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[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[硕士论文] 刘斌
内科学(血液内科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是临床最常见的一种非霍奇金淋巴瘤,其发病与多种病原学及生物化学等因素相关,其具有发展迅速、侵袭性较高的特点。EBV(Epstein-Barr virus,EBV)是一种双链DNA病毒,已经有研究证实,EBV与许多肿瘤发病相关。而近年来EBV在DLBCL发病中的作用得到了越来越多的关注。在2016年NCCN非霍奇金淋巴瘤指南中,已将EBV+DLBCL单独列为弥漫大B细胞淋巴瘤中的一种亚型。针对EBV+DLBCL的相关临床调查报道提示,EBV感染和DLBCL起病具有一定相关性,而且这种亚型的DLBCL对于常规一线治疗疗效不佳,预后相对较差。而目前还鲜有针对EBV+DLBCL发病的机制性的研究报道。本文通过回顾性研究,统计EBV+DLBCL患者的临床信息,从而分析得出EBV+DLBCL独特的临床特征。并分析其相关基因及蛋白表达水平的变化,试图找出EBV+DLBCL的发病机制,为后续探寻更有效的治疗方法打下基础。本研究共分2部分,第一部分收集初发DLBCL患者的病理标本,检测EBV在DLBCL中的表达情况。结合临床资料,分析EBV的表达情况对DLBCL预后的影响。第二部分对结合EBER表达情况,对DLBCL标本进行基因突变分析及P53蛋白测定,分析EBV+DLBCL可能的致病机制。
  第一部分 弥漫大B细胞淋巴瘤中EBV表达情况及相关生存预后分析
  目的:明确DLBCL患者中EBV的表达情况,分析得出EBV+DLBCL生存预后情况。
  方法:收集本中心346例初发DLBCL患者的肿瘤病理标本,采用EBER原位杂交方法检测EBV表达情况。结合临床及病理资料,分析EBV和部分关键临床因素的相关性及EBV对DLBCL预后的影响。
  结果:在346例DLBCL患者中,EBV表达阳性共36例(10.4%)。相关性分析提示EBV阳性表达和患者性别、年龄、Hans分型、“双表达”、ECOG体力评分、Ann Arbor分期、IPI、B症状、LDH、β2微球蛋白、骨髓侵犯均无明显相关性。生存分析提示,EBV是DLBCL患者预后不良的一项独立危险因素。
  结论:EBV在DLBCL中的阳性表达率为10.4%,EBV是影响DLBCL患者预后的一项独立危险因素。
  第二部分 EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤中P53蛋白表达情况分析及TP53基因突变分析
  目的:检测EBV阳性DLBCL肿瘤标本中P53蛋白表达及TP53基因突变,了解EBV阳性DLBCL发病可能的分子学机制。
  方法:选取36例EBV+DLBCL及36例EBV-DLBCL标本,采用免疫组化的方法检测肿瘤组织内P53蛋白表达,了解P53蛋白在EBV+DLBCL中的表达情况;采用Sanger基因测序法,明确TP53基因在EBV+DLBCL中的突变情况。分析EBV在DLBCL疾病中对P53表达的影响,探寻发病可能的分子机制,为进一步精准治疗提供依据。
  结果:1.P53蛋白表达情况:72例患者中P53蛋白阳性表达为24例(33.3%)。其中,EBV阳性组为16例(44.4%),EBV阴性组8例(22.2%)。EBV阳性组P53蛋白阳性率明显高于EBV阴性组(44.4 vs.22.2%,P=0.046)。2.TP53基因突变情况:选取经免疫组化提示P53蛋白阳性的24例DLBCL患者肿瘤标本,在16例EBV+DLBCL患者中,发生TP53基因突变的共3例(18.8%)。
  结论: P53蛋白表达方面,EBV+DLBCL中P53阳性率为44.4%。而在P53蛋白表达阳性的16例EBV+DLBCL中,TP53基因的突变率仅为18.8%。根据P53蛋白在EBV+DLBCL中的高表达可以推断P53通路的异常激活是导致EBV+DLBCL发病的原因之一。而TP53突变率较低,证实EBV+DLBCL中P53通路的异常可能与TP53并无明显相关性,可能是由其它因素导致。而EBV+DLBCL组中P53的阳性率明显高于EBV-DLBCL组,因此可以推测,EBV感染很可能和P53表达密切相关。由EBV引起的P53通路异常可能是EBV阳性DLBCL一项重要发病机制。
[硕士论文] 傅郁华
内科学(血液病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系统发病率第二的恶性肿瘤,约占所有血液系统恶性肿瘤的10%,其疾病本质为骨髓中浆细胞恶性增生产生大量单克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白),并导致相关器官或组织损伤,至今仍无有效方法治愈。在传统化疗方案治疗下,MM患者中位生存期不足3年。近年来,随着以硼替佐米为代表的各种新药以及自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)的应用,MM患者的总生存期及生存质量得到了明显的改善,中位总生存期延长至5-7年。由于患者在疾病发展及预后方面存在明显的异质性,生存期从数月至十余年不等,因此进行准确的预后分层并行合适的个体化治疗是MM患者获得成功诊治的关键。2015年国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group,IMWG)在国际分期系统(International Staging System,ISS)的基础上制定了纳入遗传学高危因素以及乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)水平的修订版国际分期系幺充(Revised International Staging System,RISS),以期能更好的实现MM患者的预后分层。本研究对我院初发的259例MM患者进行临床特征及疗效、预后分析,目的在于分析RISS分期系统对MM患者预后及治疗的影响,并与传统Durie-Salmon(DS)分期系统及ISS分期系统进行相关预后分析比较,同时分析硼替佐米的应用对各分期系统预后的影响,旨在更好的认识多发性骨髓瘤的临床特征,同时验证RISS分期系统在预后分层及指导治疗意义上优于传统分期,值得在临床MM诊治过程中推广使用。
  资料与方法:回顾性分析259例我院收治MM患者的病例资料,分别用年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、血清白蛋白、血清球蛋白、β2-微球蛋白、乳酸脱氢酶、血肌酐、血清钙、尿酸、FISH检测结果(1q21基因、RB1基因、P53基因、D13S319基因)、免疫表型(CD56、CD20、CD19)、新药硼替佐米的应用、自体造血干细胞移植的应用、硼替佐米的注射方式、缓解深度、分期等影响因素对MM患者无进展生存期(progression free survival,PFS)及总生存期(overall survival,OS)进行单因素及多因素分析,并分析各影响因素对硼替佐米疗效的影响;分别用DS分期系统、ISS分期系统及RISS分期系统对MM患者进行生存及预后分析,同时分析新药硼替佐米的应用对DS分期、ISS分期、RISS分期预后的影响。
  结果:1.259例MM患者的收治年份以2010-2016年间为主,占84.1%;中位发病年龄58(34-87)岁,其中男性患者147例,女性患者112例,男女比例为1.31∶1,发病年龄以41-70岁区间为主,占86.1%;免疫分型以IgG型为主,占59.1%;中位随访45(4-188)个月,失访率为15.1%,总体MM患者中位PFS45个月,中位OS67个月;初诊实验室指标显示:大部分MM患者起病时伴有贫血、低蛋白血症、球蛋白及β2-微球蛋白水平升高;FISH检测提示有87.4%的MM患者检出异常,其中1q21基因扩增检出率为56.9%(58/102),RB1基因缺失检出率为44.1%(45/102),P53基因缺失检出率为17.5%(18/103),D13S319基因缺失检出率为42.7%(44/103),IGH基因重排检出率为38.8%(40/103)。2.单因素分析显示,性别(P=0.006)、32-微球蛋白(P=0.005)、尿酸(P=0.021)、是否行自体造血干细胞移植(P=0.025)、ISS分期(P=0.033)、RISS分期(P=0.022)与MM患者PFS显著相关,多因素分析显示性别(P=0.023)是影响MM患者PFS的独立预后因素;而年龄(P=0.038)、β2-微球蛋白(P=0.01)、ISS分期(P=0.028)、RISS分期(P=0.001)、缓解深度(P=0.001)与MM患者OS显著相关,多因素分析显示缓解深度(P=0.021)是影响MM患者OS的独立预后因素。3.259例患者中可行DS分期MM患者239例,DS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占4.2%、16.7%、79.1%,分期以DS分期Ⅲ期为主;中位PFS分别为68、41、44个月(P=0.496),中位OS分别为99、64、67个月(P=0.478),5年PFS率分别为60%、38.1%、31.3%(P=0.208),5年OS率分别为60%、60.9%、53%(P=0.533)。可行ISS分期MM患者236例,ISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占17.4%、41.1%、41.5%;中位PFS分别为53、48、38个月(P=0.033),中位OS分别为68、92、57个月(P=0.028),5年PFS率分别为36.8%、40%、25.6%(P=0.291),5年OS率分别为60%、63.9%、42.1%(P=0.119)。可行RISS分期MM患者173例,RISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占9.2%、81.6%、9.2%,以RISS分期Ⅱ期为主;中位PFS分别为68、47、16个月(P=0.022),中位OS分别为随访未达到、72、25个月(P=0.001),5年PFS率分别为55.6%、34.7%、11.1%(P=0.049),5年OS率分别为80%、59.2%、22.2%(P=0.012)。ISS分期Ⅲ期MM患者共98例,可进行RISS分期者52例,分期为ISS分期Ⅲ期、RISS分期Ⅲ期MM患者16例,分期为ISS分期Ⅲ期、RISS分期Ⅱ期MM患者36例,两组中位PFS分别为16个月与41个月(P=0.091),中位OS分别为25个月与64个月(P=0.042)。4.硼替佐米疗效分析显示,新药硼替佐米组疗效显著高于传统化疗组(P<0.0001),BADT化疗方案组CR率、ORR优于BAD与BDT组,且明显优于BD组(P=0.001);其中血红蛋白值(P=0.022)、血小板计数(P=0.007)与P53基因(P=0.002)显著影响硼替佐米疗效。5.RISS分期Ⅲ期患者预后差,应用新药硼替佐米可获益,新药组与传统化疗组中位OS分别为30个月与14个月(P=0.014)。
  结论:1.MM好发于中老年人,男性发病率略高于女性,免疫分型以IgG型为主,起病时多伴有贫血、低蛋白血症、球蛋白和β2-微球蛋白水平升高以及染色体异常;2.性别和缓解深度分别是影响MM患者PFS和OS的独立预后因素;3.RISS分期系统在预后分层意义上优于传统DS分期系统和ISS分期系统,且可进一步筛选出ISS分期Ⅲ期患者中高危MM患者;4.硼替佐米可使MM患者疗效显著提高,血红蛋白值、血小板计数与P53基因可影响硼替佐米疗效;5.RISS分期Ⅲ期患者预后差,中位总生存期为25个月,新药硼替佐米可改善其不良预后。
[硕士论文] 赵成帅
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过对比左半结肠癌与直肠癌患者在发病年龄、性别、首发症状、组织学类型、肿瘤分期、术前是否贫血、区域淋巴结阳性率、p53阳性率、Ki-67阳性率、KRAS、BRAF基因突变状态等之间差异,以及基因组特征、基因组变异频率、转录组之间的差异,探讨左半结肠癌与直肠癌之间的异同,为结直肠癌精准治疗提供依据。
  方法:①选取2011年1月至2012年1月在海军军医大学长海医院行手术切除的323例原发性结直肠癌患者为研究对象,收集患者临床特征资料,以手术日期或病理确诊日期为随访起点对患者或家属进行随访,以死亡为终点事件,随访时间截至2017年8月1日,分别对两组的数据进行统计分析。②通过下载TCGA数据库结直肠癌患者139例TMB数据,148例MSI数据,139例SNV数据、283例CNV数据及137例RNA-Seq数据,运用生物信息学的方法进行处理并行统计学分析。计数资料比较使用x2检验,计量资料比较使用t检验,KM法用于生存分析,运用COX回归分析哪些因素对生存期有影响,P<0.05有显著统计学差异。
  结果:①左半结肠癌与直肠癌患者在首发症状、组织学类型、肿瘤分期、术前是否贫血、p53阳性率及BRAF基因突变状态之间差异有统计学意义(P均<0.05)。②左半结肠癌和直肠癌中位生存时间均未观察到。③左半结肠癌、直肠癌的5年生存率分别为79.2%、74.3%。④Ⅰ期、Ⅱ期左半结肠癌和直肠癌患者生存曲线差异无统计学意义(P=0.840);Ⅲ期左半结肠癌和直肠癌患者生存曲线差异无统计学意义(P=0.106);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期左半结肠癌和直肠癌患者生存曲线差异无统计学意义(P=0.524)。⑤Cox比例风险分析结果显示,病理类型[HR=1.759,P=0.047]和肿瘤分期[HR=2.104,P<0.001]是影响结直肠癌患者生存期的独立危险因素。⑥左半结肠癌和直肠癌在肿瘤突变负荷及微卫星不稳定方面差异无统计学意义(P均>0.05)⑦左半结肠癌和直肠癌在基因组变异频率上存在差异,其中KRAS等7个基因SNV差异有统计学意义(P均<0.05),ALK等1064个基因CNV差异有统计学意义(P均<0.05)。⑧左半结肠癌和直肠癌在转录组上存在差异,有259个基因表达及10条信号通路存在差异(P均<0.05)。
  结论:左半结肠癌多以腹痛、排便习惯改变为首发症状,直肠癌则以血便为主;左半结肠癌含粘液腺癌或印戒细胞癌成分的比例高于直肠癌;直肠癌初诊时的肿瘤分期早于左半结肠癌;左半结肠癌术前贫血的比例高于直肠癌;左半结肠癌与直肠癌生存期未见明显差别;病理类型及肿瘤分期为结直肠癌患者生存期的影响因素;左半结肠癌与直肠癌在TMB及MSI上未见差异,在基因组变异频率及转录组特征上存在一定的差异。
[博士论文] 杨阳
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌,又称大肠癌,为消化系统常见的恶性肿瘤,近十年来国内结直肠癌原发病率和年龄标准化发病率均持续增长。结直肠癌潜伏期较长、生长较慢、进展缓慢,其诊断分期对于患者愈后有着较大的影响。及时的检诊可以有效提高结直肠癌的治疗效果并改善患者预后。目前结直肠癌的诊断方法主要为生化检验、影像学检查和病理学检查。由于缺乏敏感度和特异性较好的生物标志物,其早期诊断率仍然较低。而诊断金标准结肠镜检查不适合用于大规模人群的早期筛查。因此,探索有效诊断结直肠癌的生物标志物具有重要的意义。
  近十年来,随着多种组学技术的发展,新型的生物标志物得以发现。作为组学的一个分支,代谢组学能够检测细胞信号转导、调节以及生物化学反应中的小分子物质,具有较高的敏感度和特异性。代谢组较目前临床使用的生物标记物更为敏感,对人体内任何微小的生化改变具有很强的监测能力,因而可以成为包括结直肠癌在内各种癌症的诊断和个性化治疗最有力的工具之一。基于代谢组学发现结直肠癌的肿瘤生物标志物,具有无创或微创、适合大规模人群筛查的优点,且用于分析的血浆和尿液等体液样本使用量少,容易获得。
  氨基酸在机体新陈代谢中起着至关重要的作用,是维持正常细胞功能和生物生存的必需。氨基酸的组成与含量随着肿瘤细胞代谢的改变而产生变化,因此在一定程度上能够反映原发肿瘤的形成、生长和浸润转移等情况。在结直肠癌代谢组学研究中,已有文献报道结直肠癌患者和健康志愿者的血液、尿液和粪便中氨基酸的组成不同,在癌组织与正常组织之间的氨基酸组成也存在一定的差异性。
  基于以上因素,首先,本论文建立了结直肠癌患者癌组织中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、门冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、门冬酰胺(Asn)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、瓜氨酸(Cit)、非对称二甲基精氨酸(ADMA)、胱氨酸(Cyss)、肌氨酸(Sar)、3-氨基丙酸(Apa)、3-氨基-2-甲基丙酸(Amp)、4-氨基丁酸(Aba)、5-氧代-脯氨酸(Opr)、羟脯氨酸(Hpr)、鸟氨酸(Orn)、2-氨基己二酸(Ahd)、马尿酸(Hia)、对称二甲基精氨酸(SDMA)、犬尿氨酸(Kyn)等34种氨基酸的液相-串联质谱联用(LC-MS/MS)检测方法,该方法仅需要100mg组织样本匀浆,避免了对待测氨基酸进行衍生化处理,且10min内完成分析,检测选择性好,34种待测氨基酸及内标氨基酸具有较好的色谱分离与质谱响应,标准曲线在线性范围内线性良好,提取回收率与基质效应、定量下限、日内日间准确度精密度、稳定性、稀释效应均符合生物样本分析要求,适用于临床大批量组织样本的高通量分析。
  运用该方法对94例结直肠癌患者癌组织、癌旁组织及正常组织样本进行34种氨基酸的含量测定,并进行结直肠癌组织靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明:癌组织中Gly、Asp、Glu、Pro、Cys、ADMA、Cyss、Kyn、Orn、Aba、Apa、Hpr,以及Ala、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Asn、Met、Trp、His、Opr、SDMA、Sar、Amp含量均显著高于癌旁组织、正常组织中的含量;结直肠癌组织与非癌组织的氨基酸代谢谱具有较大差异;建立的正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)模型具有较高的稳定性和较高的预测率,能够较好的区分癌组织与非癌组织;找到了Apa、Kyn、Cyss、Cys、Hpr、ADMA、Gly、Asp、Ala、Val、His十一个变量投影重要性(VIP)值大于1的差异性代谢物,其中VIP值大于1.5的差异性代谢物有Apa、Kyn、Cyss,可以作为潜在的区分肿瘤组织的生物标志物。
  其次,本论文建立了结直肠癌患者血浆中Gly、Ala、Val、Lys、Leu、Ile、Gln、Glu、Met、His、Phe、Arg、Tyr、Trp、Ser、Pro、Thr、Opr、Asn、Orn、Cit、Cyss、Cys、Hpr、Asp、ADMA、SDMA、Kyn、Apa、Sar、Amp、Hia等32种氨基酸的LC-MS/MS检测方法,该方法中待测氨基酸不用衍生化,直接通过反相C18柱进行色谱分离,血浆用量仅50μl,分析时间10min,检测选择性好,在线性范围内各待测氨基酸的标准曲线线性良好,提取回收率与基质效应、定量下限、日内日间准确度精密度、稳定性、稀释效应均符合生物样本分析要求,适用于临床大批量血浆样本的高通量分析。
  运用该方法对246例结直肠癌患者血浆、411例健康志愿者血浆、33例结直肠癌前病变患者血浆进行32种氨基酸的含量测定,并进行结直肠癌血浆靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明:结直肠癌患者血浆Gln、Ser、Glu、Asn、Opr、Orn、Lys、Cys、Amp、SDMA、Asp含量均显著高于健康志愿者血浆中的含量,Gly、Ala、Val、Phe、Trp、Pro、Arg、Met、Tyr、Cyss、His、Hia、Hpr、Sar、Apa、Leu、Kyn均显著低于健康志愿者血浆中的含量;结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆中的氨基酸代谢谱具有较大差异;建立的OPLS-DA模型具有较高的稳定性和较高的预测率,能够较好的区分结直肠癌患者与健康志愿者;找到了Trp、Sar、Glu、Ser、Met、Ala、Cys、Cyss、Tyr、Opr、Apa、Gln、Hia、Arg十四个VIP值大于1的差异性代谢物,其中VIP值大于1.5的差异性代谢物有Trp、Sar、Glu,可以作为潜在的诊断结直肠癌患者的生物标志物。通过Logistics回归,基于Trp、Sar、Glu三个氨基酸建立了联合因子诊断模型。诊断模型方程为:联合因子=0.001×Trp+0.029×Sar-0.002×Glu-9.427(Trp、Sar、Glu单位ng/ml),联合因子截断值为2.433(小于截断值,诊断为结直肠癌患者);对结直肠癌的诊断效能高于氨基酸单因子,高于临床常用的血清诊断指标癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白。该结直肠癌诊断模型对上述血浆样本的诊断准确率为91.9%、灵敏度为83.3%、特异性为96.6%、阳性预测值93.2%、阴性预测值91.3%,各项诊断评价指标均优于CEA诊断,可用于结直肠癌的辅助诊断。
  最后,本论文比较了154例结直肠癌患者与154例健康志愿者的血浆样本中Trp、Kyn含量,以及吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1酶)的含量及相对活性,比较了94例结直肠癌患者的癌组织与癌旁组织、正常组织样本中IDO1酶的相对活性,结果表明:结直肠癌患者血浆IDO1酶含量略高于健康志愿者,但含量差异无统计学意义;结直肠癌患者血浆IDO1酶相对活性极显著高于健康志愿者;结直肠癌患者癌组织IDO1酶相对活性极显著高于癌旁组织、正常组织。研究初步证实了结直肠癌患者体内存在着色氨酸代谢紊乱的异常情况。
[硕士论文] 王硕
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  肝癌是中国第二大肿瘤死因。随着老龄化和环境危险因素暴露增加,肝癌发病率居高不下。男性高发是肝癌一个重要流行病学特点。据估计,中国男性肝癌发病率约是女性3倍。生活方式如饮酒、吸烟等不足以解释所有的男性肝癌发病风险。饮酒、乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)、性激素受体以及它们之间的交互作用可能是男性肝癌高发的原因。性激素受体被认为明确与肝癌发生有关。目前认为,雄激素受体(Androgen Receptor,AR)发挥促癌作用,雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)发挥抑癌作用。HBV可能与性激素受体相互作用,共同促进肝癌发展。饮酒与HBV的交互作用也会增加HBV的致癌能力。
  目前在肝癌发病性别差异上的研究主要集中在两方面:第一,探究男性肝癌高发人群特征以及肝癌男性高发相关危险因素。第二,利用分子生物学手段研究某一特定分子和通路在男性肝癌高发中的作用。目前,尚没有研究对男性肝癌高发原因进行整体描述和分析。
  利用生物信息学的手段,全面描述男性肝癌的基因特异性表达模式,分析其与预后的关系,并预测可能调控机制。
  研究目的:
  根据转录组学分析男性肝癌基因特异性表达模式。从表观修饰、微小RNA(micro RNA,miRNA)和性激素受体角度预测男性肝癌基因特异性表达模式的调控机制。通过生存分析,探索男性特异性表达模式的临床价值,构建男性肝癌预后模型。
  研究方法:
  1.数据来源:本研究数据来源于癌症和肿瘤基因图谱计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)公共数据库中肝癌相关的RNA-seq、miRNA、甲基化数据和临床数据。本研究验证数据来源于本教研室收集并测序的男性肝癌患者癌症与癌旁组织的RNA-seq数据。
  2.样本纳入:采用频数配对法和倾向评分匹配的方法进行样本纳入筛选。首先保证肝癌和癌旁组织中病毒感染信息匹配。其次,根据年龄、肝癌病理分期、身体质量指数(Body Mass Index,BMI)等进行倾向评分匹配。
  3.本研究将肝癌性别特异性基因或表达模式定义为:1)存在性别差异的基因或表达模式,即某一性别基因或表达模式相对于另一个性别存在高、低表达;2)与肝癌有关的基因或表达模式,即排除正常人中与性别有关,与肝癌无关的基因或表达模式。
  4.在肝癌、癌旁组织中进行基因差异表达分析,筛选出男性特异性高、低表达基因和女性特异性高、低表达基因,并对差异基因进行功能富集分析。
  5.利用生存分析,探究男性特异性基因富集通路与肝癌患者预后的关系。
  6.利用验证集数据对男性特异性差异表达基因、富集通路的表达水平、富集通路与肝癌预后的关系进行验证。
  7.采用Spike-and-Slab Lasso Cox模型,构建基于男性特异性差异表达基因的男性肿瘤风险预后模型。
  8.在肝癌和癌旁组织中进行miRNA差异表达分析,筛选出男性特异高、低表达miRNA,女性特异性高、低表达miRNA。利用TARGETSCAN和miRANDA数据库预测miRNA靶基因。并将靶基因与差异表达基因相结合,寻找miRNA和基因相互作用关系。
  9.利用加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)寻找男性中具有类似表达模式的模块(module)。对模块内基因进行富集分析,确定模块相关功能。构建共表达网络,筛选模块中处于核心地位的基因。
  10.对纳入样本的甲基化数据进行分析,筛选男性差异甲基化位点和甲基化区域。结合差异表达基因,探究甲基化在男性肝癌中的作用。
  11.根据AR和ER转录因子识别模体预测其可能参与调控的靶基因。利用DNase-seq数据探究AR和ER的可能调控靶基因的染色质可接近性。筛选具有可接近性的、可能被AR、ER调控的基因,探究AR、ER在男性肿瘤高发中可能发挥的作用。
  研究结果:
  1.在基因差异表达分析中共筛选出男性特异性高表达基因633个,男性特异性低表达基因852个;女性特异性高表达基因713个,女性特异性低表达基因339个。基因富集分析结果显示男性特异性高表达基因富集在核蛋白复合体形成、非编码RNA、核糖体形成、细胞热反应通路上。男性特异性低表达基因富集于免疫相关通路中。女性特异性高表达基因富集通路与细胞形态、跨膜转运有关。女性特异性低表达基因未富集在任何通路上。
  2.男性特异性基因表达模式与男性肝癌患者预后有关。男性特异性低表达基因富集通路整体表达水平低,患者预后差;男性特异性高表达基因富集通路整体表达水平高,患者预后差。
  3.Spike-and-Slab Lasso Cox模型中共纳入29个基因,其中男性特异性低表达基因9个,男性特异性高表达基因20个。该模型可以较好预测男性肝癌患者预后。
  4.通过miRNA差异表达分析,共筛选出34个男性特异性高表达miRNA,34个男性特异低表达miRNA。18个miRNA与男性特异性差异表达基因存在相互作用关系,其中14个为男性特异性高表达miRNA。根据miRNA靶基因预测,481个男性肝癌特异性差异表达基因被miRNA调节。其中322个为男性特异性低表达基因,这些基因富集于免疫相关通路。
  5.加权基因共表达网络分析发现12个模块,免疫相关模块与RNA相关模块、甲基化模块、类固醇激素代谢模块呈负相关关系。
  6.甲基化芯片分析共检测出174551个差异甲基化位点,33444个位点位于启动子区。启动子区甲基化位点数≥3的基因中包含大量miRNA、lincRNA。本研究共检测出1506个差异甲基化区域。甲基化区域包含了97个男性特异性低表达基因,其中一部分为免疫相关基因。
  7.男性差异表达基因中有157个可能受到AR调控,其中80个具有可按近性。男性差异表达基因中有72个可能受到ER调控,其中40个具有可接近性。AR和ER调控的靶基因与RNA的形成与修饰有关。
  研究结论:
  1、免疫抑制是男性肝癌基因特异性表达模式。
  2、男性特异性表达基因富集通路与患者预后相关,男性特异性差异基因可以用于男性肝癌预后模型构建。
  3、miRNA可能通过降低免疫相关基因的表达,引起男性肝癌免疫抑制。
  4、甲基化可以通过参与RNA形成和修饰过程间接调节免疫功能,也可以通过DNA甲基化直接调节免疫功能。
  5、AR和ER作为转录因子可能通过参与RNA形成与修饰过程,进而调节男性特异性肝癌基因的表达。
[硕士论文] 余嘉惠
中医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:课题组前期发现lncRNA-ncRuPAR在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,且与胃癌的浸润程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤的大小及TNM分期密切相关,临床有效方药“滋阴化痰方”可抑制胃癌细胞增殖。本课题旨在通过一系列体内外实验探究ncRuPAR与胃癌增殖、侵袭、转移、凋亡的关系及其可能的作用机制,并验证“滋阴化痰方”是否通过干预ncRuPAR发挥其对胃癌的治疗作用,以期深化对胃癌发病分子机制的认识,并为阐释滋阴化痰方可能的作用机制提供数据支持。
  研究方法:(1)通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qPCR)技术检测AGS,HGC27,MKN45,MGC8034株胃癌细胞中ncRuPAR的表达水平。(2)重组慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分别感染HGC27细胞,构建HGC27过表达细胞株HGC27-ncRuPAR及对照细胞株HGC27-Empty Vector;重组慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分别感染MGC803细胞构建MGC803干扰细胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及对照细胞株MGC803-Empty Vector,嘌呤霉素2μg/mL筛选72h后形成慢病毒感染表达稳定株,qPCR检测各稳株中ncRuPAR的表达量。(3)CCK-8法检测ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803增殖的影响;流式细胞计数仪分析ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;细胞划痕实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803迁移能力的影响;Transwell实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803侵袭能力的影响。(4)将HGC27-ncRuPAR,HGC27-Empty Vector及HGC27-Control细胞株分别在裸鼠皮下接种造HGC27皮下移植瘤模型,观察各组裸鼠一般情况及比较瘤体体积和质量,比较ncRuPAR对HGC27皮下移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。(5)Affymetrix基因表达谱芯片技术筛选HGC27-ncRuPAR细胞株和HGC27-Empty Vector细胞株之间差异表达基因,并将芯片分析的差异基因结果进行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis,IPA)分析,推测ncRuPAR影响胃癌细胞增殖凋亡的可能通路;Western blot实验检测ncRuPAR对HGC27和MGC803细胞中PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响。(6)中药“滋阴化痰方”干预HGC27和MGC803细胞株,CCK-8法检测细胞增殖变化,观察滋阴化痰方对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞计数仪分析滋阴化痰方对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;qPCR检测滋阴化痰方对胃癌细胞ncRuPAR表达的影响,观察滋阴化痰方是否对ncRuPAR的表达存在调控作用;Western blot验证滋阴化痰方对PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响,探究滋阴化痰方可能的作用机制。
  研究结果:(1)qPCR结果显示:ncRuPAR在HGC27细胞中低表达,在MGC803细胞中高表达。(2)选择HGC27细胞构建ncRuPAR过表达稳定株,选用MGC803细胞构建ncRuPAR干扰稳定株,qPCR验证ncRuPAR过表达及干扰稳株构建成功。(3)CCK-8和流式细胞周期结果显示:过表达ncRuPAR可抑制HGC27细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并促进其凋亡,而干扰ncRuPAR表达则抑制MGC803细胞增殖、减少细胞凋亡。划痕实验和transwells实验结果显示:ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803的迁移及侵袭能力影响不显著。(4)体内实验中,HGC27-ncRuPAR组与对照组相比,实验组裸鼠成瘤减慢,瘤体减小。(5)Western blot结果显示:过表达ncRuPAR使HGC27细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达下降;而干扰ncRuPAR则可使MGC803细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达升高。(6)中药“滋阴化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803细胞,CCK-8和流式细胞周期结果显示:中药“滋阴化痰方”可以抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡;qPCR结果显示滋阴化痰方可以增加胃癌细胞中ncRuPAR的表达;Western blot结果显示滋阴化痰方可以抑制PI3K、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。
  研究结论:ncRuPAR可通过下调PAR-1的表达和抑制PI3K/Akt通路发挥其抑制胃癌细胞增殖及促凋亡作用。上调ncRuPAR的表达和抑制PI3K/Akt通路是中药“滋阴化痰方”抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的可能分子机制之一。
[硕士论文] 宫春爱
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一。在美国女性癌症中是除了皮肤癌之外的最普遍的癌症,占接近三分之一。美国癌症协会2018年最新数据表明,乳腺癌在预计新发人数上位居第一,预计死亡人数上排名第二(仅次于肺及支气管癌)。目前,乳腺癌治疗存在很多难点,特别是一些患者在接受治疗时发生耐药及术后放化疗后肿瘤复发、转移。近些年来,有研究表明,自噬在乳腺癌的发生发展以及治疗过程中发挥着重要的作用。如何改善乳腺癌的治疗效果已成为研究热点。自噬是一种广泛存在于真核生物的细胞中高度保守的一种依赖溶酶体的降解途径,是通过清除自身衰老、受损的细胞器,或通过降解蛋白质、脂类等生物大分子供细胞再次利用,以维持细胞内环境稳态。自噬常作为一种细胞在特殊情况下的保护自我的一种机制,例如在机体出现损伤、缺氧、应激等病理生理情况后一种调控细胞代谢活动的过程,可被认为是与化疗失败的重要耐药机制之一。本课题选用广谱抗癌药多西他赛(DTX)和自噬抑制ATG7siRNA(siATG7),通过硫辛酸修饰的固有无序多肽形成的多肽胶束加以介导,并载入化疗药多西他赛,从体内和体外对其抗乳腺癌的作用机制进行研究。
  本课题分为三个部分,第一部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束的构建及表征进行了报道。通过固相合成法合成了含有硫辛酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸的硫辛酸修饰的固有无序多肽的单体,然后进一步通过制备型高效液相色谱对产物进行纯化,且纯度检测结果显示符合实验要求。利用硫辛酸五元环内二硫键在一定比例的半胱氨酸催化下可实现分子间交联,进一步形成多个多肽单体聚合的载体。通过核磁共振氢谱对其结构进行了检测,结果显示了多肽单体聚合成功。然后采用超声乳化的方法制备胶束及载药,利用多肽胶束结构中分别含有疏水性的空腔以及富含带正电的阳离子型氨基酸,分别包载疏水性化疗药物多西他赛和包裹压缩带负电荷的siATG7基因药物。表征结果表明超声乳化法所制备的多肽胶束的平均粒径为165nm左右,电位值在31mV左右,且载药量在8.81%左右。
  本课题的第二部分进一步报道了共载化疗药多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌的体外评价。首先我们选用了以下五种不同种类乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-468,BT474,SKBR-3),对其进行抗增殖、促凋亡,以及周期阻滞实验研究,结果表明不同种类乳腺癌细胞对于自噬水平的依赖性不同,抑制自噬所引起的疗效也不相同。我们选择其中MCF-7细胞进一步研究通过siATG7对自噬的调控研究其抗乳腺癌的作用机制进行研究。用尼罗红代替多西他赛,荧光素FAM标记siATG7,对其摄取进行考察,结果显示尼罗红和siATG7可以在多肽胶束的介导下进入细胞。体外细胞实验表明,硫辛酸多肽胶束可以有效介导siATG7在MCF-7细胞内发挥作用并抑制了化疗药多西他赛引起的自噬,通过自噬抑制而实现增强化疗药的疗效的作用。多西他赛和siATG7可协同抗乳腺癌细胞增殖及周期阻滞并促进乳腺癌细胞凋亡。自噬抑制作用的考察上,我们通过构建稳定表达mRFP-EGFP-LC3的MCF-7细胞,然后对不同给药组的自噬流进行了考察,同时,通过Western Blot和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)对自噬相关的蛋白及ATG7mRNA的表达水平进行了考察,并通过电镜考察不同给药组产生的自噬泡的情况。结果显示共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束可以有效的抑制乳腺癌细胞MCF-7的自噬水平。
  本课题的第三部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌体内作用机制进行了报道。实验成功构建了MCF-7乳癌裸鼠移植瘤模型,通过siRNA用Cy5荧光标记后通过多肽胶束进行体内递送研究,活体成像结果显示胶束具有较好的体内靶向性。肿瘤生长抑制实验和肿瘤组织的HE染色切片观察显示,多西他赛和siATG7在硫辛酸多肽胶束介导下,可以起到协同抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长。最后进一步通过HE对其安全性进行了考察,结果表明该多肽胶束具有较低的系统性毒性。免疫组化实验也表明,多西他赛和siATG7硫辛酸多肽胶束可以有效抑制自噬水平。
  通过对本课题进行研究,以硫辛酸进行修饰的固有无序多肽胶束作为载体,共载疏水性化疗药物和siRNA基因药物。通过抑制化疗药引起的自噬实现增敏为临床治疗乳腺癌以及其他癌症的综合治疗提供了参考依据和借鉴。
[博士论文] 孔凡扬
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肿瘤微环境是肿瘤发育的“土壤”。缺氧是胰腺癌微环境重要的理化特征之一,在驱动肿瘤发生发展中发挥重要作用。胰腺癌血供缺乏,且间质比例高(大于90%),是造成胰腺癌细胞缺氧微环境形成的重要原因。缺氧微环境在胰腺癌细胞增殖、侵袭和转移的过程发挥重要的调节作用。其中,缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor1α,HIF-1α)是缺氧微环境最为重要的调节因子之一。HIF-1α及其下游通路已被证实参与了胰腺癌发生、侵袭、转移、新生血管形成和药物抵抗的全过程,同患者的不良预后密切相关。因此,明确HIF-1α调控胰腺癌侵袭转移相关的靶基因,探究缺氧微环境下信号通路激活的相关机制对寻找胰腺癌新的临床治疗靶点仍有重要意义。
  丝氨酸/苏氨酸激酶33(Serine/Threonine Kinase33,STK33)是钙/钙调蛋白依赖性激酶家族的成员,位于人体的11号染色体。STK33在正常人的睾丸、胎肺和心脏等组织中高表达,在肝、胃和胰腺等组织中低表达,以胞浆分布为主。研究发现STK33在肝癌、鼻咽癌、肺癌等多种癌症组织中高表达并表现出显著的癌基因特性。机制研究发现STK33具有自磷酸化功能,同时通过对下游基因(如Vimentin蛋白)的磷酸化修饰影响下游基因的生物学功能。近期研究表明肝癌中STK33可以通过非激酶活性依赖途径影响C-Myc基因的转录作用,提示STK33可以通过多种方式发挥促癌作用。另有研究发现STK33在携带KRAS突变的细胞系中特异性高表达,且抑制STK33的表达可显著抑制携带KRAS突变的肿瘤细胞的生长和侵袭能力,提示其可能是胰腺癌等KRAS突变相关肿瘤的重要治疗靶点。有文献报道缺氧诱导因子HIF-1α可以诱导KRAS信号通路的激活。课题组生物信息学分析发现STK33与HIF-1α表达密切相关,且STK33启动子区域存在多个HIF-1α结合缺氧反应原件(Hypoxia responsive element,HRE),因此我们提出科学假说:缺氧条件下HIF-1α通过转录调控STK33的表达促进胰腺癌细胞的恶性进展。
  本课题旨在研究胰腺癌中缺氧微环境中STK33的表达水平,探究STK33在胰腺癌增殖、转移和侵袭过程中的作用。本研究证实缺氧处理可显著升高胰腺癌细胞中STK33的表达水平,同时STK33在缺氧环境中受到HIF-1α的转录调控。体内体外功能研究结果表明STK33过表达可显著提高胰腺癌细胞增殖和侵袭能力,低表达STK33可显著抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力。临床组织样本分析发现STK33在胰腺癌患者组织中显著高表达,且STK33的表达水平与胰腺癌分化程度等多个病理参数及不良预后密切相关。此外,存在STK33细胞核表达为主的患者的生存期显著低于浆表达为主的患者。STK33显著的促癌作用以及密切的临床相关性,提示STK33可能是胰腺癌临床治疗的重要靶点。
  第一部分 缺氧环境下HIF-1α调控STK33在胰腺癌细胞的表达
  目的:缺氧条件下(1%O2)培养胰腺癌细胞,观察HIF-1α与STK33的蛋白的表达变化,明确HIF-1α调控STK33变化的分子机制。
  方法:使用缺氧培养箱,在缺氧(1%O2)环境中培养胰腺癌细胞,分别采用real-time PCR和Western blot的方法在0h、6h、12h、24h和48h检测STK33的mRNA以及两者的蛋白表达水平。利用不同浓度的CoCl2模拟缺氧微环境,培养24h后分别检测STK33的mRNA以及两者的蛋白表达水平。分别在胰腺癌细胞中过表达和抑制HIF-1α,检测STK33的蛋白表达变化。采用双荧光素梅报告基因和染色质免疫共沉淀实验明确HIF-1α转录调控STK33的结合位点。
  结果:缺氧(1%O2)处理胰腺癌细胞后,STK33的mRNA和蛋白表达、HIF-1α蛋白表达明显升高。CoCl2处理后的胰腺癌细胞,STK33的mRNA和蛋白表达、HIF-1α蛋白表达明显升高,且呈现浓度依赖性。胰腺癌细胞中过表达HIF-1α质粒,STK33的mRNA和蛋白表达水平均显著升高;相反,转染HIF-1α特异性siRNA可显著下调STK33的表达水平。双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀的实验结果提示HIF-1α靶向识别STK33启动子区域HRE2,激活STK33的转录。
  结论:缺氧条件下,HIF-1α转录激活STK33的表达过程。
  第二部分 缺氧诱导STK33表达对胰腺癌生物学功能的影响
  目的:研究STK33在胰腺癌增殖、转移、侵袭等生物学功能中的作用。
  方法:采用Western blot的方法检测不同胰腺癌细胞系中STK33的相对表达量。选取高表达细胞系转染STK33小干扰RNA(siRNA),选取低表达细胞系转染STK33过表达质粒。分别采用CCK8、Transwell侵袭和转移实验和划痕实验体外观察胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的变化。在缺氧条件下(1%O2),抑制STK33的表达,观察胰腺癌细胞侵袭能力的变化。裸鼠皮下接种胰腺癌细胞,观察STK33对体内肿瘤生长过程的影响。
  结果:体内外实验结果表明过表达STK33可显著提高胰腺癌细胞增殖、转移和侵袭能力,相反,抑制STK33表达可显著降低胰腺癌细胞增殖、转移和侵袭能力。缺氧处理可显著增强胰腺癌细胞的运动侵袭能力,而缺氧环境中干扰STK33的表达可部分抑制胰腺癌细胞运动侵袭能力的提高。结论:STK33是促进胰腺癌细胞恶性生物学行为的重要调控因子。
  第三部分 STK33在胰腺癌组织中的表达及其临床意义
  目的:检测STK33在胰腺癌组织中的表达水平,分析其在判断病理分级、评价预后等方面的临床意义。
  方法:采用Western blot的方法检测5对胰腺癌与癌旁组织STK33的蛋白表达水平,以β-Actin为内参,观察差异性表达。采用免疫组织化学染色的方法检测胰腺癌组织芯片(98例))中STK33以及HIF-1α的蛋白表达水平,分析两者表达的相关性,评价HIF-1α、STK33表达量以及两者联合评估患者预后的临床价值,统计STK33与临床病理特征的相关性,研究STK33的亚细胞定位及其对临床预后的价值。
  结果:从蛋白水平观察,胰腺癌组织中STK33的表达水平显著高于癌旁组织。组织芯片免疫组织化学染色的结果显示:98例胰腺癌组织中STK33与HIF表达呈显著正相关;STK33高表达与HIF-1α高表达患者的总体生存期均低于STK33低表达与HIF低表达组,且同时高表达HIF-1α和STK33的患者生存期低于单个指标高表达的患者。临床病理特征的相关性分析提示STK33的表达水平与胰腺癌病理分化程度呈正相关。STK33在胞核和胞浆均可表达,胞核表达的患者总体生存期低于胞浆表达的患者。
  结论:STK33与HIF的蛋白表达呈正相关。胰腺癌中STK33表达水平与患者的病理分级密切相关。胰腺癌患者STK33高表达提示预后不良,且STK33的亚细胞定位也是评价患者预后的重要指标。
[博士论文] 杨丽华
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性肝癌是一种全球常见的、高发的恶性消化系统肿瘤,其中肝癌所致的死亡率在中国高居第二位。根据其组织学分型,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的类型,占总数的85%-90%。对于肝癌的治疗,近阶段首选的方法依然是手术切除。尽管近年来在肝癌的诊断以及外科治疗、生物治疗等综合治疗手段方面取得了很大的进步,但患者的5年生存率仍然没有得到较大的改善,由于易复发和肝内外转移,进行放疗或化疗效果也不甚理想,因此肝癌患者的预后不容乐观。究其原因,主要是因为肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞的存在,在肝癌复发和异质性维持中具有重要的作用。
  肿瘤干细胞理论的提出是基于肿瘤组织中并非所有的细胞都能够无限增殖,而只有存在于其中的数量极少的细胞才能持续地进行自我更新,并能形成处于各种分化阶段的具有异质性的肿瘤细胞。BonnetD等首次报道在急性髓细胞性白血病中有肿瘤干细胞的存在,到目前为止,人们已经分离并鉴定出包括黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胶质瘤、胰腺癌等至少30多种肿瘤的干细胞。根据文献报道,肝癌中也鉴定出了肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs),鉴定的表面标志物有CD133、CD13、CD90、EpCAM、OV6或CD24等。有文献证实,肝癌干细胞是肝癌转移、复发与耐药的根源。因此寻找新的、有效的靶向肝癌干细胞的治疗靶点,对于开发针对肝癌干细胞的药物或治疗策略,最终能有效地治疗肿瘤的转移、复发和耐药以降低高死亡率,具有非常重要的科学意义和临床应用潜力。
  转录因子C/EBPβ是CEBPs(CCAAT enhancer binding proteins)家族中已发现的6种成员之一,其C端具有高度保守的bZIP结构域:包含DNA结合结构域和二聚化功能域(亮氨酸拉链),bZIP结构域可以和靶基因的启动子、增强子区域的调节序列相互作用,从而对靶基因进行表达调控。
  C/EBPβ基因mRNA存在3个转录起始位点,因此可以选择性剪接形成3个异构体,翻译形成3种蛋白质,分别为LAP1(38kDa)和LAP2(35kDa)及LIP(20kDa)。其中LAP1和LAP2既有转录激活结构域,又有DNA结合结构域,LIP只有DNA结合结构域,两者在功能上具有拮抗作用。其中LAP1是在肝脏中表达最高的亚型。
  C/EBPβ是人与啮齿动物间进化高度保守的蛋白,在机体各组织中广泛表达。该基因参与细胞增殖、分化、凋亡及机体的免疫、应激反应、能量代谢、血液生成等生命活动。C/EBPβ还参与到了肿瘤的发生与进展,近些年研究表明,C/EBPβ的表达失调可以导致多种肿瘤发生恶化,如胶质瘤、Wilm's瘤、前列腺癌、肾细胞瘤、卵巢癌等。LAP1是具有广泛功能的重要的转录因子,它参与增殖、凋亡、侵袭、EMT等细胞分子事件进而影响肿瘤的发生与发展。本课题利用生物信息学的方法,并结合临床组织样本,发现LAP1在肝癌中表达显著降低,而LAP1在肝癌发生、发展中的作用及对肝癌干细胞(LCSCs)的影响却尚不清楚。本课题结合体外、体内实验系统研究了LAP1在肝癌及肝癌干细胞中的生物学作用,并针对LAP1相关信号转导的特点,选择小分子药物MDV3100开展了初步的临床转化研究。
  本课题首先通过生物信息学的方法及对肝癌组织临床样本的检测,比较LAP1在肝癌组织与癌旁组织或正常肝组织中的表达,发现LAP1在肝癌组织中表达低;进而运用流式细胞术及悬浮成球试验,比较LAP1在CD13+肝癌干细胞与非干细胞的表达情况,结果显示肿瘤干细胞中LAP1的表达显著低于非干细胞中表达,提示LAP1可能对肝癌恶性生物学行为起到负向调控作用。
  为了进一步探讨LAP1的细胞生物学功能,本课题进一步在肝癌细胞中过表达LAP1后,利用体外和体内实验模型,系统地分析了其对肝癌干细胞进而对肝癌群体细胞的各种生物学行为的影响。首先,包装慢病毒,用慢病毒介导的方法建立稳定过表达LAP1及GFP对照质粒的肝癌细胞系Huh7和CLC13,在体外进行悬浮成球实验分析过表达LAP1对成球率的影响,并利用流式细胞术和qPCR分析过表达LAP1对干性标志表达的影响,结果提示过表达LAP1可以抑制肝癌细胞的成球能力、下调肝癌干细胞的比例、以及肝癌干细胞标志物的表达水平;同时,开展了CCK8增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验分析过表达LAP1对肝癌细胞的影响,并分析过表达LAP1对细胞周期、细胞凋亡的影响,结果提示LAP1过表达能显著抑制肝癌细胞的增殖能力、迁移能力与侵袭能力,并且诱发细胞周期阻滞;最后进行裸鼠成瘤实验,观察并分析过表达LAP1对肝癌细胞小鼠体内成瘤性和肿瘤生长的影响,结果提示LAP1过表达降低了肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力:皮下成瘤的数目、体积和重量均较对照组低,同时LAP1过表达降低瘤体干性标志物CD13、CD133及EpCAM的表达,同时显著降低增殖标志物Ki67的表达。
  细胞功能研究表明,LAP1表现出显著的肿瘤生物学功能的抑制作用,并参与肝癌干细胞的干性调控。诸多结果均提示LAP1可以作为肝癌治疗的有效靶标,基因治疗存在着很大的风险,临床应用还有很多挑战,因此筛选出可上调LAP1的小分子药物,具有更大的临床转化应用的潜力。有研究表明,雄激素受体对LAP1具有负向调控作用,而雄激素受体的表达与肝癌的预后具有相关性,这就提示通过抑制雄激素受体上调LAP1的表达在肝癌治疗中具有潜在应用价值。雄激素受体拮抗剂MDV3100是雄激素受体高度选择性拮抗剂,在前列腺癌的内分泌治疗中应用广泛。
  本课题进一步开展了雄激素受体拮抗剂MDV3100对肝癌治疗的初步研究,促进LAP1成为肝癌治疗靶标的转化应用。在肝癌细胞中,加入不同浓度的MDV3100,检测其对细胞活力的影响,结果显示MDV3100可降低肝癌细胞的活性;然后对不同MDV3100作用浓度处理后的肝癌细胞进行qPCR及WB检测,发现MDV3100可使LAP1的表达升高同时衰老标志物P53、P21、P16的表达也升高;结合经MDV3100处理后细胞形态上的体积增大及对衰老相关的β-半乳糖苷酶表达的比较而发现的SA-β-Gal染色阳性的明显增强,可初步判断出MDV3100可使肝癌细胞发生衰老;另外,对不同MDV3100作用浓度处理后的细胞进行细胞周期检测,发现MDV3100可抑制肝癌细胞的细胞周期。综上,MDV3100可通过上调LAP1诱导肝癌细胞发生衰老进而抑制肿瘤,因而LAP1可能可以作为肝癌治疗的新靶点,希望通过本课题的实施为肝癌的诊疗提供新的思路和可行方法。
  结论:
  本研究发现C/EBPβ在肝癌及肝癌干细胞中低表达;C/EBPβ的最主要且在肝脏中表达量最高的亚型LAP1能抑制肝癌干细胞的干性特征并能抑制肝癌的进展,其机制有待进一步研究;雄激素受体拮抗剂MDV3100可通过上调LAP1诱导肝癌细胞衰老,进而抑制肿瘤的发展。这些研究结果丰富了关于LAP1功能的认识,并提示LAP1具有作为肝癌治疗新靶点的可能性。
[博士论文] 汪超
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2,HER2)是一种酪氨酸激酶受体,该受体在多种类型的肿瘤中过表达,HER2过表达与患者的不良预后密切相关。曲妥珠单抗(Trastuzumab,Herceptin)是一株靶向HER2胞外段结构域Ⅳ区的人源化抗体,已获美国食品及药物管理局(FDA)批准用于HER2高表达的乳腺癌及胃癌的临床治疗。然而,随后的研究发现,大部分HER2高表达乳腺癌患者对Trastuzumab不产生反应(即原发性Trastuzumab耐药),初期对Trastuzumab产生反应的患者有半数也会在1年内产生耐药(即获得性Trastuzumab耐药)。在胃癌的治疗中同样存在这一情况。
  帕妥珠单抗(Pertuzumab)是另一株靶向HER2胞外段结构域Ⅱ区的人源化抗体。Trastuzumab和Pertuzumab具有协同的抗肿瘤作用,故二者联合用药被FDA批准为一线治疗方案。尽管临床试验证实Trastuzumab和Pertuzumab的联合用药能部分克服Trastuzumab耐药,但仍存在客观反应率及完全反应率低的问题。因此,克服Trastuzumab的原发性及获得性耐药问题仍是基础研究和临床治疗的迫切需求。
  原发性Trastuzumab耐药与获得性Trastuzumab耐药在发生机制上并不相同,在治疗方案上也应区别对待。前期研究中,课题组通过噬菌体展示技术筛选得到一株新的抗HER2全人源单克隆抗体H2-18,该抗体与HER2的胞外段结构域Ⅰ区特异性结合,可通过诱导细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)的方式克服原发性Trastuzumab耐药。本课题中,一方面研究了H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用,另一方面研究了H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在胃癌中的抗肿瘤作用。
  一、H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用
  将一株Trastuzumab敏感胃癌细胞株NCI-N87培育成获得性Trastuzumab耐药细胞株NCI-N87-TraRT。鉴于H2-18克服Trastuzumab原发性耐药的机制在于有效诱导细胞发生PCD,首先通过AnnexinⅤ与PI双染检测药物处理后细胞的死亡情况。结果发现,在NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18均能显著的诱导细胞PCD,呈浓度依赖性,而其他抗体均不能产生这种作用。相比NCI-N87细胞,在NCI-N87-TraRT细胞中H2-18能诱导更高比率的PCD。在BT-474与BT-474TraR细胞中也得到了相同的结果。随后,通过增殖抑制实验检测药物对NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞的体外增殖抑制活性。结果发现,H2-18对两株细胞的增殖抑制作用并无差异。在NCI-N87细胞中,H2-18的增殖抑制作用弱于Trastuzumab单用,而在NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18的增殖抑制作用超过了Trastuzumab的单用。进一步通过裸鼠皮下移植瘤模型对药物的体内抗肿瘤作用进行研究,结果发现,在NCI-N87细胞肿瘤模型中,H2-18的抑制肿瘤生长作用与Trastuzumab单用相近,但弱于Trastuzumab与Pertuzumab的联用,而在NCI-N87-TraRT移植瘤模型中,H2-18的抑制肿瘤生长作用远强于Trastuzumab的单用,并优于Trastuzumab与Pertuzumab的联用。为了探讨H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用机制,使用蛋白印迹法检测药物对NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞HER2下游信号通路的作用。结果发现,在NCI-N87细胞中,H2-18对HER3、AKT、ERK的磷酸化能产生抑制作用,而在NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18对HER3、AKT、ERK的磷酸化的作用微乎其微。进一步的研究发现,在两株细胞中,H2-18均能引起细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的升高,同时伴JNK与c-jun磷酸化的上调,而当使用ROS清除剂或使用SiRNA沉默JNK、c-jun后,H2-18诱导的细胞PCD均明显下降。因此,推测在获得性Trastuzumab耐药细胞中,H2-18仍可通过RIP1-ROS-JNK-c-jun通路有效诱导细胞的死亡,进而克服Trastuzumab的获得性耐药。
  二、H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在胃癌中的抗肿瘤作用
  首先通过蛋白印迹法及流式法对多株胃癌细胞HER2表达情况进行检测。结果发现,只有在NCI-N87细胞株以及本实验室自行培育的NCI-N87-TraRT细胞株中存在HER2的高表达。通过增殖抑制实验检测药物联用对胃癌细胞的体外增殖抑制活性。结果发现,在HER2高表达的NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞中,Trastuzumab与Pertuzumab联用的增殖抑制作用要强于Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18各自的单用,而Trastuzumab与H2-18联用的增殖抑制作用超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者的联用表现出最强的抑制活性。用CompuSynsoware软件拟合之后发现H2-18与Trastuzumab联用或H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者联用均具有协同的抗肿瘤作用。而在HER2低表达的胃癌细胞中,均未发现这一这结果。进一步使用平板克隆实验检测药物联用对细胞增殖能力的作用。结果发现,在NCI-N87细胞中,H2-18与Trastuzumab联用较Trastuzumab与Pertuzumab联用对克隆形成都有一定的抑制作用且作用效果相近,在NCI-N87-RraRT细胞中,H2-18与Trastuzumab联用对克隆形成的抑制作用超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,而在两株细胞中,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18联用均表现出最强的克隆形成抑制作用。同样通过裸鼠皮下移植瘤模型对药物联用的体内抗肿瘤作用进行研究。结果发现,在两株细胞移植瘤模型中,H2-18与Trastuzumab联用对裸鼠皮下移植瘤抑制作用均超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者联用同样表现出最强的肿瘤抑制作用。进一步的研究发现,在胃癌细胞中,抗体联用组对HER3、AKT、ERK磷酸化的抑制要强于各抗体的单用,H2-18与Trastuzumab联用较Trastuzumab与Pertuzumab联用对HER3、ERK、AKT磷酸化的抑制作用相近,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者联用对HER3、AKT、ERK的磷酸化表现出最强的抑制作用。更重要的是H2-18单用或是H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用均能引起细胞PCD,同时伴ROS升高以及JNK、c-jun磷酸化的上调,而Trastuzumab与Pertuzumab的单用或是联用均不能引起ROS-JNK-c-jun通路的改变。因此,推断H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用均具有协同抗肿瘤作用的机制在于同时抑制胃癌细胞下游PI3K/AKT及RAS/MAPK信号传导通路以及H2-18通过HER2胞外Ⅰ区有效诱导细胞PCD。
  综上所述,H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在Trastuzumab耐药的胃癌中均展现出良好的体内外抗肿瘤作用,提示这样的药物组合有望成为克服Trastuzumab耐药的新型方案。
[博士论文] 虞淦军
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例数约为140万例,其发病率在男性及女性中均处于恶性实体肿瘤的第3位,癌症相关死亡原因已分别上升至第2位和第3位。近年来,结直肠癌的发病率不断上升,而中国的上升速度是国际平均增速(2%)的2倍,尤其在上海等东南沿海发达城市,发病率达到实体肿瘤的第二位,严重威胁着人类的健康和生活质量。肠癌发病隐匿,相当一部分患者在首次就诊确诊时已经发生远处转移。目前对于晚期结直肠癌患者而言,姑息手术、新辅助放化疗以及靶向药物的应用是主要治疗手段,但又由于患者间个体差异和耐药性的出现等,晚期结直肠癌的疗效和预后不够理想。
  近年来,肿瘤的免疫治疗越来越受到关注。2012年,被Science杂志评为未来值得关注的六大领域之一;2013年,又被Science杂志评为“年度十大进展之首”;并连续成为2015、2016年全球肿瘤研究顶级盛会——美国临床肿瘤学会(ASCO)热点中的焦点,当仁不让的成为了会议的主旋律。Topalian博士因其在PD-1和PD-L1免疫治疗研究的突出贡献,被授予2015年“David A.Karno fsky Memorial Award”(ASCO最重要的奖项)。目前,大量的基础和临床研究已经聚焦肿瘤免疫治疗。
  结直肠癌患者也从免疫治疗中看到了希望,尤其是错配修复基因缺陷(Mismatch repair deficiency,dMMR)的CRC患者,对PD-1单抗药物的敏感性比微卫星稳定性(Microsatellite stability,MSS)患者显著提高。微卫星不稳定(Microsatellite instability,MSI)是结直肠癌发病的重要原因之一。它是指MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2等错配修复基因发生突变导致DNA重复序列(微卫星)的增加或缺失,进而引起肿瘤的发生。由于微卫星序列突变累积,蛋白质翻译过程中发生框移突变,导致肿瘤细胞产生了大量异常的多肽片段,这些片段更容易被免疫系统所识别,激发机体的抗肿瘤免疫应答反应,这也是微卫星不稳定患者对PD-1单抗敏感的主要原因。微卫星不稳定性在散发性结直肠癌中的发生频率大约仅为15%。但是对于大部分微卫星稳定性的结直肠癌患者而言,PD-1单抗难以取得显著的疗效,如何提高这部分患者的疗效成为结直肠癌治疗的重大问题。
  地西他滨(5-aza-2'-deoxynucleoside,DAC)是一种腺苷类似物,通过抑制DNA甲基转移酶,降低DNA的甲基化水平,从而抑制肿瘤细胞的增殖,是作用能力较强的DNA甲基化特异性抑制剂,已经广泛应用于骨髓增生异常综合征、急性白血病的治疗,作为甲基化抑制剂也在实体瘤中被广泛研究。研究证明,低剂量DAC不仅可以明显诱导和提高肿瘤抗原的表达,如NY-ESO-1、MAGE-A3/6等,还能提高CD80、MHC-I类分子等免疫标志物的表达,进而增加肿瘤局部免疫细胞的浸润,为免疫检查点抑制剂、治疗性疫苗、过继性细胞治疗等免疫疗法提供了更加适合的免疫微环境。
  本课题旨在研究低剂量DAC对肿瘤生物学特征、免疫原性的影响以及对肿瘤微环境的作用及其机制,探讨其与PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞等免疫治疗的协同效应,为MSS结直肠癌的临床治疗提供新的策略和科学依据。
  本研究主要分为三个部分:
  第一部分:低剂量地西他滨对肿瘤的表观修饰作用研究
  DNA甲基化是一种不改变基因碱基序列的可逆的基因修饰,其甲基化水平与基因的“开放”状态密切相关。
  为了探究DAC对不同微卫星状态的CRC细胞的影响,选取了两株MSI细胞HCT116、LOVO和两株MSS细胞HT29、SW480,用0μM、0.1μM、1μM、10μM等不同浓度的DAC进行处理,在处理后的不同时间点(第1天,第3天,第7天)收集了肿瘤细胞的总RNA、DNA和蛋白质,通过qPCR、Western Blot等技术检测了细胞中NY-ESO-1抗原mRNA和蛋白的表达水平,并通过甲基化测序检测了基因组DNA中NY-ESO-1启动子区的甲基化情况。
  通过第一部分的研究,证实了小鼠微卫星稳定性肠癌细胞系CT26细胞经过低剂量DAC处理后,其基因组甲基化水平明显下调,重新激活或上调了大量功能基因的表达,改变了肿瘤的免疫学特征,提高了其免疫原性。在PDX肿瘤模型中,这一现象得到了再次验证。该部分研究结果为下一步的研究提供了理论依据。
  第二部分:低剂量地西他滨对肿瘤微环境的作用研究
  影响免疫治疗在实体瘤中疗效的主要问题是肿瘤抑制性的免疫微环境。如何打破和重塑肿瘤微环境,激发机体的抗肿瘤免疫应答是实体瘤治疗取得突破的关键。肿瘤微环境中的免疫微环境决定了免疫治疗的有效性,而免疫相关分子的表达及细胞的浸润是肿瘤微环境的关键组成。
  通过第二部分的研究,发现了低剂量DAC可以重塑肿瘤微环境,召募更多的T淋巴细胞,包括CD4+T细胞、CD8+T细胞,浸润到肿瘤局部,且大部分细胞分泌高水平的IFN-γ,但是这些细胞大部分是PD-1阳性的,其功能可能通过PD-1/PD-L1通路被抑制。
  第三部分:地西他滨为基础的协同免疫治疗策略的研究
  一、地西他滨与PD-1抑制剂协同性治疗策略研究
  研究证明,PD-1单抗对于MSS肿瘤基本上是无效的。通过前面两部分的研究,发现低剂量DAC可以改变肿瘤的免疫学特征,提高其免疫原性,且能够召募大量的T淋巴细胞浸润到肿瘤局部,从而有可能对肿瘤微环境进行重塑。但是这部分浸润到肿瘤局部的T淋巴细胞大部分为PD-1阳性,因此紧接着联合应用PD-1单抗,探讨协同效应提高疗效的可能性。
  在这一部分中,首先选取CT-26小鼠肠癌细胞构建了MSS的荷瘤小鼠模型,给予了DAC+PD-1单抗联合用药的治疗方法,将PBS、PD-1单抗单药、DAC单药治疗作为对照组,探讨了DAC与PD-1单抗协同治疗的疗效。结果显示,DAC+PD-1单抗组与PD-1单抗组、DAC单药组相比,对肿瘤生长具有明显的抑制作用,延长小鼠生存期的效应也更加显著。
  二、地西他滨与TCR-T细胞治疗协同性治疗策略研究
  在第一部分中,证实了DAC可以诱导和提高MSS肿瘤细胞NY-ESO-1抗原的表达,而肿瘤抗原的表达直接决定着特异性细胞免疫治疗的效应。因此,探索了将DAC与NY-ESO-1特异性的T细胞进行协同治疗的疗效。首先,从文献和数据库中获得了NY-ESO-1157-165(SLLMWITQC)特异性TCRα/β基因序列,将α链95-96位的TS突变为LY,以提高其抗原特异性杀伤功能;另外,将旺链的Thr48和β链的Ser57突变成Cys,有利于形成二硫键,提高其与外源基因的匹配成功率。
  通过本部分的研究,通过将DAC分别与两种免疫治疗方法PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞联合应用,通过体内外实验,证实了DAC可以提高PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞的免疫治疗的疗效,对MSS肿瘤发挥了协同治疗效应,为MSS肿瘤患者提供了新的治疗策略和依据。同时,DAC特异性诱导肿瘤细胞表达NY-ESO-1等多种肿瘤抗原,为治疗性疫苗、TCR-T细胞等以抗原为基础的免疫治疗提供了更多的靶点,以DAC为基础的协同免疫治疗有望显著提高实体肿瘤患者的临床疗效。
  全文结果与结论:
  1、低剂量DAC可以显著降低小鼠结直肠癌细胞CT26细胞以及人MSS性CRC的PDX模型肿瘤细胞基因组甲基化水平,提高结直肠癌细胞中抗原加工递呈、细胞因子等基因的表达水平。低剂量DAC能够通过靶基因启动子区的去甲基化作用,诱导和提高MSI-H以及MSS性CRC细胞中NY-ESO-1抗原的表达。说明低剂量DAC改变了CRC细胞的免疫学特性,提高了其免疫原性。
  2、经过低剂量DAC处理后的CRC肿瘤可以招募更多的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润到肿瘤局部,具有更多的高分泌IFN-γ的细胞。这些浸润的T淋巴细胞大多呈现PD-1阳性。说明低剂量DAC改变了CRC的肿瘤微环境,但是其状态可能通过PD/PD-L1通路被抑制。
  3、低剂量DAC与PD-1单抗联合应用可以显著抑制小鼠体内CRC肿瘤CT26的生长,并延长小鼠的生存期。说明低剂量DAC为PD-1单抗疗效的发挥提供了良好的肿瘤微环境,而PD-1单抗再次激活了肿瘤微环境中被PD-1/PD-L1通路抑制的T淋巴细胞,发挥抗肿瘤效应。DAC和PD-1单抗能够发挥协同性作用,提高抗肿瘤疗效。
  4、通过慢病毒转染人外周血T淋巴细胞,成功制备了NY-ESO-1特异性TCR-T细胞,并在体内外进行了功能验证。所制备的TCR-T细胞对HLA-A2限制性的NY-ESO-1阳性肿瘤具有良好的特异性识别和杀伤能力。
  5、低剂量DAC的预处理可以提高MSS性结直肠癌细胞中NY-ESO-1抗原的表达水平,与TCR-T细胞联合应用可以明显抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期。说明低剂量DAC对肿瘤细胞的诱导为TCR-T细胞发挥抗肿瘤效应提供更多的靶点,提高TCR-T细胞治疗的疗效,两者具有协同作用。
[博士论文] 方征
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胆囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是胆道系统中一种发病率较高的恶性肿瘤,在胆道系统恶性肿瘤中占于首位,在消化系统恶性肿瘤中占第五位。但随着流行病学调查、研究的不断深入,近年来发病率亦出现了逐年上升的趋势。胆囊癌发病初期较隐匿,潜伏期长,早期诊断困难,往往发生在胆囊结石合并胆囊炎而行胆囊切除术时发现的“意外胆囊癌”,而无明显的临床表现。再加上手术方式尚不固定,很多意外胆囊癌行经腹腔镜胆囊切除术而导致早期腹腔内广泛转移亦不为少数。而且,对不能手术者或术后复发或转移者,药物化学性治疗以及放射治疗,效果均不十分理想。因此,此种疾病越来越得到大家的重视,胆囊结石,胆囊炎至胆囊癌的“炎癌转变”亦受到大家关注。对于胆囊癌发病的具体分子机制尚不特别明确,以及耐药性强的特点,多种基因、信号转导通路的研究都在广泛的进行中,如Nakamura报道的EGFR、ERBB3和PTEN在胆囊癌中的发生了突变,以及针对HER2、VEGF、PI3k/PTEN、AKT/mTOR、FGFR、IDH、MEK/ERK和多激酶途径的药物或抑制剂的实验的实施。但是,目前仍无关于胆囊癌的发生发展的具体分子机制及靶向治疗的报道。
  同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)是一种十分重要的癌症监护基因,亦被认为是仅次于P53的第二大的肿瘤抑制性基因。PTEN编码的蛋白质能够抑制PI3K/Akt、MAPK、FRAP/mTOR、NF-κB等信号传导通路,参与调节细胞生长、代谢、维持内环境稳态等多种生命活动,其功能和表达的异常与人类多种恶性肿瘤的发生、发展有密切相关性。PTEN可以通过干扰细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、阻碍肿瘤的侵袭和转移、维持免疫稳态等一系列进程,完成其强大的抑癌作用。在胆囊癌中,PTEN在其发生、发展等系列过程中也起着十分重要的作用。PTEN的缺失与胆囊癌,特别是胆囊腺癌的临床、病理、预后之间的关系密切相关,但分子机制尚不明确。此文中,进一步探究PTEN在胆囊癌发生发展中的作用以及发挥功能的具体分子机制,为胆囊癌的临床分子的靶向治疗策略提供潜在的干预靶点和新的思路。
  方法:
  1.本研究获取了2010年1月到2016年12月海军军医大学附属东方肝胆外科医院收治的胆囊癌患者,收集了经过根治性治疗并经术后病理诊断为胆囊癌的患者的临床病理资料。共350例患者纳入了此项研究。所有患者均常规接受了术前的系列相关检查,均予以行胆囊根治性切除性手术。临床胆囊癌TNM(Tumor node metastasis,TNM)分期(2017)均根据AJCC(American Joint Committee on Cancer)(美国癌症联合委员会)(第八版)标准。该组患者均根据标准随访流程进行随访。总体生存时间是本次研究的终点。分类变量用例数(百分数)表示,组间比较应用x2检验,Yates'校正检验或者Fisher's精确检验。连续型变量用中位值(四分位数)进行表示,组间差异性比较,应用t检验或者Mann-Whitney U检验。采用Kaplan-Meier法,来估计,这组患者术后的总体生存率。采用Log-Rank检验的方法,比较生存分布之间差异。采用COX等比例风险回归模型,探索了影响了胆囊癌患者的术后复发以及总体生存率的独立的危险因素。利用SPSS19.0和R软件2.10.1(R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria;www.r-proj ect.org)进行数据分析。
  2.对本院收集的正常胆囊及胆囊癌组织提取的mRNA进行实时定量RT-PCR检测,检测PTEN在转录层面的表达水平。同时,抽取样品蛋白进行蛋白质印迹分析。随后对这些样品进行石蜡包埋,后用免疫组织化学的方法检测了PTEN蛋白的表达。
  3.对东方肝胆外科医院张永杰教授手术组2014.1-2016.12行胆囊癌根治手术的患者的胆囊癌组织,共计157例蜡块病理组织标本,进行免疫组织化学染色分析PTEN表达情况。用K-M方法,在检测样本中比较高、低表达PTEN的患者预后情况。
  4.对胆囊癌细胞系GBC-SD、EHGB1、NOZ、NZ细胞,提取蛋白,采用Western Blotting方法检测PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平。设计针对PTEN基因的外显子的引物对四种细胞系进行PCR检测。并设计靶向PTEN探针,进行深度靶向测序分析。
  5.构建PTEN稳定干扰的细胞系,进行PCR检测,Western Blotting方法检测在此细胞系中;PTEN的mRNA水平和蛋白水平。用此细胞系进行平板克隆形成实验,同时CCK-8实验法,来检测细胞增殖的情况。
  6.对低表达PTEN和对照组细胞进行软琼脂克隆形成实验来探讨高低表达PTEN对胆囊癌细胞恶性生长的影响。随后,用Matrigel-coated Boyden chamber检测PTEN对胆囊癌细胞转移和侵袭能力的影响。
  7.应用Western Blotting实验检测了的PARP、P53和γH2AX的蛋白水平,这些蛋白反应了DNA损伤程度。应用定量PCR和Western Blotting的方法检测差异表达PTEN的癌细胞中是否存在EMT表型的转变。
  8.选取多种通路的抑制剂和常用肿瘤化疗药物,用CCK-8试验的方法对胆囊癌进行药物筛选试验。
  结果:
  1.本研究纳入病人350例,单因素分析显示,黄疸,肿瘤位于肝脏侧,淋巴结N2、N1转移,非根治性切除,肿瘤差分化,以及TNM分期Ⅲ&Ⅳ期为患者术后总生存的影响因素。多因素分析发现肿瘤位于肝脏侧,淋巴结N2、N1转移,非根治性切除以及TNM分期Ⅲ&Ⅳ期是患者术后总体生存的独立危险因素。
  2.胆囊癌组织中PTEN在转录层面的表达低于正常胆囊组织。对收集的冰冻的胆囊癌和胆囊组织样品进行分析,PTEN在6例肿瘤组织中5例呈低蛋白表达,4例胆囊癌组织中p-AKT呈现较高表达水平。对这两组石蜡包埋后检测PTEN,PTEN在正常胆囊组织中为高水平的表达,而在胆囊癌组织中约50%呈现低水平表达。
  3.在157例张永杰教授组实施手术时获取的胆囊癌组织中,根据免疫组化PTEN蛋白表达强度分为2组,PTEN蛋白高有67例,PTEN蛋白低表达有90例。与高表达PTEN组患者相比,低表达PTEN组患者总的生存时间更短,预后更差(p=0.006)。且PTEN低表达是术后总体生存的独立危险因素。
  4.四种胆囊癌细胞系检测PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平,显示GBC-SD细胞中PTEN为低水平表达,而另外三种相反,呈较高水平。提示PTEN的低表达促进了下游信号通路的活化。检测了PTEN基因的9号外显子拷贝数,GBC-SD细胞9号外显子为单拷贝,其余3株细胞为双拷贝。设计的靶向PTEN的探针,进行了深度靶向测序分析,GBC-SD细胞PTEN为杂合性丢失,其余细胞为双拷贝,并且这四株细胞均没有检测到PTEN发生突变。
  5.建立稳定干扰PTEN细胞系,行细胞克隆形成及CCK-8细胞增殖试验,结果提示PTEN的干扰与否对正常培养的胆囊癌细胞增殖可能影响不大。采用软琼脂克隆形成实验,干扰PTEN非常显著的抑制了肿瘤细胞的恶性增殖,同时受抑制的还有胆囊癌细胞迁移及侵袭能力。
  6.测定DNA损伤的相关蛋白的水平,提示PTEN的干扰引起了基因组DNA的损伤,引发的基因组的不稳定性。PTEN对胆囊癌间质样表型有维持作用。
  7.相比野生型NOZ,PTEN单拷贝的GBC-SD胆囊癌细胞对多种药物显示较高的敏感性。
  8.干扰PTEN的表达增强了NOZ-shPTEN对GEM的药物敏感性,EPB反而对药物产生抵抗,对Bortezomib表现出高度药物敏感性。Bortezomib处理使得更多PTEN敲低细胞发生凋亡。光镜观察和PI染色,处理后的细胞剪切的PARP及Caspase3水平,以及发生凋亡的细胞进行流式检测也证实这一点。
  结论:
  根据以上实验结果可以清楚地发现,PTEN在胆囊癌病人肿瘤组织中,存在较高比例的缺失或低表达,而在正常胆囊中则正常阳性表达。PTEN缺失或低表达的患者总生存时间短,恶性程度高。在胆囊癌细胞系中,发现,PTEN对肿瘤细胞的基因组稳定性和DNA的损伤修复具有调节作用,而PTEN的缺失则会影响基因组的稳定性和DNA的损伤,而导致较差的预后。
  选取了多种信号通路的抑制剂和临床常用的肿瘤化疗药物进行针对胆囊癌治疗的药物筛选实验。不管是PTEN缺失的肿瘤细胞,还是在裸鼠体内细胞荷瘤实验,或是PDX小鼠体内行荷瘤实验,均提示,在PTEN阴性组单独BTZ给药即可达到很好的治疗效果。
  最后,进一步在细胞系中证实,PTEN的缺失或低表达上调了蛋白酶体组分的表达和蛋白酶活性,使得肿瘤细胞对高蛋白酶体活性产生高度依赖性。
[硕士论文] 樊逸夫
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  长期以来,中医药一直是治疗肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要力量。在国内,中医药被广泛应用于肝癌预防和治疗的全过程,尤其在晚期肝癌中的应用更为常见。多年的中西医结合研究为临床提供了为数不少的成药、验方,其疗效也逐步得到认可。2011年中国卫生部颁布的《原发性肝癌诊疗规范》明确将中医药列入晚期肝癌的系统治疗,并指出中医药“可以改善癌症相关症状和生活质量,可能延长生存期,可以作为肝癌治疗的重要辅助手段”。
  中药解毒颗粒是我科开发的院内制剂,在我科的日常肝癌防治中应用广泛,经过十几年的临床验证,疗效确切。但其作用机制尚不明确。众所周知,中药复方成分复杂,需要煎煮后,经患者口服,并通过肠道吸收代谢后发挥疗效,这就使其有效成分、及后续作用机制的研究变得相当复杂。近年来,肠道菌群与肿瘤相关联的研究备受关注,肠道也是中药吸收代谢的必经之地,因此,本课题想从肠道菌群的角度去探讨口服解毒颗粒所产生的影响。
  此外,免疫治疗是近年来治疗晚期肝癌的重要手段之一。其中,免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade)是当下研究的热门。细胞毒T淋巴细胞抗原-4(lymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)及程序性细胞死亡受体1(programmed cell death protein1,PD-1)是常见的阻断靶点;阻断CTLA-4及PD-1,可以通过影响T细胞功能发挥抗肿瘤作用。有文献报道,肠道菌群可增强上述靶点的抑制剂的作用。因此,本课题以免疫检查点阻断为切入点,探讨解毒颗粒对CTLA-4及PD-1的调节作用。
  目的:
  1、观察解毒颗粒对晚期肝癌患者肠道菌群的影响。2、研究解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4与PD-1表达的调节作用。
  方法:
  1、选取年龄≥18岁、巴塞罗那临床肝癌分期为C期(BCLC-C)的HCC患者,随机分为解毒颗粒组和对照组,每组各10例。解毒颗粒组每日冲服解毒颗粒,早晚各一次;解毒颗粒组服药前留取一次粪便,服解毒颗粒后一个月与两个月各留取一次粪便,共三次。对照组不服用解毒颗粒,共留取三次粪便,每次间隔一个月。解毒颗粒组服药前留取一次静脉血,两个月后再留取一次静脉血,共两次。对照组共留取两次静脉血,间隔两个月。
  2、采用16S多样性测序分析对收集的粪便标本分别进行DNA提取、质量检测、测序,通过各菌属丰度产生的变化,观察解毒颗粒对肠道菌群所产生的影响,并通过SPSS21.0(IBM Corp)软件对数据进行统计学分析。两组细菌丰度治疗前后的变化趋势使用重复测量的多因素方差分析(ANOVA of repeated measurement data);菌属OTU水平的差异分析使用Kruskal-Wallis检验法(Kruskal-Wallistest)。
  3、采用流式细胞术探讨解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4及PD-1表达的影响。
  结果:
  1、解毒颗粒组的患者在服药前所具有的与肠癌、肝癌发病相关的梭菌属Ⅺ(ClostridiumⅪ)及消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceae)在服用解毒颗粒后一个月与两个月均消失不见,而在对照组中,上述两菌治疗前后无明显变化。2、对照组中,可以增强肝癌免疫抑制剂疗效的拟杆菌属细菌(Bacteroides)的占比随时间变化呈明显减少趋势,在各个时间点拟杆菌属细菌的占比差异具有统计学意义(P<0.001)且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.032)。而解毒颗粒组中拟杆菌属细菌的占比随时间变化并不明显。3、在解毒颗粒组中,可产生丁酸从而起到抗结肠癌作用的有益菌罗氏菌属细菌(Roseburia)随着时间变化,其占比呈增加趋势;而在对照组中,罗氏菌属细菌的占比随着时间变化呈减少趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.029)。4、在解毒颗粒组中,与结直肠癌相关的普氏菌属细菌(Prevotella)的占比随时间变化呈减少趋势;而在对照组中,普氏菌属细菌的占比随时间变化呈增加趋势。虽然普氏菌属细菌的占比在两组中的变化趋势比较明显,两组在时间、时间与分组的因素上的差异并无统计学意义。5、在解毒颗粒组中,与结直肠疾病相关的毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae)的占比随时间呈轻微减少趋势;而在对照组中,毛螺旋菌科细菌的占比随时间变化呈增加趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.044)。6、随着时间的变化,解毒颗粒组的物种比起对照组更为相似。7、对照组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度呈增长趋势;而在解毒颗粒组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度较前变化不大或呈减少趋势。两组患者外周血CD4+和CD8+的细胞中PD-1的阳性率及平均荧光强度变化趋势均不明显。
  结论:
  通过观察中药解毒颗粒对BCLC-C肝癌患者肠道菌群的影响,发现解毒颗粒对有益菌拟杆菌属及罗氏菌属细菌有良性促进作用,对有害菌梭菌Ⅺ及消化链球菌科细菌可能有抑制作用,其中拟杆菌属与肝癌的免疫治疗疗效密切有关。还发现解毒颗粒对患者外周血CD4+和CD8+细胞中的免疫抑制蛋白CTLA-4的表达具有一定的抑制作用,该结论有待进一步的大样本实验进行验证。
[博士论文] 王洪祥
外科学(神经外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,其中恶性程度及发病率最高者为胶质母细胞瘤。由于胶质母细胞瘤恶性增殖、侵袭性生长及放化疗抵抗等特性,即使手术联合术后放疗及替莫唑胺化疗的标准方案也未能显著改善患者预后,肿瘤几乎百分之百复发,患者不可避免面临致死性病程,中位生存时间仅12-15个月。因此,寻找改善胶质母细胞瘤临床治疗效果的新方法是神经外科当前最迫切的研究方向。
  现有研究认为胶质母细胞瘤的发生发展与基因突变积累及信号通路功能失调密切相关,基于大数据组学的分析,参与其中的多种分子病理机制正被逐步发现,靶向这些异常作用的分子元件为胶质母细胞瘤的治疗提供了新思路。然而,当前大多分子靶向治疗的临床试验结果均表明胶质母细胞瘤患者总体预后未得到显著改善。因此,寻找胶质母细胞瘤恶性增殖、侵袭转移和放化疗抵抗等过程中具有核心作用的新分子靶点显得尤为重要。
  肌动蛋白互作蛋白WDR1参与调节肌动蛋白丝动力学和肌动蛋白依赖的细胞生物学过程,如细胞骨架和细胞间连接的结构与重塑等,在细胞分裂及迁移中具有重要作用。已有研究发现WDR1在乳腺癌、卵巢癌和甲状腺癌等恶性肿瘤中表达明显升高,并促进肿瘤侵袭和迁移,提示WDR1可能作为肿瘤特异性分子参与了肿瘤的发生发展。本研究通过多组学芯片数据筛选发现WDR1在胶质母细胞瘤中表达上调并与患者预后相关,并且利用分子生物学及细胞生物学手段研究了WDR1在胶质母细胞瘤中的功能及信号通路,最后借助流行病学数据分析了WDR1基因遗传变异与胶质母细胞瘤发病风险的相关性。
  第一部分:WDR1在胶质母细胞瘤中表达及与患者预后相关性研究
  目的:通过小样本筛选出胶质瘤中具有预后判断潜能的分子,在多数据库及大样本患者队列中验证目标基因在胶质母细胞瘤中的表达及其在患者预后判断中的作用价值。
  方法:收集14例新鲜胶质瘤样本,提取RNA后行基因芯片检测,根据生存期长短(以60个月为界)筛选出两组患者差异表达基因并行聚类分析。收集TCGA及CGGA数据库胶质瘤患者和正常脑组织基因表达谱数据及临床资料,采用Student-t检验分析筛选出的基因地表达水平在肿瘤和正常脑组织中的差异;Spearman相关性检验分析基因表达水平与胶质瘤病理级别的相关性;Kaplan-Meier曲线分析基因表达水平与胶质母细胞瘤患者预后的相关性。进一步收集100例胶质母细胞瘤和16例正常脑组织样本,构建组织芯片行免疫组化染色,利用Student-t检验、单因素及多因素Cox回归分别验证WDR1在胶质母细胞瘤中的表达及与患者预后的相关性。
  结果:在基因表达芯片数据中,经过p小于0.001并且表达差异大于2倍的筛选,共有83个差异表达基因被筛选出来,其中59个差异基因的表达量在预后较差组中显著上调。将筛选出的差异基因分别在TCGA和CGGA数据库中分析,TCGA数据库显示,与正常脑组织相比,WDR1在胶质母细胞瘤中上调2.2倍(p<0.001),并且高表达的WDR1与患者较短的总体生存期(p=0.017,中位生存时间=345天)和无进展生存期(p=0.044,中位无进展时间=186天)均密切相关;CGGA数据库显示,WDR1表达水平随着胶质瘤病理级别增加而升高(p<0.001),并且较高的WDR1表达水平与胶质母细胞瘤患者较短的总体生存期(p=0.024,中位生存时间=345天)和无进展生存期(p=0.046,中位无进展时间=240天)显著相关。进一步在自己收集的患者队列中对WDR1进行验证,结果同样发现WDR1在胶质母细胞瘤中较正常脑组织中表达显著升高(p<0.001),生存分析显示高表达WDR1与较短的患者总体生存期(p=0.001,中位生存时间=10个月)和无进展生存期(p=0.005,中位无进展时间=8个月)相关,并且是两者独立的危险判断因子(HR=2.147,p=0.001;HR=1.912,p=0.005)。
  结论:WDR1在胶质母细胞瘤中表达明显上调,表达水平与病理级别呈正相关,并且表达量高低是胶质母细胞瘤患者独立的预后判断因子。
  第二部分:WDR1在胶质母细胞瘤细胞中的功能和机制研究
  目的:通过细胞功能学实验明确WDR1在胶质母细胞瘤恶性增殖和侵袭性生长中的功能,探索WDR1表达调控的机制及下游潜在信号通路。
  方法:构建WDR1慢病毒过表达及干扰质粒,包装慢病毒感染胶质瘤细胞系T98G和U87,利用CCK-8和EdU染色检测细胞增殖能力以及Transwell实验检测细胞侵袭能力。构建转录因STAT3过表达载体转染T98G和U87细胞,在IL-6作用下,利用实时荧光定量PCR检测WDR1 mRNA表达变化。构建WDR1基因启动子荧光报告素酶载体及突变载体,与STAT3过表达载体共转293FT细胞,在IL-6作用下,利用双荧光素酶报告系统检测荧光值变化。最后,基于TCGA和CGGA数据库中胶质母细胞瘤表达谱数据进行生物信息学分析,筛选WDR1潜在的下游信号通路。
  结果:脑胶质瘤细胞中验证可见,过表达质粒使WDR1表达明显升高,两条shRNA干扰WDR1效果显著。功能实验结果显示,与对照组相比,过表达WDR1可以显著增加肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,细胞增殖速率加快,EdU染色阳性细胞数明显增多,Transwell发生侵袭细胞数目明显增加;抑制WDR1表达后,细胞则增殖减慢,EdU染色阳性细胞数减少,Transwell发生侵袭细胞数目降低。荧光报告素酶检测结果显示,与突变型WDR1启动子相比,IL-6作用下STAT3可显著增加野生型WDR1启动子的荧光素酶的表达,并且在过表达STAT3的胶质瘤细胞中,WDR1的表达显著升高。生物信息学分析发现,WDR1可能参与调控了细胞粘附、细胞外基质与胞膜受体互作及PI3K-Akt信号通路,从而影响胶质母细胞瘤的恶性进程。
  结论:WDR1基因的表达可以显著影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,STAT3可在转录水平调控WDR1基因的表达;WDR1可能通过细胞粘附、细胞外基质与胞膜受体互作及PI3K-Akt信号通路参与调控胶质母细胞瘤的增殖和侵袭过程。
  第三部分:WDR1基因遗传多态与胶质瘤发病风险的相关性研究
  目的:通过分子流行病学分析WDR1基因遗传多态性与胶质瘤易感性之间的关系。
  方法:收集530例胶质瘤患者(胶质母细胞瘤208例)及524例正常健康人群的血样,记录基本流行病学信息(性别、年龄等),提取血样DNA,通过HapMap数据库分析,筛选标签SNP,并对标签SNP进行基因分型。采用Student-t检验比较连续性变量均值的差异,采用卡方检验比较分类变量的分布差异。非条件逻辑回归分析各位点基因型与胶质瘤发病风险的相关性。
  结果:在收集的530例胶质瘤患者和524例正常健康人群的平均年龄分布为50.83±10.54和46.09±13.18。病例组男性比例为58.7%,对照组中男性比例为60.3%。按照WHO病理级别划分,Ⅰ级患者占2.3%,Ⅱ级患者占37.9%,Ⅲ级患者占20.6%,Ⅳ级患者占39.2%。根据最小等位基因频率(MAF≥0.05)且r2≥0.8的筛选标准,在WDR1基因上下游各延伸2kb范围共发现12个标签SNP,其中rs9926位于基因3,UTR区,rs13441位于基因外显子编码区,可导致异亮氨酸错义突变为缬氨酸,其余位点均落在基因内含子或基因间区。卡方分析发现位点rs3756230、rs734122和rs13441等位基因型在胶质瘤病例组和对照组中分布具有显著差异,p值分别为0.03、0.02和0.02。单位点分析显示,在共显性模型下rs3756230位点GG基因型可以显著增加胶质瘤患病风险(p=0.04,校正后OR值为1.976),在显性模型下CG+GG基因型与野生型CC相比可显著增加胶质瘤的患病风险(p=0.045,校正后OR值为1.304),并且趋势分析发现随着G等位基因型的增大,发病风险显著增加(p=0.019,校正后OR=1.303);在共显性模型下rs13441位点TT基因型与野生型TT相比具有降低发病风险的保护作用(p=0.002,校正后OR值为0.541),趋势分析发现随着T等位型的增多,发病风险显著降低(p=0.007,校正后OR=0.779)。分层分析结果显示,共显性模型下rs13441位点的CT基因型(p=0.043,校正OR=0.615)和TT基因型(p=0.001,校正后OR=0.341)与野生型CC相比可显著降低女性患者胶质瘤的患病风险(p=0.001,校正后OR=0.589),显性模型下CT+TT基因型与野生型CC相比可显著降低胶质瘤的患病风险(p=0.006,校正后OR=0.534)。在病理类型分层分析中,rs13441位点的TT基因型与野生型CC相比可显著降低胶质母细胞瘤的患病风险(P=0.029,校正后OR=0.537),趋势分析发现随着T等位型的增多,胶质母细胞瘤的发病风险显著降低(p=0.027,校正后OR=0.768)。
  结论:WDR1基因遗传多态性与胶质瘤发病风险显著相关,提示了WDR1基因的遗传背景在胶质瘤发挥作用。
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