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[硕士论文] 张婷
控制工程 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:我国农业种植面积广大,而且一直都是农民凭借经验进行人工灌溉,故用于灌溉的水资源消耗一直很大。随着近几年环境的恶化,大部分地区的小河、水井等都已经干枯,所以提高水资源的利用率、加快转变农业的发展方式迫在眉睫。国家也一直在号召农业现代化,随着国家政策的推出,越来越多的技术被逐渐地应用在农业上,比如智能控制、物联网技术、云计算等。针对目前的形式,本文以小麦田为例,设计了一套基于物联网的小麦智能灌溉系统。
  基于物联网的小麦智能灌溉系统主要包括四部分:下位机的终端监控设备模块、网关模块、上位机的智能灌溉决策模型和交互界面。终端监控设备用于监测小麦的环境参数和控制电磁阀的开关,该部分主要完成了ZigBee芯片、各类传感器和电源模块的软硬件设计。网关模块是整个智能灌溉系统的协议转换设备,它将来自终端监控模块的数据包进行分析、压缩和融合后,利用4G网络传输到上位机,此部分主要是ZigBee、处理器、4G模块的硬件电路设计和网关处理数据的软件工作流程设计。上位机的智能灌溉决策模型主要包括规则模型和数学模型,规则模型是根据小麦灌溉管理的专家知识和种植人员的经验设计的,数学模型是利用彭曼公式和水平衡方程对小麦需水量和所需灌溉量进行的建模,这两种模型均可对小麦的灌溉进行预报和决策,从而达到节水灌溉的目的。最后设计了可实时显示的监控界面,将采集的信息和灌溉决策更直观的展现给用户。
  本文设计的基于物联网的小麦智能灌溉系统以ZigBee技术和4G技术相结合的方式实现无线传输,解决了有线传输中布线麻烦、不易维修等问题。同时,该系统的智能灌溉决策模型给出了两种基于不同的灌溉策略下的灌溉决策方法,提高了小麦智能灌溉的准确性,为小麦节水灌溉提供了参考,具有一定的实际意义。
[硕士论文] 梁丽秀
农业电气化与自动化 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻的根系不但是支撑植株吸收营养物质的重要的器官,还与其周围环境有着千丝万缕的联系,近年来水稻根系的研究不断深入,有研究表明,水稻根系的形态特征与水稻的品质、抗性、产量乃至于水稻植株的生长发育等方面都有着紧密的关联,水稻根系形态特征的相关研究对于田间管理方式的改进、水稻遗传特性的改良以及水稻育种等方面都有具有重要意义。随着表型组技术的不断发展,利用图像处理技术对水稻根系性状进行无损动态检测,是未来根系研究中的必然趋势,而水稻根系图像的准确分割是进行后续表型组学分析的重要基础内容之一。
  本文针对水稻表层根系图像的分割问题,结合前人在图像分割中一些经验,尤其是医学和指纹识别等领域中的一些图像处理经验,对水稻表层根系图像进行分割试验。首先,将水稻幼苗种植在单侧透明的根室中,根室里装有添加了营养液的土壤,并且与地面有一定的倾斜角度,保证根系能够紧贴根室的透明玻璃壁生长,根室放置在室外环境中,在自然光照下定期对根系图像进行采集。对采集的水稻根系表层图像,在MATLAB2016图像处理软件上,运用多种分割算法对其进行分割处理,本文主要探讨了三种分割算法,分别是:主干-分支连接分割算法,基于形态特征的局部阈值分割算法和基于形态特征的自适应阈值分割算法,并在三种算法的基础上提出了一种综合的分割算法。
  结果表明,主干-分支连接算法,虽然保留了大量细节,但是受噪声影响严重,其结构略显杂乱,毛刺现象严重,整体的分割效果较差;局部阈值分割算法和自适应阈值算法各有优缺点,而这两种算法的优缺点刚好是可以互补的,基于形态特征的局部阈值分割算法能够保留更多根系的细节,但根系顶部密集部分的线条轮廓完整度尚且不够;自适应阈值分割算法顶部密集部分根系的连续性比较好,根系轮廓完整,但是一些靠近项部和两侧的较为细小的根须损失较多。通过对试验结果的分析,将局部阈值分割和自适应阈值分割的结果结合起来,提出了一种综合的水稻表层根系分割算法,取长补短,可以得到更优的分割的结果,对分割结果的质量评价数据表明,综合分割算法的评价指标整体要好于其他算法,说明了综合后分割算法的可行性。本研究为后续水稻根系表型性状的提取提供了重要研究基础。
[硕士论文] 邓嘉昕
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻是我国的主要粮食作物之一,通过转基因育种方法增强水稻自身的抗性为病虫害防治提供了的高效的解决途径。目前我国已经研发出一系列转Bt基因水稻,正处在批准商业种植的关键时期,环境安全性和食品安全性评价工作十分紧迫。近年来,就一些转基因抗虫水稻品系的基因漂流,靶标害虫的抗性风险,对非靶标生物和稻田节肢动物群落的影响以及毒蛋白在土壤中的残留等方面已经取得了长足进展,为转基因水稻的环境安全性评价积累了一定的经验和技术。转Bt基因水稻环境风险评价的核心是追踪外源蛋白的环境行为、以及外源蛋白的生态学效应。本论文以华中农业大学研发了转cry1Ab/1Ac基因和转cry2A基因水稻为材料,开展了四部分的研究工作,①建立了以二化螟为敏感靶标的外源蛋白环境持留期的生活测定技术,并与ELISA测定的结果进行了对比研究,②外源蛋白在以敏感靶标和非敏感靶标为节点的食物链中的传递,以及对第三营养级(天敌)的影响,③外源蛋白在水生食物链中的传递及其生物学效应,④Bt稻和非Bt稻秸秆的腐烂过程研究及其过程中的细菌和真菌多样性差异研究。主要结果如下:
  1.Bt稻外源蛋白在秸秆残体中的环境持留期的生物测定
  黄熟期转cry1Ab/1Ac和cry2A基因水稻秸秆对二化螟(Chilo suppressalis Walker)初孵幼虫的致死率分别为85%和73%,此时ELISA测定结果显示两种秸秆中的Bt蛋白含量分别约为4700ng/g(鲜重)和2800ng/g(鲜重)。将黄熟期的两种秸秆添加入人工饲料后的致死率分别为46%和35%(1000g人工饲料添加30g干重)。在此基础上设置一系列的Bt秸秆添加量(从30g至0.375g),结果显示以二化螟死亡率作为指标对Bt秸秆添加量的反应极限为7.5g/1000g人工饲料,以二化螟体重抑制率作为指标对Bt秸秆添加量的反应极限为0.75~0.375g/1000g人工饲料,生长抑制率比致死率对秸秆中Bt外源蛋白的反应灵敏度高出20-40倍。通过换算得出二化螟生长抑制率对秸秆残体中Bt外源蛋白的检测下限约为10ng/g左右。用ELISA方法测得的外源蛋白在Bt稻秸秆中的半衰期约为9d至17d,90%衰减期接近80d;用二化螟为靶标生物的生测结果发现,Bt水稻秸秆中的外源蛋白半衰期约为5d至10d,90%衰减期为13d至20d。生测得出的外源蛋白环境持留期要远远短于ELISA测定的结果,因此,随秸秆残体持留在环境中的Bt外源蛋白的环境风险要比原来估计的低很多。
  2.Bt稻外源蛋白在以敏感和非敏感靶标为节点的食物链中的传递和生物学效应
  研究了Bt水稻对三种植食性昆虫(二化螟C.suppressalis Walker、粘虫Mythimna separate Walker及褐飞虱Nilaparvata lugens St(a)l)生长发育影响,取食Bt稻的二化螟的存活率及体重增长显著低于对照(p<0.05),而粘虫和褐飞虱对Bt稻不敏感,存活率及体重增长与对照相比没有显著性差异。分别用取食Bt稻嫩苗的三种植食性昆虫饲喂饥饿处理后的狼蛛(Lycosa pseudoamulata),检测对狼蛛生长发育的影响,结果显示捕食取食Bt稻的二化螟处理组的狼蛛存活率和体重显著低于对照,而捕食取食Bt稻的粘虫和褐飞虱的狼蛛存活率和体重与对照相比无显著差异。测定了Bt蛋白沿食物链传递的并在第二级和第三级营养级中的富集情况,结果显示在三种植食性昆虫体内都检测到了Bt蛋白,浓度分别为40ng/g、45ng/g和25ng/g,在天敌狼蛛体内也检测到了微量的Bt蛋白,浓度分别为9ng/g、6ng/g和8ng/g。综合以上结果可以看出,转Bt水稻可以对第三营养级(即天敌)造成负面影响,也可以对第三营养级没有负面影响,关键在于第三营养级捕食的是Bt稻的敏感靶标还是非敏感靶标。通常情况下,自然界中天敌除捕食Bt稻的敏感靶标外还捕食Bt稻敏感靶标,从这种意义上说Bt水稻对天敌是安全的。
  3.Bt稻外源蛋白在水生食物链中的传递及其生物学效应
  本试验研究了Bt稻外源蛋白沿着食物链“水稻-大型溞Daphnia magna-斑马鱼Brachydanio rerio"及“水稻-小龙虾Procambarus clarkii"的传递规律及生物学效应,并分析了Bt稻对大型溞、斑马鱼及小龙虾生长发育及体内三种保护酶的影响,最后用ELISA方法检测每级营养级生物中的Bt蛋白富集量。结果显示,用Bt稻饲喂的大型溞的存活率、产卵量及体内三种保护酶活性与对照相比没有显著性差异(p>0.05);用培养Bt稻后的培养液培养大型溞、饲喂饥饿处理的斑马鱼10天后,转基因处理组斑马鱼的存活率、体长及体内的保护酶活性相比对照处理没有显著性差异(p>0.05);用Bt稻苗直接饲喂的小龙虾8周内的存活率、体重增长、体长增长、体内保护酶活性相比对照常规处理没有显著性差异(p>0.05),并与鱼饲料对照处理也无显著性差异(p>0.05)。大型溞体内检测到的Bt蛋白浓度约为50ng/g,斑马鱼体内检测到的Bt蛋白浓度约为11ng/g,小龙虾肠道体内检测到的Bt蛋白浓度约为5ng/g。从以上结果可以看出Bt稻对这些水生生物是安全的。
  4.Bt稻和非Bt稻秸秆腐烂特性及其过程中的微生物多样性的差异
  转基因抗虫水稻秸秆还田后与常规秸秆相比在腐烂特性有无差异是环境风险评价的重要内容之一。本试验以转cry1Ab/1Ac和cry2A基因的明恢63水稻秸为材料,在田间与常规非转基因明恢63秸秆的腐烂速率进行了比较,通过二代测序的方法比较了转基因与非转基因秸秆中的微生物(包括细菌和真菌)的多样性。结果表明,两个转基因品系的秸秆在各时期的残重、含碳量、含氮量以及碳氮比均无显著差异,但转基因品系和非转基因品系之间,以及转cry1Ab/1Ac和cry2A基因的明恢63水稻之间细菌和真菌的种类和多样性出现可检测到的差异,这些微生多样性的差异可能是由于Bt外源蛋白引起的,也可能是由于转基因事件本身引起的,但本研究的结果可以确定微生物组成的微小差异并未影响到秸秆的腐烂矿化过程。
[博士论文] 李英
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着自然资源的逐步枯竭和环境气候的不断变化,发展可部分替代化石能源的生物燃油有其重要性和紧迫感。业已证明:木质纤维乙醇是一种理想的生物能源,如添加汽油中可减少废气和碳排放,亦可提高燃油品质。此外,开发木质纤维乙醇,不仅可以解决农作物秸秆大田焚烧带来的空气污染问题,还可增加经济收入。木质纤维乙醇生产主要包括三个步骤:理化预处理、酶解产糖和乙醇发酵。然而,基于植物细胞壁的抗降解性,木质纤维乙醇生产不仅成本高,还易产生第二次污染。因此遗传改良植物细胞壁结构,旨在用温和环保的预处理方法,高效酶解木质纤维素,并最大限度提高纤维乙醇产率。本研究通过利用转基因技术,定向改良了水稻细胞壁结构组成,探讨了提高转基因材料产糖产醇效率的分子机理,并初步设计出纤维乙醇的优化工艺和优质能源作物的选育方法与途径。主要研究结果如下:
  1.超表达外源真菌纤维素酶定向改良水稻纤维素结构:利用水稻rbcS组成型启动子和特定定位信号分子在质外体和叶绿体中分别超表达里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素内切酶基因EGⅡ,纤维素外切酶基因CBHⅠ和β-葡萄糖苷酶基因BGLⅠ,测定了转基因材料细胞壁结构和产糖产醇效率的变化。结果表明:(1)与对照材料相比,转基因材料株高稍矮,但抗倒伏能力显著增强;(2)转基因茎秆材料纤维素结晶度(CrI)与聚合度(DP)显著降低,而木质纤维素孔隙度显著提高;(3)转基因材料半纤维素和木质素结构因子亦发生相应改变;(4)温和预处理下转基因材料纤维素可完全降解产糖,而对照材料降解产糖低于70%;(5)温和预处理下转基因材料乙醇产率获历史记录最高(占干重的23%);(6)关联分析总结出影响木质纤维素酶解产糖产醇的主要细胞壁结构因子,并提出了关于生物质降解分子机理的模型。
  2.下调表达内源Os4CL4改良水稻木质素单体组成:4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是调控植物木质素合成代谢的重要基因,调控着苯丙烷类相关化合物的代谢。通过筛选RNAi抑制Os4CL4的4个纯合转基因水稻株系,分析了转基因材料的基因表达、酶活、木质素组成和生物质酶解产糖效率。结果表明:与对照品种相比,转基因水稻中Os4CL4酶对香豆酸底物的亲和力强于阿魏酸;抽穗期和成熟期茎秆的H单体含量显著提高,从而提高生物质酶解产糖产醇效率。
[博士论文] 奥马尔·阿齐兹
土壤学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻是中国主要的粮食作物,是一种需水量大的作物。因此,水是中国粮食生产稳定的重要因素之一。在中国南方,水稻种植面积占播种总面积的94%,占生产总面积的88%,水稻的生产直接关系到中国的粮食安全。然而,水分的供应与水稻的时空分布一直存在矛盾。目前,有16-22%的稻田遭受季节性缺水威胁,损害了粮食生产能力和粮食安全,水稻迫切需要一种节水生产技术。除水以外,氮肥的施用量在世界各地和中国的水稻种植系统中都有所增加。但是,传统灌溉方式下氮肥的利用效率一直很低。水稻采用节水灌溉,改变了土壤的环境条件,水稻田间水环境对氮的动力学变化的影响需要深入研究。
  在此背景下,利用节水灌溉和15N同位素示踪技术,对稻田水和氮资源的有效利用进行了田间和温室研究。2015-2016连续两年在中国湖北省荆门市团林灌溉试验站进行田间试验,稻田土壤质地为粉壤土。试验采用裂区试验设计,以灌溉处理为主处理,设传统灌溉(CI)和“薄浅湿晒”节水灌溉(TSMDI);氮肥施用量为副处理,设3个水平:N0(0kg N ha-1),N1(90kgN ha-1)和N2(180kg N ha-1,),N2是当地农民习惯施用量。试验进行三次重复。2016年夏季,在中国武汉华中农业大学的一个开放温室(有一个可移动的防雨棚)进行了土柱模拟种稻试验。模拟试验的土壤样品采自上述田间试验田周边水稻田。采用两因素完全随机试验设计,三次重复。试验因素包括灌溉方式和氮肥施用量,灌溉设置两个水平:CI和TSMDI,氮因子设置3个水平:N0(0kgN ha-1),N1(90kgN ha-1)和N2(180kgNha-1),氮肥施用15N丰度为6%的尿素。论文的主要结论如下:
  1.薄浅湿晒节水灌溉处理水资源的有效利用明显优于传统灌溉。与传统灌溉处理相比,采用薄浅湿晒灌溉的水稻节水灌溉每个生育期的田间灌溉水利用系数(FIWUC)明显提高了0.21-3.85%。FIWUC对衡量水稻生长利用的田间有效灌溉水量具有参考价值。薄浅湿晒灌溉具有较高的FIWUC,可能是由于田面灌水深度较浅,降低了水头的压力势,从而减少了渗漏水的损失。与传统灌溉处理相比,薄浅湿晒节水灌溉处理节约灌溉用水16-21%。在薄浅湿晒节水灌溉条件下,灌溉水分生产力(WPI)比传统灌溉水平高出19.04-30.26%,达到5%差异显著水平。比较N2处理(180kgNha-1)(当地农民习惯氮肥施用量),节水灌溉处理的WPI比传统灌溉提高了25.96%。同样,总水分生产力(包括降雨和灌溉)WPI+R薄浅湿晒节水灌溉比传统灌溉高出4.54-16.50%左右。在水稻田田间水利用研究中,同时应用田间水利用系数(FIWUC)和水分生产率(WPI)两个指标能更全面地反映水分的利用状态。
  2.薄浅湿晒节水灌溉水稻的产量与传统灌溉的产量持平,有时甚至略高。2015年的田间试验表明,薄浅湿晒节水灌溉比传统灌溉方法的稻谷产量提高了5.53-6.37%,2016年温室试验节水灌溉比传统灌溉产量提高1.72-3.52%。研究表明,薄浅湿晒节水灌溉为水稻根系的生长创造了较为健康的环境,有利于水稻有效地吸收水分和氮素,从而比传统淹灌具有较高的产量。薄浅湿晒节水灌溉条件下水稻生长参数和产量构成因子,如植高、分蘖数、叶面积指数、生物量、穗数、结实率和干粒重等指标与传统灌溉相比,均未表现出明显的差异。田间试验结果显示,N1和N2两种氮肥用量处理的产量差异不大,节水灌溉条件为施用较低的氮肥达到预期的水稻产量创造了条件。
  3.薄浅湿晒节水灌溉条件下水稻根系和籽粒器官中肥料氮吸收明显高于传统灌溉,从而提高了氮肥利用率。薄浅湿晒节水灌溉N1和N2的氮肥利用率分别比传统灌溉N1和N2的高出5.68-30.23%和6.56-13.92%。15N示踪结果表明,节水灌溉条件下不同植物部位中肥料氮素含量均高于传统灌溉,水稻根系和籽粒中氮吸收量的差异达到显著水平。薄浅湿晒节水灌溉中大量的根系增加了植株对N的吸收,并有效地将N转移到植物的地上部分,最终形成较高的产量。尽管N2处理植株对氮的吸收总量比N1植株的高,但氮肥利用率却低于N1处理。
  4.水稻薄浅湿晒节水灌溉大量减少渗漏水和总氮的淋失,具有较好的环境效应。与传统灌溉相比,薄浅湿晒节水灌溉处理渗漏水量减少了18.63%。渗漏水的测试表明,NH4+是N的主要淋失形态。土壤中的NH4+移动受灌溉方式的影响很大,而NH4+淋失的巨大潜在风险值得关注。水稻采用薄浅湿晒节水灌溉的方法,可以明显降低土壤的NH4+和总氮的淋失量,但在一定程度上却增加了NO3--N的淋失,特别是在晒田后的复水过程中。
  5.肥料氮的氮量平衡显示薄浅湿晒节水灌溉的肥料氮水稻植株氮吸收量、水稻土壤残留氮和氮损失的比例得到了合理的分配。结果表明,比传统灌溉相比,薄浅湿晒节水灌溉N1和N2植株肥料氮吸收量比传统灌溉提高了10.49%和6.56%,肥料氮在稻田土壤中的残留量分别提高了3.77%和4.77%;同时,在N1和N2处理中肥料的氮损失分别降低了32.38%和19.03%。薄浅湿晒节水灌溉具有减少环境退化的作用。
  研究表明,薄浅湿晒节水灌溉是较为合理的灌溉方式,在两种氮素处理水平中,低氨水平(N1)的综合效益明显优于高氮水平(N2),且两种氮肥处理的粮食产量差异不大。然而,N1提高了氮肥利用率,大大减少了氮的淋失。研究结果表明,为了确保生态环境的安全,水稻可以通过节水灌溉措施有效节约农业用水量和降低氮肥施用量。然而,还需进一步研究节水灌溉的后续影响以及可持续农业系统的最佳氮素管理战略。
[硕士论文] 刘晓青
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:玉米百粒重是影响产量的重要因子之一,解析玉米籽粒百粒重主效QTL/基因的遗传机制是进一步提高玉米产量的重要途径。染色体片段代换系(CSSLs)是进行产量等复杂数量性状QTL鉴定、克隆的理想材料。本研究以玉米自交系吉1037为供体,Ye478为受体构建了染色体片段代换系材料H15-6-2,通过多年多点试验对玉米百粒重主效QTL进行鉴定,结合亲本材料在籽粒授粉后11DAP的转录组分析数据,获得了主效QTL目标区段内7个关键候选基因,为下一步QTL的精细定位及关键候选基因的鉴定奠定了工作基础。本研究获得的主要结果如下:
  1.影响百粒重的染色体片段代换系表型鉴定。在保定、安阳、邢台三个环境开展染色体片段代换系H15-6-2表型鉴定试验:H15-6-2百粒重和Ye478相比平均下降10g;Ye478和代换系H15-6-2籽粒的粒宽差异显著(P<0.01)。Ye478籽粒授粉后灌浆速率始终快于H15-6-2;综合石蜡切片结果表明授粉后的Ye478籽粒发育进程快于H15-6-2。利用玉米基因组上的1021对SSR标记对导入片段进行分析,发现控制百粒重的导入片段主要位于第3和第6染色体。
  2.F2群体构建及百粒重QTL定位。2015年和2016年利用H15-6-2与Ye478杂交自交构建了一个F2群体和两个F2:3群体,群体大小为207,利用这两种群体将控制百粒重的主效QTL定位在标记C3-89与C219-90间共6Mb的范围内,位于第3染色体3.08bin,可解释23%的表型变异,将该主效QTL命名为qHKW3。
  3.qHKW3精细定位。从2016海南种植的F2.3家系后代中筛选出12种不同类型的qHKW3目标区段内的重组家系,根据这些重组家系的基因型和表型,将qHKW3定位在标记C214-16-C215-34之间,约1.3Mb的范围内。2017年在四川和黄冈两个环境利用12种类型重组家系的纯系分别进行子代测验,都将qHKW3定位于标记C214-16-C215-34之间,与之前精细定位结果一致。
  4.目标区段转录组分析。2017年夏季提取亲本Ye478和H15-6-2授粉后11DAP的籽粒RNA进行测序分析。将RNA-seq检测结果和B73Ref Gen-V4参考基因组结合分析:1.3Mb范围内共有23个基因,只有7个基因在Ye478与H15-6-2间表达量倍性差异大于2倍,因此作为候选基因。
[博士论文] 邓勇
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)、细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae,M.oryzae)是极具破坏力的水稻病原菌,也是造成水稻大面积减产的罪魁祸首。籼稻品种明恢63是一个在我国大面积使用超过30年的恢复系,其携带的主效抗白叶枯病基因Xa3/Xa26因其持久且广谱的抗病能力,在生产中得到广泛应用。该基因在粳稻品种中的抗性可能比在籼稻品种中更好(Cao et al2007)。OsWRKY45在籼稻和粳稻中拥有不同的等位基因,并且这对等位基因可能是引起Xa3/Xa26在不同水稻亚种中抗病功能有差异的原因之一(Zhou et al2009;Tao et al2009;Kou et al2010)。为了在水稻抗病育种中更好的应用这两个基因,我们分别以籼稻品种明恢63和粳稻品种牡丹江8为受体构建近等基因系以研究Xa3/Xa26基因抗性出现差异的原因和OsWRKY45等位基因的功能差异。获得的主要结果如下:
  在携带Xa3/Xa26基因的自然品种中,粳稻品种早生爱国3比籼稻品种IRBB3和明恢63对Xoo具有更好的抗性以及更高的Xa3/Xa26和OsWRKY45基因的表达水平。MD1是以牡丹江8为背景的携带Xa3/Xa26和OsWRKY45-1的近等基因系,其病斑长度比供体亲本明恢63短,其中Xa3/Xa26的表达水平也比明恢63更高。在Xa3/Xa26基因存在的情况下,分析携带OsWRKY45-1和OsWRKY45-2的近等基因系抗病程度和相关基因的表达量,发现牡丹江8背景的家系比明恢63背景的家系更抗病,同时携带OsWRKY45-1的家系比携带OsWRKY45-2的家系更抗病;牡丹江8背景中Xa3/Xa26和OsWRKY45的表达量都显著高于明恢63背景,同时在两种背景中OsWRKY45-1的表达量显著高于OsWRKY45-2。证明粳稻背景有利于提高Xa3/Xa26的抗病功能,该现象可能普遍存在,并且OsWRKY45-1基因对此现象有贡献。进一步实验证明OsWRKY45基因参与Xa3/Xa26介导的抗病路径。
  分析粳稻背景中Xa3/Xa26抗病过程中内源植物激素的含量发现水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸(jasmonic acid,JA)的含量在抗病家系和感病家系间有显著差异。外源激素处理后接种病原菌发现JA抗病信号路径在Xa3/Xa26介导的对Xoo的抗病过程中发挥重要的作用。分析粳稻背景中植保素的含量和细胞壁抗性相关基因的表达量,发现在Xa3/Xa26抗病过程伴随着植保素的大量积累而不需要细胞壁的加厚。进一步分析OsWRKY45-2转基因材料接种不同病原菌后内源激素和植保素的含量,发现OsWRKY45介导对Xoo和Xoc的抗病反应引起JA的积累;而对M.oryzae的抗病反应引起SA的积累;对Xoo和M.oryzae的抗病反应都与增加二萜类植保素的积累有关。说明OsWRKY45基因在Xa3/Xa26介导的抗病路径中的作用是引起植保素和茉莉酸化合物的积累。
  OsWRKY45的等位基因在183份中国品种中的分布与水稻亚种的分类正相关。进一步分析发现携带OsWRKY45-1的品种倾向于分布在高纬度地区,而携带OsWRKY45-2的品种倾向于分布在低纬度地区。然而长短日照处理并不影响不同近等基因系的抽穗期,说明OsWRKY45等位基因在不同纬度分布与日照长度无关。
  尽管OsWRKY45-1和OsWRKY45-2都负调控水稻抗高温,高温处理却发现携带OsWRKY45-1的近等基因系对高温更敏感。分析近等基因系中不同温度下OsWRKY45的表达量,发现OsWRKY45-1的表达量受温度的诱导,在35℃时OsWRKY45-1的表达量显著高于OsWRKY45-2。以上结果证明OsWRKY45等位基因在高温下表达水平的差异会引起近等基因系对高温的敏感度不同,从而导致OsWRKY45等位基因在不同纬度的分布。进一步分析发现OsWRKY45-2的启动子中包含两个额外的脱落酸(abscisic acid,ABA)响应原件。种质资源品种中OsWRKY45启动子单倍型与等位基因的单倍型分布情况一致。携带OsWRKY45-2启动子的品种倾向于分布在低纬度地区,随着纬度的升高,携带OsWRKY45-1的品种比例越来越高。该结果暗示启动子的差异使OsWRKY45等位基因对温度敏感程度不同,从而造成携带不同等位基因的品种倾向于分布在不同的纬度。
  综上所述,本研究发现粳稻背景有利于提高Xa3/Xa26的抗病能力,OsWRKY45等位基因表达量的差异不仅会影响Xa3/Xa26的抗病能力,也会影响水稻对高温胁迫的响应。暗示用传统育种方法将Xa3/Xa26导入粳稻中能更好的发挥其功能。OsWRKY45-1位点更适合用于抗病育种,OsWRKY45-2位点更适合用于抗逆境育种。
[硕士论文] 刘晨
生理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:两系法杂交水稻为水稻杂种优势利用提供了新的技术途径,而探明两用不育系育性转换机理则是该技术的理论与应用基础。本研究从光敏感核不育材料育性转换的转录组差异结果中获得了茉莉酸合成相关基因的表达差异信息,对长光不育型水稻农垦58S、短光不育型水稻D52S进行光周期育性诱导,在穗发育的Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ期对叶片JA总含量及JA合成途径关键酶LOX、AOS、AOC和OPR的酶活性进行测定,并且利用qPCR技术测定这4个关键酶基因的表达水平差异,试图分析荣莉酸与光周期诱导育性转换的关系。主要研究结果如下:
  1.光周期处理能够有效地诱导农垦58S和D52S的育性发生变化,两个材料的花粉育性变化结果相反;农垦58S在自然长光(14h)时花粉为不育,而短光(10h)处理后的花粉可育;短光处理后D52S表现为不育,自然长光条件下D52S表现可育。
  2.获得两个材料在不育和可育光周期下的转录组数据。光周期处理会使两材料产生44个共有的差异基因,但两材料中得到的差异基因数目不同,且上下调的趋势也不一致:以显著性检验的p-value值<0.05和FC≥2为标准筛选差异基因,并以可育材料作为参照,D52S中共得到1036个差异基因,其中451个下调,585个上调;农垦58S中共得到140个差异基因,其中39个上调,101个下调。此外,从转录组数据和GO富集结果中也筛选到了JA合成途径的差异基因LOX,AOS、AOC和OPR。
  3.光周期处理后农垦58S短光可育叶片中的JA含量在减数分裂期(Ⅵ期)比长光不育叶片高;两材料中各时期JA含量均有显著差异,说明长、短光周期在水稻的生长发育时期会不断地对植物体内的JA合成代谢进行调节。喷施MEJA可以使农垦58S和D52S的花粉碘染率变为不育材料的39.24倍和118.6倍;农垦58S中可育材料的花粉碘染率是喷施SHAM的34.47倍,D52S喷施SHAM后则变为了完全不育;喷施MEJA后可以提高LOX、AOS、AOC和OPR的酶活性及JA含量,但SHAM处理没有降低这些酶的活性和JA含量,推测这一结果可能与取样时期较后有关,SHAM的抑制作用不明显。
  4.qPCR结果表明,光周期处理下,两材料叶片中的LOX,AOS、AOC和OPR基因的相对表达水平主要在Ⅴ期和Ⅵ期可育比不育材料表达量高;当喷施MEJA或SHAM后,分别使这四个基因的表达水平一致升高或降低,即当这四个基因表达量升高时材料可育,表达量降低时材料不育,推测这两个处理主要通过调节JA合成途径基因的表达来实现对育性的调控。
  本研究获得了长、短光周期敏感核不育水稻农垦58S和D52S在光周期处理下、外源喷施MEJA和SHAM后的JA含量、茉莉酸合成途径的相关酶活性、关键酶基因的表达变化,初步证实了茉莉酸参与了光敏核不育材料的育性转换过程,但仍需要今后大量研究来明晰其内在的机理。
[硕士论文] 付杰
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:茉莉酸(JA)和脱落酸(ABA)作为重要的植物激素,在植物响应和适应各种非生物胁迫(包括高盐、干旱、物理伤害和冷害等)中发挥重要的作用。大量研究表明,植物(水稻、拟南芥、番茄等)JAZ(JASMONATE ZIM-domain)蛋白依赖JA信号途径负调控植株防御生物胁迫和非生物胁迫。然而,仍然缺乏直接证据证实JAZ蛋白可以参与调节水稻抗旱性。本研究阐释了OsJAZ1蛋白调控水稻抗旱性的机制。研究结果显示OsJAZ1的表达水平受MeJA(茉莉酸甲酯,茉莉酸活性形式)强烈诱导,而其受脱落酸、水杨酸和非生物胁迫(包括干旱、高盐和冷害)的诱导程度相对较弱。在水稻苗期和孕穗期,OsJAZ1超量表达植株相比于野生型中花11(ZH11)对干旱敏感性增强,而T-DNA插入突变体植株与野生型(Dongjin)相比,抗旱性增强。在MeJA和ABA激素处理条件下,OsJAZ1转基因植株(OsJAZ1超表达和osjaz1突变体材料)的根长和地上部分长度与相应的野生型植株相比有显著差异。OsJAZ1超量表达植株相比于ZH11对MeJA和ABA的敏感性降低,而osjaz1突变体家系相比于野生型Dongjin对MeJA和ABA的敏感性增强。亚细胞定位的实验结果表明,OsJAZ1蛋白在细胞核和细胞质中均有分布。转录组数据分析结果显示,在干旱胁迫前后,ABA和JA信号通路中许多基因,包括OsNCED4、OsLEA3、RAB21、OsbHLH006、OsbHLH148、OsDREB1A、OsDREB1B、SNAC1和OsCCD1等的表达水平在OsJAZ1超量表达和野生型ZH11植株之间有显著差异。通过实时荧光定量PCR进一步证实了这些差异表达基因干旱胁迫前后的表达水平的变化,以上这些结果表明,OsJAZ1可以通过ABA和JA途径调控水稻抗旱性。
[硕士论文] 朱香
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:玉米(Zea Mays L.)是许多国家的重要农作物之一,在满足粮食和能源需求方面发挥着重要作用。由于死体营养型病原菌可以导致玉米产量大幅度下降,使得人们越来越重视对死体营养型病原菌的防治。玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌以及Epicoccum sorghinum属于死体营养型病原菌。玉米纹枯病和玉米小斑病是全球玉米产量的主要威胁。
  E.sorghinum既可以作为病原菌危害作物,又可以作为内生菌具有抑菌活性,且在国内还尚未有将其作为玉米病原菌的报道。本研究通过对玉米病原菌的分离,获得7种真菌,经过鉴定筛选出3种对玉米具有致病性的病原菌,玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌和E.sorghinum。通过对病原菌E.sorghinum的致病性、抑菌性以及分泌物毒性的鉴定,最终将分离所得的E.sorghinum鉴定为一类对玉米具有致病性的玉米病原真菌。
  本研究结果表明,聚合多个基因的转基因育种能很好地防治玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌以及E.sorghinum引起的病害。通过对转有多基因玉米回交6代株系抗病性的筛选,得到49个转基因玉米株系,这49个株系可以有效防治玉米纹枯病。经过进一步筛选,得到6个分别含有7个、8个和9个基因的玉米株系,这6个株系对玉米纹枯病具有显著抗性。最终筛选出具有最高抗病水平的910株系(含有9个基因)(sAUDPS<20)。研究表明,株系111和112(含ZmPROPEP1基因)在抗玉米纹枯病的同时还对玉米小斑病具有较高的抗性(sAUDPS<40)。株系912(含9个基因)不仅抗玉米纹枯病还对E.sorghinum引起的病害具有很高的抗性(sAUDP S<20)。株系211(含Iap和p35基因)在具有抗病性的同时还具有较好的抗盐和抗旱效果。但无论是在抗病还是抗盐抗旱方面,这些株系的抗性效果都没有910显著,且qPCR结果证实了这9个基因在910中都有较高表达。
  传统的育种方法对死体营养型病原菌如玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌和E.sorghinum的防治存在着局限性。本研究证实了转有多个基因的玉米聚合育种不仅能很好地防治死体营养型病原菌,还能起到抗盐抗旱的作用。其中9个基因的联合应用(910)不仅在抗死体营养型病菌方面表现突出,还具有较高的抗盐抗旱能力。在本研究中,这9个基因分别选自于3个方面,1)植物直接抗病相关基因:Ace-AMP1,Tlp,Chi,Rs-AFP2和Glu;2)植物防御反应基因:Pti4和ZmPROPEP1;3)抗细胞凋亡基因:Iap和p35。本研究在充分利用这些基因的同时,更深层次地挖掘这些基因的联合应用潜力,为玉米死体营养型病原菌的防治和玉米抗盐抗旱提供了新策略。
[硕士论文] 徐鹏
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:稻瘟病、白叶枯病和褐飞虱是水稻生产上最主要的三种病虫害,在病虫害流行年份,会严重的影响水稻产量和品质。而水稻作为全世界一半以上人口的主食,其产量的损失不仅带来粮食安全问题,与此同时由于病虫害的防治还会严重影响自然生态环境。R1813是湖南隆平种业有限公司选育的籼型、高产、抗倒、迟熟的恢复系,以R1813为父本,已经选配出一批组合通过审定。本研究利用分子标记辅助选择技术及表型选择,通过杂交和回交,将MD12086-41携带的将抗稻瘟病基因Pi9、抗白叶枯病基因Xa23、抗褐飞虱基因Bph14、Bph15导入到R1813的背景中,期望选育稻瘟病、白叶枯病和褐飞虱抗性明显提高,但表型与R1813相似的改良株系,为后续的育种提供中间材料。主要研究结果如下:
  1、从“R18134/MD12086-41”的后代中,通过分子标记和表型选择,选育出携带Bph14、Bph15、Pi9和Xa23基因的株系7个,株系号是ST15005-1-280、ST15005-1-284、ST15005-1-8-9、ST15005-1-106-9、ST15005-1-318-1、ST15005-1-318-4和ST15005-1-318-14,携带Bph14、Bph15和Xa23的株系1个,株系号是ST15005-1-206,目测表型与受体亲本R1813相似。
  2、褐飞虱抗性鉴定结果表明,株系ST15005-1-206、ST15005-1-280、ST15005-1-8-9和ST15005-1-318-14的抗性为3级,表现抗;株系ST15005-1-106-9、ST15005-1-318-1和ST15005-1-318-4的抗性为5级,表现中抗。
  3、白叶枯抗性鉴定结果表明,所有育成的8个株系对本实验接种的2个菌株ZHE173和GD1358均表现抗或高抗。
  4、在稻瘟病病区自然诱发鉴定表明,8个育成株系的稻瘟病综合抗性指数为1.0-2.3,比受体亲本R1813的5.5有明显提高。使用35个菌株对育成株系进行人工接种,叶瘟抗谱鉴定表明,育成株系的抗性频率为91.43%-100%,比受体亲本R1813的77.14%也有明显提高。
  5、对育成株系的产量、主要农艺性状和稻米品质分析表明,除了株系ST15005-1-206和ST15005-1-318-1的产量显著低于受体亲本R1813以外,其它6个株系的产量均与R1813无显著差异,8个育成株系的结实率都低于R1813,其他性状与R1813相似。株系ST15005-1-280、ST15005-1-284、ST15005-1-8-9的稻米品质较差,其他5个株系的米质都与R1813相似。
  6、杂种优势鉴定结果表明,丰39S/ST15005-1-318-1、丰39S/ST15005-1-318-14、华5282S/ST15005-1-318-1、华5325S/ST-15005-1-106-9和华5325S/ST15005-1-318-4这5个组合的综合表现较好,表现产量较高、稻米品质优,建议进一步进行试制种和多点比产试验。
[博士论文] 杜艳芳
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:禾本科单子叶植物水稻和玉米,分支均包括叶腋分生组织(axillary meristems:AMs)产生的分蘖和花序分支分生组织(branch meristems:BMs)产生的花序分支。研究表明,参与调控分蘖和穗分支的基因,在水稻和玉米中具有一定的同源性。unbranched3(UB3)属于SBP-box转录因子家族的基因,通过调控腋芽原基的起始来影响雄穗分支和雌穗穗行数的变异,进而影响产量,但是其作用机理并不清楚。KRN4是一个穗行数主效位点,为UB3下游~60kb处的基因间区域,UB3的表达与功能位点KRN4的基因型显著关联,但是KRN4远距离调控UB3的作用方式还有待解析。本研究将UB3在玉米和水稻中进行遗传转化,解析了UB3在水稻和玉米中影响穗分支发育的功能,为禾本科植物基部的分蘖和花序分支系统的建立提供基础。此外,还研究了KRN4远距离调控UB3表达的作用方式,建立了假说,为非编码基因间区调控基因表达提供了依据。主要结果如下
  1.UB3过量表达抑制玉米愈伤的分化和水稻分支的发育:将UB3在玉米进行过表达,显著抑制愈伤的分化和再生,不能形成幼苗;将UB3在水稻中进行遗传转化,UB3过表达时,显著抑制株高、分蘖和穗分支;UB3适度表达时,轻微的减少分蘖和株高,并增加穗分支和穗粒数。
  2.UB3通过细胞分裂素水平调控水稻分支发育:对UB3过量表达的转基因株系的茎尖分生组织和幼穗进行转录组测序,结合已有的Ideal Plant Architecture1(IPA1)Chromatin Immunoprecipitation quantitative PCR(ChIP-seq)的数据进行分析,并结合体外验证,发现UB3蛋白可以结合在LONELY GUY1(LOG1),LOC_OS04G44354和OsCKX2基因的启动子区域,在UB3过量表达材料中,降低细胞分裂素的合成并促进其降解,使得分生组织细胞分裂素水平降低。对水稻苗期地上部分进行细胞分裂素水平的测量,发现UB3过表达植株中细胞分裂素含量确实有所降低,符合预期。因此UB3通过影响分生组织中细胞分裂素的水平,影响细胞分裂的速率,从而参与腋生分生组织分支发育的调控。而UB3适量表达时,可以通过与SPL(SPL7,SPL14,SPL17)基因合作,精准调控小穗的发育。
  3.UB3可能通过细胞分裂素途径和CLAVATA-WUSCHEL途径调控玉米穗行数发育:对ub3::mum和野生型株系的幼穗进行转录组测序,发现在所有的与细胞分裂素相关的差异表达基因中,17个与之合成相关的基因在突变体中上调表达,3个与之降解途径相关的基因下调表达。因此认为细胞分裂素途径在UB3调控玉米穗行数发育过程中也存在。此外,影响玉米分生组织发育的CLAVATA-WUSCHEL负反馈调控途径上的一些基因,包括THICK TASSEL DWARF1(td1),FASCIATED EAR2(fea2),COMPACT PLANT2(ct2)和FASCIATED EAR3(fea3),FON2-LIKE CLE PROTEIN1(ZmFCP1),WUSCHEL1(ZmWUS1)和CLA VATA3(ZmCLV3)均检测到有差异表达,结合体外的实验,证明了UB3蛋白可以直接结合在ZmFCP1,ZmWUS1的启动子区域,直接调控它们的表达。
  4.KRN4顺式增强UB3的表达:KRN4是一个基因间区域,在负调控穗行数的功能基因UB3下游~60Kb处。在krn4-mum12-3mm的雌穗中,UB3的表达量相对于野生型显著下降,成熟时期雌穗的穗行数、雄穗的一级分支数、二级分支数等均显著高于野生型。KRN4在不同的玉米自交系中存在两种不同的单倍型,即KRN4NX和KRN4,KRN4NX较KRN4存在1.2kb的插入。瞬时表达的结果表明,不同单倍型的KRN4均能增强报告基因的表达,并且KRN4的增强效应要强于KRN4NX,KRN4也可以直接作用于pUB3,产生相同趋势的变化差异。
  5.KRN4的结合蛋白分析:通过酵母单杂、凝胶阻滞迁移和瞬时表达实验,验证了玉米OCS Element Binding Factorsl(OBFl)和OCS Element Binding Factors4(OBF4)可以结合在KRN4的E1增强子元件,并增强荧光素酶报告基因的表达。
  6.UB2正调控UB3表达:UB2是UB3的旁系同源基因,UB2和UB3的双突变体能加强ub2或ub3单突变体穗部的表型。在UB2过表达植株和突变体ub2::mum的幼穗中,发现UB2正调控UB3表达。通过UB2超表达转基因株系幼穗的ChIP-qPCR,发现UB2结合在KRN4-P4位点以及UB3-P位点。并且双分子荧光互补实验表明UB2,OBF1和OBF4两两之间存在互作。
  7.总结KRN4顺式调控UB3影响玉米穗行数的途径:UB2蛋白介导KRN4和UB3transcription start site(TSS)之间染色质环的形成,使得KRN4在空间上靠近UB3的启动子区域;KRN4招募OBF1和OBF4蛋白,与UB2蛋白形成转录复合体作用于UB3的启动子区域,在RNA polymeraseⅡ(RNAPⅡ)的作用下启动和增强UB3的表达。借助于UB3在水稻中调控分蘖和穗分支的模式,结合玉米幼穗中转录组的数据,推测其在玉米中也很可能通过调控细胞分裂素途径的基因,参与对玉米穗行数的调控;此外,在已经报道的通过CLAVATA-WUSCHEL途径调控IM的大小的基因中,UB3可能通过作用于ZmFCP1和ZmWUS1启动子区域,负调控其表达从而影响雌穗的横向发育。
[硕士论文] 杨志远
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全球变暖以及温度增加的不对称性对水稻产量和稻米品质的影响已经受到了越来越多的关注,有关大田条件下不同增温方式(如白天增温、夜晚增温或全天增温)对水稻生长发育、产量和品质形成的影响的研究报道仍然不多。为此,本试验于2016和2017年在湖北武汉采用自制的鼓风加热增温系统模拟长江中下游地区未来大气温度的变化趋势,选用大面推广种植的4个水稻品种作为试验材料,在大田条件下分别设置白天增温(Daytime Warming,DW)、夜间增温(Nighttime Warming,NW)以及全天增温(All-day Warming,AW)和对照4个不同温度处理,比较研究不同增温方式对水稻生长发育、产量及品质的影响以及品种之间的响应差异,以期揭示增温对水稻生长发育、产量以及品质影响的机理,从而为培育耐高温品种选育提供理论依据,为抗高温栽培提供决策支持。主要研究结果如下:
  1.在2016和2017年的大气温度基础上增温1℃-2℃会显著降低水稻的产量。不同增温方式对水稻产量的影响程度不同,全天增温处理对所有供试水稻品种的产量影响最大,2016和2017年4个供试品种在AW处理下的平均降幅分别为61.93%和42.58%。本试验条件下,两年的NW和DW对产量影响的差异不显著,2016年两者的平均降幅分别为31.06%和30.76%,2017年分别为29.63%和21.66%。
  2.NW和DW导致产量降低的途经有差别。NW和DW对水稻的结实率和千粒重的影响程度大致相同,不同的是每穗颖花数在NW处理下的降幅大于DW。进一步比较NW和DW对结实率降低的内在机理,结果发现,两者都是通过降低花药开裂率、花粉活性、柱头附着花粉数以及柱头上花粉萌发数从而导致结实率下降;而NW导致花药开裂降幅大于DW,DW导致花粉活性以及柱头附着的花粉数的降幅相对较大。
  3.增温导致水稻的株高显著降低,但对水稻叶片的比叶重(SLW)的影响不显著。耐高温品种SY63的叶面积指数(LAI)在增温处理下显著增加,其他3个品种LAI在增温处理下无明显的变化。水稻植株形态在增温处理下的变化不影响水稻各个时期的干物质积累。表明增温处理下的干物质供应并不限制产量的形成。
  4.增温处理影响水稻的部分加工品质和外观品质指标。AW、DW和NW3种增温处理均显著降低稻谷的整精米率、直链淀粉含量以及胶稠度,增加垩白度和垩白粒率。
[博士论文] 胡鑫
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:硬粒小麦(Triticum durum,AABB,2n=4x=28)是四倍体栽培小麦,其播种面积约占世界小麦总面积的10%,是世界重要的粮食作物之一。硬粒小麦是由野生二粒小麦(Triticum dicoccoidesL.,AABB,2n=4x=28)驯化而来,在其起源和驯化的过程中经历了长期复杂的环境演变条件,在很多性状上具有丰富的变异,同时具有良好的环境适应性,是普通小麦次级基因源库。因此,对硬粒小麦进行遗传评价及主要农艺性状的研究,对于发掘优异的种质资源,用于硬粒小麦及普通小麦的遗传改良具有重要的意义。本文首先对来自世界各地的150份硬粒小麦材料的10个主要的农艺性状进行了4年3个重复的表型鉴定;其次利用基于EST序列开发的1366个SNP标记对150份硬粒小麦材料的遗传多样性,群体结构研究以及连锁不平衡(LD)进行了研究;并利用1366个SNP标记基于混合线性模型(MLM)对其10个主要的农艺性状进行了关联分析;另外,利用MALDI-TOF-MS技术,对150份硬粒小麦材料的低分子量麦谷蛋白亚基组成进行了鉴定。主要结果如下:
  1.硬粒小麦主要农艺性状的表型鉴定:硬粒小麦10个主要的农艺性状间都存在丰富的变异,都呈连续性分布,表现为典型的数量性状。大部分性状间存在显著的相关关系。广义遗传率的结果也表明考察的所有性状都有较高的遗传率(H2>80%)。因此这些农艺性状的表型数据可以用于后续研究。另外鉴定了一些农艺性状优异的材料可进一步验证加以利用。
  2.硬粒小麦遗传多样性研究:利用1366个单核甘酸多态性(SNP)标记对硬粒小麦进行了遗传多样性研究,硬粒小麦表现出较高的遗传多样性,平均Nei's遗传多样性和PIC值分别是0.2395和0.1950。B基因组相对A基因组具有更高的遗传多样性。不同生态地理区域的硬粒小麦群体的遗传多样性也表现出较大差异。
  3.硬粒小麦群体结构分析:群体结构分析表明,供试硬粒小麦材料主要被分为两个明显类群。硬粒小麦不同类群并没有表现基于国家和地区上一致规律性,而部分生态地理区域的材料有一定的关联,不同时间段的材料的聚类也表现出一定的一致性。
  4.硬粒小麦连锁不平衡分析:硬粒小麦基因组中表现出较高的LD水平,不同的基因组和染色体的平均LD程度不同,A基因组的LD程度总体上要高于B基因组。极显著的LD的成对位点的比率范围从1A的2.4%到2B的7.4%(R2>0.1,p<0.001),14条染色体上平均R2值变化范围从1B的0.043到4A的0.113。结合EST标记的最新物理位置,在染色体和基因组水平,对其LD衰减水平进行评估,不同的染色体内LD衰减距离各异,总体上A基因组衰减距离大于B基因组。
  5.硬粒小麦10个主要农艺性状的关联分析:在四年数据中,基于混合线性模型(MLM)对10个主要农艺性状进行了关联分析,共检测到165个显著关联结果,不同性状的关联标记的数目从1个到54个不等,这些标记解释了5.0%-26.1%的表型变异。单个性状可能与多个标记相关联,同时单个标记也可能与多个性状相关联。一些关联标记与已报道的数量性状位点(QTL)研究相一致。共有7个显著的关联结果在四年的关联分析中被重复检测到(主穗长(LMS)和株高(PH)分别有4和3个),同时2个关联结果在3年数据中被重复检测到,11个关联结果在两年数据中都有检测到,这些重复性的关联结果多是显著且可靠的。通过对关联标记对应的EST序列进行同源性序列比对,共确定了多个可能控制相关农艺性状的主效候选基因。同时我们在2A、5A、6A、7A、1B和6B染色体特殊区域发现了一些与农艺性状显著关联的标记聚集形成的QTL簇。
  6.硬粒小麦低分子量麦谷蛋白亚基组成鉴定:在Glu-A3和Glu-B3两个位点,一共鉴定出了12个低分子量麦谷蛋白亚基基因的等位变异,其中有2个先前没有报道的新的变异。Glu-A3和Glu-B3位点各有5个先前报道过的亚基被鉴定出来,其中Glu-A3位点Glu-A3e、Glu-A3a/c、Glu-A3d、Glu-A3f和Glu-A3b分别占43.0%、16.1%、10.1%、12.8%和7.4%;Glu-B3位点Glu-B3d,Glu-B3b和Glu-B3c分别占60.4%、6.0%和6.0%,Glu-B3h的材料有4个,Glu-B3f也仅在一个材料中被鉴定出来。另外,在Glu-A3和Glu-B3位点各有一个新的蛋白亚基基因型被鉴定出来,分别编码的蛋白亚基分子量在40500Da和41260Da左右。
[博士论文] 贾海涛
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:玉米是世界上最重要的粮食作物之一,为了满足人们对玉米及其衍生产品饲料和能源的需求,提高玉米产量是必需的。在过去的一个多世纪里,育种家致力于提高玉米杂交种产量,在玉米大果穗和适应性强的品种选育上取得了巨大成功。但是产量是由微效多基因控制的复杂性状,至今我们对玉米产量形成的遗传基础以及玉米改良过程中所选择的位点信息知之甚少。行粒数和穗长是玉米重要的产量性状。本研究通过精细定位,候选基因关联分析,表达量分析及玉米遗传转化验证,鉴定克隆到一个控制行粒数和穗长的QTL KERNEL NUMBER PER ROW6(KNR6),编码丝氨酸苏氨酸类受体蛋白激酶,主要研究结果如下:
  1.KNR6的精细定位与分离
  利用NILqKNR6(长穗)与其近等基因系NILqknr6(短穗)回交,构建分离群体。在超过28000个单株的回交群体中共鉴定了10种不同交换类型的重组基因型。通过重组单株的子代测验,将qKNR6定位在标记M6-M8约110kb的区间内。该区间编码2个基因,Zm00001d036601和Zm00001d036602。基于PCR扩增重测序和表达量分析发现,Zm00001d036601在近等基因系中无序列差异和表达差异,Zm00001d036602作为KNR6的候选基因,在近等基因系中存在4个多态性位点,包括5'-UTR区域一个5054bp转座子插入缺失的变异,及外显子上3个SNP变异,其中两个SNP为非同义替换。相对于NILqknr6等位基因型,第一外显子上碱基C/T的替换,导致第7位的氨基酸由亮氨酸变成了苯丙氨酸,第三外显子上碱基C/T的替换,导致第70位氨基酸由亮氨酸转变成了缬氨酸,第三外显子219位碱基G/A为同义替换。KNR6的5'-UTR区域在NILqknr6中存在一个5054bp转座子插入。进一步分析5054bp的转座子序列,它包含3bp TTA碱基正向重复和14bp的反向重复序列,是在一个MITE转座子上插入了4926bp序列而形成的一个新的Harbinger-like转座子。
  2.近等基因系中KNR6甲基化水平与基因表达量
  Harbinger-like转座子的插入,导致KNR6核心启动子区CG、CHG及CHH类型的甲基化水平显著提高,且TE下游紧邻区域的CG的甲基化水平也显著提高,甲基化水平提高抑制KNR6在NILqknr6中的转录水平。105个玉米自交系和12个近等基因系幼穗表达量分析结果证实,KNR6的表达量与行粒数,穗长极显著正相关。KNR6在20个TE+(KNR6上存在Harbinger-like转座子插入)自交系材料平均表达量显著低于85个TE(KNR6上不存在Harbinger-like转座子插入)自交系材料。
  3.KNR6功能分析
  以玉米自交系A188为转化受体,获得了2个独立的RNAi转化事件,2个超表达转化事件。表型鉴定结果表明,相对于阴性对照植株,RNAi转化家系中,阳性植株穗长平均缩短1.35±0.11cm(p=2.05×10-14),行粒数平均降低2.85±0.22粒(p=1.37×10-25),花期平均提前2.3±0.11d(p=1.32×10-9)。KNR6超表达家系中,阳性植株穗长平均增加1.1±0.26cm(p=3.53×10-15),每行粒数增加2.5±0.15粒(p=1.85×10-28),花期推迟3.1±0.35d(p=2.42×10-21)。
  4.KNR6的关联分析
  在224个不同的自交系材料中,KNR6共存在93个最小等位基因频率大于0.05的多态性位点,其中有56个位点与行粒数,穗长变异显著关联,包括编码区的一个非同义突变(L7F,p=3.62×10-4)。与TE-PAV(Harbinger-like转座子存在缺失的变异)在一个连锁不平衡区域(r2≥0.97)的50个变异位点与行粒数相关性最强(p=8.81×10-5)。
  5.KNR6等位基因在的育种应用价值上的评价
  利用NILqknr6和NILqKNR6分别与11个TE+自交系和10个TE自交系杂交,构建42个杂交组合。在不同的自交系遗传背景下,与NILqKNR6杂交获得的F1杂交种的穗长较长,行粒数较多,表明KNR6可以用于杂交种穗长和行粒数的遗传改良,进而提高杂交种的籽粒产量。进一步地利用KNR6TE-等位基因对郑单958的两个亲本(郑58和昌7-2)进行MAS改良,改良后的郑58和昌7-2在穗长和行粒数上都有所增加,且生育期不同程度的推迟。小区测产数据表明,Zheng58qKNR6×Chang7-2qKNR6的籽粒产量为13.3T/ha,显著高于Zheng58×Chang7-2的12.6T/ha(p=4.12×10-5),产量提高约5.6%,这些结果说明KNR6可以用来提高杂交种的行粒数,进而提高杂交种的籽粒产量。
  6.KNR6TE+位基因的起源与KNR6驯化选择分析
  对43个大刍草材料,275个玉米自交系(包括214个温带材料,61个热带材料),24个地方品种材料进行重测序。通过核苷酸多样性分析,KNR6的5'-UTR内含子区域(TE-PAV)在驯化中受到了强烈的选择。地方品种中的Harbinger-like转座子起源于玉米祖先种大刍草的MITE,MITE在驯化过程中插入了一个大的片段序列形成一个新的DNA转座子,进而传递到玉米自交系中并在温带玉米材料中得以富集。
  总之,KNR6调控行粒数,穗长和生育期。该基因编码丝氨酸苏氨酸类受体蛋白激酶。位于KNR65'-UTR非翻译区的Harbinger-like转座子存在缺失的变异是KNR6功能变异的重要位点。它显著影响玉米的产量并对生育期有相对较弱的影响,Harbinger-like转座子提高了其两侧DNA的甲基化水平进而抑制了KNR6的表达,它起源于大刍草的Mexicana亚群,是一个微型反转座子插入了编码HARBI1转座酶的序列而来。
[博士论文] 任雪梅
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:玉米籽粒相关性状是复杂的数量性状,籽粒的发育决定籽粒大小及灌浆充实,影响玉米产量。目前,已克隆了很多影响玉米籽粒发育的基因,但籽粒发育的调控机制仍不是十分清楚。因此,玉米籽粒发育相关基因的克隆对解析玉米籽粒发育的分子机制具有重要意义。本课题组克隆并鉴定影响玉米籽粒发育的PPR及mTERF两个家族的新成员,分别为Emp11及ZmSmk3,通过分子生物学实验证实其功能,获得主要结果如下:
  1.籽粒发育基因Emp11的克隆及功能分析
  emp11-1纯合突变籽粒早期发育停滞,胚乳基部转运层发育异常,籽粒淀粉粒积累降低,成熟后空瘪、皱缩。该突变性状受单隐性核基因控制,通过等位突变及RNAi遗传转化进一步证明Emp11的突变导致缺陷籽粒的产生。Emp11为组成型表达基因,在雌穗、子房、胚(尤其是SAM)胚乳糊粉层及BETL中的表达量较高。该基因编码一个靶向线粒体的P型PPR蛋白,突变后导致线粒体基因nad1四个内含子都不能被正常剪切加工,线粒体复合体Ⅰ组装受阻、活性降低,线粒体形态结构缺陷,从而影响了正常的能量供应,交替氧化酶途径作为能量的补偿机制被激活,能量的供应不足最终导致缺陷籽粒的产生。
  2.籽粒发育基因ZmSmk3的克隆及功能分析
  Zmsmk3为单隐性核基因控制的突变材料,ZmSmk3启动子区转座子的插入导致籽粒变小。ZmSmk3在所有被检测的组织中都有表达,表达量相对较高的组织为:茎、雌穗、子房、胚和胚乳基部转运层。该基因编码一个含有2个mTERF重复结构域的mTERF蛋白,定位于线粒体,突变后导致线粒体基因nad4第一个内含子及nad1第四个内含子都不能被正常剪切,且突变体籽粒中部分线粒体结构存在缺陷,嵴的形态排布松散,影响复合体Ⅰ的积累量及活性,导致交替氧化酶途径被激活,暂时供应种子发育所需能量。野生型和突变体中差异表达基因主要在营养物质贮存相关分类中富集,淀粉合成及醇溶蛋白相关的基因在突变体中都下调表达,且该基因可能参与逆境胁迫响应。
[硕士论文] 王凯
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻是我国重要的粮食作物,随着全球高温天气的频繁发生,高温热害已成为威胁水稻产量和品质的重要因素,培育耐高温的水稻品种成为目前主要的育种目标。本研究通过对水稻灌浆期进行高温胁迫处理,挖掘水稻灌浆期耐热性的相关位点,探究其遗传效应。此外还对水稻主要农艺性状及稻米品质性状进行了QTL定位分析,寻找控制水稻产量及品质的新位点,为提高水稻产量及品质提供理论依据。本文利用由ZS97B/IRAT109构建的133份RILs群体及其遗传连锁图谱,以完备区间作图法对灌浆期耐热性(采用相对耐热指数RHI为指标)、主要农艺性状(包括播始历期DSF,株高PH,有效穗数EPN,穗长PL,穗着粒密度SD,结实率SSR,千粒重TGW,单株产量YP,每穗颖花数SP和每穗实粒数GP)、稻米品质性状(包括糙米率BR,精米率MR,整精米率HR,垩白粒率CGR,垩白度CD,粒型GS,糊化温度GT,胶稠度GC和直链淀粉含量AC)的相关位点进行QTL定位分析,主要研究结果如下:
  1、本研究利用315个分子标记(包括191个InDel标记,124个SSR标记)构建整合了水稻的遗传图谱,图谱全长3051.09cM,两个标记之间的平均图距是9.69cM。
  2、在RILs群体中共定位到2个与灌浆期耐热性相关的QTLs位点,分布在7、9染色体上。其中qRHI7-1位于MRG7006-PWK16076之间,其LOD值为2.54,对表型的贡献率为10.69%,加性效应为-4.41,有利基因来自于母本ZS97B;qRHI9-1位于YY018-YY194之间,其LOD值为2.4,对表型的贡献率为9.01%,加性效应为4.04,有利基因来自于父本IRAT109。此外还定位出4对具有上位效应的QTLs,对表型的贡献率均在20%左右,说明水稻灌浆期耐热性不但受到主效多基因控制,还受到非等位基因间的上位性互作调控。
  3、在RILs群体中,两年中共检测到37个与主要农艺性状相关的QTLs位点。其中控制DSF的位点4个,控制PH的位点6个,控制EPN的位点3个,控制PL的位点5个,控制SD的位点2个,控制SSR的位点4个,控制TGW的位点1个,控制YP的位点4个,控制GP的位点5个,控制SP的位点3个。其中qDSF7-1,qPH3-1,qSSR3-2,qTGW1-1两年中被重复检测到,说明这4个QTLs位点在各环境中表达比较稳定,遗传力较高。本文中定位到的主要农艺性状的QTLs位点在前人研究中大部分已经被定位到,如qDSF7-1,qPH6-1,qEPN7-1,qPL4-1,qTGW1-1等。此外,本文中还定位到一些新的QTLs位点,分别是qDSF3-1,qPH1-1,qEPN9-1,qPL11-1等,可做进一步的研究。
  4、在RILs群体中,共定位到15个与品质相关的QTLs位点,控制BR的位点1个,控制HR的位点1个,控制GS位点3个,控制CGR的位点2个,控制CD的位点1个,控制GT的位点3个、控制GC的位点2个,控制AC的位点2个。其中在Chr6上检测到多个与蒸煮食用品质相关的QTLs位点,并且位点之间紧密连锁。在YY127标记附近定位到的qAC6-1,qAC6-2,qGC6-1,qGT6-1对表型的贡献率值很大,其中控制直连淀粉含量的两个位点贡献率超过80%,这与前人在附近定位到的waxy基因吻合。
[硕士论文] 万谦千
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:杂交水稻的杂种优势源于双亲之间存在的遗传差异,利用亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间远缘杂交后代选育基因渗入系为亲本选配部分种间杂交稻组合,能够丰富亲本的遗传基础,扩大双亲间的遗传差异,是超级杂交稻高产育种有希望的新途径。
  本试验以8个非洲栽培稻基因渗入恢复系和10个不同类型的水稻恢复系为父本材料,4个细胞质雄性不育系作为母本材料,应用4×18不完全双列杂交(NCⅡ)得到72个F1,通过田间试验综合考察了22个亲本材料及72个F1杂交组合的播始历期、株高、剑叶长、穗长、单株有效穗、每穗粒数、结实率、千粒重和单株产量9个农艺性状的中亲优势和配合力表现;筛选出具有较强产量优势的杂交稻新组合;基于表型性状对4个母本及18个父本材料进行了遗传多样性分析。主要研究结果如下:
  1.对72个F1的杂种优势研究结果表明,绝大部分组合在除了结实率外,株高、剑叶长、穗长、单株有效穗、每穗颖花数、播始历期、千粒重和单株产量均表现为正向中亲优势,其所占总组合的比例分别69.17%、68.06%、95.83%、70.83%、98.61%、70.83%、69.17%和81.94%。以丰两优香1号为对照分析了72个组合杂种一代的竞争优势,结果表明,在剑叶长、穗长和每穗颖花数3个产量相关农艺性状上表现正向竞争优势组合占总组合的比例分别为52.67%、54.17%和77.78%;说明与丰两优香1号相比,绝部分组合表现为具有较长的剑叶和穗大粒多。
  2.对22个亲本材料的GCA分析表明,4个母本材料单株产量的GCA排列顺序为:C1>C4>C3>C2;18个父本材料单株产量GCA排列顺序为:Q3>Q7>Q13>Q12>Q8>Q1>Q18>Q5>Q10>Q4>Q17>Q14>Q9>Q15>Qll>Q16>Q6>Q2。其中非洲栽培稻基因渗入系Q7、Q13和Q12的单株产量GCA值居2-4位,表明非洲栽培稻基因渗入系的产量性状一般配合力较高。
  3.相关性分析表明,9个产量相关农艺性状的中亲优势与F1杂交组合SCA、父本材料GCA、母本材料GCA、双亲材料GCA之和、SCA+GCA的相关性达到显著或极显著水平,其中株高SCA及SCA与GCA之和、结实率SCA+GCA、单株产量SCA及SCA+GCA与中亲优势的相关性均达到极显著水平,能够用来预测中亲优势。
  4.对72个F1进行综合筛选,获得5个高产杂交新组合,分别为C4×Q13、C1×Q18、C4×Q3、C4×Q4,C1×Q125个组合的单株产量均高于丰两优香1号,具有竞争优势,其中部分种间杂交稻组合C4×Q13的竞争优势达37.85%。
  5.利用表型性状进行遗传多样性研究,得到的UMPGA聚类图与亲本材料的遗传系谱大致相符。表明基于表型性状的的遗传多样性分析能够较好的反映亲本之间的遗传差异。
[硕士论文] 牛国卿
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着全球变暖已对生态环境和降水分布等造成严重影响,干旱危害加剧。干旱已成为全球粮食安全的重要威胁。水稻(Oryza sativa L.)是全球半数以上人口的主食。培育节水抗旱稻是解决严峻的生产环境与日益增长的水稻产量需求之间矛盾的重要途径之一。根系是水稻最重要的器官之一,直接影响水稻的许多地上性状和抗逆性,根系研究是水稻抗旱性研究的重要方向。在水稻根系分布中,深根越多其避旱性越强,定位克隆控制水稻深根比的基因,有助于研究抗旱机制,丰富抗旱相关基因信息。
  本实验室利用重组自交系群体(来源于组合:珍汕97/IRAT109)定位到了6个控制水稻深根比的主效QTLs,并对位于第7号染色体上的qRDR-7进行了初步精细定位,发现该QTL并未定位在初定位的RM478-RM134区间内,而是位于RM478的另一侧。在此基础上,本课题对qRDR-7做了进一步的精细定位研究。结果如下。
  1.qRDR-7定位区间内多态性分子标记筛选:根据qRDR-7定位于RM478(25.9Mb)一侧的实验结果和亲本的基因组重测序信息,在25Mb-26Mb区间内预测了217个InDel标记,对其中间隔均匀的60个进行多态性验证,从中挑选了12对多态性标记用于精细定位。
  2.重组交换单株筛选及重要交换位置确定:将qRDR-7为杂合的近等基因系BC4F3发展成一个7000株的群体。用筛选出来的多态性标记检测随机小群体重组交换的发生位点,发现重组交换位点全部位于R7Q89-RM478,认为qRDR-7位于R7Q89-RM478区间内,用R7Q89和RM478标记共筛选得到74株重组交换单株。利用qRDR-7定位区间内的12个多态性标记检测到10个交换位置,覆盖了整个目标区间。
  3.qRDR-7精细定位:从74个重组单株中选取11个具有不同重组交换位置的重组交换单株的F4家系,每个家系选取60株健壮幼苗采用“篮子法”进行深根比表型检测,结合每个单株的深根比及其qRDR-7基因型,推测,qRDR-7位于R7Q89-R7Q106区间或R7Q106-R7Q146区间。为了进一步确定QTL区间,选取5个家系使用篮子水培法对上述两个区段进行了确认。在幼苗期首先用发生交换位置两侧的标记检测其基因型,在每个家系中挑选2种亲本基因型的幼苗各6株进行深根比测定。结果表明,qRDR-7定位于R7Q133-R7Q146区间,大小为58kb。
  4.基于表达量的候选基因筛选:在R7Q133-R7Q146区间有7个编码基因:LOC_Os07g42600,LOC_Os07g42610,LOC_Os07g42620,LOC_Os07g42626,LOC_Os07g42632,LOC_Os07g42640,LOC_Os07g42650。用珍汕97和IRAT109两亲本的根尖提取出RNA,进行荧光定量分析,检测基因在不同亲本根尖组织的表达量差异。
[硕士论文] 丁丹
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物在遭受病虫害等生物胁迫时,外界的胁迫信号可以通过信号传导途径传递到植物细胞内,激活抗逆相关基因的表达。MAPK蛋白激酶广泛参与植物对胁迫信号的传递,是调控植物抗性的关键基因。
  近年来,随着CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated Protein)系统的快速发展,该技术被广泛应用于生物学研究和应用中。而在基因组编辑的实践中,gRNA的表达是CRISPR技术的难点之一。
  为了构建更加高效的CRISPR载体用于作物的抗病等研究,我们创建了一种新的方法来表达CRISPR/Cas9技术所需的gRNA和Cas9两个元件。本研究验证了该方法能够高效率的同时编辑多个水稻基因,并获得了抗病相关基因的靶向突变材料,取得的主要结果如下。
  (1)序列分析结果表明,本实验室前期构建CRISPR载体所用的水稻UBllO(Ubiquitin10)基因的启动子的5'-UTR(untranslated region)包含了一个内含子,该内含子具有典型的5'-GU-A-AG-3'的剪接序列。通过改造UBllO基因的启动子,构建了pRGEB33和pRGEB34用于表达含tRNA-gRNA内含子(intronic polycistron of tRNA-gRNA,inPTG)和Cas9的融合基因(inPTG-Cas9)。
  (2)水稻原生质体的实验结果表明,将串联polycistronic tRNA-gRNA(PTG)的片段克隆到Cas9的内含子时对蛋白表达有一定影响,但对内含子的正常剪接无影响。
  (3)通过对三个MAPK(Mitogen-activated protein kinase)基因和PDS(phytoene desaturase)基因进行靶向突变实验表明,inPTG-Cas9载体能高效率的靶向编辑2-4个位点。
  (4)为了测试内含子的位置对编辑效率的影响,本研究构建了内含子位于3'-UTR的inPTG和Cas9融合表达的载体。水稻原生质体中的实验结果表明,与5'-UTR比较,3'-UTR表达inPTG能提高编辑效率。
  (5)通过农杆菌转化获得inPTG-Cas9稳定转化植株,结果表明,inPTG-Cas9载体能高效率地同时编辑多个靶位点,而且这些突变均能遗传到T1代。
  (6)通过mPTG-Cas9技术,获得了MPK1、MPK5和PDS的单基因突变材料,以及MPK1和MPK5双基因的突变材料。对所获得的MAPK功能敲除材料进行稻瘟菌接种实验和根结线虫侵染实验。结果表明,MPK1和MPK5功能敲除的基因编辑水稻的抗病性下降。
  综上所述,本研究开发了一种新型的内含子表达CRISPR技术所需gRNA的技术,利用该技术可把Cas9和多个gRNA用一个融合基因表达。在开发CRISPR技术的过程中,本研究还获得了两个MAPK基因的靶向编辑的水稻,并初步分析了这两个材料的抗性。MAPK是植物抗病信号通路以及抗逆、激素、发育等信号通路的调控枢纽,因此这些材料也有助于进一步阐明抗病与其他信号通路交互作用的机制。
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