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[硕士论文] 张沛
水利工程 重庆交通大学 2018(学位年度)
摘要:呼伦贝尔地区是全球/区域变化的典型敏感地区,以温度增加和降水波动为特征的全球气候变化对呼伦贝尔地区的影响是显著的,近年来呼伦贝尔地区植被退化、沙漠化加速发展,草原生态系统遭到严重破坏。为了揭示呼伦贝尔地区水热条件时空变化特征及其生态效应影响,本文结合6期1990-2015年呼伦贝尔地区更新水体数据后的土地利用分类数据,利用土地利用转移矩阵和景观格局指数分析方法对1990-2015年呼伦贝尔地区土地利用/覆被和地表水体(含地表水体二级类)的面积动态变化特征、转移规律和景观格局特征进行了研究。然后利用呼伦贝尔地区内9个气象站1990~2015年逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温、平均气温距平、日照时数等热量资料,通过在ArcGIS中采用Kriging空间插值法得到区域的热量资料,以探求热量在时间序列上的年际变化特征,并按照年代将数据空间化,求取前后期热量在空间上的变化特征。最后选择植被覆盖指数作为呼伦贝尔草地生态系统的指示因子,分析水热条件时空动态变化与植被覆盖指数的联系,以探求水热条件时空动态变化的生态效应。研究发现:
  (1)由1990-2015年呼伦贝尔地区各土地利用/覆被类型的面积变化特征可知,呼伦贝尔地区的土地利用/覆被变化存在以耕地和居民地等人类活动为主的人为景观增多,以林地和草地等自然覆被为主的自然景观减少的客观形状。在呼伦贝尔地区土地利用/覆被变化的影响下,1990-2015年呼伦贝尔地区的地表水体面积呈现先增后减再增的整体趋势,在1995年达到最大值46759km2,25年间面积从1990年的3377km2增加到2015年的3451km2,共增加74km2。在各地表水体二级分类中,河渠、湖泊和滩地面积在25年内都呈先增后减再趋于稳定的变化趋势,而水库面积在1990-2005年保持稳定状态,从2005年以后呈增加趋势。
  (2)从1990-2015年呼伦贝尔地区地表水体的时空转移分析,与地表水体转移的一级土地利用类型主要为草地、林地、沼泽和未利用地,25年间,地表水体在与其他土地利用/覆被类型的转移上共净增加74km2,从局部变化期来看,1990-2000年,地表水体与其他土地类型发生转移较频繁,2000-2015年地表水体与其他土地类型发生转移较少。对1990-2015年呼伦贝尔地区地表二级类水体的时空转移分析,研究区各地表二级类水体转移趋势与总地表水体的转移趋势较为一致,同样是与草地、林地、沼泽和未利用地的转化较多,与耕地的转化相对较少,与居民地的转化最少。另外,地表二级类水体中各类之间的转化以河渠和滩地与其它地表水体二级类的转化较为剧烈。
  (3)1990-2015年呼伦贝尔地区的景观格局呈现出简单到复杂的变化过程。研究区的景观格局有微弱的倾向于复杂和不连续的斑块镶嵌体的变化趋势,研究区的优势景观占景观的比例趋于减小,且景观有被分割成不连续斑块的倾向,研究区的各土地利用/覆被类型越来越趋于均衡,弱势土地利用/覆被类型的占比有所增加。其中地表水体25年间呼伦贝尔地区地表水体破碎度数值较小,并保持稳定趋势,说明整体水体景观保存较好,连通性高,湖泊、水库等水体景观趋向于成为一个完整的整体,河渠则被分割成不连接斑块的程度越大。
  (4)由1990-2015年呼伦贝尔地区逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温年际变化特征可知,25年间,年均温、年平均最低气温和年平均最高气温变化趋势较为一致,均呈先增加后减小再增加的波动变化趋势。25年间日照时数整体趋势呈较小的减少趋向。1990-2015年间,呼伦贝尔地区平均温度距平只有2010年、2012年、2013年小于零,其它22年均大于零,说明呼伦贝尔地区在近25年内年平均气温高于多年平均气温,气温上升趋势明显。由1990-2015年呼伦贝尔地区年均温空间变化特征可见,呼伦贝尔大部分地区处于增温趋势,但增温趋势较小,处于0-1℃,这与之前得出的呼伦贝尔地区气温进入变暖趋缓的阶段的结论一致。
  (5)利用呼伦贝尔地区9个气象站点的气温和降水资料分别从年际、季候、生长季月变化角度分析该地区植被指数对水热条件时空变化的响应,研究发现降水变化是促使草地植被年际变化的主要因子,从季候水平来看,草地植被指数在不同季节对水热条件变化的敏感性不同,春季植被生长与气温关系密切,夏季草地植被生长受降水强度影响较大;从生长季月变化来看,5月份植被指数变化受气温变化影响较大,6月和7月植被指数变化受降水影响显著,植被生长对7月和8月降水变化具有一定的滞后性。
[博士论文] 曾哲
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:冠状病毒对人类和动物健康造成了严重的危害。2010年以来,猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)对我国经济造成了巨大的损失,随后PEDV变异株引起的猪流行性腹泻在我国持续发生,然而截止目前我国湖北地区的PEDV变异情况和流行病学尚未完全阐明,同时新出现的猪δ冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)与PEDV共同感染的情况时常发生。深入研究冠状病毒的复制机制对疫病的防控具有重要的指导意义。冠状病毒非结构蛋白9(nsp9)是病毒复制复合体的重要组成部分,参与病毒RNA的结合,对病毒复制起到重要作用,是抗病毒药物的潜在靶点。本文首先对2016年湖北省PEDV的流行病学情况进行了研究,然后以PDCoV为模型,对nsp9的结构和功能进行了深入研究,具体内容如下:
  1.通过对省内34家猪场收集的172份各类样品,系统分析了PEDV S基因的遗传演变规律,阐明了2016年湖北省PEDV的分子流行病学情况。首先针对PEDV nucleocapsid(N)基因进行了检测,74份样品确定为PEDV阳性,随后对所有阳性样品的spike(S)基因全长进行了测序,通过序列分析获得了21种有不同氨基酸序列的S基因。据此分析得到湖北省内的PEDV基因型具有多样性,除了经典的Ⅰ型和Ⅱ型,同时还存在INDEL型。此外,在本研究中的所有S基因序列上还发现了58个氨基酸突变位点,其中44个位于S1基因,14个位于S2基因。结果表明多种基因型PEDV毒株共存和病毒快速变异的情况是导致我省猪流行性腹泻疫情发生的重要原因之一。我省复杂的PEDV分子流行病学情况是对评估传统PEDV疫苗保护力的挑战,迫切需要研发新的疫苗来应对不断出现的新变异毒株,并制定系统的防控措施,才能更有效的预防和控制地方性的PEDV引发的疫情。
  2.解析了PDCoV nsp9的晶体结构和进行了PDCoV nsp9的生化功能研究,阐明了冠状病毒nsp9二聚体形成和核酸结合的分子机制。在表达纯化了PDCoVnsp9蛋白后,筛选获得高分辨率的蛋白晶体,并解析了其三维结构。PDCoVnsp9单体由1个α-helix和7个β-strand组成。发现PDCoVnsp9氨基端的电子云密度比其它冠状病毒nsp9的更清晰,并参与了二聚体形成,我们将氨基端这个区域命名为N-finger。通过对二聚体界面的分析发现,N-finger上的Leu4和Arg7分别与Arg70和Ser103形成了两个氢键,同时在α-helix的疏水性相互作用下共同形成二聚体。通过分子体积排除色谱法(Size-exclusion chromatography,SEC)和分析型超速离心(Analytical Ultracentrifuge,AUC)实验证实了当PDCoV nsp9缺失N-finger时,其突变蛋白在溶液中完全成为单体。如果同时对N-finger上的Leu4、Leu6、Arg7和Asn8同时突变,突变蛋白在溶液中的单体形式含量上升。在与核酸结合的分子机制上,首先验证了α-helix上的Gly对核酸的亲和力也有很大的影响,这一特点与其它冠状病毒nsp9是一致的。在针对N-finger的进一步研究中,通过凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和微量热泳动(Microscale thermophoresis,MST)实验揭示了当PDCoVnsp9缺少N-finger时,结合核酸的能力下降。并进一步发现当对N-finger上Arg7突变后,核酸的亲和力也会减小。结合以上研究,我们首次发现N-finger在PDCoVnsp9的二聚体形成过程中起到了重要作用,并且N-finger也影响PDCoVnsp9的核酸结合能力。冠状病毒nsp9二聚体与核酸的亲和力高于单体更有利于发挥其生物学功能并帮助病毒复制。
  综上所述,系统分析了2016年湖北省的PEDV的分子流行病学情况,揭示了PEDV S基因的遗传演变规律,为流行性腹泻疫苗的防控提供了指导;解析了PDCoV nsp9的晶体结构,阐明了冠状病毒nsp9的二聚体形成机制和核酸结合特性,揭示冠状病毒的复制机理和为抗病毒药物的研究提供了理论基础。
[硕士论文] 闫科技
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病毒是一种致死性的神经嗜性病原微生物,由于其很高的致死率以及目前缺乏很好的防治方法,对人类和相关宿主动物的健康造成了巨大的威胁,也因此成为了病原学中一个很重要的研究对象。另一方面因其具有对神经元的特殊嗜性以及在神经元内生存和复制的能力,狂犬病毒被开发成为了一种用来神经环路示踪和标记的有力工具,相对于传统的神经环路示踪工具有着天然优势,在神经科学的研究中具有巨大的应用价值和开发潜力。单细胞测序技术作为近几年发展起来的新型技术,凭借其独有的优势为现代生物学的发展起到了巨大的推动作用,通过对单个细胞组学相关信息的分析实现在细胞和分子层析探索相关生物学过程以及复杂组织的结构和功能的解析,在发育、癌症以及神经科学等研究领域具有不可替代的应用潜力。
  大脑,作为目前动物体中结构和功能最复杂的器官,已成为现在生命科学和医学研究领域最热门也最有挑战性的领域,对其深入的研究和探索对理解大脑运行机制以及对相关脑疾病的防治提供理论意义和指导作用。而对于大脑奥秘的揭示,最重要的一步是对其中数量庞大而又错综复杂神经环路结构和功能的解析。
  于是,基于以上相关技术和科学背景,本课题主要的目的是利用狂犬病毒对特异神经环路进行示踪和标记,描绘对应神经环路的结构基础,同时结合单细胞测序技术对标记的特异神经环路上的神经元进行单细胞水平上的转录组分析,分析对应神经环路的功能基础。从而实现对特定神经环路结构和功能的解析,为进一步深入探索神经环路的调节机制以及在受到外界病原入侵时如何变化提供科学基础和研究思路。本课题的研究内容主要分为以下几个方面:
  1.片段化酶Tn5的纯化和应用
  Tn5是来源于大肠杆菌中一种转座酶,由于其在体外可以转座以及对DNA片段进行切割和连接接头的能力被开发为二代测序文库构建时用于片段化和接头化的工具酶,并在单细胞测序文库构建中具有很广泛的应用价值。在该课题中,我们首先对其进行了表达、纯化和组装。其次对其进行了活性检测,验证了Tn5具有DNA片段化和加接头的能力。最后我们经过不断优化反应条件将其成功应用到单细胞转录组测序Smart-seq2建库方法中,节省建库成本的同时又可以进行特殊功能应用的扩展。
  2.Smart-seq2技术在培养细胞和特异神经环路神经元上的应用
  Smart-seq2技术是目前最常用的单细胞RNA-seq技术,我们首先通过不断地尝试和摸索将其应用到培养的细胞上,做到了个位数细胞起始量的转录组扩增。然后结合狂犬病毒对特异神经环路神经元的标记和分离技术,将其应用到特异神经环路神经元上,完成了对神经环路单个神经元转录组的建库测序和数据分析,从而实现对感兴趣的特定神经环路结构的解析和功能的探索。
  3.PVN-LHA神经环路的标记和初步探索
  PVN是下丘脑中具有调节机体相关自主性的生理功能作用的神经核团,PVN-LHA神经环路对于机体饮食的调节起着直接的影响,对其深入的研究可以理解大脑对饮食行为的调节机制以及在受到病原入侵时的响应。本课题中,我们首先利用GFP重组的狂犬病毒对PVN-LHA环路进行了标记,然后对在PVN处标记的神经元进行了单细胞转录组测序实验。我们分析了这些神经元的基因表达谱,并对神经元类型和功能相关的基因表达情况做了免疫组化方面的验证,为进一步深入研究提供了数据基础。
  总体而言,本课题结合狂犬病毒对特异神经环路的示踪标记技术和单细胞RNA-seq技术,实现了在特定神经环路上神经元单细胞转录组分析技术的建立,并将其应用到PVN-LHA神经环路,初步鉴定了该环路PVN处神经元的类型和功能,为进一步研究此环路提供了一定的技术,而且这两种技术的结合为神经科学相关问题的研究提供了一定的技术基础和研究思路。
[硕士论文] 常沛玺
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的猪病原体,它能够引起猪的多种疾病包括脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎,甚至导致死亡。在猪链球菌33个血清型中,猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)是临床分离最多的、毒力最强的病原菌,在给世界的养猪业带来了巨大的经济损失的同时,也能通过患病的动物或者污染的生猪肉副产品感染人类,威胁人类健康,严重的可引起人死亡。双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)广泛存在于细菌中,调节各种重要的细菌生理和代谢过程,在细菌的毒力和致病性方面发挥重要作用,但是对于猪链球菌中参与逃避天然免疫反应的双组分调控系统尚不清楚。
  本实验室已有△TCS2(△bceRS)、△TCS3(△nisKR)、△TCS4(△salKR)、△TCS5(△ciaRH)、△TCS6(△vicK)、△TCS8(△ihk/rr)、△TCS11(△1910KR)等双组分基因缺失株。本课题利用同源重组构建了△TCS1(△vraSR)、△TCS7(△SC84_1438hk/1439rr)、△TCS9(△SC84_1523hk/1522rr)、△TCS10(△covR)、△TCS12(△SC84_1840rr)、△TCS13(△revS)、△TCS14(△SC84_1925rr)、△TCS15(△virSR)等双组分基因缺失株,并用PCR内外部引物验证成功获得15个双组分基因缺失突变株。通过猪链球菌2型野生株SC19与天然免疫细胞互作以及猪链球菌2型15个双组分基因缺失突变株在人全血中的存活能力比较,筛选出了1个重要的双组分调控系统VraSR,并探究了其在帮助猪链球菌2型逃避宿主免疫过程中发挥的作用以及毒力功能的作用。主要结果如下:
  1.15个双组分系统基因缺失突变株在人全血中存活能力的比较
  将猪链球菌和人血互作,并在1h、2h、3h分别收集样品计数,与初始菌量比较计算存活率。结果表明,野生株和15个突变株均在人全血中呈现不断增殖的趋势。但是与野生株相比较,其中△vraSR和△ihk/rr增殖能力明显下降。
  2.猪链球菌2型感染人中性粒细胞后双组分调控蛋白的表达变化
  将猪链球菌2型野生株与人中性粒细胞互作3h,收集样品提取细菌总RNA,检测15个反应调控蛋白表达水平。结果表明,与未经中性粒细胞刺激的对照组相比,vraR(SC84_0373),ciaR,SC84_1224,SC84_1439和SC84_1522基因上调明显。
  3.VraSR在天然免疫反应中的作用
  筛选出了双组分调控系统VraSR,进一步通过中性粒细胞杀菌验证野生株SC19、△vraSR、C△vraSR对免疫细胞的抵抗能力。结果证实了缺失了VraSR后,猪链球菌在中性粒细胞中存活能力明显下降。随后采用流式细胞术检测中性粒细胞对野生株SC19、△vraSR、C△vraSR的吞噬,体外模拟吞噬后的杀菌途径:氧化杀伤(H2O2)和非氧化杀伤(溶菌酶),均表明了缺失VraSR后,猪链球菌抵抗能力明显减弱。
  4.VraSR参与调控猪链球菌荚合成和细胞黏附
  荚膜的厚度影响着中性粒细胞对猪链球菌的吞噬,我们通过透射电镜检测了SC19、△vraSR、C△vraSR的荚膜变化,并比较了唾液酸水平的差异和荚膜合成相关基因的表达差异。结果表明,缺失VraSR后,猪链球菌荚膜变薄。此结果与△vraSR黏附HBMEC细胞能力下降相悖,进一步通过qPCR发现缺失株体内与细胞黏附相关基因下调明显,表明双组分调控系统VraSR调控细胞黏附相关基因表达作用大于调控荚膜合成相关基因作用。
  5.VraSR基因缺失株对致病性和炎症反应的影响
  以BALB/c小鼠为模型,存活曲线和组织载菌量表明,双组分调控基因VraSR缺失后小鼠死亡率明显降低,猪链球菌更容易被机体清除。在感染初期,突变株和野生株引起的炎症因子表达水平无差异;在感染后期,突变株所引起的炎症反应明显低于野生株。
[硕士论文] 邹丹阳
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪腹股沟/阴囊疝是一种常见的影响养猪业经济效益的发育异常疾病,主要发生在鞘状突和腹股沟管的薄弱部位。该病是由遗传和环境因素共同作用产生的,但目前对影响猪腹股沟/阴囊疝的遗传机制却知之甚少。本研究利用实验室前期对120头猪只个体(59头患病个体和61头健康个体)进行特异性位点扩增片段测序(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing,SLAF-seq)的结果进行全基因组关联分析,并对猪腹股沟/阴囊疝的易感基因进行筛选和功能验证。主要研究结果如下:
  1.将120个样本分成三个群体(group1:患病个体与健康个体;group2:患病大约克猪,健康大约克猪,患病长白猪,健康长白猪患病杂交猪和健康杂交猪;group3:患病法系猪,健康法系猪,患病美系猪与健康美系猪),利用FarmCPU(fixed and random model Circulating Probability Unification)模型进行全基因组关联分析,选择两种不同的阈值对关联结果进行筛选。当筛选阈值为系统默认值p.threshold=0.01/标记数时,共鉴定到21个与腹股沟/阴囊疝显著关联的SNPs(P<0.01),定位了9个易感基因(AUH,TMPRSS3,UBASH3A,PTPN20B,VWA3B,NOL10,TENM3,PLCG2和NUAK1);当筛选阈值为推荐值p.threshold=1E-05时,共鉴定到6个新的与腹股沟/阴囊疝显著关联的SNPs(P<0.01),定位了3个新的易感基因(DEGS1,MEPE和PRKCE)。上述结果均经过QQ图检验假阳性程度,发现统计结果与预测值拟合良好,关联结果可靠。
  2.针对筛选出的5个与细胞凋亡相关基因(DEGS1,PLCG2,PRKCE,NUAK1和TENM3)进行扩大群体验证。结果发现,在总群体和法系大约克猪中,PRKCE基因多态位点的基因型和等位基因频率在患病、正常两组中的分布差异显著(P<0.05);在所有群体中,DEGS1基因多态位点的等位基因频率以及基因型频率的分布与阴囊疝的发生并没有显著的关联(P>0.05);在法系群体和法系长白群体中,NUAK1基因多态位点的基因型的分布差异显著(P<0.05);在总群体中,PLCG2基因多态位点的基因型的分布差异显著(P<0.05);在法系群体、法系长白群体和多元杂交群体中,TENM3基因多态位点的基因型分布差异显著(P<0.05),而且在总群体和美系群体中,该基因多态位点的基因型分布差异极显著(P<0.01)。
  3.根据转录因子预测结果,选择TENM3基因作为腹股沟/阴囊疝候选基因进行初步功能研究。利用NNPP网站在线预测TENM3基因可能的核心启动子区域,与pGL3-Basic构建重组载体,通过双荧光活性检测发现TENM3-2片段的荧光活性最高(P<0.01),将其定义为TENM3基因的核心启动子区域。构建包含核心启动子TENM3-2和不同基因型(G/T)内含子片段的重组pGL3-Basic载体,双荧光素酶活性检测发现pGL3-P2-G的荧光活性显著高于pGL3-P2-T(P<0.05)。干扰预测的可能与目标SNP位点结合的转录因子RUNX2后,细胞晚期凋亡数量未发生显著变化(P>0.05),但TENM3的蛋白和mRNA水平均显著降低(P<0.05)。结果说明TENM3基因该SNP位点可以影响转录因子RUNX2的结合,且该转录因子可能具有抑制TENM3基因转录激活的作用。
[博士论文] MUJEEB UR REHMAN
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.cold是一种常见的食源性、条件性致病菌,一般人畜呈无症状感染,但在一定的条件下能够产生威胁人畜生命安全的并发症。反刍动物是致病性E.coli最重要的宿主之一。牦牛(Bos grunniens或Yak)是生活在青藏高原上特有的反刍动物,也是当地牧民主要肉食品来源。目前,由于药物的滥用,导致大肠杆菌耐药性不断产生,耐药基因不断被发现。因此,越来越多的专家指出研究和评估食用性动物(如牦牛)的抗菌耐药性(Antimicrobial resistance,AMR)和致病因子(Virulence factors)对于公共卫生安全非常重要。现在临床上关于细菌耐药性的监测还不够全面,对动物耐药研究还没形成完整的理论系统,并且关于青藏高原地区牦牛大肠杆菌耐药性报道也较少。因此,本研究开展对青藏高原地区牦牛大肠杆菌中致病基因、遗传谱系、血清型和抗生素抗性模式的研究,以期为青藏高原地区牦牛肉食品安全性评估提供理论依据。研究内容如下:
  1.青藏高原地区散养牦牛大肠埃希氏菌耐药性研究
  在我国散养牦牛中关于抗生素耐药性、血清型、遗传谱系和相关毒力特征的研究还未见详细的报道,为系统的研究青藏高原地区大肠杆菌耐药机制,本研究开展了青海地区腹泻牦牛中分离出来的大肠杆菌菌株的表型、基因型、毒力因子、遗传谱系和血清型的可能关联和分布,以及对未接触过抗生素的西藏地区半山区放牧的健康牦牛进行系统的研究。结果显示,在青海省腹泻的牦牛分离出的大肠杆菌菌株中,大多数菌株是多重耐药(97%),并且具有至少有一个毒力基因。而在西藏健康牦牛分离的488个大肠杆菌株中,其中大约31.1%的菌株具有多重耐药性。我们观察到10个毒力基因中,其中sfa在腹泻牦牛中最为常见(96.9%)。而且,OmpA(30.2%)和etrA(23.1%),blaCTX-M(27.6%)和blaTEM(14.4%)分别是西藏健康牦牛中主要流行的毒力基因和耐药基因。相关性分析显示在两个区域中一些抗性表型和毒力基因之间呈现显著的正相关(P<0.05,OR>1)。分离出来的大肠杆菌菌株主要属于遗传谱系A(Phylogroup A,接近70-80%)和血清型(Serogroups)O91和O145。重要的是,我们注意到阳性选择的印迹在青藏高原牦牛上通过各种最大似然模型推测广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamase,ESBL)产生的CTX-M基因中含有单核苷酸多肽(SNPs)基因型。研究结果表明,牦牛作为致病性E.coli拘宿主,携带多种致病基因和抗性表型。因此,临床医生和相关部门必须确保抗菌药物的规范使用,以避免这些微生物通过粪便传播给农场工人和食品加工者。
  2.食用型动物体内耐抗生素大肠杆菌整合子和相关基因盒的特性
  为进一步调查在散养健康动物群体中耐药性和毒力特性的分布情况,我们分别从中国散养的牦牛、仔猪和鸡体内分离出大肠杆菌耐药菌株,并研究了耐药菌株中整合子和ST131基因的出现频率,同时识别出隐藏在整合子基因中的基因盒。我们一共检测了432株至少表现出一种抗生素耐药性的大肠杆菌菌株,利用PCR分析、限制性片段长度多态性(Restriction fragment-length polymorphism)、DNA测序、接合实验、质粒分析和多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)等实验手段识别整合子基因及其相关基因盒。在432株耐药菌株中有29株(6.7%)扩增出了整合子基因。其中,含有1级整合子的有26株(6%),含有2级的有3株(0.7%)。同时,在6个可变区(Variable regions,VRs)内检测到6种不同的基因盒,分别是drfA1,drfA12,aadA1,aadA2,sat1和orfF。其中drfA1+aadA1组合是最常见的,在26个中有12个1级整合子(46.1%)发现了该类组合。另外,只有1个2级整合子包含1个基因盒,其余2个则还未确定VRs。值得注意的是,从散养健康动物群体内发现了17种序列类型(Sequence types,ST),其中6种可能是新型ST。最后的接合实验也证实有4种不同类型的1级整合子转移入受体菌株,其质粒大小在20kb到30kb之间。我们在超过6%的耐药大肠杆菌菌株中检测到了整合子和ST131基因。因此,需要采取一定预防措施来防止食用型动物群体中移动性耐药基因决定簇的扩散,并对其实施监控。
  3.牦牛源大肠杆菌菌株对小鼠致死性试验
  为了解从健康牦牛粪便中分离的大肠杆菌的致病性,采用皮下注射感染小鼠模型来观察具有不同血清型和遗传谱系的大肠杆菌分离株毒力及致病性。这些菌株分离自西藏地区较少使用抗生素的健康牦牛,检测菌株至少含有一种毒力基因(与ExPEC或InPEC致病型相关,属于不同的遗传谱系:A、B1、B2和D)。结果发现,23%的感染大肠杆菌分离株的小鼠引起致死性感染。此外,大多数致死菌株属于遗传谱系A(65%)和血清型O60或O101(35%)。遗传谱系B1、血清组O60和O101与致死性状态存在统计学上关联(P<0.05)。而且,致死性大肠杆菌分离株和所有其他细菌毒性特征之间存在正相关(OR>1)。本研究首次报道了西藏散养健康牦牛粪便中分离到的大肠杆菌具有潜在的毒力,表明健康牦牛源大肠杆菌的致病性也能带来严重的公共卫生问题,要引起重视。
  4.鱼腥草提取物对多重耐药性大肠杆菌的抑菌效果和耐药调节
  为了研究鱼腥草提取物(Houttuynia cordata water extract,HCWE)对携带有AcrA基因(大肠杆菌的多药外排系统)的多重耐药(Multi-drug resistant,MDR)大肠杆菌菌株的抑菌活性,我们对至少抗三种不同种类的抗生素的耐药菌株进行HCWE抑菌活性试验。并采用琼脂扩散技术、试管稀释法和实时PCR分析方法,对AcrA基因的抑菌效果、最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)和AcrA基因转录水平进行了HCWE抑菌活性评价。试验结果显示:具有抗菌活性的HCWE在500mg/mL和50mg/mL浓度下,对多重耐药的E.coli的抑菌区域直径(Zone diameter of inhibition,ZDI)最大是29mm和最小是13mm。HCWE针对具有多重耐药大肠杆菌分离株的MIC和MBC分别为400mg/mL和500mg/mL。此外,当采用25mg/mL、50mg/mL和100mg/mL浓度的HCWE培养E.coli时,AcrA基因的表达水平以一种剂量依赖的方式递减(分别是0.39倍、0.29倍和0.16倍)。这些结果表明,鱼腥草水提取物对多重耐药性大肠杆菌具有非常大的潜在应用价值。它能作为一种抗多重耐药病原体的抗菌药物替代品,并且对该药物的进一步开发是非常必要和值得的。
  综上研究,青藏高原地区散养牦牛大肠杆菌耐药检出率较高,并且牦牛在危险的病原菌及多抗药基因的携带和传播中起重要作用。与之相关的原因有许多,可能包括抗性基因的正向选择,联合选择,频繁使用自然资源以及在治疗中无限制地使用抗菌药物等。而且,散养健康牦牛源大肠杆菌遗传谱系A和血清型O60或O101菌株具有致病性,对人畜的生命健康构成一定的威胁。在研究中尝试使用中草药(鱼腥草水提取物)作为一种合成抗生素的替代品,它对抗多重耐药大肠杆菌具有很大的潜在应用价值。
[硕士论文] 孙灵灵
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甲氧苄啶类药物是一类二氢叶酸还原酶抑制剂,常与磺胺类联用增加药物的抗菌活性,所以在临床上广泛应用。由于该类药物较好的抗菌增效作用,实际生产中滥用现象时常发生,影响了药物协同作用的防治效果以及导致细菌耐药性的产生,并且关于甲氧苄啶类药物的残留消除研究较少,因此为了该类药物在临床上的安全有效使用,有必要建立它的残留预测研究。仅仅依靠制定的最大残留限量和休药期,并不能对标签外用药残留量进行较好预测,由此可能会导致兽药在动物中残留。若是对上市的动物进行抽检,不但工作量大,而且一旦抽检不合格也会造成很大的经济损失。生理药动学(PBPK)模型作为一种新的残留预测方法,可以弥补现存残留预测方法的不足。本研究开展了二甲氧苄啶(DVD)在猪体内的生理模型研究,并通过化合物外推得到同类药物甲氧苄啶(TMP)、艾地普林(ADP)在猪体内以及种属外推得到DVD在鸡和鱼体内的PBPK模型。通过这些研究,建立甲氧苄啶类药物的残留预测方法,促进甲氧苄啶类药物残留监控体系的完善,加大PBPK模型在兽药领域的应用范畴。
  1.DVD在猪体内PBPK模型构建
  生理参数如猪的心输出量和组织器官容积都可以通过文献查阅得到。化合物特异性参数:吸收速率常数通过计算初值为0.061h-1,肾清除率为0.075L/h/kg,组织/血浆分配系数是利用血浆与组织中的药时曲线下面积比值得到,在肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中分别为0.7、1.31、0.38和0.53,肝脏、胆汁和肠道代谢速率常数是采用后3个点消除相斜率得到,分别为0.008h-1、0.017h-1和0.009h-1,这些参数值作为模型运行的初值。
  根据查找到关于DVD的药动学以及残留消除数据,建立一个血流限速型PBPK模型。采用一级速率方程描述DVD在肝脏中的代谢,模型包含肝脏、肾脏、肌肉、脂肪、血浆和其他组织房室,肝肠循环过程也包含在结构中。利用查找到的实验数据对模型中的化合物动力学参数进行有针对性的调试和逐步优化,灵敏性分析确定对模型影响较大的参数,分别为吸收速率常数、生物利用度、肝脏代谢速率常数、肠道代谢速率常数、肾清除率和各组织/血浆分配系数,以灵敏性参数为研究对象进行蒙特卡罗模拟,考量参数的变化对于预测结果产生的影响,并且实验数据也都包含在蒙特卡罗模拟的结果中。同时用非拟合数据对模型进行验证,验证采用直观对比分析、残差分析、线性回归分析和2倍因子分析进行评价,结果表明,模型能较好地对大多数时间点药物浓度进行残留预测,表明了模型建立的成功。本课题是采用acslXtreme软件((advanced continuous simulation language,acslX,Version3.0.2.1,Aegis Technologies Group,Inc.,Huntsville,AL,USA)以代码的形式建立PBPK模型。
  2.TMP在猪体内残留消除研究
  本研究建立了TMP在猪的可食性组织肝脏、肾脏、肌肉、脂肪以及血浆中的HPLC检测方法,样品经乙酸乙酯和氨水提取,MCX小柱净化,0.5%高氯酸和甲醇(67∶33,V/V)复溶,HPLC检测。色谱柱:Zorbax SB-C18,流动相:0.5%高氯酸∶甲醇=67∶33,紫外检测波长:230nm,进样量:20μL,柱温:30℃。该方法在猪血浆以及各组织中的定量限为40μg/kg,在40、80和160μg/kg浓度下回收率均在82%以上,且日间相对标准偏差低于10%,该方法满足相关方法学要求。
  20头28kg左右的杜长大三元杂交猪,按照6mg/kg b.w连续7d灌胃给药,最后一次给药后在1、3、5、7和14d宰杀动物,取肝脏、肾脏、肌肉和脂肪组织及采集血浆。HPLC分析结果显示,停药1d后肾脏中TMP含量最高,达到693.8μg/kg,停药3d和5d时各组织中药物浓度均高于定量限,第7d时仅在肝脏、肾脏和血浆中检测到药物残留,肌肉和脂肪中的药物含量低于定量限,第14d时在组织和血浆中都检测不到药物残留。
  3.PBPK模型外推
  以DVD在猪体内的PBPK模型为基础,化合物外推到同类药物TMP和ADP,种属外推到DVD在鸡、鱼体内。化合物外推所需要的生理参数与DVD在猪体内的生理参数一致,化合物动力学参数的初值通过文献查找,没有查找到的假设与DVD拟合后的结果一致,通过药动学和残留消除结果对模型进行拟合。TMP在猪体内的PBPK模型能较好地拟合连续7d给药后肝脏、肾脏、肌肉、脂肪和血浆中药物浓度,但在最后一次给药后第7d肾脏中药物残留预测值略高于实验值,这可能是因为肾脏中血流量较少,但预测值仍在实验值的2倍因子范围内,因此模型能较好地对TMP在猪体内的药物残留进行监控。ADP在猪体内的PBPK模型能很好地对肝脏、肾脏、肌肉、脂肪和血浆中药物浓度进行预测,但是模型高估了最后一次给药后肝脏中第3d和肾脏中第3d和5d中的药物浓度,这可能是由于肝脏和肾脏器官容积、血浆分配系数较大的原因。种属外推需要的鸡、鱼生理参数通过文献查找得到,假设化合物动力学参数在种属间是不变的,通过组织和血浆中DVD浓度对模型进行拟合以及验证。DVD在鸡体内的PBPK模型预测值和实验值在一些时间点存在差异,这可能是由于鸡的生理结构与哺乳动物差异较大,但是模型还是能对DVD在鸡体内的残留趋势进行预测。DVD在鱼体内的PBPK模型能较好地拟合连续7d给药后1d、3d和7d中肝脏和肌肉中药物浓度,以及14d时肝脏和肾脏中的药物残留,但高估了最后一次给药后肾脏中第3d的药物浓度,这可能与肾脏中组织血流量有关,但2倍因子分析结果表明,模型预测值均在实验值2倍因子范围内,符合模型评价标准,也证明了模型外推的成功。
  综上所述,本课题建立了能够预测不同给药方案下DVD在猪体内残留的PBPK模型,并通过化合物外推和种属外推建立了ADP和TMP在猪体内及DVD在鸡、鱼体内的PBPK模型。该研究结果为甲氧苄啶类残留监控提供了新型预测手段,促进了甲氧苄啶类药物残留监控体系的完善,对于保障动物源性食品安全以及养殖行业的健康发展具有重要的意义。
[硕士论文] 张瑶
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多动物共患病,猪是伪狂犬病毒的天然宿主。2011年底,我国多省份经gE基因缺失株Bartha-K61弱毒疫苗免疫的猪突发伪狂犬疫病,对猪场造成巨大经济损失。病毒分离等实验证明疫病爆发根源是该毒株发生变异。对感染PRV变异株和疫苗免疫的猪区别诊断,是国际上控制伪狂犬病的策略之一。为有效防控并清除猪伪狂犬病,亟需建立针对PRV变异株gE蛋白抗体的检测方法。
  本实验用原核系统表达了PRV新流行株河南博爱株的gE蛋白,建立了一系列检测gE蛋白抗体的方法。建立了间接ELISA方法,包被抗原浓度0.32μg/mL,待检血清1∶400稀释,1%牛血清白蛋白(BSA)封闭,羊抗猪IgG5000倍稀释,以5倍信噪比为阴阳性判定标准。本方法与阻断法ELISA试剂盒相比符合率为91.36%,灵敏性为76.92%,特异性为94.12%。
  为建立更快速的检测方法,基于间接ELISA实验,我们将gE蛋白与猪IgG分别作为检测线和质控线,以胶体金颗粒标记羊抗猪IgG制备免疫胶体金,组装成胶体金免疫层析试纸条。试纸条的质控线(C线)包被2mg/mL的猪IgG,检测线(T线)包被2mg/mL的gE蛋白。胶体金标羊抗猪IgG的pH9.0~9.2,浓度0.07mg/mL。敏感性实验发现,血清稀释640倍时检测线和质控线最清晰,但特异性实验发现试纸条特异性较差。
  为更快速准确地检测gE蛋白抗体,我们建立了基于磁珠的检测方法。优化反应条件后,本方法检测限达到阳性血清稀释51200倍,线性范围为血清稀释50~25600倍,灵敏度比ELISA方法有较大提高。并且,本方法可在30m in内完成gE蛋白抗体检测。
  综上所述,本实验建立了三种检测PRV gE蛋白抗体的方法:间接ELISA方法、免疫层析试纸条方法以及基于磁珠的快速检测方法。基于磁珠的快速检测具有灵敏度高、操作简便等优点,有望开发成新型PRV gE蛋白抗体快速检测商品化试剂盒。
[硕士论文] 姜晓娜
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎附植期是猪早期妊娠胚胎丢失最敏感时期之一,受很多因子调控,但目前对猪胚胎附植的相关因子研究较少。在本实验室先前的转录组和蛋白的测序数据分析发现ANXA8基因在猪的胚胎附植期差异表达。ANXA8基因是膜联蛋白家族的成员之一,编码抗凝血蛋白参与凝血级联并作为一种间接性的凝血酶特异性复合物。然而,目前在猪的胚胎附植以及猪的子宫内膜细胞中ANXA8基因的功能均未见报道。为了了解ANXA8基因在猪的子宫内膜中以及可能对猪胚胎附植产生的作用,本研究先检测了猪妊娠早期的子宫内膜组织中ANXA8基因的相对表达;然后将构建的真核超表达载体pcDNA3.1(+)-ANXA8和ANXA8基因的干涉片段转染到猪子宫内膜细胞中,通过免疫荧光、实时荧光定量PCR、流式细胞术和western blot等技术研究ANXA8基因在猪子宫内膜细胞中的调控作用;通过小鼠子宫角注射方法确定ANXA8基因对胚胎附植的影响。主要研究结果:
  1.实时荧光定量PCR技术检测猪妊娠9-15d和18d的子宫内膜组织中ANXA8基因的表达情况,发现该基因在妊娠12d的相对表达量最高。通过免疫荧光方法确定了ANXA8蛋白在猪子宫内膜细胞中的表达位置,发现ANXA8蛋白在细胞质中有表达。
  2.实时荧光定量PCR测定表明ANXA8基因显著上调LIF和EGF基因在猪子宫内膜细胞的表达量。
  3.流式细胞术确定ANXA8基因促进猪的子宫内膜细胞的细胞周期的S期细胞增加。免疫荧光技术和western blot技术确定超表达ANXA8基因可以通过促进细胞中增殖标志蛋白PCNA的表达来促进猪子宫内膜细胞的增殖。
  4.Western blot技术确定超表达ANXA8基因在不影响猪子宫内膜细胞中AKT总蛋白的情况下促进细胞中p-AKT蛋白的表达,进而调控细胞中AKT信号通路。免疫荧光技术和western blot检测证实ANXA8基因通过AKT信号通路来调控猪子宫内膜细胞的增殖,其中免疫荧光技术结果发现超表达ANXA8并添加AKT磷酸化抑制剂(Perifosine)后,细胞中PCNA蛋白含量与对照组无显著差别,且其含量低于只超表达ANXA8组中细胞内PCNA蛋白的含量,其次western blot结果发现AKT磷酸化抑制剂对细胞内ANXA8蛋白含量无影响。实时荧光定量PCR技术确定超表达ANXA8可以上调AKT下游mTOR基因在猪子宫内膜细胞中的表达。
  5.在小鼠子宫角注射实验发现注射干涉片段ANXA8的小鼠的胚胎附植数明显少于对照组。
  6.实时荧光定量PCR技术结果发现干涉ANXA8基因可以降低同家族ANXA4基因在子宫内膜细胞中的表达。
  以上主要结果表明ANXA8基因可以通过AKT信号通路促进猪子宫内膜细胞的增殖。此外还发现ANXA8基因也影响猪子宫内膜细胞中胚胎附植标志LIF和EGF基因的表达;ANXA8基因也会影响小鼠的胚胎附植数目。
[博士论文] 哈西卜哈利克
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  1.硼对脾的影响
  在研究中检测了硼对脾发育变化之间的关系和硼(以硼酸的形式)对Hsp40/70表达水平的影响。将30羽健康雏鸵鸟随机分为6组:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组,分别饲喂添加0,40,80,160,320,640mg/L硼的基础日粮。通过HE染色对脾组织进行病理学检查;采用IHC和Western blot检测技术分析Hsp40/70的表达水平;并通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测Hsp40/70的mRNA表达水平。为了研究细胞凋亡,分析了所有处理组的TUNEL反应。该部分研究工作的内容和结果如下:
  1.1硼对鸵鸟脾组织结构的影响
  与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组没有显著性差异。与Ⅰ组比较,Ⅲ组和Ⅳ组白髓的数量和体积增多,边缘区细胞密集增厚,边界清晰。试验组Ⅴ和Ⅵ组织病理学变化明显;白髓的数量和体积减少,边界不清晰。
  1.2硼对Hsp40/70在雏鸵鸟脾中分布的影响
  Hsp70主要在脾脏组织中呈弥漫分布。与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组的Hsp70的分布无显著性差异,但Ⅲ组,特别是饲喂添加160mg/L硼的Ⅳ组的Hsp70分布差异显著。然而,高硼处理组的Hsp70阳性信号的分布开始下降,其在Ⅵ下降得犹为明显。此外,与Ⅰ组相比,Ⅱ组中阳性信号IOD略有增加,但无显著性差异;Ⅲ组和Ⅳ组中Hsp70阳性信号的IOD显著性升高。然而,Ⅴ组阳性信号的IOD却略有降低,但无显著性差异,Ⅵ组阳性信号的IOD显著性降低。通过蛋白免疫印迹分析,Hsp70表达量水平与免疫组化结果的趋势相似。随着硼含量的增加,Hsp70s表达量也增加并在Ⅳ组中达到峰值。Hsp40的表达量的趋势与Hsp70的相似;然而,与Hsp70相比,相同组中Hsp40的表达量较少。这表明Hsp40是Hsp70的辅因子,有助于Hsp70的活性。
  1.3硼对鸵鸟脾Hsp40/70mRNA表达量的影响
  Ⅱ组(40mg/L硼)中Hsp40/70的mRNA表达量水平高于Ⅰ组;Ⅲ组mRNA表达量水平显著升高;Ⅳ组mRNA表达量水平达到峰值,之后Hsp40/70的mRNA表达量水平开始下降;Ⅵ组的mRNA表达量水平最低,与Ⅰ组(对照组)相近。mRNA表达量下降,表明Hsp40/70mRNA表达量是呈现剂量依赖性的,最初在较低剂量下诱导表达,然后在较高量的硼处理组中被抑制。
  1.4硼对鸵鸟脾细胞凋亡的影响
  为了检测硼对雏鸵鸟脾细胞凋亡的影响,采用TUNEL法评估细胞凋亡。TUNEL细胞主要是棕色颗粒的细胞。在Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组中,TUNEL阳性信号弱于Ⅰ组;但在第Ⅴ组,特别是Ⅵ组(640mg/L硼)TUNEL阳性信号增强。IOD分析显示Ⅱ-Ⅳ组水平较低,Ⅳ组最低;而与Ⅰ组相比,Ⅴ组和Ⅵ组的IOD水平显著升高。
  2.硼在肾脏组织发育中的作用
  在本试验中,研究了硼对雏鸵鸟肾的作用,特别是抗氧化能力。将48羽雏鸵鸟随机分为6组,在饮用水中补充不同浓度的硼。测定相对氧化/抗氧化酶(T-AOC,MDA,GSH-Px,CAT,GR,SOD)和肾细胞凋亡各项指标。通过qPCR测量该通路(Nrf2,HO-1和GCLC)中3个重要基因的表达,并通过免疫组化分析关键调节因子Nrf2的定位。研究的相应内容和结果如下:
  2.1硼对雏鸵鸟肾组织凋亡的影响
  凋亡的细胞分布在肾的各个部位,这些细胞基本上是棕色颗粒的细胞。与对照组相比,Ⅱ组和Ⅲ组凋亡细胞数量较少。饲喂添加160mg/L硼基础日粮处理组凋亡细胞数量略有增加,当添加剂量达到320mg/L时凋亡细胞数明显增加,在640mg/L剂量时达到峰值。此外,IOD分析显示Ⅱ组和Ⅲ组的水平较低,Ⅲ组水平最低,而与对照组相比,Ⅴ组和Ⅵ组IOD水平显著升高。
  2.2硼对雏鸵鸟肾组织抗氧化活性的影响
  与对照组相比,添加40mg/L和80mg/L硼组MDA含量分别显著降低了26.02%和48.12%,然而添加160-320mg/L硼时增加,640mg/L硼组增加了一倍。添加40mg/L硼组雏鸵鸟肾组织T-AOC活性与对照组相比没有差异,添加80mg/L硼组则明显升高。相反,添加640mg/L硼组T-AOC活性显著下降,与同组MDA含量变化相反。雏鸵鸟肾组织的GSH-PX活性在添加40和80mg/L硼组略有增加,但差异不显著。然而,GSH-PX在添加160,320mg/L硼组显著增加了约50%,添加640mg/L硼组增加了一倍。
  2.3硼对雏鸵鸟肾组织Nrf2抗氧化通路的影响
  研究结果表明,在低剂量硼组,Nrf2阳性产物主要分布在肾近端小管,而高剂量组Nrf2阳性产物分布主要位于上皮细胞中。IOD分析显示,低剂量组Nrf2阳性产物的分布较高,而与Ⅰ组相比,高剂量组的Nrf2阳性产物分布较少。抗氧化通路(Nrf2,HO-1,GCLc)中3个重要基因的qPCR分析显示不同组之间相似而强烈的差异。与对照组相比,当添加硼达到160mg/L剂量时能显著提高了雏鸵鸟肾组织中Nrf2的表达水平,添加80mg/L硼组达到峰值。除了添加40mg/L硼组外,其他添加硼组抗氧化通路GCLc表达量水平均显著升高,添加80mg/L硼组达到最大值。此外,与其他抗氧化因子相比,硼对雏鸵鸟肾组织中HO-1表达量水平的影响是最大的。
  3.硼对肝脏功能的影响
  在非洲鸵鸟饮用水中添加硼酸(0mg,40mg,80mg,160mg,320mg和640mg),观察并检测雏鸵鸟肝中由不同剂量硼引起的组织学,细胞凋亡,组织化学和血清生化参数的变化。通过HE染色和PAS染色评估不同组的组织结构变化;通过TUNEL检测细胞凋亡情况;通过分光光度法检测血清生化指标。得到的结果如下:
  3.1硼对肝组织结构的影响
  90羽鸵鸟肝显示出良好的结构,具有丰富的细胞数量和不同形状的肝门管区。在低剂量硼组,进一步发现肝细胞发育良好,肝门管区清晰可见。在高剂量组中观察到肝组织结构发生改变。与硼中毒有关的主要病变包括:肝门管区炎症和肝细胞病变。肝门管区炎症在Ⅵ组最严重。在肝组织的一些肝细胞中观察到轻度症状,添加640mg/L硼剂量组中较多。此外,一些肝细胞还观察到核疱化。同时,还观察到的部分的核固缩和坏死。
  3.2硼对糖原含量的影响
  Ⅱ组糖原含量高于Ⅰ组,Ⅲ组糖原含量最高,有显著性差异。Ⅳ组可能是最佳剂量,之后糖原量开始下降。与Ⅰ组比较,在Ⅴ组和Ⅵ组中糖原含量最少。经IOD分析证实了以上所述各组糖原水平。
  3.3硼对雏鸵鸟肝细胞凋亡的影响
  低剂量组显示较少的细胞凋亡,Ⅱ组中细胞死亡最少。与Ⅰ组相比,高剂量组,特别是添加640mg/L硼组中肝细胞凋亡量较多。IOD的统计学分析与本研究的TUNEL结果相似,表明硼对细胞凋亡具有剂量依赖性作用,并且添加超过160mg的硼剂量会使更多的细胞凋亡。
  3.4硼对血清生化指标的影响
  血清生化指标受硼剂量的影响显著。高剂量组(添加320mg/L,特别是640mg/L硼组)酶活性参数与空白组相比差异显著。同时,参与代谢的血清生化指标在低剂量组(至Ⅳ组)中显示出硼有利的作用。总体结果表明硼在低剂量(80-160mg/L硼酸)对肝酶活性和代谢有正面的影响,高剂量(主要是640mg硼酸/L)则具有相反的作用。
  简言之,总体结果表明适当的膳食硼摄入量(约160mg)可以使雏鸵鸟各组织发育良好,提高抗氧化的能力,减少细胞的凋亡和正向调节各项血清生化指标。然后,高剂量的硼能引起中毒反应并表现出明显的组织学结构病变。此外,长期超量添加硼会导致HSP表达量下降,糖原消耗过多,细胞凋亡增多和酶活性增加,这些都与硼的作用密切相关。
[博士论文] 王晓艳
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:干扰素-τ(Interferon-τ,IFN-τ)是反刍动物在妊娠早期由胚胎滋养层细胞分泌的一类Ⅰ型干扰素,被视作妊娠识别信号,具有抗黄体溶解、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能。其在调节胚胎着床时期子宫容受态和子宫免疫环境等方面的作用对于胚胎的顺利着床尤为重要。IFN-τ在奶牛妊娠早期,即胚胎植入窗口期,通过对牛白细胞Ⅰ类抗原(Bovine leukocyte antigen,BoLA-Ⅰ)及其他妊娠相关分子的调节,提高母体对胎儿的容受性,增加胚胎植入的成功率。BoLA-Ⅰ,是牛的主要组织相容性Ⅰ类(Major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)蛋白,在牛的胚胎滋养层和子宫内膜上皮细胞中均有表达,与妊娠早期母体对胎儿免疫耐受密切相关。IFN-τ也可以调节分离培养的奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达miRNAs。miRNAs普遍存在于真核生物,通过对靶基因的调节,参与机体各种生理和病理过程,在妊娠免疫和重塑子宫内环境等方面也有重要作用。
  本实验室前期的研究表明,IFN-τ在奶牛妊娠早期可上调BoLA-Ⅰ的表达,并可调节奶牛子宫内膜上皮细胞中miRNAs的表达谱。通过高通量测序和分析,发现一些差异表达显著的miRNAs可能与IFN-τ调节奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达BoLA-Ⅰ类蛋白有关。为进一步验证其相关性,也为进一步研究奶牛妊娠免疫和子宫容受性的调节机制提供实验依据,探索IFN-τ在奶牛妊娠早期协助胚胎免疫逃逸,为胚胎植入提供可能的潜在机制,本研究从验证miRNAs/miRNAs靶基因入手,展开了深入的研究,主要研究内容和结果如下:
  (1)从高通量测序的结果中筛选到bta-miR-145和bta-miR-204在IFN-τ作用下的奶牛子宫内膜上皮细胞中的表达明显降低。选取空怀和妊娠早期奶牛子宫内膜组织进行在体验证。RT-qPCR和Western blot检测结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织相较于空怀奶牛而言,其bta-miR-145和bta-miR-204的mRNA水平显著降低,MHC-Ⅰ类相关链(MHC classⅠ-relatedchain,MIC1)基因和Ⅰ类MHC重链(Major histocompatibility complex,classⅠ-A,BoLA)基因的mRNA水平却显著上调,且BoLA-Ⅰ蛋白水平也明显升高。
  (2)分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)进行体外验证,结果显示,在IFN-τ(200ng/mL)作用下,和对照组相比,bEECs中bta-miR-145与bta-miR-204的mRNA水平同样下降明显,MIC1和BoLA的转录水平上升明显,BoLA--Ⅰ蛋白表达水平升高显著。
  (3)利用生物信息学技术对bta-miR-145与MIC13'UTR,bta-miR-204与BoLA3'UTR靶序列的碱基配对情况,结合形成RNA双链的二级结构和自由能等主要生物信息学指标进行了归纳分析,初步确定MIC1为bta-miR-145的靶基因,BoLA为bta-miR-204的靶基因。通过双荧光素酶报告检测分析,发现,bta-miR-145显著抑制MIC13'UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性,而bta-miR-204也能显著抑制BoLA YUTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性。确证MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (4)bta-miR-145、bta-miR-204的过表达和抑制实验表明,在bEECs中转染bta-miR-145模拟物能显著抑制MIC1基因mRNA的表达;而转染bta-miR-145抑制剂后,MIC1基因mRNA的表达则显著上调。而在bEECs中转染bta-miR-204模拟物则能显著抑制BoLA基因mRNA的表达;而转染bta-miR-204抑制剂后,BoLA基因rnRNA的表达则显著上升。在IFN-τ的作用下,bEECs中MIC1和BoLA的mRNA水平显著增加,BoLA-Ⅰ的蛋白表达水平也明显上调。进一步证实了MIC1是bta-miR-145的直接靶基因,而BoLA是bta-miR-204的直接靶基因。结果证明,IFN-τ可以通过对bta-miR-145和bta-miR-204的负调节作用,提高MIC1和BoLA的表达。
  (5)为了验证IFN-τ在胚胎植入期对细胞外基质和免疫微环境的影响,采用RT-qPCR分析了未孕和妊娠早期奶牛子宫内膜组织中崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白10(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10,ADAM10),崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白17(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein17,ADAM17),程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death-ligand1,PD-L1)和程序性细胞死亡配体2(Progammed cell death-ligand2,PD-L2)的mRNA水平。结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织中的ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的mRNA水平都有不同程度的升高。而在IFN-τ的作用下,bEECs中ADAM10,ADAM17,PD-L1与PD-L2的mRNA水平都有明显的增加。
  (6)为了验证IFN-τ是否通过对MIC1和BoLA的调节来影响ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的表达,采用siRNA干扰技术在bEECs中进行体外验证。结果表明,siRNA干扰MIC1的表达后,ADAM10和ADAM17mRNA水平明显下降;在bEECs中转染BoLA siRNA后,PD-L1与PD-L2的mRNA水平也显著下调。结果提示,IFN-τ通过bta-miR-145对MIC1的调节影响ADAM10和ADAM17的表达;同时可通过bta-miR-204对BoLA的调节作用,来调节PD-L1与PD-L2的表达,从而对细胞外基质和免疫耐受等多方面的调节来影响胚胎植入。
  (7)进一步验证IFN-τ对胚胎植入的影响,建立了LPS诱导的小鼠胚胎植入障碍模型,进行在体验证。实验结果表明,IFN-τ能提高LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量,同时FN-τ也能抑制LPS诱导的炎性因子IL-1β和TNF-α的表达,并上调抗炎因子IL-10的表达。
  结论:
  (1)MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (2)IFN-τ通过抑制bta-miR-145上调MIC1的表达来增加ADAM10和ADAM17的表达,以影响细胞外基质,促进胚胎黏着、侵袭等过程。
  (3)IFN-τ通过抑制bta-miR-204上调BoLA的表达来提高PD-L1与PD-L2的表达,以此影响母胎界面的免疫微环境,促进胎儿免疫逃逸。
  (4)IFN-τ通过下调bta-miR-145/204的表达来调节BoLA-Ⅰ类相关分子的表达和功能,以增加胚胎植入的成功率。
  (5)IFN-τ通过对免疫平衡的调节来增加LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量。
[硕士论文] 宋娇阳
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:高致病性禽流感H5N1和低致病性禽流感H9N2在全球范围内的广泛传播,加速了新型流感的发生和流感大流行的风险。H9N2和H5N1亚型禽流感病毒常与其他亚型发生广泛的基因重组形成致病力较高的新型病毒,如H7N9、H10N8,并且可以跨越物种障碍直接感染人类,威胁人类健康。因此,对H9N2和H5N1禽流感的预防尤为重要。禽流感病毒主要通过呼吸道、消化道等黏膜部位感染机体。通过鼻腔免疫亚单位疫苗可以引起局部的黏膜免疫反应,从而阻断禽流感病毒原发部位的感染。将抗原完整的跨越黏膜屏障转运是成功诱导黏膜免疫的关键。但是由于黏膜免疫系统的复杂性,抗原的有效转运受到制约。鸡卵黄抗体IgY Fc受体(FcRy)是鸡IgY的转运受体。在本实验室前期研究中,已经证实了FcRy可以将IgY Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障进行转运。在本研究中,将禽流感病毒H9N2和H5N1的主要保护性抗原HA1与鸡IgY Fc片段融合,在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中表达,并辅以佐剂CpG-ODN2007,制备二价亚单位疫苗。通过滴鼻免疫鸡,显示融合蛋白可以借助呼吸道黏膜上皮细胞表达的FcRy进行转运跨越黏膜屏障,诱导机体产生了针对H9N2、H5N1禽流感病毒HA1的有效特异性黏膜免疫和全身性免疫应答。主要结果如下:
  1.H9N2禽流感病毒HA1的表达及鼠抗H9N2HA1多克隆抗体的制备
  成功构建pGEX-KG-HA19原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中诱导表达GST-HA19融合蛋白,将该融合蛋白纯化后辅以佐剂免疫小鼠,成功制备了鼠抗H9N2HA1的高免血清,利用间接ELISA检测抗体效价高达1∶256000,经Western Blot鉴定该多克隆抗体具有良好的特异性。
  2.构建pFastBac HTb-sHA19-HA15-Fc、pFastBac HTb-sHA19-Fc重组质粒及融合蛋白的表达与鉴定
  将禽流感病毒H9N2含有信号肽的HA1(sHA1)及H5N1HA1与鸡IgY Fc片段融合,构建pFastB ac HTb-sHA19-HA15-Fc真核表达载体;将禽流感病毒H9N2sHA1与鸡IgY Fc片段融合,构建pFastBac HTb-sHA19-Fc真核表达载体。然后,利用Bac-to-Bac表达系统分别表达sHA19-HA15-Fc和sHA19-Fc融合蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,其蛋白大小约为140KDa、105KDa,比预测蛋白略大。应用Western Blot分别对该融合蛋白的HA19、HA15和Fc片段进行检测,结果显示各蛋白均成功表达。在非还原条件下检测蛋白大小约为280KDa、210KDa,说明该融合蛋白以二聚体的形式存在,具有类似IgY的分子结构。
  3.sHA19-HA15-Fc融合蛋白二价亚单位疫苗对鸡的免疫效果评价
  将sHA19-HA15-Fc融合蛋白辅以佐剂CpG-ODN2007滴鼻免疫鸡,可以同时诱导有效的局部黏膜免疫和全身性免疫应答。(1)二免后第10d,气管和肺脏冲洗液检测中,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组抗H9N2HA1和抗H5N1HA1特异性sIgA和IgY抗体效价均最高,除了sHA19-Fc和sHA15-Fc滴鼻免疫组外,与其他免疫组相比差异极显著(P<0.01)。(2)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组血清中IFN-γ、IL-2均极显著高于sHA19-HA15滴鼻免疫组和灭活苗组(P<0.01),与sHA19-Fc或sHA15-Fc滴鼻免疫组无显著性差异。(3)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组脾淋巴细胞增殖指数显著高于sHA19-HA15-Fc皮下免疫组和sHA19-HA15滴鼻免疫组。(4)二免后第14d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组血清中抗H9N2HA1和抗H5N1HA1特异性IgY的ELISA抗体和HI抗体水平均为最高,与sHA19-HA15滴鼻免疫组差异极显著(P<0.01)。(5)H9N2病毒攻毒后第5天,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组、sHA19-Fc滴鼻免疫组的咽拭子和泄殖腔拭子均未检测到H9N2病毒的血凝活性,其保护率均为100%,sHA19-HA15-Fc皮下免疫组、灭活苗组攻毒保护率分别为75%、87.5%,而sHA19-HA15滴鼻免疫组保护率仅为25%。
  该研究结果表明,将sHA19-HA15-Fc融合蛋白辅以黏膜佐剂,滴鼻免疫鸡,可以利用鼻腔黏膜上皮细胞表达的FcRy胞转将鸡IgY Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障进入血液循环,诱导机体产生抗H9N2、H5N1禽流感病毒的有效局部黏膜免疫和全身性免疫应答,完全保护免疫鸡抵抗H9N2禽流感病毒的感染。
[硕士论文] 谢梦利
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:禽流感作为重要的人畜共患病,一直以来对养殖业和公共卫生健康造成重大影响。H9N2禽流感病毒感染家禽后虽不会造成很高的死亡率,但被感染的鸡抵抗力降低,导致鸡对其他病原易感而引发二次感染,对家禽养殖业造成重大经济损失。当禽流感病毒感染哺乳动物时其体内的RIG-Ⅰ和MDA5受体能识别病毒RNA产生天然免疫反应,天然免疫系统的激活会引起下游的信号通路产生级联反应,并释放干扰素(IFN)和多种炎性因子发挥抗病毒效应。有研究表明在鸡的体内缺乏RIG-Ⅰ受体,但当鸡被禽流感病毒感染时鸡体内同样可产生抗病毒作用的IFN-Ⅰ。在哺乳动物MDA5的研究中,发现MDA5在抗流感病毒感染过程中可发挥识别病毒RNA并诱导IFN应答的作用,虽鸡的体内存在MDA5受体,但其在抗流感病毒中的功能并不清楚。因此本研究拟通过CRISPR/Cas9技术构建DF1细胞mda5功能失活的细胞系,评价mda5对H9N2禽流感病毒诱导IFN-β及对病毒增殖的影响,为阐释禽流感诱导IFN信号通路及开发适合H9N2流感病毒疫苗株增殖细胞系奠定基础。
  本研究首先拟通过将既可表达Cas9蛋白又可直接转录sgRNA的质粒转染到细胞完成基因突变,但结果显示在抗生素筛选下细胞均无存活,即该方法未能成功。接着在优化的慢病毒构建体系基础上,通过lenti-CRISPR-v2慢病毒系统构建突变细胞系,但同样构建失败。因此又选择运用两个小骨架慢病毒系统进行构建,首先通过lentiCas9-Blast慢病毒系统构建稳定表达Cas9蛋白的DF1细胞系,经检测可知DF1-Cas9细胞系构建成功;其次通过lenti-Guide-puro慢病毒系统将sgRNA整合入该细胞中,并通过T7E1试验及基因测序验证细胞系功能,结果表明在构建的DF1-Cas9细胞系中可发挥对mda5基因靶向切割的功能。利用对IFN敏感的VSV-GFP荧光病毒进一步筛选mda5基因功能失活的细胞系,结果显示成功实现DF1-Δchmda5细胞系的构建。
  为探究mda5对H9N2诱导的IFN-β及H9N2增殖的影响,因此分别测定了DF1-Δchmda5和DF1-Cas9细胞感染H9N2后诱导IFN-β和PKR转录水平。结果显示,DF1-Cas9感染H9N2后,细胞中IFN-β和PKR的转录水平随感染时间的延长呈现上升趋势,表明在H9N2刺激下DF1-Cas9细胞可诱导IFN的应答;在DF1-Δchmda5细胞系中也可检测到IFN-β的转录,但其转录水平显著低于DF1野生细胞,表明鸡mda5虽不是禽流感诱导IFN-β和PKR转录的唯一受体,但仍在IFN诱导中发挥主导作用。进一步测定细胞上清病毒的血凝价,结果显示mda5功能失活后可在24h内快速提高H9N2病毒血凝素含量。
  通过CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定表达Cas9蛋白的DF1细胞系;在该细胞系的基础上成功构建mda5功能失活的DF1细胞系;DF1细胞中mda5功能的失活可显著下调H9N2诱导IFN-β的转录,并在短时间内提高H9N2病毒血凝素含量。
[硕士论文] 余庆
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:沙门氏菌的各种血清型可对人、畜、禽和野生动物引起疾病,沙门氏菌引发的疾病遍布世界各地,许多血清型的沙门氏菌可使人感染并发生食物中毒。近年来,禽沙门氏菌病的发生日趋严重,鸡白痢是其中的一种,而且此病在流行、发生、临床表现及剖检变化、药物敏感性等许多方面都发生了一些新的特点,目前在鸡白痢病方面还没有一种有效的疫苗防治。本研究对收集的禽源沙门氏菌进行鉴定,耐药性和毒力基因的分析,并筛选了其中两株鸡白痢沙门氏菌,运用病理组织学和免疫组织化学方法进行致病性研究。
  1、禽源沙门氏菌的鉴定及血清型分析
  本试验对收集的10株背景清晰的禽源沙门氏菌,进行培养,革兰氏染色、PCR鉴定、血清型测序分析及生化实验,并以肠炎沙门氏菌参考标准株作为对照。结果表明鸡源沙门氏菌中有2株为鸡白痢沙门氏菌,1株为猪霍乱沙门氏菌;鸭源沙门氏菌中有1株为肠炎沙门氏菌,6株为鼠伤寒沙门氏菌。
  2、禽源沙门氏菌的耐药基因检测及耐药性分析
  通过K-B(Kirby-Bauer)法对收集的10株沙门氏菌进行14种药物敏感试验及11种对应的耐药基因PCR检测,并以大肠杆菌ATCC25922作为对照。检测结果表明对链霉素的耐药率最高,达到了70%;对氨苄西林的耐药率为30%;对阿莫西林,诺氟沙星,四环素,复方新诺明的耐药率均为20%;对头孢西林,卡那霉素,庆大霉素,氯霉素的耐药率均为10%;对头孢哌酮,新霉素,氧氟沙星,诺氟沙星均表现出敏感性,有四株菌表现为多重耐药;耐药基因检测结果表明耐药基因catA1在的检出率为100%;aadA1,aadA2,sulⅠ的检出率在50%以上,qnrB,tetB,blaTEM,tetA,sulⅡ的检出率低于35%;blaPSE,qnrA,tetG检出率为0。分析沙门氏菌耐药性的结果与耐药基因的结果表明,药物的耐药表型与耐药基因的检出率基本一致,细菌所携带的耐药基因与其对药物耐药性呈正相关,沙门氏菌DNA上携带的耐药基因能很大程度的决定其耐药性。
  3、禽源沙门氏菌的毒力基因检测
  采用PCR技术检测了10株沙门氏菌15个毒力基因,它们已知参与沙门氏菌的粘附,侵袭和存活。检测结果表明大多数沙门氏菌对选择的大多数毒力基因都是阳性的,携带率均在80%以上,其中1号菌株携带检测的全部毒力基因;pipD,fimA,misL,sopA,invA,stn,spvC,spiC,sifA和orf319的检出率均为100%;virK的携带率为90%;sipA的携带率为80%;spvB的携带率为60%;fliC的携带率为40%。
  4、鸡白痢沙门氏菌的致病性研究
  根据10株菌的感染宿主的临床症状,毒力基因检测,筛选两株鸡白痢进行动物致死性感染试验,筛选出致病性较强的一株测定半数致死量试验,以此为依据进行动物感染试验,同期根据药敏试验结果选用临床兽用药进行抗生素治疗试验。经腹腔注射,分别在感染第1d、3d、5d、7d、10d、15d取SPF鸡的心、肝、脾、肺、盲肠、法氏囊进行HE染色,选取肝脏和盲肠测定载菌量;选取损伤最为严重的肝进行毒力蛋白SpiC的定位及相关肝损伤指标的免疫组织化学染色。
  在感染第3d到第7d是死亡高峰期,也是各器官损伤最严重的时期。同期肝脏Spic的表达范围最广,表达量最高,与肝脏坏死灶的分布一致,说明毒力蛋白与肝损伤有关。Caspase-1和Caspase-3也在此期间高表达,说明了在此期间肝脏受到损伤,即细菌感染导致动物的器官损伤,因此使宿主发病。
[博士论文] 李俊
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:我国水牛种质资源丰富,既有沼泽型,又有河流型,主要用于耕地和产肉。近年来,随着水牛向乳用方向改良,奶水牛产业得到快速发展。水牛奶营养丰富全面、消化吸收率高,将水牛奶深加工成乳制品,如“乳豆腐”、“奶饼”、“双皮奶”等,深受消费者喜爱,具有广阔的市场前景。然而,尽管我国水牛存栏量多,但水牛产奶量和繁殖力低,目前为止还没有专门的乳用型水牛品种,从而影响奶水牛产业的进一步发展。
  水牛的繁殖性状和泌乳性状均是重要的经济性状,为典型的数量性状。由于遗传力低和影响因素多,通过传统方法选育高繁殖力和高产奶量奶水牛进展缓慢。目前,全基因组关联分析和转录组测序对研究数量性状提供了新的方向。因此,本研究利用全基因组关联分析和转录组测序方法对影响水牛繁殖性能和产奶性能的候选基因进行筛选与鉴定。本研究的目的旨在揭示奶水牛泌乳性能和繁殖性能的分子遗传基础,为提高奶水牛的产奶性能和繁殖性能以及遗传改良提供理论基础。
  1水牛繁殖性状候选基因分析
  本试验分为三个部分。首先利用商业化水牛90K基因芯片(Affymetrix Axiom(@))对462头意大利地中海水牛的头胎产犊日龄、第二胎产犊日龄、第三胎产犊日龄、受精所需输精次数、空怀天数、产犊间隔6个繁殖性状进行全基因组关联分析。繁殖性状原始数据来自于意大利水牛育种评估中心。通过GWAS分析寻找影响水牛繁殖性状的SNP、基因组区域和候选基因。其次利用二代测序技术对四个时期(卵泡直径<5mm,5~8mm,8~12mm和>12mm)的水牛有腔卵泡颗粒细胞进行转录组测序,并进行定性和定量分析。根据GO和KEGG富集分析,寻找影响卵泡发育的候选基因。最后通过整合GWAS结果和转录组测序结果,鉴别影响水牛繁殖性能的关键候选基因,并利用RNAi技术对候选基因IGFBP7在水牛颗粒细胞中进行验证。主要结果如下:
  (1)全基因组关联分析鉴别到与繁殖性状相关的40个SNP和28个候选基因。
  (2)单倍型分析发现在5号染色体的2.3~2.7Mb区域存在一个与水牛繁殖性能相关的QTL区,其中多个SNP主要位于TRHDE基因内和附近的序列上。
  (3)对水牛卵泡颗粒细胞的转录组分析鉴别出17700个基因,其中1076个基因在卵泡发育的不同时期差异表达显著,30个基因在卵泡发育的四个时期有差异表达。差异表达基因数最多的是卵泡发育的最后两个时期。
  (4)差异表达基因在卵泡发育末期主要富集在免疫相关信号通路,提示该时期卵泡为排卵做准备。
  (5)整合GWAS分析结果和转录组测序结果,发现与繁殖性状相关的28个候选基因中有25个基因在卵泡发育不同时期有表达,提示这些基因可能直接参与水牛卵泡发育的调控,从而影响水牛繁殖性能。
  (6)IGFBP7基因在卵泡发育的4个阶段均有较高的表达量。水牛颗粒细胞用RNAi敲低IGFBP7后,增值和凋亡以及雌激素和孕激素的分泌均发生显著的变化。
  2水牛泌乳性状候选基因分析
  本试验分为两个部分。首先对1002头水牛的16个体型外貌指标与产奶量进行回归分析,筛选出与产奶量显著相关的体型外貌指标,并用地中海水牛群体对该指标进行验证。其次,根据获得的体型外貌指标,利用90K Affymetrix Axiom(@)Buffalo SNP Array对176头意大利地中海水牛进行基因分型,质控后,分别与关键体型外貌指标进行全基因组关联分析,寻找与体型外貌指标相关的SNP、候选基因和QTL。主要结果如下:
  (1)通过体型外貌指标与泌乳量的分析,发现乳房性状与产奶量显著相关,乳房性状可做为水牛产奶量的直接或间接指标。
  (2)对水牛前乳头长、后乳头长、前乳头间距、后乳头间距和前后乳距5个乳房性状的全基因组关联分析,共获得10个与乳房性状相关的SNP和5个候选基因,分别是PTPN11、ZNF385B、LRP2、COX18和DTHD1。
  (3)单倍型分析发现一个位于候选基因LRP2内的QTL显著影响水牛的乳房性状。对LRP2进行表达谱分析,发现LRP2在乳腺组织中高表达,推测该基因可能参与调控乳腺的发育以及在泌乳调控过程中参与乳蛋白和乳脂肪的重吸收。
[硕士论文] 于菲菲
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:革兰氏阴性菌已经进化出多种蛋白质分泌系统,以输出或输入跨膜大分子来适应环境和存活。2006年,Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System,T6SS)首次在铜绿假单胞菌和霍乱弧菌中作为新型的细菌蛋白分泌系统被定义,并证明其与致病性有关且介导致病菌与宿主的相互作用。T6SS广泛存在于约四分之一的革兰氏阴性菌中,是一种多功能的注射装置,可以将效应分子传递至环境、真核宿主和原核竞争者。T6SS由跨膜复合物和类似噬菌体尾鞘的针管状结构组成。关于T6SS的结构研究中,普遍认为Hcp是T6SS的关键结构组分,以头对头或头对尾的方式聚合形成环状六聚体从而形成T6SS的内管道,在鞘收缩时推动T6SS靶向细胞以输送效应蛋白。作为T6SS结构重要组成部分的同时,Hcp的分泌作为T6SS发挥功能的标志。
  有关细菌分泌系统的结构和机制研究已取得重大进展。近年来,关于分泌系统在宿主一致病菌的互作中尤其是关于免疫应答的复杂作用己成为研究热点。细菌分泌系统传送效应分子来干扰宿主细胞的正常生理功能,以一定的方式影响炎性小体通路。本研究中,PCN033是分离于病猪的肠外致病性大肠杆菌,通过全基因组测序发现其含一套T6SS基因簇。如其他致病性大肠杆菌一样,PCN033的基因组中有3个hcp拷贝,其中两个位于T6SS基因簇内,另一个位于T6SS基因簇外,分别命名为hcp1、hcp2、hcp3。本实验室已构建了并保存了Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株,hcp作为T6SS发挥功能的标志,缺失hcp后,T6SS无法正常组装进而发挥作用,故本研究利用PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3两个菌株,对PCN033感染后的宿主应答及T6SS在激活炎症过程中发挥的作用进行了探究,主要内容如下:
  1.RNA-seq检测PCN033感染后RAW264.7的转录组变化
  选择小鼠巨噬细胞RAW264.7为PCN033的宿主细胞模型,对感染PCN033后宿主细胞RAW264.7内发生的转录组变化进行分析,发现了508个差异表达的基因,对差异基因进行功能分析,发现在GO数据库中,与之相关且有统计学意义的涉及2052项生物过程、133种细胞组分、211个分子功能及52种KEGG代谢通路。差异基因参与的KEGG代谢通路中与天然免疫相关的有NF-κB、TNF、Apoptosis、TLR、NLR等信号通路。
  2.PCN033激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体
  通过Western-blot检测PCN033感染后RAW264.7中NF-κB信号通路的激活情况和胞内蛋白NLRP3、NLRC4、ASC的表达情况。结果表明,随着感染时间增加,p65发生磷酸化、IκBα降解,NLRP3、NLRC4及ASC的表达均明显上调。这说明,PCN033感染后激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。
  3.T6SS在PCN033与宿主互作过程中的作用
  有文献报道T6SS能够促进小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用。对细胞培养液中的LDH进行检测,发现Δhcp1Δhcp2Δhcp3感染相对于PCN033感染后的细胞毒性显著降低,表明了T6SS对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用有促进作用。PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3以同样的剂量静脉注射小鼠后,通过ELISA测定小鼠血清中的IL-1β。发现相对于野毒株PCN033,缺失hcp后感染使得小鼠产生IL-1β的能力减弱,也就是说T6SS以一定的方式参与PCN033促进IL-1β的释放。进一步,我们对炎性因子的转录水平进行qRT-PCR检测,发现T6SS对促炎因子IL-1β、IL-18、CXCL3、TNF-α的表达有上调作用,说明T6SS确实有一定的促炎作用。经Western-blot检测,发现PCN033感染促进RAW264.7中caspase1的活化及pro-IL-1β的加工,且T6SS在此过程中发挥作用。另外我们发现T6SS参与PCN033感染激活宿主的NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。
[硕士论文] 陈文娟
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:清平猪具有妊娠期短和产仔数多等优良繁殖性状,利用标记辅助选择对繁殖、生长和胴体性状进行选育能有效加快清平猪杂交品系的育种进程。本试验选择了9个候选基因:ESR、FSHβ、PRLR、MC4R、GH、IGF1、NR6A1、FUT1和MUC13,分别对清平猪杂交群体(F1和F2)的繁殖、生长和胴体性状进行关联性分析,以期为生产实践中对清平猪杂交品系的选育提供一些理论依据。本试验的研究结果如下:
  1.F1群体和F2群体的平均妊娠期分别为112.89d和113.36d,总产仔数分别为12.42头和9.98头,清平猪的杂交后代(F1和F2)均具有妊娠期短的优良特性。
  2.FSHβ基因、ESR基因、PRLR基因、IGF1基因和MUC13基因与清平猪杂交后代的关联性:
  (1)两个群体中FSHβ不同等位基因的优势均不明显,不同基因型对F1群体的产活仔数以及F2群体的总产仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重等重要繁殖性状均有显著影响(P<0.05),其对繁殖性状的有利基因型为BB型。
  (2)两个群体中ESR的优势基因均为B等位基因,三种基因型对妊娠期的影响趋势均为AB<AA<BB,对F2群体的妊娠期和木乃伊性状有显著影响(P<0.05)。ESR基因的AB型个体可能具有较短的妊娠期,A等位基因可能会增加每胎木乃伊的数量。
  (3)F1和F2群体中PRLR的优势基因均为C等位基因,不同基因型对F1群体的妊娠期和乳头数(左和右)均有极显著影响(P<0.01),对总产仔数、断奶仔猪数、70日龄存活数和70日龄重均有显著影响(P<0.05),对F2群体的弱仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重均有显著影响(P<0.05),其有利基因为T等位基因。
  (4)F2群体中IGF1-1位点和IGF1-2位点的优势基因分别为G基因和A基因,两个位点对繁殖性状的有利基因型可能均为AA型。
  (5)MUC13基因的G等位基因在F2群体中优势明显,AG和GG型对背膘厚的影响接近显著水平,对妊娠期、断奶仔猪重和3周龄重的影响均显著(P<0.05),其有利基因型为GG型。
  3.MC4R、GH和NR6A1对F2群体生长和胴体性状的影响:
  (1)MC4R的优势基因为G等位基因,不同基因型对背膘厚差异显著(P<0.05),AA型个体的平均日增重与AG型个体差异显著(P<0.05),与GG型个体差异极显著(P<0.01),其有利基因型为GG型。
  (2)GH的G等位基因优势明显,不同基因型对平均日增重的影响接近显著性水平(P≈0.08),对达100kg日龄的影响差异极显著(P<0.01),其有利基因为G等位基因。
  (3)NR6A1的优势基因为A等位基因,不同基因型对背膘厚的影响差异极显著(P<0.01),其对胴体和生长性状的有利基因分别为A和G等位基因。
  4.F2样本中的FUT1基因暂未检测到TT抗性基因型,呈极端单态分布。其对妊娠期、总产仔数、初生重、断奶仔猪数和3周龄重等繁殖性状的影响趋势均为CT>CC,对达100kg日龄的影响接近显著性水平,其有利基因为T等位基因。
[硕士论文] 刘晓蓉
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪δ冠状病毒(PDCoV)是近年发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起仔猪腹泻和肠道损伤。PDCoV为有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目,冠状病毒科,δ冠状病毒属成员。全长基因组约25.4kb,其基因组序列为5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3'UTR,编码15个非结构蛋白(nsp2-nsp16),4个结构蛋白和3个特异性辅助蛋白。研究证实感染脊椎动物的套式病毒目病毒(冠状病毒科和动脉炎病毒科)编码的内切核糖核酸酶(又称为NendoU)较为保守,在病毒的复制和转录中起着关键作用,并且已证实部分冠状病毒的内切核糖核酸酶(nsp15)和动脉炎病毒的同源蛋白nsp11能够拮抗干扰素(IFN)的产生。我们之前的研究发现PDCoV通过抑制RIG-I信号转导拮抗IFN-β的产生,而PDCoV nsp15是否参与拮抗IFN-β的产生尚不清楚。基于此,本课题以PDCoV nsp15作为研究对象,探究其对IFN-β产生的影响以及具体的作用机制。主要研究内容如下:
  1.PDCoV nsp15呈剂量依赖性抑制IFN-β的产生
  将不同剂量的PDCoV nsp15真核表达质粒与IFN-β荧光素酶报告质粒IFN-β-Luc、内参质粒pTK-Luc分别共转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析和RT-PCR检测,发现PDCoV nsp15显著抑制仙台病毒(SeV)诱导的IFN-β启动子激活以及IFN-βmRNA表达,并且呈剂量依赖性,提示PDCoV nsp15具有拮抗IFN-β产生的特性。
  2.PDCoV nsp15主要抑制NF-κB的活化
  IRF3和NF-κB是调控IFN-β产生的关键转录因子,为了探究PDCoV nsp15是否影响它们的活化从而拮抗IFN-β的产生,将nsp15的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现nsp15显著抑制SeV诱导的NF-κB活化并呈剂量依赖性,但对SeV诱导的IRF3的活化无显著影响;IRF3和p65的磷酸化及其核转运分别是IRF3和NF-κB激活的标志,Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明nsp15蛋白主要抑制SeV诱导的p65磷酸化和入核,不影响IRF3的磷酸化和入核。表明PDCoV nsp15主要通过抑制NF-κB的活化拮抗IFN-β的产生。
  3.PDCoV nsp15的关键酶活位点为His219、His234和Lys269
  根据PDCoV和其他冠状病毒nsp15的氨基酸序列同源性比对及结构同源性分析,推测PDCoV的NendoU结构域活性催化氨基酸位点为His219(H219)、His234(H234)和Lys269(K269)。通过定点突变的方法获得3个突变的nsp15基因,并将其和野生型nsp15基因分别克隆至原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6P-1-nsp15以及相应的突变体质粒(pGEX-6P-1-H219A/H234A/K269A),经IPTG诱导表达、纯化后,利用荧光共振能量转移试验(FRET)分析发现,与nsp15野生型蛋白相比,3个突变体蛋白的NendoU活性显著降低,说明His129、His234和Lys269是PDCoVnsp15的关键酶活位点。
  4.PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生不依赖其内切核糖核酸酶活性
  有报道某些冠状病毒nsp15和动脉炎病毒nsp11拮抗I型IFN的产生依赖其内切核糖核酸酶活性;也有研究表明动脉炎病毒nsp11潜在的细胞毒性会影响IFN的产生。为了探讨PDCoV nsp15对IFN-β产生的抑制作用是否依赖于其内切核糖核酸酶活性及细胞毒性,首先检测了PDCoV nsp15野生型和突变体的细胞毒性,发现野生型对细胞有一定的毒性作用,3种突变体对细胞几乎没有毒性。在此基础上,将表达PDCoV nsp15野生型及突变体(H219A、H234A和K269A)的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现,3个突变体与野生型一样均显著抑制SeV诱导的IFN-β产生,相互之间无显著差异;且主要抑制p65的磷酸化,而对IRF3的磷酸化无显著影响。进一步以突变体H234A为代表,检测了nsp15突变体对内源性IRF3和p65核转运的影响,结果与nsp15野生型一样,突变体H234A抑制了SeV诱导的p65入核,但不影响IRF3的入核。上述结果表明PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生和NF-κ3的活化不依赖其内切核糖核酸酶活性,也不是其细胞毒性所致。
[博士论文] 黄淑成
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胫骨软骨发育不良(Tibial dyschondroplasia,TD)是一种家禽的营养代谢性腿部疾病,主要在胫骨干骺端的肥大软骨细胞区出现非血管化和非钙化的不成熟的软骨细胞堆积在生长板,表现为软骨内骨化的异常。在1965年,该病最先在美国被Leach RM和MC Nesheim在青年肉鸡上发现并报道,随后在火鸡和鸭等家禽上也陆续发现,临床主要表现为不愿站立,腿部骨骼变形,行动缓慢并常常以双翅来辅助行走,严重者丧失行走能力,影响采食。禽类TD病在世界各国呈广泛分布,没有区域集中性或特意高发性,每年给全世界禽类行业造成不可估量的经济损失。由于发病原因的复杂性,增加了研究其机理的难度性,肉鸡发生TD的最根本的病因至今还不清楚。
  藏鸡(Tibetan chicken,TBC)主要生活在海拔2,200~4,100m的青藏高原农牧地区,是世界上在高海拔低氧环境生活历史最悠久的土著鸡种,且至今未见有藏鸡腿病的报道,这可能与其长期生活在高海拔低氧环境有关。研究指出肉鸡TD的发生与胫骨生长板血管生成的异常有关,而骨骼的形成过程都与血管生长的过程是紧密相关的。鉴于此,我们对高海拔藏鸡和低海拔肉鸡进行了对比研究,并验证高海拔低氧环境对低海拔肉鸡的胫骨生长发育的影响,也对肉鸡TD的发生是否与胫骨生长板血管生长抑制有关作进一步研究,同时更深入的研究肉鸡发生TD时,胫骨生长板血管生长过程是如何调控的以及血管生成的减少如何影响胫骨的生长和发育。主要研究内容如下:
  1.藏鸡与肉鸡在生产性能和骨骼发育上的对比研究
  与生活在低海拔肉鸡相比,藏鸡在骨骼生长方面是否存在什么特殊之处至今仍很大的未知。在同一月份内,120只1日龄健康高海拔TBC和低海拔爱拔益加肉鸡(Arbor Acres chicken,AAC)分别在两地进行饲养。结果显示:TBC的采食量、日增重和体重,以及胫骨的重量、胫骨的长度和胫骨生长板的宽度均显著低于低海拔AAC(p<0.05)。然而,胫骨的组织病理观察到藏鸡胫骨生长板区域血管的分布明显增多。qRT-PCR结果显示HIF-1α、VEGFA以及其受体VEGFR1和VEGFR2在藏鸡胫骨生长板上的表达量均显著高于低海拔AAC(p<005)。ELISA结果也显示类似的改变,整个试验期间藏鸡血清VEGFA的蛋白含量均高于低海拔AAC。血清中VEGFR2和IL-8蛋白含量除了第7天低于AAC,在第3天、第10天和第14天均显著高于AAC(p>0.05)。这些结果表明,高海拔缺氧环境对TBC的身体和胫骨的生长是抑制的。但藏鸡胫骨生长板区域分布丰富的血管,而且较高血管生成调控基因HIF-1α、VEGFA以及其受体的表达,这可能就是TBC不发生TD的原因。
  2.高海拔低氧环境对肉鸡胫骨生长板上HIF-1α/VEGF/VEGFR信号通路表达的影响
  藏鸡是青藏高原上一个土著的地方鸡种,能够对当地严酷的高原低氧含量、低气压、高寒的环境有很好的适应性。并且通过之前的研究发现藏鸡胫骨生长板区域拥有更丰富的血管分布,血管生长相关调控基因表达水平也较高。那么,高海拔低氧环境是否可以诱导胫骨生长板更多的血管分布还未深入研究。因此,本实验选取120只健康低海拔AAC,运输到高海拔地区西藏进行饲养,分为自然低氧组和正常氧气组进行试验。结果显示,在高海拔低氧环境下AAC的生产性能和体重都受到抑制,死亡率增加;另外,胫骨的重量和长度也不同程度受到抑制。然而,血液常规指标显示在低氧环境下AAC在第14天出现的红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)增加。值得注意的是,胫骨的组织病理学分析显示在自然低氧环境14天后AAC胫骨生长板区域血管密度显著增加。qRT-PCR和Western blot结果显示肉鸡在高海拔低氧的条件下,胫骨生长板上缺氧应激基因HIF-1α和血管生长相关基因VEGFA和VEGFR1的表达水平都有显著的过表达。ELISA检测血清蛋白含量进一步证实缺氧条件下可以增加血清中VEGFA、VEGFR2和IL-8的蛋白含量。这些结果说明,低海拔AAC生活在高海拔低氧环境下,可以通过调控机体缺氧应激基因HIF-1α和血管生长相关基因VEGFA和它的受体的表达,促进胫骨生长板肥大软骨细胞区血管分布的增加。
  3.HIF-1α/VEGF/VEGFR信号通路在福美双诱导的TD肉鸡上的作用机制
  TD是一种比较棘手的家禽腿病问题,组织病理显示在胫骨近端的生长板上出现大面积的非血管化和非钙化的“软骨楔”为特征,导致骨骼钙化不全,这可能与胫骨生长板血管生成异常有关。然而,血管生成抑制在肉鸡TD发生中所扮演的角色仍然还不清楚。通过福美双诱导肉鸡发生TD期间观察到肉鸡发生跛行,胫骨生长板增宽,呈白色的非血管区。对胫骨形态指标测量显示胫骨的重量和长度减少,生长板宽度及生长板宽度系数增加。组织病理显示AAC发生TD时,胫骨近端静止区和增殖区血管的分布没有显著改变,而肥大软骨细胞区血管的分布呈显著的减少并且软骨细胞大量死亡。另外,血常规指标也显示AAC发生TD时,RBC、Hb和Hct都显著减少。接下来通过qRT-PCR、Western blot和ELISA的方法分别检测胫骨生长板上和肉鸡血清中血管生成相关基因和蛋白的表达情况,结果显示:HIF-1α、VEGFA以及它的受体的基因表达和蛋白水平在第7天TD肉鸡组都显著的减少,并且这些基因的表达水平与胫骨生长板血管的分布呈极强的正相关。总之,这些发现说明AAC发生TD时,机体可能是通过下调胫骨生长板上血管生成相关基因和蛋白HIF-1α、VEGFA以及它的受体的表达,从而抑制胫骨肥大软骨细胞区血管的分布,导致家禽胫骨生长发育的抑制。
  4.VEGF/FGF/Ang-1/PDGF-BB及其受体在TD肉鸡胫骨血管形成过程中的作用机制
  先前的研究表明,骨骼是一种高度血管化的组织,并且依赖于血管生成与成骨形成之间的协调耦联。既然血管生成的抑制和肉鸡TD的发生具有极大的相关性,那么肉鸡TD发生时,胫骨生长板肥大区血管形成过程是如何被调控的仍不清楚。研究结果显示:AAC发生TD时,中胚层分化的标志性基因纤维母细胞生长因子2(FGF2)和受体FGFR1表达水平下降;血管岛形成标志性基因血管内皮生长因子(VEGF)和受体VEGFR1\VEGR2的血清蛋白浓度被显著降低;血管岛成熟相关基因的调控包括血管生成素(Ang1,Ang2)以及它们的内皮受体酪氨酸激酶Tie2等相关基因被抑制,这些或许将导致血管发生的推迟。另外,机体通过下调VEGFA和VEGFR1\VEGFR2受体基因和蛋白的表达,上调血小板源性生长因子(PDGF)-BB及受体PDGFR-β基因表达和血清蛋白水平的升高,导致胫骨生长板血管的异常增殖和成熟,血管生成的减少。总之,肉鸡发生TD时,血管生成的抑制可能是通过抑制血管发生和血管生成过程的相关调控基因和蛋白的表达,从而导致胫骨生长板上血管分布的减少。
  5.OPG/RANKL信号通路在TD肉鸡胫骨生长上的作用机制
  TD肉鸡血管形成的抑制势必会影响骨的正常形成,那么骨生成过程发生怎样的异常调控至今仍不清楚。研究结果显示:与正常组AAC相比,肉鸡发生TD时,肉鸡的体重,胫骨的骨量、长度和中央直径都显著减少,并且体重与胫骨的骨量呈正相关。组织病理和形态学结果显示TD肉鸡胫骨近端生长板肥大区血管分布显著减少,软骨细胞呈核固缩和核溶解,生长板宽度增加。血清生化结果显示AAC发生TD时血清碱性磷酸酶(ALP)活性受到抑制,钙磷平衡被破坏。另外,通过qRT-PCR和ELISA检测胫骨生长板和血清中调控骨骼生成相关基因和蛋白发现TD肉鸡胫骨生长板和血清中骨保护素(OPG)基因和蛋白的表达都显著受到抑制,核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达水平上调,这将促进其受体核因子-κB受体活化因子(RNAK)信号的激活。并且OPG的水平与胫骨生长板上血管的分布以及胫骨的生长呈正相关,RANKL呈负相关。这些结果说明肉鸡TD发生时,胫骨近端血管浸入的减少导致软骨细胞的死亡影响骨架的延伸,同时死亡软骨细胞在生长板肥大软骨细胞的堆积,在生长板处形成严重的损伤区域。另外,肥大软骨细胞区血管侵入的减少,血清钙磷水平的失调影响肥大区软骨基质的钙化。基因水平进一步说明,促进骨形成的OPG基因被抑制,而RNAKL基因的上调,促进RNAK信号激活破骨细胞的骨吸收功能,从而影响骨的转化,导致骨量的减少。
  总之,试验通过对藏鸡的研究首次揭示藏鸡不发生胫骨软骨发育不良的生理机制可能是通过长期的高海拔低氧环境适应,上调HIF-1α,VEGF以及其受体基因的表达,提高胫骨生长板上血管的侵入有关;而且,高海拔缺氧环境对肉鸡的影响进一步证实这一作用机制。另外,福美双诱导的肉鸡TD模型显示胫骨生长板上VEGF以及其受体VEGFR1和VEGFR2基因的异常表达,抑制胫骨生长板血管化与肉鸡TD发生存在极强的正相关,这一过程可能是通过血管发生与血管生成过程中相关调控基因的异常表达,从而抑制胫骨血管化的正常分布而实现的;重要的是,血管与骨的形成是紧密相偶联的,胫骨血管化的减少影响OPG/RANKL信号通路的不平衡的表达,血清中钙磷比的异常,最终影响骨的形成,引起胫骨骨量的减少。
[硕士论文] 赵兴
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸腺(thymus)是T细胞发育、分化和成熟的场所,骨髓中淋巴祖细胞在多种趋化因子的作用下进入胸腺,在胸腺微环境内发育分化为成熟的T细胞,进入外周血和淋巴器官中,成为机体健康的卫士。但动物朐腺的增龄性萎缩将导致其功能减退,机体也随之衰老,疾病丛生。因此,掌握动物胸腺发育的基本规律,探索其萎缩的机理和能够增强其功能抑制其退化的有效方法,对疾病的预防和诊断、抵抗免疫衰老具有非常重要的现实意义。目前关于鸡胸腺生长发育过程中的基因表达变化和分子机制的研究鲜有报道。因此,本研究以科宝肉鸡为研究对象,采用HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色、RNA-Seq以及实时荧光定量PCR等方法研究了鸡胸腺生长发育过程中组织结构和基因表达变化规律,主要研究内容和结果如下:
  1.鸡胸腺发育过程中重量和指数的变化规律
  测定了0w、1w、5w、9w、18w和27w鸡(n=6)的体重及胸腺重量,并计算胸腺指数(胸腺重量(g)/体重(kg))。随着周龄的增加,胸腺重量呈现先上升后下降的趋势,18w时胸腺重量达到最大,27w时萎缩严重。0w到1w,胸腺指数呈上升趋势,从1w到27w,胸腺指数呈下降趋势。
  2.鸡胸腺发育过程中组织结构的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织进行石蜡切片,并进行HE染色。结果显示,胸腺分为外周的皮质和内层的髓质,皮质主要由淋巴细胞和少量上皮细胞构成,着色较深;髓质主要由上皮细胞和少量淋巴细胞构成,着色较浅,其中有典型的胸腺小体结构。随着周龄增加,鸡胸腺皮质逐渐变薄,髓质面积增加,皮髓面积比逐渐减小,胸腺中血管和胸腺小体呈增多趋势。
  3.鸡胸腺发育过程中细胞增殖的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行免疫组织化学染色,检测PCNA阳性细胞的分布和发育变化规律。结果显示,PCNA阳性细胞在胸腺皮质和髓质均有分布,随周龄增加,阳性细胞数目逐渐减少。以上结果表明,鸡胸腺中细胞增殖活动随着周龄的增加而减弱。
  4.鸡胸腺发育过程中肥大细胞的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行甲苯胺蓝染色,检测肥大细胞的分布和发育变化规律。结果显示,肥大细胞主要位于胸腺髓质和血管周围。肥大细胞数目在1w升高然后下降,在9w又升高以后逐渐减少。
  5.鸡胸腺发育过程中基因表达的变化规律
  采用RNA-Seq技术检测鸡胸腺发育过程中的基因表达变化规律。测序共获得原始数据21723697300bp,经过过滤质控去除低质量读段后,剩余有效数据21708736650bp,有效读段434174733条,平均24120819条有效读段,有效读段率均大于99.8%,与参考基因组比对率均达到了90%。根据基因表达量进行表达趋势分析,共获得显著富集趋势10个。对持续上调趋势Profile39和持续下调趋势Profile8进行GO和KEGG通路富集分析发现,profile39(即上调趋势)GO富集主要与炎症、免疫、信号转导、凋亡等有关;KEGG富集主要与免疫系统、分泌系统、感染性疾病、信号传递、细胞活动和脂质代谢有关;profile8(即下调趋势)GO富集主要与遗传物质相关组成、传递、修复以及能量代谢等有关;KEGG富集主要与细胞生长和死亡、遗传信息传递、能量和碳水化合物代谢、氨基酸和核苷酸代谢有关。
  对下调趋势细胞周期通路中与细胞增殖和遗传信息传递密切相关的几个关键基因PCNA、CDK1、CCNA2、CCNB2进行实时荧光定量PCR检测,发现其变化规律和测序结果一致,随周龄增加表达量持续降低。
  以上研究结果表明,随着周龄增加,细胞增殖减少,胸腺结构完整性被逐渐破坏,微环境发生变化,导致胸腺重量减少。胸腺中遗传物质传递被破坏阻断,胸腺中物质代谢水平降低,脂肪代谢增加,炎症反应和免疫反应增强。
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