活性剂对其进行改性,并用于固定Lipase OF和Candida rugosalipase(TypeⅦ)(CRL)这两种脂肪酶,以此来研究表面活性剂改性膨润土对酶特性的影响。
  首先,选用阳离子、阴离子、非离子这三类表面活性剂分别改性Na-Bent,用于固定Lipase OF。当采用不同碳链长度的阳离子表面活性剂改性膨润土固定Lipase OF,发现载体表面的疏水性是影响固定化酶活性的一个关键因素,其中十八烷基三甲基溴化铵(OTAB)改性效果最佳,固定化酶比活为415.8 U·mg-1,是Na-Bent固定化酶比活的2倍。通过对比不同类型表面活性剂改性膨润土的蛋白固载量和固定化酶活性,认为载体表面的带电荷性对载体吸附性能影响不显著,但表面的官能团则可能因为影响载体的疏水性及酶分子与载体的非特异性结合而影响固定化酶的特性。
  采用复合表面活性剂改性膨润土分别固定Lipase OF和CRL时,发现对这两种褶皱假丝酵母脂肪酶均有较好的固定化效果,其中改性膨润土固定Lipase OF酶呈现更高的固载量和比活回收率。通过综合对比不同表面活性剂组合改性膨润土的固定化效果,发现CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)/TX100两种阳-非复合离子表面活性剂改性效果最佳,蛋白固载量为0.68mg·g-1support,比活回收率达133.4%。
  比较改性膨润土固定化酶和游离酶的催化特性,发现由改性膨润土制备的固定化Lipase OF酶和CRL酶比游离酶具有更宽泛的耐pH和温度范围,且酶的储藏稳定性也得到改善。同时,以复合表面活性剂CTAB/TX100改性膨润土为载体制备的固定化Lipase OF酶的Km和Vmax值分别由5.57mg·mL-1和42.63μg·min-1变化至3.43 mg·mL-1和57.57μg·min-1,表明将此改性膨润土用于制备固定化酶,不仅改善酶与底物的亲和力,且最大反应速率提高1.35倍,有效提高酶的催化效率。
  另外,采用扫描电镜(SEM)、X射线衍射仪(XRD)、比表面(BET)、热重分析(TGA)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、拉曼光谱(RRS)等表征手段,探究膨润土、改性膨润土及改性膨润土固定化酶的性能,发现脂肪酶已成功固定于改性膨润土上,且膨润土经CTAB/TX100复合表面活性剂改性后,层间距由1.20 nm增大至1.59 nm,酶的吸附位点增多,利于酶的固定化,且发现部分脂肪酶吸附在改性膨润土的表面,部分脂肪酶嵌插在膨润土层间。
[硕士论文] 韩英坤
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:谷氨酰胺合成酶(GS)广泛存在于动物、植物和微生物体内,能够利用ATP提供的能量催化合成谷氨酰胺,与生物的氮代谢密切相关。此外,研究中发现部分GS也能催化乙胺和谷氨酸生成茶氨酸。谷氨酰胺有很好的营养价值和药用价值,茶氨酸是很好的保健品,这两种化合物均有巨大的市场,所以GS有很好的工业应用潜力。因此,研究针对本室筛选的拥有GS活性的巨大芽孢杆菌N6展开了工作,取得了以下结果:
  根据巨大芽孢杆菌相关基因组信息设计引物,经PCR扩增得到目的基因BGS。测序得知BGS有1335bp,共有氨基酸444个,分子量约为50.4kDa。经比对与枯草芽孢杆菌的GS的相似性最高(88%)。纯化产物酶学性质检测表明,最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.0。该酶在55℃的条件下保温2.5h后,BGS仍有高达90%的活性,在65℃条件下保温1h后,仍有50%的活性。通过薄层层析和HPLC验证该酶具有合成茶氨酸的活性。
  为了改良BGS的酶学性质,利用随机突变和定点突变技术对该基因进行体外定向进化。通过易错PCR构建了随机突变文库,从8000个转化子中筛选获得了2个突变株:F1-D10(D198G)、F1-F10(I28T、L159I)。经测定,F1-D10对ADP的催化效率提高了33%,对谷氨酰胺的催化效率下降了20%,对盐酸羟胺的催化效率提高了79%;F1-F10对ADP的催化效率提高了65.7倍,对谷氨酰胺的催化效率提高了56%,对盐酸羟胺的催化效率提高了67%。对F1-F10进行回复突变,构建了I28T和L159I,其中L159I对ADP、谷氨酰胺、盐酸羟胺的催化效率分别提高了93.7倍,2.5倍和3.2倍。通过多序列比对和同源建模方法选取了7个距离活性中心比较近的位点进行了定点突变。结果表明,E65A与野生型相比对ADP、谷氨酰胺、盐酸羟胺的催化效率分别提高了154.7倍、1.4倍和2倍。为了探讨不同突变位点是否存在叠合效果,构建了E65A/D198G,结果并未产生叠加效应。对E65A,L159I酶学性质研究表明,与野生型相比E65A的最适温度由30℃变为50℃,L159I的最适温度变为55℃。同时,L159I的热稳定性得到了显著提升,在65℃水浴2.5h后还有90%的活性,而野生型在相同的条件下仅剩15%。在合成茶氨酸方面,L159I较野生型产量提高了35%。结构模拟的结果显示,L159I的159位的Leu变为Ile,使得两个单体之间的空间位阻变小,附近氢键结合更紧密。65位的Glu变为Ala不仅使催化位点更容易暴露而且使活性空腔开口变大,反应底物更易进入。总之,本研究为BGS的结构与功能研究及进一步研发奠定了基础。
[硕士论文] 柯蒙蒙
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:酯酶(Esterase,EC3.1.1.X)是水解酶的一种,能够催化酯键断裂生成醇类和酸类产物,也可以催化酯键的形成。酯酶由于能够催化酯水解反应和转酯反应,广泛应用于工业、农业、洗涤业以及制药业等领域。冷活性酶具有在低温下催化效率高,可以节约能源和特殊化合物的合成。因此,本研究针对酯酶EstA进行了研究,主要结果如下:
  从肠肝菌Enterobacter sp.中克隆到一个新的酯酶基因estA,大小为717bp,编码238个氨基酸,分子量为25 kDa。序列比对结果发现EstA没有被报道过。另外,序列分析表明EstA序列具有水解酶典型的结构催化三联体Ser-Asp-His及包含Ser的保守结构Gly-Ala-Ser-Met-Gly。
  酯酶EstA在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达和纯化后,对酶学性质进行了分析,结果表明:在不同侧链长度的对硝基苯酯类底物中,酯酶EstA对对-硝基基苯乙酸酯活性最高,活性随着底物侧链长度增加而降低,对对硝基苯基棕榈酸酯(p-Nitrophenyl palmitate)的活性最低。最适反应温度是40℃,最适反应pH值为9.0。以对硝基苯乙酸酯为底物,测得EstA的动力学常数Km为393.75μmol/L,Kcat为905.6 min-1,Kcat/Km为2.30×103 min-1·μM-1。在0℃到20℃范围之间,EstA仍保持70%以上的活性,说明酯酶EstA具有较好的冷活性。在3M NaCl存在下,EstA保留60%左右的活性,而且经过4M NaCl溶液4℃处理24 h,EstA仍保留100%活性,说明酯酶具有一定程度的耐盐性。乙二醇、30%的异丙醇和30%的丙酮对EstA有明显的抑制作用,10%、20%的异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇和二甲基亚砜对EstA活性影响较小,说明EstA具有有机溶剂耐受性。EstA在0.5%和1% Triton-100、tween-20、tween-80 CTAB及10%的Triton-100、tween-20去污剂中保留60%以上的活性。
  EstA热稳定性差,45℃处理120 min或50℃处理30 min,酶活几乎丧失。为了提高EstA的热稳定性,通过随机突变得到一个热稳定性提高的突变体A92P,45℃处理120 min,仍保留95%的活性,是野生型的19倍;A92P在50℃处理30 min,保留55%的活性,是野生型EstA的2倍;为了进一步探讨92位氨基酸对热稳定性的影响,对92位位点进行饱和突变,结果表明:突变体A92D热稳定性显著提高,45℃处理120 min对其活性几乎没有影响,50℃处理30 min,仍保留85%左右的活性,是野生型的3.4倍。为了探究92位突变位点对酶热稳定的影响机理,对EstA及突变体进行同源模拟及92位点附近空间结构进行了分析,结果显示:突变体A92D的92位疏水性氨基酸(Ala)被亲水性氨基酸(Asp)取代后,其与溶液之间及周围亲疏水结构之间形成了更有利于蛋白稳定的结构;而突变体A92P热稳定提高可能是由于脯氨酸Pro具有限制蛋白二级结构的旋转,增加蛋白的刚性,从而推测可能是提高热稳定性的主要原因。这些结果为进一步研究冷活性酶结构和功能关系及热稳定性研究提供了重要信息。
[硕士论文] 徐志龙
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:角蛋白是一种结构致密的蛋白质,在自然界中的资源分布非常广泛。然而,因其分子间存在大量的二硫键,使角蛋白很难被普通蛋白酶降解。角蛋白酶是一类能够特异性降解角蛋白的生物酶,若能合理地利用角蛋白酶的这个特性,不仅可以将每年数百万吨的禽类羽毛变废为宝,还保护了环境。
  本研究从土壤中分离到一株产角蛋白酶菌株——枯草芽孢杆菌KS12,液态发酵角蛋白酶酶活可达46.89 U/mL。在对其粗酶的酶学性质进行探究后发现:枯草芽孢杆菌KS12生产的角蛋白酶的最适反应pH为7.5,在碱性环境(pH7.5-9.0)中的稳定性较高,酸性条件下的酶活受到明显抑制;该酶的最适反应温度为37℃;不耐高温,60℃条件下孵育1h后,相对酶活仅为50%。Ca2+和Mg2+(5 mmol/L)对酶活有较大的促进作用;重金属离子普遍对角蛋白酶活性表现出抑制作用,Cu2+的存在会强烈抑制角蛋白酶的活性。浓度为5%的吐温80会在一定程度上提高角蛋白酶的活性,SDS和H2O2对酶活的抑制作用明显;有机溶剂的加入可能会对角蛋白酶产生毒害作用,致使酶活受到强烈抑制。
  为了进一步了解枯草芽孢杆菌KS12在发酵中产酶的能力,研究通过单因素试验确定了羽毛粉麸皮混合固态发酵的工艺条件:羽毛粉70%,麸皮30%,培养基初始含水量55%,氢氧化钙浓度0.2%,葡萄糖3%,接种量为10%,适宜的发酵温度为37℃,发酵3d,间隔12h翻料一次。当发酵进行到72h时,角蛋白酶酶活最高可达356.34±7.21 U/g,可溶性蛋白含量为60.46±1.69mg/g。浅盘放大发酵结果表明,36h角蛋白酶酶活达到542.46±15.47U/g,可溶性蛋白含量为45.41±2.27mg/g。体外模拟消化试验测得罐头瓶发酵产物的体外消化率较未发酵前提高了28.1%。
[硕士论文] 王文宸
生物工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:超氧化物歧化酶(SOD)可以交替催化超氧化物自由基(O2-),使其发生歧化反应变为普通分子氧(O2)和过氧化氢(H2O2),这使得超氧化物歧化酶具有关键的抗氧化作用,在人类的生产生活中是不可或缺的;过氧化氢酶(CAT)可以催化过氧化氢(H2O2),使其变为水(H2O)和氧(O2),从而使超氧化物歧化酶催化反应所产生的过氧化氢变为完全无害的物质,且可以促进超氧化物歧化酶的催化反应。固定化酶使得酶的稳定性提高,且便于回收、再利用,对于环境也有保护作用,具有很强的现实意义。
  本论文首先对SOD-ELP和CAT-ELP在适宜的条件下进行表达纯化,之后,通过酸催化热缩聚、水浴、碱性条件下水解的方法制得可溶性的聚合物载体接枝十六烷基链的聚天冬氨酸(PASP-C16)。然后,使用NHS-EDC化学交联法将SOD-ELP和CAT-ELP固定到PASP-C16上。得出:交联单酶和交联双酶都具有活性,且与游离酶相比,活性损失不大;另外,通过比较交联单酶和交联双酶的活性,得出了CAT可以促进SOD的催化反应,两种酶具有协同作用。证明了交联双酶可以更有效地提升反应速率,具有更广阔的市场前景。
  此外,本论文运用了扫描电子显微镜、红外光谱、荧光光谱、激光扫描共聚焦显微镜、圆二色光谱等一些仪器对载体、游离酶及固定酶进行了表征分析。扫描电子显微镜、红外光谱和激光扫描共聚焦显微镜的实验结果证明了单酶SOD和双酶SOD-CAT确实通过交联的方法固定在了载体PASP-C16上。荧光光谱通过使用荧光猝灭剂丙烯酰胺对固定前和固定后的酶进行猝灭反应,得出的结论为固定化使酶的稳定性得到了提高,使酶不易因环境的改变而改变蛋白结构。圆二色光谱(CD)通过对固定前和固定后的酶的二级结构进行分析,得出的结论为固定化并没有使酶的二级结构发生太大的改变,α-螺旋的含量略微有些下降,无规则卷曲变多,可初步的确保酶活性没有丧失。
[硕士论文] 李发家
微生物学 广西大学 2017(学位年度)
摘要:壳聚糖为目前发现的唯一一种天然阳离子多糖,它在自然界中分布广泛,储量丰富。壳寡糖为壳聚糖的水解产物,具有壳聚糖抗菌、抗肿瘤和抗氧化等独特生理活性;同时,又因为壳寡糖低分子量、高水溶性和易被生物体吸收等特点,更利于工业生产和利用。红树林生态系统结构复杂,其中蕴含着丰富的微生物资源,存在数量繁多的甲壳类生物,是天然壳聚糖的重要产地。
  本研究通过纯培养技术,从广西亚热带海洋土壤沉积物样品中分离筛选得到四株能够在壳聚糖筛选平板上产生水解圈的菌株,经过复筛后选择其中壳聚糖酶活力最高的菌株GZ1进行菌种鉴定。鉴定结果表明,菌株在显微镜下观察为杆状,革兰氏染色呈阳性,有芽孢和荚膜,在培养基上菌落生长较大,颜色呈黄色,表面粗糙不透明,边缘呈不规则波浪状。同时,经过16S rDNA测序后发现GZ1与Bacillussubtilis strain CS10有99%一致性,进化树构建结果显示亲缘性最近菌株为Bacillus subtilis strain CS10,结合菌株GZ1的常规生理生化性质鉴定,菌株GZ1可鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为Bacillus subtilis GZ1。
  采用DNS法测定发酵液的壳聚糖酶活力,同时对粗酶液的最适反应温度与pH进行了测定,测定结果显示粗酶液的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.5。
  进行氮源、碳源、pH值、装液量、转速、温度和壳聚糖量的单因素实验,并根据单因素实验结果进行了氮源浓度、pH值、装液量和温度的四因素三水平正交实验,最终所得到的最适氮源为1%蛋白胨、最适碳源为1%可溶性淀粉、最适发酵温度为20℃、最适发酵pH为7.5、最适装液量为80mL/250mL、最适培养转速为180rpm、最适壳聚糖量为0.75%、培养时间为2d。在最优发酵条件下进行发酵产酶,测定所得发酵液最高酶活力为1.886U/mL,为优化前的2.6倍。在本研究中,经过正交实验优化后,除了温度没有改变外,其他几个因素相对于单因素实验都有一定的变化,因此,在Bacillus subtilisGZ1的发酵条件优化中,各因素间的相互作用可能影响较大,以响应面法来进行条件优化应该能取得更好的效果。
  当前报道的重组表达壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌发酵产酶能力大都较高,与之相比,Bacillus subtilis GZ1为野生型菌株,未经过改造,发酵产酶能力较低。因此,通过对Bacillus subtilis GZ1壳聚糖酶基因的启动子与拷贝数进行改造的方式,应能使Bacillus subtilis GZ1的发酵产壳聚糖酶能力有一个较大的提升。此外,枯草芽孢杆菌为动物饲料的常用添加剂,而Bacillus subtilis GZ1所产壳聚糖酶最适反应温度较高,达到55℃,较高的酶反应温度使其在饲料工业的生产中有一定的应用价值和参考价值。
[硕士论文] 安扬东方
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:海藻糖普遍存在于自然界,是一种非还原性二糖。海藻糖酶可以将海藻糖特异性地水解为葡萄糖,海藻糖酶作为食品添加剂可以治疗二糖缺乏症,人体内某些肾脏疾病的诊断可以通过检测尿海藻糖酶的活性来实现,故而海藻糖酶在食品、医疗等领域具有很高的应用价值,此外,也可以通过研究海藻糖酶的结构与功能开发新型酶抑制剂应用于昆虫防治中。
  本研究从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae strain AR_0002)中克隆到了一个海藻糖酶基因,将其命名为treE。treE基因全长1650bp,GC含量58%,编码549个氨基酸,分子量为63.5kDa,预测的pI为4.93。与NCBI数据库中的海藻糖酶基因序列对比后发现,treE与来自于Enterobacter Cloacae ATCC13047的海藻糖酶基因序列具有88%的一致性。
  酶学性质分析表明,treE的最适反应温度和pH分别为50℃和6.0。在pH5.5-9.0的范围内,酶在4℃条件下处理了48h,保持了80%以上的活性,说明在偏中性的条件下,该酶的稳定性良好。Mn2+,Fe3+(1mM,5mM),Co2+(1mM)可以提高treE的活性, Cu2+,Fe3+(10mM),Mg2+(10mM),Co2+(10mM)抑制了treE的活性。最适条件下,treE的Km是3.318 mmol/L,Vmax是0.445 mmol/L·min, kcat是1265.164s-1,催化效率(kcat/Km)为381.303 L·mmol-1·s-1。
  为了提高treE的催化活性,对treE进行了体外诱变,构建了随机突变文库,利用实验室建立的高通量筛选方法,我们从16000个随机突变体中筛选获得了一个酶活提高突变子1-D8。序列分析表明,1-D8含有两个突变位点:Tyr22Cys和Trp491Arg。酶学性质分析表明,1-D8的最适反应温度为45℃,比野生型降低了5℃;最适反应pH为6.5,用pH5.5-9.0的缓冲液在4℃下处理48h后,仍保留80%以上的活性。动力学分析表明,1-D8的Km是3.082 mmol/L,kcat值为1819.651 s-1,kcat/Km值为590.412 L·mmol-1·s-1,比野生型提高了54.8%。
  为了探究1-D8中两个突变位点对酶活的影响,本研究依次对它们进行了单点回复突变。酶动力学分析表明, Y22C的Km是3.355mmol/L, kcat为1331.910 s-1,催化效率(kcat/Km)为396.993 L·mmol-1·s-1,比野生型提高了4.0%。突变体W491R的Km值为3.060mmol/L,kcat值为1734.137s-1,催化效率(kcat/Km)为566.711 L·mmol-1·s-1,比野生型高了48.6%。这表明1-D8活性的提高主要来自突变位点W491R的贡献。
  此外,本研究通过结构模拟与分子对接,初步确定R168可能与treE的催化效率有关。为了验证这一推测,我们构建了单点突变R168G,其Km为2.380mmol/L,kcat为530.777 s-1,催化效率(kcat/Km)为223.016L·mmol-1·s-1,与野生型相比下降了41.5%。
  本研究在获得海藻糖酶的基础上,对其进行定向改良,获得了酶活提高的突变体,为进一步改造提高酶活提供了材料和线索。同时,鉴定了与催化效率相关的氨基酸残基,为深入探索海藻糖酶结构与功能关系提供了参考。
[硕士论文] 郑德兵
环境工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:针对传统交联酶聚集体(CLEAs)粒径小、黏性大、重复利用困难等缺点,本研究以CLEAs技术为基础,将无官能修饰的纳米Fe3O4嵌入脂肪酶CLEAs中,制备磁性纳米交联酶聚集体(M-CLEAs),利用纳米Fe3O4的纳米特性和超顺磁性,改善CLEAs结构及性能,实现CLEAs重复利用的便捷性;将M-CLEAs应用于有旋转磁场的微管式反应器中,利用旋转磁场使M-CLEAs与反应体系中的底物充分接触及产物的瞬间分离,并考察了该装置在油酸丁酯合成和含柴油废水降解中的应用。此外,还优化了M-CLEAs的制备条件,分析了M-CLEAs的酶学性能及形态结构,具体结果如下:
  (1)当游离脂肪酶浓度为70 mg·mL-1,纳米Fe3O4在脂肪酶液中浓度为9 mg· mL-1,交联剂浓度为2.075%(v/v),沉淀剂用量为脂肪酶液体积的12倍,交联时间为120 min,沉淀时间为30 min,交联温度为4℃,制备获得的M-CLEAs酶活力最大为2897.69 U·g-1。
  (2)形态结构分析表明,添加纳米Fe3O4增大了CLEAs粒径,M-CLEAs孔隙度增加,紫外光谱吸收峰增强,并伴随轻微的红移现象。M-CLEAs的二级结构中,β-折叠、α-螺旋、β-转角的含量分别增加3.5%、1.1%、2.6%,而无规则卷曲降低8.7%,即酶蛋白分子刚性增加,柔性降低。M-CLEAs中两个发色基团(色氨酸残基和酪氨酸残基)的荧光强度均减弱,尤其对峰1(色氨酸残基)更为突出。
  (3)与游离酶相比,M-CLEAs对外界环境的敏感性降低,对温度、酸碱、有机变性剂的承受能力增加,置于pH为6-9的缓冲液中保存2h无酶活损失,低温(4℃)放置30天酶活力仅损失5%。M-CLEAs显示出较强的操作稳定性,水解三油酸甘油酯摇瓶试验结果表明,连续反应3次(30 min/次),酶活回收率在88%左右,连续反应6次,酶活回收率仍超过50%; M-CLEAs在微管式反应器中的应用表明,4个连续循环后(18h/循环),M-CLEAs结构无明显变化,二级结构和荧光强度发生轻微的变化。反应动力学研究表明,M-CLEAs对三油酸甘油酯的亲和力小于游离酶,但最大反应速率比游离脂肪酶大。
  (4) M-CLEAs在微管式反应器中催化合成油酸丁酯试验表明,在最佳反应温度45℃,M-CLEAs在反应液中的浓度为9 mg·mL-1,反应15h,油酸丁酯产率约为84%; M-CLEAs在微管反应器中多层(3层)分布比少层(2层)分布催化效率高16%(反应18h);M-CLEAs连续4次循环反应(18h/次),油酸丁酯产率并没有下降。降解模拟柴油废水试验表明,25℃下,对质量浓度2000 mg·mL-1模拟乳化柴油废水降解12 h,降解率为91%;在相同条件下,对质量浓度500mg·mL-1模拟乳化柴油废水降解8h,降解率可达93%,明显高于降解其它高浓度的柴油废水。
  上述结果表明,纳米Fe3O4不仅优化了CLEAs的性能及结构,而且使CLEAs重复利用更为简便,为CLEAs工业化应用提供了参考。
[硕士论文] 闫红梅
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:γ-氨基丁酸(GABA)是一种普遍存在于自然界中的非蛋白质类的氨基酸,它可由谷氨酸或其钠盐经谷氨酸脱羧酶(GAD)在一些辅因子的辅助下催化转化而来。GABA具有使血压降低、治疗癫痫类疾病、保肝利肾、预防哮喘、调节激素的分泌水平、镇静安神、增强记忆力等重要的生理功能。本论文利用微生物发酵生产GABA,具有安全系数高、成本低的特点,首先,以基因工程技术为基础,构建能够高效表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌。其次,采用固定化技术,利用固定化的GAD发酵生产GABA,避免直接用工程菌生产GABA带来的安全隐患。最后,通过固定化酶的反复使用有效降低生产成本。
  本研究首先从Lactobacillus plantarum22144和E.coli AS1.505中分别克隆gad基因,构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coliBL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad),两种工程菌经IPTG诱导后,都能够表达GAD蛋白,其分子量均在53kDa左右,但基因序列差别很大,同源性仅58%,氨基酸序列相似性更低,为45%。通过HPLC比较E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad)的谷氨酸脱羧酶酶活力,最终选择酶活力较高的E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)作为研究对象。
  利用信号肽分泌表达、与融合标签融合表达和与分子伴侣共表达3种在大肠杆菌中提高外源蛋白可溶性表达的策略,分别构建了E.coliBL21(DE3)(pET-22b-22144-gad);E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad,Δpe1B);E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-22144-gad);E.coli BL21(DE3)(pMA-c2X-22144-gad(TGA));E.coli BL21(DE3)(pET-28a-SUMO-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL· ES,pET-28a-22144-gad)共6株重组大肠杆菌。通过比较重组蛋白的可溶性表达量及酶活力高低,发现E.coliBL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)可以提高GAD的可溶性表达,且酶活力最高,在酶活测定条件下对MSG的转化率可达95%以上,确定利用其表达外源蛋白GAD。
  为提高E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)对GAD的可溶性表达,及提高细胞破碎率,减少细胞破碎对酶活性的损害,对诱导温度、IPTG添加量等诱导表达条件和破碎缓冲液进行了优化,最后获得的诱导及破碎条件为:IPTG添加量为0.1 mM,诱导温度25℃,140 rpm诱导表达10h后,每5OD600离心后的菌体加0.5 mL TGE缓冲液进行超声破碎。对超声破碎处理得到的GAD粗酶液的酶学性质进行研究,其酶的最适催化pH=4.6,最适催化温度为37℃,酶活力可达1.86 U/mL。
  分别用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、环氧基树脂和氨基化树脂对酶进行固定化,结果表明氨基化树脂LX-1000EA在pH4.6的缓冲液中对酶固定化效果最好,可以达到约50%的酶回收率。通过单因素实验和Box-Benhnken试验设计对酶固定条件进行优化,得出用氨基化树脂LX-1000EA固定谷氨酸脱羧酶的最佳条件为:固定化时间7.5 h、固定化温度42℃、载体g∶酶U=1∶7.5,酶活力可达4.22±0.1 U/g。固定化酶IGAD的酶学性质为:最适催化pH=4.8,比游离酶(pH=4.6)偏高;在pH=3-5的偏酸性条件下,酶的稳定性较强;IGAD的最适催化温度与游离酶相似,为37℃,该条件下酶活力约4.4 U/g;酶的热稳定性较好,在45℃保存8h仍保留80%的酶活,但温度越高酶活丧失越严重。所以IGAD应在偏酸性低温(4℃)条件下保存。
  最后利用IGAD在3L发酵罐里转化生产GABA,通过分批添加MSG,转化72h后,GABA产量可达117 g/L,转化率达97%,再经下游分离纯化工艺处理后,即可符合工业生产的要求。
[博士论文] 史婧
生物化学与分子生物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:以大肠杆菌recQ基因命名的RecQ家族解旋酶是对基因组稳定性维持极为重要的分子马达蛋白,其功能几乎涉及到DNA复制、修复、重组、转录和端粒维持等代谢过程。在人类的五种RECQ解旋酶中,基因blm,wrn和recq4的突变分别会引起三种显著不同的疾病病征:布鲁姆综合征(Bloom syndrome,BS)、沃纳综合征(Wemer syndrome,WS)和先天性血管萎缩皮肤异色综合征(Rothmund Thomson syndrome,RTS)。其中,BS病人细胞最典型的特点是呈现出比正常人约高10倍的姐妹染色单体交换率(Sisterchromatid exchanges,SCEs),而且倾向于形成多种恶性肿瘤。由于所有已鉴定的RecQ家族解旋酶都具有结构和功能特点非常相似的C端解旋酶核心结构域,所以,N端的显著差异可能是细胞中各解旋酶具有特异功能的重要因素。然而,截至目前,关于BLMN端结构研究的报导仍较欠缺,关于BLM全长蛋白结构的研究也因其稳定性低、回收量少、大量纯化耗资多等而受到限制。
  首先,鉴于以上不足,本研究在与已报导的BLM同源蛋白的序列和表达系统进行对比分析的基础上,选取与人BLM解旋酶(homo sapiens BLM helicase,简称hBLM)亲缘关系较近的模式生物鸡BLM解旋酶(Gallus gallus BLM helicase,简称gBLM)为研究对象,优化并确立了gBLM及其截短蛋白gBLM Core和gBLM CΔHRDC在大肠杆菌中的高水平表达和高产量纯化方法体系,这可为gBLM酶学特性和生物物理实验研究提供足量高质量的蛋白。通过对gBLM进行凝胶过滤层析、动态光散射(DLS)、荧光各向异性DNA结合实验、快速停留DNA解旋实验的酶学特性测定,研究得出以下结论:(1) gBLM是一种活力较强的非典型性DNA结构特异性解旋酶,不仅对具有3'尾链的DNA结构底物具有高亲和性,而且可有效结合并解旋具有平末端结构的复制泡状DNA底物,这暗示了gBLM潜在的加工DNA代谢中间物的生物学功能。(2)不同截短gBLM蛋白的活性对比分析显示gBLM N端不仅与gBLM的多聚体形成相关,而且具有明显的辅助结合复制叉和复制泡状DNA底物的功能,对多种DNA结构底物的解旋也是必需的,这揭示了N端对BLM聚体和活性的调控作用。(3) DNA结合和解旋活性对比分析也显示HRDC结构域呈现出明显的辅助gBLM结合和解旋大多数复杂结构DNA底物的特性。因此,gBLM的大量高纯度纯化策略及相应的酶学特性分析结果可为hBLM的结构和分子机理研究提供一个新的参考模型。
  其次,基于以上gBLM的酶学特性分析,本研究进一步综合利用生物信息学、生物化学和生物物理学方法对BLM的N端进行了深入研究,并取得了以下结果:
  (1)对数据库中已测序的78种BLM同源蛋白的生物信息学分析发现:BLM同源蛋白N端在物种间差异较大,序列保守性低,且柔性区域较多,推测BLM同源蛋白N端可能不具有保守的三维结构。然而,进一步的分析发现其中含2至3个二级结构元件的DHBN(Dimerization Helical Bundle in N-terminal domain,N端二聚化螺旋束)是存在于脊椎动物BLM同源蛋白N端中的唯一高度保守的结构域,这可能与其在进化中的重要生物功能相关。gDHBN结构稳定性高的特点在不同截短gBLM N端蛋白的限制性蛋白水解实验和LC-MS/MS鉴定中也得到了验证。
  (2)通过对不同BLM N端截短蛋白的系统晶体初筛、优化、X-射线晶体衍射与解析,研究分别获得了hBLM、gBLM和pBLM(Pelecanus crispus BLM helicase) DHBN的高分辨率的晶体结构:hDHBN(2.0(A))、gDHBN(2.7(A))和pDHBN(1.4(A))。进一步的相互作用力和生化特性对比分析显示高度保守的DHBN结构域主要通过疏水作用力稳定存在,并主要负责参与BLM解旋酶的二聚化。溶液中gDHBN的SAXS测定模型也较好地证实了DHBN的二聚体结构。
  (3)不同截短gBLM蛋白的凝胶过滤层析分析和DLS测定显示高度保守的二聚化DHBN是BLM高聚体组装的基本单位,在此基础上,本研究提出了之前电镜研究观测的hBLM环状结构模型。同时,不同截短gBLM蛋白的DNA解旋活性测定和DLS对比分析显示伴随着BLM从二聚体被组装成六聚体,其DNA解旋速率与解旋幅度不断降低,这暗示了DHBN结构域对DNA解旋过程的调控作用,也揭示了BLM聚体形态与DNA解旋活性之间的关系。有趣的是,稳定的DHBN二聚体在BLM全长蛋白分子中可由ATP水解诱导解离,这与hBLM和WRN的ATP诱导解离性质相一致。
  总之,本研究不仅首次优化确立了gBLM的大量高纯度纯化方法,分析了N端对其聚体和酶学活性的调节作用,而且也首次揭示了BLM DHBN的高度序列、结构保守性与多种潜在调控功能,这些研究不仅可深化对BLM同源蛋白酶学特性与结构相似性的理解,同时也可为深入认识细胞中hBLM的聚体组装和结构机理提供重要参考依据。
[硕士论文] 刘伟华
食品科学 天津商业大学 2017(学位年度)
摘要:固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一种为克服游离酶稳定性能差、成本高、产物纯度低等缺点而应运而生的一种技术,固定化酶已在许多领域显示出重要的应用价值。但是固定化酶的制备过程通常耗时较长,少则几个小时,多则几十个小时。现今,随着科学技术的发展,人们对生活质量的要求越来越高,费时、繁杂的方式和方法不断被淘汰,快速测定技术迅猛发展,人们的生产生活方式越来越快捷。因此探索高效制备固定化酶的方法,以满足生产、应用的需求是必要的。
  近年来,微波作为一种高效的辅助手段被广泛地应用到科研之中。但目前为止,国内外对微波辅助固定化酶的研究相对较少,且还没有对胰蛋白酶进行微波固定化的研究。因此本课题采用微波固定化的方法来制备固定化胰蛋白酶。
  本课题研究包括以下四个部分:
  (1)以ES-105环氧基树脂为固定化胰蛋白酶的载体,在微波辅助的条件下,对胰蛋白酶进行固定化,应用Box-Behnken响应面法设计实验,优化确定了最佳的固定化条件。结果表明,在加酶量为41 mg/g、pH值6.2、微波温度为30℃、微波时间10 min的条件下,制备的固定化胰蛋白酶的活力为322.6 U/g。此酶在25℃~40℃的温度范围内、5~7和9~10的pH值范围内稳定性较好,经过9次使用后还可以保持63.2%的初始酶活力,在4℃环境下贮藏五周后仍能保持初始酶活力的64.6%。
  (2)以ESR-5伯氨基树脂为固定化载体,在微波辅助的条件下,以戊二醛为交联剂制备固定化胰蛋白酶。应用Box-Behnken响应面法设计实验,优化确定了最佳的固定化条件。结果表明,在加酶量为26 mg/g、戊二醛质量分数为0.53%、pH值为9.1,微波温度为35℃、微波时间为5 min的条件下,制得的固定化胰蛋白酶的活力为390.8 U/g。此酶在25℃~45℃的温度范围内、在8.5~10.0的pH值范围内酶的稳定性较好,经过11次使用后还可以保持86.7%的初始酶活力,在4℃环境下贮藏五周后仍能保持初始酶活力的63.7%。
  (3)以D151大孔树脂为固定化载体,在微波辅助的条件下,采用吸附-交联法制备固定化胰蛋白酶。采用星点设计-响应面法优化确定了最佳的固定化条件。结果表明,在吸附时间1.5 h、加酶量81 mg/g、戊二醛质量分数1.0%、pH值5.0、微波温度29℃、微波时间3.5 min的条件下,制备的固定化胰蛋白酶的活力为221.5 U/g。此酶在25℃~45℃的温度范围内、在4.0~5.0和9.0~10.0的pH值范围内酶的稳定性较好,经过8次使用后还可以保持73.1%的初始酶活力,在4℃环境下贮藏五周后仍能保持初始酶活力的71.1%。
  (4)应用各种不同载体制备的固定化酶水解酪蛋白和紫苏饼粕蛋白,以考察各种固定化酶的酶解性能。结果表明,三种不同载体制备的固定化胰蛋白酶水解蛋白后得到的产物有差别,但差别不显著。
  综上所述,以ESR-5伯氨基树脂为固定化载体制备的固定化胰蛋白酶的酶活力最高,制备过程中酶活力的损失最少;操作稳定性优于其他两种固定化胰蛋白酶,说明通过Schiff反应将树脂和胰蛋白酶交联在一起的化学固定化方式更牢固;其温度稳定性优于ES-105树脂固定化胰蛋白酶;酸碱稳定性和贮藏稳定性与另外两种相差不大;其催化水解蛋白的效果与另外两种固定化胰蛋白酶相差不大,总体而言是三种固定化胰蛋白酶中性能最好的。
[硕士论文] 付玄
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是哺乳动物中普遍存在的天然杂多糖,结构上由二糖重复单元连接而成,以蛋白聚糖或游离形式存在。糖胺聚糖的重要生理功能及其与重大疾病的密切关系近年来受到国内外科学家的广泛关注。透明质酸(hyaluronan,HA)是结构最简单的糖胺聚糖,由二糖重复单位[-D-glucuronic acid-β1,3-N-acetyl-D-glucosamine-β1,4-]连接而成,不同于其他糖胺聚糖,透明质酸没有硫酸化修饰且不与蛋白共价结合,以游离形式存在。
  HA广泛存在于动物组织及某些微生物中,由于其良好的保水性、粘弹性和生物相容性,已经广泛应用于保健品、化妆品及医药等领域。近年来研究发现,HA除了作为细胞外基质的结构组成外,还参与了细胞识别、信号转导等重要生理过程,在肿瘤的发生、发展及炎症反应过程中发挥了多重生物效应。代谢异常是肿瘤的重要特征,肿瘤微环境中,HA合成和降解的动态平衡发生异常,糖链长度变化是一个重要体现,也是肿瘤恶性程度的评价指标之一。肿瘤细胞表面存在大量HA特异性受体和结合蛋白,HA通过与受体或结合蛋白的相互作用,激活细胞内多条信号通路,参与肿瘤发生发展和炎症反应等生物效应过程。尤为值得关注的是,有别于其它生物效应分子的合成后修饰过程,HA的生物活性受其糖链长度的调控,不同糖链长短的HA表现出截然不同的生物效应。受生物体内多糖合成过程的影响,商品化HA具有高度不均一性(分子量分布范围较宽且呈弥散性分布),严重阻碍了HA生物学功能的正确表述。
  目前,商品化HA的生产方法主要有两种。一是动物组织提取,这种技术产量较低,且存在动物原料受限和动物病毒残存问题。二是微生物发酵,用这种方法生产HA成本低、规模大且不受原料的限制,但存在细菌内毒素、核酸、蛋白质及重金属污染的风险。上述方法在商品化HA的制备方面得到了较大发展,但在均一化HA的精细化制备方面还极具挑战性。
  本论文围绕均一HA的制备这一科学问题,对巴斯德氏菌来源的透明质酸合酶(PmHAS)的催化反应机理进行了深入研究,采用逐步酶法合成HA寡糖片段和一步法同步化合成均一HA,发展了均一HA的两步偶联酶法合成策略。论文第二章节通过深入研究PmHAS的催化反应机理,发现PmHAS催化新生HA糖链合成过程中存在起始限速步骤,造成了产物的高度不均一性。通过对PmHAS的底物选择性分析,发现透明质酸三糖是PmHAS催化合成均一HA所必需的最小受体底物;进一步研究发现,催化反应体系中受体与供体的摩尔浓度比例是影响HA糖链长度的关键因素,通过对反应体系中受体/供体摩尔浓度进行化学计量控制,实现了均一HA的糖链长度可控酶法合成。随后进一步拓展了均一HA酶法合成策略在化学结构明确、HA糖链长度可控的HA缀合物制备领域的应用。制备了生物素标记的透明质酸(HA-biotin conjugates)以及透明质酸-药物缀合物(HA-oroxylin conjugates)。HA-biotin conjugates能够作为分子探针,对外源HA的细胞内代谢过程进行可视化检测;HA-oroxylin conjugates作为模式药物,为HA修饰抗肿瘤靶向药物的研发奠定了基础。
  论文第三章开展了透明质酸一硫酸软骨素(HA-CS)嵌合型糖胺聚糖的合成。由于HA与CS结构的相似性及PmHAS灵活的底物适应性,通过逐步反应的方法合成了CS2HA2-N3、 HA2CS2HA2-N3、CS2HA4-N3和CS4HA4-N3四种HA-CS嵌合型糖胺聚糖,用于研究微观结构改变对HA生物功能的影响。该方法也可应用于其他不同嵌合型糖胺聚糖的合成中,为嵌合型糖胺聚糖的生物功能研究奠定了基础。
  论文第四章节中,结合本实验室在糖核苷酸酶法合成方面的工作基础,建立了一种以单糖为起始的多酶偶联的HA合成策略。以廉价单糖GlcNAc和GlcA为起始底物,将糖核苷酸的酶法合成与透明质酸的聚合反应相偶联,一锅多酶催化高效合成HA。并利用此方法成功合成了HA衍生物,用于交联HA的制备和应用研究,具有十分广阔的应用前景。
[硕士论文] 赵龙
微生物学 合肥工业大学 2017(学位年度)
摘要:三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)在医疗领域应用广泛,对肝炎、脑溢血后遗症、心肌疾患等多种疾病均具有良好疗效。但由于三磷酸腺苷酶法合成中酶的价格昂贵,未在工业上获得广泛应用。在生物体内外Mg2+的存在下,丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)能够催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的磷酸基团转移到二磷酸腺苷(ADP)上从而生成丙酮酸(PYR)和ATP。此步反应为ATP的酶法合成提供了新的思路;而且基于此步反应的ATP再生系统,采用再生ATP的廉价底物来替代ATP,可以有效提高有用物质生产过程的经济性。
  本研究利用DNAMAN、MEGA7软件对PykA氨基酸序列进行分析发现,PykA中涉及构成ATP及PEP结合位点的氨基酸残基是高度保守的。然后进一步采用基因工程技术成功构建Ⅱ型丙酮酸激酶(PykA)的表达载体pET28a(+)-pykA,并实现了其在大肠杆菌BL21中的高效表达:1L菌液可以得到34mg的蛋白;利用镍柱对PykA进行纯化,并对纯化后的蛋白进行定量,浓度可达到2.3mg/mL。通过高效液相色谱技术(HPLC)对PykA催化功能进行检测,结果发现在30℃,pH为8.0的环境中,ADP和PEP的浓度比为1∶1时,无论反应进行0.5h还是1h,0.05mg/mL的PykA都无法将ADP完全转化为ATP,ATP的积累对PykA催化ADP磷酸化反应具有抑制作用;当ADP和PEP的浓度比为1∶2时,0.05mg/mL的PykA只需0.5h就可以将ADP完全转化为ATP。
  本研究的结果可以达到将丙酮酸激酶更好地应用于ATP再生系统,为ATP的酶法合成提供新的思路的目的。
[博士论文] 张珏
儿科学 华中科技大学 2016(学位年度)
摘要:第一部分:胆固醇调节钠钾ATP酶α亚型特异性的研究
  实验目的:
  钠钾ATP酶α1在细胞内质膜胆固醇下降时出现表达下调,并激活Src蛋白激酶信号途径。本实验的目的旨在研究胆固醇下降时对钠钾 ATP酶α亚基不同亚型的表达和分布影响。
  实验方法:
  1.培养钠钾ATP酶α亚基不同亚型特异性表达细胞系,通过Western blot检测相应的钠钾ATP酶基础表达水平;
  2.通过总胆固醇测定试剂盒检测不同亚型特异性表达细胞中总胆固醇的含量;
  3.使用细胞内胆固醇转运抑制剂U18666A化合物处理不同亚型特异性表达细胞,通过Filipin染色技术检测游离胆固醇的分布;
  4.使用细胞内胆固醇转运抑制剂U18666A化合物处理不同亚型特异性表达细胞,通过Western blot检测细胞中相应钠钾ATP酶α的表达水平;
  5.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞后,通过免疫荧光技术检测细胞中相应钠钾ATP酶α的分布情况。
  6.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞后,使用生物素标记蛋白和Western blot技术检测细胞膜上相应钠钾ATP酶α的表达情况。
  7.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞,通过Western blot检测细胞中另一种跨膜蛋白Claudin-4的表达水平。
  实验结果:
  1.培养基因敲除钠钾 ATP酶的猪肾小管上皮细胞(PY-17细胞)、转染大鼠α1的AAC-19细胞、转染大鼠α2的LX-α2-4细胞及转染大鼠α3的LM-α3细胞,检测结果显示AAC-19细胞中钠钾ATP酶α1呈现高表达,且未检测到其他亚型表达, LX-α2-4细胞仅检测到α2表达,LM-α3细胞中仅α3表达;
  2.AAC-19、LX-α2-4及LM-α3不同亚型特异性表达细胞中,总胆固醇的含量无明显差别(P>0.05);
  3.与AAC-19、LX-α2-4细胞基础状态相比较,LM-α3细胞中游离胆固醇在胞质内的分布较多,细胞膜上分布较少;
  4.使用U18666A化合物处理不同亚型特异性表达细胞,均导致游离胆固醇重新分布,质膜上胆固醇减少,胞质内胆固醇增加;
  5.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇,可以下调钠钾ATP酶α1特异性表达细胞中的α1表达水平(P<0.01),且变化呈现时间及剂量依赖性;对α2及α3特异性表达细胞中相应α2及α3的表达无明显影响(P>0.05);
  6.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇,可以改变钠钾ATP酶α1特异性表达细胞中α1的分布,减少质膜上α1,增加胞质内α1(P<0.05);但对α2特异性表达细胞中钠钾ATP酶的分布无明显影响(P>0.05)。
  7.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇,可以减少钠钾ATP酶α1及α3特异性表达细胞中细胞膜上相应α1及α3的表达分布,增加内吞(P<0.01);但不改变α2特异性表达细胞中α2在细胞膜上的表达(P>0.05)。
  8.经U18666A处理不同亚型特异性表达细胞,上调α1及α3特异性表达细胞中跨膜蛋白Claudin-4的表达水平(P<0.05),对α2细胞中Claudin-4的表达无影响(P>0.05)。
  实验结论:
  U18666A减少钠钾ATP酶α亚基不同亚型细胞内的质膜胆固醇,对α的表达及分布呈现亚型特异性调节作用,α1在功能复合物中作用独特。
  第二部分:Src与胆固醇调节钠钾ATP酶的机制研究
  实验目的:
  细胞内质膜胆固醇对钠钾ATP酶α1的调节被证实与Src蛋白激酶的激活密切相关。本实验旨在研究胆固醇在钠钾ATP酶α亚基与Src连接位点突变的细胞中,对α亚基不同亚型的调节作用,深入探讨钠钾ATP酶α与Src及胆固醇的相互作用,以及作用机制研究。
  实验方法:
  1.培养α1与Src连接区域CD3突变细胞A416P、A420P及A425P细胞,通过Western blot检测相应的钠钾ATP酶表达水平;
  2.三种A416P、A420P及A425P突变细胞经U18666A处理后,通过Western blot比较细胞中突变钠钾ATP酶α1的表达水平;
  3.培养α1与Src连接区域CD2突变细胞Y260A细胞,经U18666A处理后,通过Western blot比较细胞中突变α1的表达水平;
  4.培养AAC-19、LX-α2-4细胞和α2与Src连接区域突变系LY-a2细胞,通过Western blot检测比较细胞中钠钾ATP酶α及磷酸化Src、ERK1/2表达水平,免疫荧光技术检测比较α2分布情况;
  5.培养LY-a2突变细胞,加入U18666A处理后,通过Western blot比较细胞中突变α2的表达水平,通过免疫荧光技术检测细胞中α2的分布情况;
  6.培养LY-a2突变细胞,加入U18666A处理后,使用生物素标记蛋白和Western blot技术检测细胞膜上钠钾ATP酶α2的表达情况。
  实验结果:
  1.培养AAC-19细胞以及α1突变细胞系A416P、A420P与A425P细胞,Western blot结果显示A416P、A420P与A425P三种细胞中突变α1的表达水平一致,与AAC-19细胞中野生型大鼠α1的蛋白水平无明显差别;
  2.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇24h及48h,均可下调A416P细胞中α1的表达水平(P<0.001);减少质膜胆固醇48h可以减少 A420P细胞中α1水平(P<0.001),但24h无明显变化(P>0.05);而减少质膜胆固醇不能改变 A425P细胞中α1的表达水平(P>0.05);
  3.使用 U18666A化合物减少质膜胆固醇48h,可以减少α1与 Src连接突变细胞Y260A中突变α1蛋白的表达水平(P<0.05),但24h无明显变化(P>0.05);
  4.α2突变系LY-a2细胞中α1蛋白表达水平极低,与LX-α2-4细胞相比较α2蛋白表达水平及分布一致(P>0.05),且 LY-a2细胞中 Src与 ERK基础激活水平均较AAC-19细胞高,较LX-α2-4低(P<0.05);
  5.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇48h,可以减少LY-a2细胞中突变α2蛋白表达水平(P<0.05),但24h无明显变化(P>0.05);
  6.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇48h,可以减少LY-a2细胞中质膜α2的分布,增加胞质内α2(P<0.01)。
  7.使用U18666A化合物减少质膜胆固醇24h,不改变LY-a2细胞中α2在细胞膜上的表达(P>0.05);但48h后可以减少细胞膜上α2的分布,增加内吞(P<0.05)。
  实验结论:
  钠钾ATP酶α与Src之间的连接对胆固醇调节钠钾ATP酶α的表达及分布至关重要。
  第三部分:Caveolin-1与胆固醇调节钠钾ATP酶的机制研究
  实验目的:
  胞膜窖主要成分caveolin-1被证实对维持钠钾ATP酶α1功能和胆固醇的稳态密切相关。本实验旨在研究胆固醇在caveolin-1基因敲除细胞中对α1的调节作用,深入探讨钠钾ATP酶与Src、caveolin-1及胆固醇的相互作用及机制。
  实验方法:
  1.培养AAC-19细胞、PY-17细胞、LX-α2-4细胞、LY-a2细胞及LM-α3细胞,通过Western blot比较细胞中caveolin-1的基础表达水平;
  2.培养α1与Src连接区域突变细胞A416P、A420P及A425P细胞,通过Western blot检测caveolin-1的基础表达水平;
  3.培养AAC-19细胞、LX-α2-4细胞、LY-a2细胞及LM-α3细胞,通过蔗糖密度梯度离心法(fractionation)将相应的细胞分为11个部分,通过Western blot检测细胞中钠钾ATP酶、Src及caveolin-1于不同部分的表达分布情况;
  4.培养猪肾小管上皮 LLC-PK1细胞及基因敲除 caveolin-1的LLC-PK1细胞(C2-9细胞),通过Western blot比较细胞中caveolin-1的基础表达水平,加入U18666A处理后,通过Western blot比较C2-9细胞中相应钠钾ATP酶α1的表达水平;
  5.培养C2-9细胞,加入U18666A处理后,通过免疫荧光技术检测细胞中α1的分布情况。
  实验结果:
  1.与AAC-19细胞相比,LX-α2-4细胞和LM-α3细胞中caveolin-1基础表达水平明显降低(P<0.01),LY-a2细胞中caveolin-1与AAC-19中表达一致(P>0.05);
  2.钠钾 ATP酶α1突变细胞 A416P与 A420P细胞中 caveolin-1蛋白表达水平与AAC-19细胞相比无明显差别,仅A425P细胞中caveolin-1比AAC-19细胞减少;
  3.AAC-19细胞、LX-α2-4细胞、LY-a2细胞及LM-α3细胞经梯度离心后,4/5低密度部分为caveolae富集的质膜部分,且caveolin-1在四种细胞中不同部分分布均一致(P>0.05);与AAC-19细胞相比,LX-α2-4细胞中相应的钠钾ATP酶α及Src更多分布在较高密度的胞质部分(P<0.01),而非caveolae富集的4/5部分。LY-a2细胞相应α及Src的分布介于AAC-19与LX-α2-4细胞之间(P<0.05);
  4.与LLC-PK1细胞相比,基因敲除C2-9细胞中无可检测到的caveolin-1蛋白表达;使用U18666A化合物减少质膜胆固醇24h,α1蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),但更长时间处理48h,可以减少C2-9细胞中α1的表达(P<0.05);
  5.使用U18666A化合物减少C2-9细胞中质膜胆固醇24h,对α1于细胞内的分布无明显影响(P>0.05)。
  实验结论:
  胆固醇调节钠钾ATP酶亦需要caveolin-1的表达。
  第四部分:钠钾ATP酶与胆固醇连接域对胆固醇调节钠钾ATP酶的机制研究
  实验目的:
  在大多数胆固醇结合蛋白中,“L/V-X(1-5)-Y-X(1-5)-R/K”被证实是胆固醇识别/结合氨基酸序列(CRAC)。本实验旨在研究钠钾ATP酶α1亚基中的胆固醇结合位点,及其在胆固醇调节钠钾酶表达和转运中的作用。
  实验方法:
  1.使用NCBI网站Blast软件进行氨基酸序列比对,找出钠钾ATP酶的胆固醇结合域;
  2.建立α1 CRAC突变细胞系(Y55S),比较α1突变细胞中钠钾ATP酶的表达;
  3.采用fractionation(细胞分级分离技术)检测比较AAC-19与Y55S突变细胞中钠钾ATP酶、caveolin-1及Src的分布表达;
  4.使用U18666A化合物处理Y55S细胞,通过filipin染色比较游离胆固醇于细胞内分布情况;;
  5.在Y55S突变细胞中,加入U18666A减少质膜胆固醇后,通过Western blot比较细胞中α1的表达。
  6.在Y55S突变细胞中,加入U18666A减少质膜胆固醇后,使用免疫荧光技术检测细胞中α1的分布;
  实验结果:
  1.人类钠钾ATP酶α1亚基N端中具备胆固醇识别/作用氨基酸序列(CRAC),于不同物种中序列比较显示CRAC为保守序列。α2具备此保守序列,α3中无此序列。
  2.建立α1 CRAC突变细胞系(Y55S),使用特异性识别大鼠α1的多克隆抗体检测α1,结果显示Y55S中α1的表达量与AAC-19细胞相比,无明显差别(P>0.05)。
  3.经密度梯度离心后,与AAC-19细胞相比,Y55S细胞中钠钾ATP酶α1、caveolin-1及 Src更多分布于较高密度的胞质部分,较少集中在 caveolae富集的4/5部分(P<0.01);
  4.使用U18666A化合物处理Y55S细胞24h,通过filipin染色可见质膜胆固醇分布减少,胞质内胆固醇分布增多;
  5.使用 U18666A化合物减少质膜胆固醇24,突变α1的蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);
  6.使用 U18666A化合减少质膜胆固醇24h, Y55S细胞中α1的分布无明显变化(P>0.05)。
  实验结论:
  胆固醇通过钠钾ATP酶α的胆固醇连接区域调节α1表达与分布。
[博士论文] 周建芹
药理学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(EC2.3.2.13,microbial transglutaminase,mTG)催化肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(酰基供体或氨基受体)与伯氨化合物(酰基受体或氨基供体)之间进行酰基转移反应,实现蛋白质的分子交联、分子修饰,是一种用途非常广泛的酶。为了解决无法定点修饰蛋白质药物 Lys残基的难题,本文突破mTG仅定点修饰蛋白质Gln残基的限制,以mTG作为生物催化剂,实现了蛋白质药物(细胞色素C、尿酸酶)Lys残基的定点修饰;为了将mTG从催化蛋白修饰反应的溶液体系中回收,并克服传统固定化方法的底物扩散限制问题,本文以温度敏感材料为载体制备出可逆溶解-析出的固定化mTG,提高了固定化酶催化大分子底物反应的反应效率。针对上述两个问题,本文具体开展的研究工作如下:
  首先,对 mTG的酶学性质展开研究,考察还原剂、金属离子、温度、pH值等因素对mTG活力的影响。结果表明:还原剂的存在有利于其活力表达。镁离子对mTG有激活作用,铁离子对酶的活力有显著抑制作用,钠离子在浓度较低(2 mM)时对酶的活力具有促进作用,但其浓度较高时,反而对酶有轻微抑制作用,钙离子对酶活力有轻微抑制作用。mTG的最适温度为50-55 ℃左右,在40 ℃以下有很好的热稳定性,在40℃以上热稳定性比较差。酶的最适pH值在6-7左右,在6-8范围内,酶的酸碱稳定性最好。mTG催化双底物反应符合乒乓反应机制。
  在mTG酶学研究的基础上,探索利用mTG的催化作用实现聚乙二醇(PEG)定点修饰蛋白质药物(细胞色素C、尿酸酶)Lys残基的可行性。结果表明:甲氧基聚乙二醇氨(mPEG-NH2)与 N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺甘氨酸(CBZ-QG)共价结合后生成的CBZ-QG-mPEG,可以作为mTG的酰基供体。基于mTG对Lys残基的特异选择性,在mTG的催化作用下,CBZ-QG-mPEG与细胞色素C(Cyt C)、尿酸酶特定位点的Lys残基结合,实现了细胞色素C(Cyt C)、尿酸酶的PEG定点修饰。对mTG催化Cyt C修饰的反应条件进行优化,在优化条件下,酶法修饰Cyt C的转化率达到76.5%。修饰后的Cyt C仍具有良好的热稳定性和酸碱稳定性,而且活力与天然Cyt C相比略有提高。对mTG催化尿酸酶修饰的反应条件进行优化,优化后酶法修饰尿酸酶的转化率达到100%。修饰后尿酸酶的活力比修饰前尿酸酶活力高,且修饰后尿酸酶的溶解性能显著改善。修饰后尿酸酶的热稳定性、酸碱稳定性明显提高。这些性质的改善更有利于其临床应用。与化学修饰法相比,酶催化法修饰Cyt C、尿酸酶,修饰产物只有一种,而化学法修饰产生多种不同修饰度的不均一修饰产物。
  通过研究mTG催化蛋白质分子(酪蛋白、过氧化氢酶)的交联反应,实现了凝胶的合成和酶蛋白的酶法交联。结果表明:mTG能催化酪蛋白发生分子交联生成大分子聚合物。凝胶形成的决定性因素为酪蛋白浓度,而酶的用量对凝胶的形成速度有重要影响,酶用量越多,凝胶形成越快。SDS-PAGE分析表明,mTG也能催化过氧化氢酶(CAT)发生分子交联生成大分子聚合物。游离CAT的热稳定性和酸碱稳定性均比较差,而聚合后CAT的热稳定性和酸碱稳定性显著提高。
  分别以Affi-Gel?102微球和温度敏感的pNIPAM为载体实现mTG的固定化,并对两种固定化酶的动力学性质和应用方面的差异进行比较。结果表明:以Affi-Gel?102为载体的固定化酶对大分子底物的亲和性显著降低。固定化到载体Affi-Gel?102上之后,mTG仍然可以催化蛋白质分子的聚合反应、Cyt C和尿酸酶的修饰反应,而且能很容易地从溶液中分离出来,但与游离酶相比,催化效率降低。可逆溶解-析出的pNIPAM作为载体固定化mTG,具有对温度敏感的可逆溶解-析出特性,其低临界溶解温度(LCST)为39 ℃左右。mTG-pNIPAM对大分子底物的亲和性比游离酶略有降低,但远大于Affi-Gel?102固定化酶。mTG-pNIPAM催化蛋白质分子交联反应、Cyt C修饰反应的催化效率大于以Affi-Gel?102为载体的固定化酶的催化效率,而且通过加热和离心可以实现酶的回收。
[硕士论文] 王杉杉
化学工程 大连理工大学 2016(学位年度)
摘要:壳寡糖是一种低分子量的壳聚糖,分子量在500-10000之间,水溶性比壳聚糖好,可以直接被机体吸收,现已广泛应用于医药、保健食品和农业领域中。壳寡糖的制备可分为物理降解法、化学降解法和酶降解法。目前市场上大多数壳寡糖生产仍然采用酸降解或氧化降解方法,其生产工艺复杂,对环境污染大,产品分子量大,溶解性和生物活性低。而酶解法反应条件温和、整个降解过程中无其他反应试剂的加入、不至于发生其它副反应、降解过程及降解产物相对分子质量分布易于控制、壳寡糖得率高、不造成环境污染。
  本研究所用的高产壳聚糖酶的微生物菌株是从自然界中分离筛选出的,经过鉴定为蜡样芽孢杆菌SHS-0903,提取此菌种壳聚糖酶基因,连接到原核表达载体pET28a上,以大肠杆菌BL21为宿主转化表达,获得了工程菌,并对其发酵产酶条件进行优化,研究确定其最适产酶培养基。在此培养条件下,经过破壁离心后的壳聚糖酶活力可达到1500U/mL。发酵粗酶液经离心,20%-70%硫酸铵盐析后经浓缩得到壳聚糖精酶。酶学性质研究表明,其酶解最适温度为55℃,最适pH在4.8,该酶在60℃以下稳定,4℃冷藏30天后酶活保持在90%以上。Mn2+对酶活有促进作用,Cu2+,Fe3+对酶活有抑制作用。该壳聚糖酶为专一性内切酶,此酶的比活性比己知的壳聚糖酶酶活都要高,应用此酶使得酶法生产壳寡糖实现工业化生产成为可能。
  研究了壳寡糖的酶法生产条件,分别考察了酶促反应中温度,pH,底物浓度,酶用量,反应时间的影响。结果表明在pH4.8-5.3,壳聚糖浓度6.5%,壳聚糖酶加入量10U/g的条件下,反应温度53-57℃,酶解反应时间为100min,经离心浓缩喷雾后得到壳寡糖。检测了其部分质量标准。具体如下:外观:淡黄色粉末,pH5.74,水不溶物:0.015%,水分:10.1%,灰分:1.7%,色度:5800,平均分子质量:1920,得率为97.2%。
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