绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 14
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 273 条结果
[硕士论文] 闫宁
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:细菌生物膜是指细菌为适应特定自然环境,在生长过程中形成的附着于固体介质表面的特殊功能结构。生物膜的形成能力对细菌发挥生理功能具有决定性因素,大量报道发现,生物膜在菌体的胁迫抗性、耐药性、宿主吸附、有效侵染及致病性等过程中具有重要功能。不同细菌形成的生物膜组份变化多样,而且影响生物膜形成的环境因素和调控机制也不尽相同。开展相关研究对于全面认识细菌的群体行为及解析重要代谢功能的发挥具有重要意义。施氏假单胞菌A1501是一株联合固氮菌,可以侵入禾本科植物的内根际进行固氮作用。围绕该菌的固氮基因表达调控、环境适应机理等工作开展了大量的研究,但关于A1501生物膜形成机理及其对外界信号的响应机理未见报道。本研究测定了A1501菌生物膜的组成成分、影响生物膜形成的环境因素与营养条件,明确了A1501菌生物膜形成的最适条件,进一步聚焦外界葡萄糖信号诱导生物膜形成的分子机理,取得了以下结果:
  (1)在A1501菌生物膜形成前期与成熟期分别加入蛋白酶K、DNaseⅠ、纤维素酶、藻酸盐裂解酶处理菌体,结晶紫染色检测4种酶对生物膜形成能力的影响,进而验证A1501菌生物膜形成的主要影响因素。结果显示,无论生物膜形成前期与成熟期加入4种酶类,均可以抑制或降解生物膜的形成。推测蛋白质、DNA、纤维素、藻酸盐等成分是A1501菌生物膜的重要影响因素,推测为重要组成成分。此外,研究通过设置不同酶浓度梯度与处理时间,建立了酶处理A1501生物膜的反应体系。
  (2)测定了不同NaCl浓度、pH值、温度等培养条件下A1501生长及其生物膜形成的机理。研究发现,NaCl浓度2mmol/L、pH值6.8、温度30℃是A1501的最适生长条件,而在0.6mol/L的NaCl、pH值6.0及温度40℃等胁迫条件下,A1501菌的生物膜形成量均达到最高,分别为最佳生长条件下的7.8、7.0和2.0倍。除环境因素外,同时测定了不同碳氮条件对A1501生物膜形成的影响,结果表明非优势碳源葡萄糖的添加诱导了生物膜的形成,达到优势碳源乳酸钠培养条件的2.3倍。不同氮源浓度对A1501生物膜形成的测定表明,限氮条件下生物膜形成量最高,为有氮(2-24mmol/L)条件的2.4-5.7倍。
  (3)确定了A1501生物膜形成的最适条件,分别为NaCl浓度0.6mol/L,pH值6.0,温度40℃,碳源为葡萄糖,限氮。上述3种环境因素与2种营养条件均对A1501菌生物膜形成具有显著影响,且呈现出规律性,即生物膜的形成与菌体生长负相关,即高盐、弱酸、高温、葡萄糖、限氮等条件不利于A1501的生长,但刺激了其生物膜的形成。
  (4)研究发现葡萄糖的添加强烈诱导了A1501生物膜的形成,推测葡萄糖是诱导A1501生物膜形成的重要信号分子。通过qRT-PCR分析,发现葡萄糖的添加特异的诱导了A1501菌中参与生物膜形成的多个基因的表达,包括非编码RNA rsmX1、RNA聚合酶因子AlgU基因,脂多糖基因lpxB、kdsC、rmlD、wbpM,但是第二信使环二鸟苷酸c-di-GMP调控基因sadC与bifA及纤维素合成基因bcsA与bcsE的表达量没有受到影响,暗示葡萄糖可能通过诱导RsmA调控系统、AlgU调控系统与脂多糖合成的途径刺激了A1501生物膜的形成,具体作用机理值得进一步深入研究。
  综上所述,本研究初步明确了A1501菌生物膜的组成成分,阐明了外界环境因素与营养条件对A1501菌生物膜形成能力的影响,进一步解析了A1501生物膜的形成机理,筛选获得了生物膜形成的外界信号分子葡萄糖,并就葡萄糖诱导生物膜形成的分子机理进行了初步的探索,为深入阐述A1501菌的生物膜分子调控、根系定殖与生物固氮的协同关系研究奠定了重要的理论基础。
[硕士论文] 张念
通信与信息系统 重庆理工大学 2017(学位年度)
摘要:微藻的高效培养是生物能源开发利用的前提及关键,目前关于微藻培养方法有悬浮培养和固定化培养。虽然微藻悬浮态培养模式的操作方便,但采收困难、复杂而且采收的成本比较高;而微藻固定化培养模式的操作稳定、生物量密度高,同时采收便利快捷、能耗低等优势,目前已成为微藻领域研究者关注的焦点。虽然微藻固定化培养具有诸多优点,但是微藻品质,尤其是微藻生物量受生物膜生长因素影响显著。因此,开发出一种快速简便的无损在线检测方法对微藻生物膜生长信息进行监测,以便于及时调节生长条件来提高微藻生物膜量尤为重要。
  高光谱成像技术作为一种新型的无损、快速、准确的检测技术,该技术结合了计算机视觉和光谱检测两种技术的优点,能够很好的记录生物膜生长的丰富信息,可为微藻生物量的快速无损检测找到了一条简便有效的方法。本文利用高光谱技术与生物测量技术结合,对不同生长环境条件下的微藻生物膜反射光谱特征与生物膜量预测两方面分别进行研究分析,提出了一种基于高光谱的微藻生物膜量的监测方法,为微藻生物膜生长信息的快速获取提供了技术支持以及微藻生物膜的高效培养提供了参考。
  取得的研究结果如下:
  ①培养了不同温度、不同PH值以及不同光强条件下的微藻生物膜。
  ②根据高光谱成像仪的理论基础,搭建了高光谱图像采集系统,并对微藻生物膜生长信息进行检测,获取了不同温度、PH值以及光强条件下微藻生物膜的高光谱信息。
  ③根据微藻生物膜的原始光谱反射值有三个明显的特征峰,特征波长(789nm、811nm、930nm)处对应的光谱反射值随培养时间的增加而降低。
  ④根据采集到微藻生物膜的光谱反射数据,通过衡量生物量的光谱特征变量,提取出了25个与微藻生物膜量有关的光谱特征变量,计算出了每个特征变量的相关性系数。
  ⑤采用相关性系数绝对值大小来衡量,提取出了与微藻生物膜干重关联度前四的光谱特征变量,分别为:+SDy)(SDr-SDy)/(SDr、SDr、OSAVI、NDVI。将这四个光谱特征变量构建了三种数学预测模型,对比分析了BP神经网络预测模型、单一光谱特征变量以及多特征变量融合的预测模型,通过模型预测的耗时以及精确度来衡量,结果表明多特征变量融合模型对微藻生物膜量的综合评价最高。
  ⑥根据原始光谱反射值的变化以及微藻生物膜量的预测模型结果分析,小球藻生物膜培养的最佳生长环境是:温度为28℃、PH值为8、光照强度为3500lx,而且预测模型还可以预测出不同时间的微藻生物膜量。
[硕士论文] 王卫芳
生物学、生理学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:巨噬细胞是一类具有高度异质性和可塑性的免疫细胞群体,起源于骨髓的单核细胞,能够改变自己的表型以适应于所处微环境。巨噬细胞极化分为经典活化型巨噬细胞(classically activated macrophage,M1)和替代活化型巨噬细胞(alternativelly activatedmacrophage,M2)两种类型。巨噬细胞在γ-干扰素(IFN-γ)、细菌脂多糖(LPS)刺激下分化为M1型巨噬细胞,分泌多种促炎细胞因子、活性氧等,如TNF-α、IL-1β、ROS等以清除病原体、坏死组织和激活其他免疫细胞,帮助机体抵御感染。M2型巨噬细胞由IL-4、IL-13诱导产生,可分泌多种抗炎因子,如Ym-1、IL-10等,主要出现在炎症消退阶段有助于组织修复。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶多酚的主要活性成分,具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物学效应。EGCG抗癌和抗炎作用机制已有较多的研究。但EGCG能否影响髓源性巨噬细胞的极化,目前并不清楚。因此,本实验通过观察EGCG对髓源性巨噬细胞分化的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的标志性因子的表达情况探讨EGCG对髓源性巨噬细胞极化的影响。
  本研究以6~8周龄C57BL/6小鼠骨髓细胞为材料,经100 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)体外诱导分化为巨噬细胞(bonemarrow-derived macrophages,BMDM),加入50 ng/mL的IFN-γ和1μg/mL的LPS刺激分化为M1型巨噬细胞,或者加入20 ng/mL的IL-4刺激分化为M2型巨噬细胞,然后暴露于12.5~50μmol/L的EGCG处理,7天后收集细胞提取RNA和蛋白,利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA),检测M1型巨噬细胞标志物iNOS和促炎因子IL-1β、TNF-α以及M2型巨噬细胞标志物Arg-1、Ym-1和抗炎因子IL-10的mRNA表达水平和蛋白含量。结果显示, IFN-γ和LPS刺激使髓源性巨噬细胞的IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA和蛋白水平上调,而EGCG处理可抑制IFN-γ和LPS刺激的IL-1β、TNF-α和iNOS表达,且具有剂量依赖效应。IL-4刺激使髓源性巨噬细胞的Arg-1、Ym-1、IL-10表达上调,EGCG处理组可增强Arg-1、Ym-1、IL-10的表达,且存在剂量依赖效应。上述结果表明,EGCG以剂量依赖方式减弱M1型巨噬细胞标志因子的表达,而增强M2型巨噬细胞标志因子的表达。
[博士论文] 李臻
化学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:生物膜系统具有阻挡外源伤害,维持生命活动稳定、有序进行的功能。生物膜系统作为生物体的外层结构,为生命活动的进行提供必要的能量、信息、物质的交换。生物膜系统的选择性通透能力为生物体提供交换途径的同时也起到保护作用。对于作用靶点在胞内的药物,其发挥作用的先决条件是要穿透细胞膜进入细胞内。然而生物膜的屏障作用阻止了许多药物的渗透,从而很大程度上限制了这类药物分子的生物利用率。因而,生物膜渗透能力成为药物筛选的重要研究内容。
  近三十年间,生物膜系统的功能性与药物渗透性研究由复杂的体内实验逐渐发展到体外实验。体外模型涵盖了计算机模拟、分子水平、人工膜水平、细胞水平、组织水平实验等诸多方式。然而在渗透性检测方法上的突破十分有限,目前的研究报道大多基于荧光标记、电学信号检测等模式。然而部分荧光标记分子对细胞功能可能具有一定的影响,且荧光修饰改变了药物分子的原有结构,难以在接近真实环境中进行药物渗透能力的检测。电学信号检测的芯片结构和设备较为复杂,电极容易受到污染,方法重现性较差。为克服现有研究方法的缺点,本论文旨在建立一种非标记光学检测方法,用于生物膜功能和药物渗透性的研究。论文构建了基于硅纳米孔阵列的支撑人工生物膜系统,利用硅纳米孔阵列的微结构和反射干涉光学现象研究了人工生物膜系统对纳米孔的封闭效应。在所构建的光学传感平台上研究了离子通道蛋白对氢离子的选择性通透功能,同时研究了肽类物质的跨膜行为,以及药物分子跨越内皮细胞的能力。上述研究工作为非标记光学传感器应用于药物筛选奠定了基础。本论文的主要内容如下:
  (1)构建了一种硅纳米孔阵列-水凝胶复合材料支撑型人工细胞膜系统,在H+敏感水凝胶的信号放大作用下,研究了复合材料在微环境下对H+的高灵敏传感能力,采用微流控技术成功构建了纳米孔阵列支撑的磷脂双分子层(Phospholipid bilayers,PLBs),傅里叶变换反射干涉光谱(Fourier transferred-reflectometric interference spectrum,FT-RIS)结果表明PLBs能有效阻断溶液中的H+向纳米孔阵列的扩散。在PLBs中镶嵌离子通道蛋白(短杆菌肽A)后,该人工细胞膜恢复了部分离子通透功能。在此基础上研究了离子通道抑制剂的抑制作用,建立了离子通道靶向药物筛选的模型。
  (2)构建了一种硅纳米孔阵列表面支撑型人工细胞膜系统,基于人工细胞膜对纳米孔阵列表面非跨膜生物分子的封闭作用,建立了多肽跨越细胞膜过程的实时光学检测方法,研究了TP2、Cecropin A、hIAPP、Dermaseptin等多种跨膜肽(Membrane-translocating peptides,MTPs)分子跨越细胞膜的动力学过程,建立了不同类型MTPs的区分模型,结果与真实微生物抗菌结果、真实细胞膜相互作用结果相吻合。最终建立了针对载体型MTPs和抗菌型MTPs的药物筛选模型。
  (3)构建了一种硅纳米孔阵列支撑的体外血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)系统,基质胶Matrigel(@)共培养状态下成功实现了人脑微血管内皮细胞hBMECs的体外培养并形成了紧密连接结构。基于BBB对纳米孔阵列表面非渗透型分子的封闭作用,建立了体外BBB的非标记光学检测方法,研究了不同培养时间下体外BBB通透性的改变,用乙酰胆碱、荧光素钠等模型分子验证了所构建的体外模型。用该模型测试了氯霉素、环丙沙星、红霉素等多种抗生素对BBB的渗透能力,建立了脑外伤药物的体外筛选模型。
  (4)构建了一种硅纳米孔阵列表面固定微生物层的系统,基于硅纳米孔阵列的封闭效应,建立了微生物的非标记分析方法。将特定抗体(E.Coli抗体)固定于纳米孔阵列表面并捕获E.Coli后,微生物层对纳米孔阵列的分子通透产生阻碍作用。以BSA作为探针分子,通过测量不同封闭状态下BSA对多孔层光学信号的变化,建立了用于微生物层密度定量分析的非标记光学方法,上述方法在抗菌药物筛选中具有潜在的应用价值。
  (5)论文的最后一章介绍了作者在美国斯坦福大学医学院交流访问期间所做的研究工作,建立了一种用于疾病诊断的比色阵列传感器。该比色阵列对不同来源的尿液样本能产生特征光学响应,利用成像系统和信息学图像分析方法提取光学响应信号,并利用统计学算法筛选出阵列式传感的最优化组成。在最优化条件下实现了川崎病和普通发烧患者之间的区分,在训练组中灵敏度和特异性分别为0.94和0.91(其ROCAUC值达到0.981),测试组中则达到0.94和0.82(ROCAUC值为0.873)。利用统计学算法进行文献信息挖掘并探讨了该传感器的作用机理。
[硕士论文] 路永鹏
动物学 河北大学 2016(学位年度)
摘要:家蝇Musca domestica的整个生活史都与复杂的微生物环境有着紧密联系,其高效的先天免疫防御机制能够保护家蝇不受病原菌的侵害。但同时,微生物又在家蝇幼虫发育中起着至关重要的作用,不恰当的免疫应激可能对无害的共生菌群造成破坏,或对机体造成损伤。因此家蝇需要严格控制免疫系统的强度,在维持共生菌与应对病原体感染之间取得平衡。作为一种模式识别受体,肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)在免疫系统应对细菌感染过程中起着重要的调控作用。本实验室前期在家蝇中克隆得到一种肽聚糖识别蛋白 PGRP-SC,该蛋白在家蝇幼虫肠道中表达量最高,我们猜测家蝇PGRP-SC可能在肠道免疫中起调控作用。为验证这一假设,我们通过RNAi技术干扰家蝇幼虫PGRP-SC基因表达,进而对该肽聚糖识别蛋白在家蝇幼虫肠道免疫中的功能进行鉴定。
  本研究主要内容包括:⑴使用注射法和投喂法两种方式尝试对家蝇幼虫PGRP-SC基因进行RNA干扰:首先通过体外合成双链RNA(double-strand RNA, dsRNA)并注射到家蝇1龄幼虫体内,利用qPCR技术检测PGRP-SC基因的表达情况。结果显示,与阴性对照组相比,在注射48 h后干扰组幼虫目的基因表达量出现极显著下调,最大干扰效率为70.94%。接下来,我们对家蝇1龄幼虫投喂表达dsRNA的大肠杆菌,并利用qPCR检测PGRP-SC基因表达情况。结果显示,与阴性对照组相比,在注射24 h后干扰组幼虫目的基因表达量出现显著下调,在注射48 h后干扰组幼虫目的基因表达量出现极显著下调,最大干扰效率为53.95%。⑵通过投喂表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的大肠杆菌可以在荧光显微镜下监测摄入的外源细菌在家蝇幼虫肠道内的时空动态。分别对阴性对照组和干扰组完成投喂后,放置30 min再次在荧光显微镜下观察,发现干扰组幼虫肠道内荧光明显减弱,说明摄入的大肠杆菌被幼虫清除。⑶分别对空白对照组、阴性对照组以及干扰组幼虫肠道内过氧化氢含量进行检测,发现各组数据之间没有显著性差异,推测在上述清除过程中不涉及过氧化氢合成的参与。⑷利用荧光定量PCR技术,分别对阴性对照组和干扰组幼虫肠道内attacin, diptericin, muscin和cecropin等抗菌肽基因的表达情况进行了检测,并发现干扰 PGRP-SC表达之后,4种抗菌肽基因表达均有不同程度的显著上调,表明PGRP-SC在控制家蝇幼虫肠道免疫敏感程度中起作用。干扰PGRP-SC基因表达可能引起IMD通路激活并导致下游抗菌肽的合成,从而对摄入肠道内的外源大肠杆菌进行清除。
[硕士论文] 章纬菁
生物学;生物化学与分子生物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:哺乳动物是地球上最为高等且占据主导地位的一类脊椎动物。其中绝大多数体表被有毛发,体温恒定,具有肉食、草食、杂食等多种食性。哺乳动物的生存环境多样----陆地、海洋、天空、洞穴都有其身影。由于哺乳动物类群的庞大和多样性,在长期的进化过程中,为了适应不同的生存环境,哺乳动物中某些特殊类群势必发生了较其他类群显著不同的适应性改变。先天免疫作为大多数动物抵御病原微生物入侵的系统,是较为古老的、机体抵御外界病原微生物的第一道防线。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一个介导先天免疫的古老家族,分为病毒型和非病毒型两类。其中TLR3、TLR7、TLR8和TLR9属于病毒型TLRs。它们定位在胞内体膜上,识别病毒的核酸类物质。由于哺乳动物的生存环境和食性等的巨大差异,其面临的病毒种类也有所不同。然而,关于病毒型TLRs的进化研究一般认为其较为保守。
  本研究选取27个哺乳动物的TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的序列进行了进化分析。PAML的位点模型、枝位点模型以及Datamonkey的SLAC、FEL、REL模型分析发现,这4个基因在哺乳动物中检测到了大量的正选择位点,其中TLR9最多。并且绝大多数位点位于胞外域的LRR功能域中。LRR功能域是直接与PAMPs结合的区域,受到了较为强烈的正选择作用。通过枝位点模型和free-ratio模型分析发现,病毒型TLRs在鲸类物种和翼手目物种受到了较强的选择压力。推测鲸类及翼手目在长期的进化过程中,由于海洋生存环境以及天空、洞穴的生存环境,使得其面临的病毒类型、数量和大多数哺乳动物存在有差异,其病毒型TLRs受到的选择压力发生了改变。在其它枝系如鲸偶蹄目、灵长目等也检测到了正选择信号,说明哺乳动物病毒型TLRs受到了普遍的正选择作用。其中TLR9检测到了最普遍的正选择信号,推测可能与其是唯一识别DNA物质的TLR有关,是与病毒长期共进化的结果。除此之外,本研究还在细胞水平上对瓶鼻海豚TLR8基因进行了功能验证。结果发现瓶鼻海豚的TLR8基因是有免疫应答功能的基因,可以被TLR8特异配体R848刺激激活,但是与家牛比较,其对R848的敏感程度不如家牛TLR8。这可能是由于鲸类为了适应海洋环境,其先天免疫基因TLR8发生了某些适应性进化。
[硕士论文] 熊伟
动力工程及工程热物理 重庆大学 2016(学位年度)
摘要:微藻作为一种最具有潜力的新型生物质,具有光合效率高、零净碳值、易培养、生长周期短、油脂含量高、环境适应性强等优点。微藻吸附式生物膜培养可有效提高光生物反应器内单位体积生物量,且具有操作稳定、采收方便、节能等优点,相比于悬浮态微藻培养技术具有更大优势。因此本文采用普通小球藻作为实验藻种,以琼脂凝胶作为微藻营养物质的供给源层,微孔滤膜作为微藻生物膜吸附基质构建了源层/基质层双层结构微藻生物膜反应器,在相同环境条件下,分别利用柱式光生物反应器和双层结构微藻生物膜反应器进行了微藻悬浮式培养和吸附式生物膜培养,研究了光传递及 CO2供应对微藻悬浮细胞和生物膜生长的影响,从而从光传递角度和 CO2供给角度解释微藻生物膜培养的优势所在。然后,基于双层结构微藻生物膜反应器研究了营养液供给对生物膜形态、微藻生长以及微藻油脂积累的影响,为微藻生物膜培养方法的发展和应用提供实验指导。最后,为了高密度培养微藻并节约水资源投入、减少采收脱水能耗,参考膜生物反应器的构造,采用强度高、生物相容性好的永久性亲水PVDF/PTFE复合滤膜材料作为微藻吸附基质,设计了密闭腔式微藻生物膜光生物反应器及其实验系统,并进行了该培养系统的性能优化实验,以获得其运行最佳条件,并评估了该培养系统的水资源投入情况。全文主要结论如下:
  ①吸附式生物膜培养达到稳定时,生物质面积密度为99.44g/m2,比悬浮式培养最终生物质面积密度高35.07%;入射光为120μmol/(m2·s)时,在相同生物质面积密度条件下,光在生物膜内穿透优于悬浮液,有效照射比例明显高于悬浮液生物膜培养中。光能有效穿透微41.35±3.73μm厚度的藻生物膜(对应40 g/m2),当生物膜面积密度低于40g/m2时,光能穿透整个生物膜,当面积密度为100g/m2时,生物膜上层40%的部分被有效照射,而悬浮液有效照光照比例仅为2.5%。当初始接种密度为12.5g/m2时,微藻生物膜的生长速度最大为27.85g/(m2·day),光能穿透整个生物膜,继续提高接种密度,微藻生物膜生长速度降低。
  ②以相同浓度的CO2作为碳源时,生物膜培养生物量高于悬浮态培养;空气作为碳源时,生物膜有较好的生长,而悬浮细胞几乎不生长;生物膜培养 CO2的饱和点为1.5%,悬浮培养 CO2饱和点为4.5%,生物膜对 CO2具有更好的亲和能力。
  ③营养液供给对生物膜结构影响明显,当琼脂浓度从0.125%升高到8%时,生物膜含水量降低,微藻细胞缩水变小,微藻生物膜变得更加致密,微藻生物膜厚度从91.23降到62.33μm;营养液供给对微藻光合生长影响明显,琼脂浓度从0.125%升高到8%时,单位厚度生物膜内含水量(第2天)从18.12降低至9.19mg/μm,光和 CO2向生物膜内部传递阻力减小,加速了微藻光合生长,使得最终生物膜密度从40.56提高45.9%至59.16g/m2;营养液供给对微藻油脂积累影响明显,相对较低的生物膜含水量有利于油脂积累,当琼脂浓度从0.125%升高到8%时,油脂含量从25.21%提高到28.24%,油脂产量提高了63.39%。
  ④基于光和CO2的传递及含水量的影响,设计了密闭腔式微藻生物膜膜式反应器,最佳运行条件为反应器设计高度5cm,最佳光照强度为200μmol/(m2·s),最佳培养基方案为0.1N-BG11×20,最佳率为0.018VVM,最低培养基体积为5L/m2;微藻生物膜膜式反应器性能优良,生物质产量高达178.25g/m2,油脂含量为20.25%,油脂产量高达36.10g/m2;微藻生物膜膜式反应器生产1kg干藻和1kg油脂的水足迹分别为28.05L、138.50L,相比于悬浮培养方式最高减少了2828.95L/kg。
[硕士论文] 徐海燕
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:细胞中存在多种模式识别受体(PRR),PRR可以识别入侵细胞病原体产生的病原相关分子模式(PAMP),这是天然免疫系统应对病原体入侵的第一步。I型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type1,HSV-1)是一种双链DNA病毒,作为一种典型的DNA病毒,HSV-1感染后可以显著诱导细胞内DNA受体识别信号通路介导的抗病毒天然免疫反应。细胞内存在着以cGAS(cyclic GMP–AMP synthase)、IFI16(interferon-inducible protein16)为代表的多种DNA识别受体,HSV-1 DNA可被多种DNA受体识别。cGAS可识别胞内多种DNA,诱导抗病毒天然免疫,且不依赖于细胞类型,是胞质内重要的DNA sensor。cGAS结合DNA后催化ATP和GTP形成环化二核苷酸cGAMP。2,3,-cGAMP结合到干扰素刺激基因STING(stimulatorof interferon genes)上,激活的STING进一步招募TBK1(TANK1-binding kinase1),促进转录因子IRF3和 NF-κB的激活,最终导致 IFN-Ι及其它细胞因子的产生。cGAS-STING信号通路的激活,在宿主抗HSV-1感染免疫中发挥着重要的作用。HSV-1编码的病毒蛋白 UL24整个疱疹病毒家族中高度保守。尽管已发现HSV-1 UL24在病毒致病中发挥重要作用,然而UL24在逃逸宿主抗病毒天然免疫中的作用尚未见报道。本研究旨在探讨UL24是否参与HSV-1逃逸宿主抗病毒作用及其分子机制。
  本研究发现,UL24抑制cGAS-STING介导的天然免疫信号通路,参与病毒的免疫逃逸。本研究首先通过双荧光报告实验证实,外源超表达 UL24能够抑制cGAS-STING介导的 IFN-β启动子的激活且其抑制作用并不依赖其核酸内切酶结构域。通过转染 cGAS-STING信号通路接头分子确定 UL24的抑制作用发生在cGAS-STING信号通路的NF-κB分支的p65水平。免疫荧光实验证实,超表达UL24抑制TNFα诱导的p65的入核。免疫共沉淀实验发现UL24与p65之间存在相互作用,从而阻止了p65入核。在病毒感染水平,感染了UL24缺失的HSV-1株病毒(UL24X)的细胞,其IFN-β产生量明显高于野生型(WT)HSV-1。综上所述,UL24可抑制cGAS-STING信号通路,UL24作用于cGAS-STING信号通路的NF-κB分支的p65水平,进而抑制cGAS-STING介导的天然免疫信号通路,参与病毒的免疫逃逸。
[硕士论文] 叶瑞婕
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:天然免疫信号通路通过模式识别受体识别病原相关分子模式抵抗病原微生物入侵。当DNA病毒入侵时,DNA识别受体识别病毒双链DNA并介导天然免疫反应,其中NF-κB信号通路发挥重要作用。泛素化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰,参与很多重要生命过程,如信号传导、蛋白质降解及免疫应答反应等。多种病毒编码的去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)可通过调控宿主蛋白的泛素化来干扰宿主抗病毒应答。人类I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type1,HSV-1)是一种线性双链DNA病毒,在人群中极为常见,可导致口唇疱疹、角膜结膜炎、脑炎等疾病。HSV-1编码皮层蛋白UL36,其蛋白氨基端的去泛素化酶结构域,称为UL36USP,目前UL36USP干扰宿主抗病毒天然免疫信号通路的机制尚不清楚。
  本文通过双荧光素酶报告基因检测系统结合多种分子生物学、免疫学实验技术及利用细菌人工染色体技术构建的突变病毒,研究HSV-1 UL36USP干扰宿主DNA受体信号通路的分子机制,以阐明 UL36USP在 HSV-1致病机制中的作用,为防治疱疹病毒寻找新的药物靶点及研发新型药物和疫苗奠定理论基础。细胞质DNA受体cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)识别外源DNA,利用STING(stimulator of interferon gene)介导的下游信号通路能显著抑制HSV-1的复制。本研究发现,外源表达的UL36USP可以抑制ISD(interferon stimulatory DNA)激活的干扰素β(interferon-β,IFN-β)的转录。双荧光素酶报告基因实验显示,UL36USP可以抑制cGAS和STING激活的IFN-β和NF-κB的启动子活性。同时,UL36USP可以抑制超表达STING、TBK1(TANK-binding kinase1)、IKKα(IκB kinaseα)、IKKβ激活的 NF-κB启动子活性,但不能抑制 p65激活的 NF-κB启动子活性,这说明UL36USP对NF-κB通路的抑制水平在IKK和p65之间。进一步研究发现,UL36USP可以去泛素化IκBα抑制IκBα降解,从而抑制NF-κB激活。接下来我们用缺失了去泛素化酶活性的重组病毒(C40A HSV-1)来验证UL36USP的作用,发现C40A HSV-1不能去泛素化IκBα,且感染C40A HSV-1的细胞,其IFN-β产生量明显高于野生型(WT)HSV-1。这些结果表明,在DNA受体信号通路中,UL36USP利用其去泛素化酶结构域,通过去泛素化IκBα抑制NF-κB的激活,从而逃逸宿主的抗病毒天然免疫反应。
[硕士论文] 张丹丹
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:天然免疫系统主要通过模式识别受体识别病毒的入侵,进而产生一系列的细胞因子抵抗病毒的入侵。在DNA病毒感染的宿主细胞中,病毒的核酸被DNA受体所识别,从而启动下游信号级联反应,诱导I型干扰素(type I interferons,IFN-I)、促炎症细胞因子(proinflammatory cytokines)等的产生。cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)作为DNA识别受体与STING一起激活天然免疫信号通路。研究表明,cGAS结合DNA后可催化合成cGAMP(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate),cGAMP作为一种第二信使被STING识别,STING活化后招募TBK1,并进一步促进IRF3的磷酸化、激活、入核,从而诱导IFN-I的表达。I型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type I,HSV-1)编码的VP24是一个由UL26基因编码的丝氨酸蛋白酶,作为一个必需基因,VP24缺失后,病毒基因组 DNA不能有效包装入核衣壳内,严重影响了子代病毒粒子的成熟。病毒为了完成它们的生活周期,必须主动调控宿主IFN介导的免疫应答。现有研究表明,HSV-1编码的多个病毒蛋白逃逸宿主的抗病毒天然免疫。
  本研究发现VP24是第一个被鉴定到的DNA识别受体信号通路的拮抗剂。发现VP24对ISD激活的IFN-β mRNA转录有明显抑制作用;通过共转染低剂量cGAS和STING或单独过表达高剂量STING激活DNA识别受体信号通路,发现VP24能够抑制IRF3启动子激活的IFN-β,但是对NF-κB启动子激活的IFN-β却没有作用;进一步的研究我们发现VP24在TBK1和IRF3之间的信号传递中发挥作用。非变性胶实验以及IRF3磷酸化实验表明VP24下调IRF3的二聚化以及磷酸化,而在敲低了VP24的情况下,IRF3的二聚化及磷酸化得到恢复。免疫共沉淀结果证明,在 HSV-1感染细胞中,VP24能够影响 TBK1和IRF3的相互作用。综上所述,这些结果证明HSV-1 VP24蛋白通过影响TBK1和IRF3的相互作用,进而抑制ISD诱导的DNA识别受体信号通路的激活,阻止IFN-β产生,这可能直接参与了HSV-1感染的致病。在本研究中我们发现了VP24的新功能,即参与了HSV-1的免疫逃逸作用。
[硕士论文] 任莹
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:IFN家族是调节先天免疫以及机体抵抗病毒感染的最重要的细胞因子。IFN家族包括三大类:I型、II型和 III型。它们主要是通过激活一系列信号分子来发挥生物学效应,其中包括Janus激酶、信号转导和转录激活子(STAT)。STAT家族包括七个成员,其中STAT1参与所有三类IFN信号的调控。STAT1活化后形成转录复合物,进入核内,结合到干扰素刺激基因(ISG)的启动子元件ISRE上,从而诱导一系列ISGs的表达。STAT1活化主要是依赖其蛋白上701位酪氨酸位点磷酸化(pY701-STAT1)。维持细胞核内有效的pY701-STAT1水平能够维持IFN信号和抗病毒功能。目前关于STAT1蛋白的研究主要集中在总STAT1上。总STAT1不同的转录后修饰,比如:甲基化、乙酰化、SUMO化和泛素化,都参与STAT1信号的调控。但是,详细的机制研究仍然很贫乏。而关于泛素修饰方面,细胞因子如何诱导STAT1泛素化,以及STAT1泛素化在调控细胞信号中发挥怎样的作用尚未知。细胞因子比如IFN,短时间刺激细胞数小时,总STAT1蛋白仍相对比较稳定。由此可见,在IFN活化信号的早期,总STAT1的泛素化和蛋白水平的变化对于IFN的早期信号影响并不大。如前所述,pY701-STAT1传递了IFN信号入核,是 IFN信号的核心和关键。因此,阐明活化的pY701-STAT1蛋白水平在细胞核内是如何被调节显得尤为重要。
  本研究发现pY701-STAT1是IFN诱导的STAT1泛素化的主要形式,pY701-STAT1能够通过泛素蛋白酶体系统被降解;并且,我们发现泛素化的pY701-STAT1主要集中在细胞核内,抑制pY701-STAT1的入核能有效的阻止pY701-STAT1的泛素化和蛋白降解。进一步,我们发现去泛素化酶USP2a在 IFNα刺激下能够入核,并结合到pY701-STAT1上。我们发现USP2a能抑制pY701-STAT1的K48位泛素化修饰和蛋白降解。更重要的是,USP2a稳定了IFN诱导的pY701-STAT1水平,增强了三类IFN介导的信号和抗病毒功能。本文鉴定了能够靶向活化的STAT1(pY701-STAT1)的一个去泛素化酶。这一发现揭示了IFN抗病毒信号和功能的一个新的调控机制,并有望为提高 IFN抗病毒治疗提供潜在的靶点。
[硕士论文] 李乐敏
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:目的:双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)在干扰素(Interferon,IFN)的产生、干扰素发挥作用以及抗病毒固有免疫中发挥着至关重要的作用。腺苷脱氨酶ADAR1(Adenosine Deaminase Acting on RNA1)由于其作用于双链RNA的编辑作用而被广泛关注。ADAR1作用于dsRNA,催化双链结构RNA的腺苷(adenosine)发生脱氨基而变成肌苷(inosine),使得dsRNA结构变得不稳定,因此病毒及细胞内的RNA都能被ADAR1所作用编辑。近年来的研究主要集中在 ADAR1如何通过抑制干扰素通路上下游的一些因子而抑制干扰素的产生或抑制其发挥作用,从而起到负调控干扰素抗病毒的作用,或者研究ADAR1对不同病毒起到不同调控作用的机制。然而对于干扰素是否以及如何调控ADAR1的机制还不清楚。本课题拟研究IFNα对ADAR1-p110的泛素化水平和蛋白水平的调控机制,以及该调控对于IFNα抗病毒效应的影响。这一研究旨在进一步理解干扰素有效抗病毒信号中新的调控机制,并为临床上增强干扰素抗病毒治疗新药的研发提供潜在的新靶点。
  方法:用 IFNα处理 HEK293T细胞以及过表达 Flag-ADAR1-p110的HEK293T细胞,用免疫印迹检测IFNα对内、外源性ADAR1-p110蛋白水平的影响。进一步检测IFNα对ADAR1-p110蛋白的影响是否依赖于泛素化。接下来鉴定ADAR1-p110泛素化过程中的E3连接酶,以及IFNα对ADAR1-p110与其E3相互作用的影响。最后用免疫印迹及流式细胞计数检测IFNα对ADAR1-p110的降解对IFNα有效抗VSV病毒效应的影响。
  结果:⑴ADAR1-p110抑制了IFNα介导的抗病毒功能。⑵IFNα能够诱导ADAR1-p110的降解,并且具有时间和剂量依赖效应。⑶IFNα诱导了ADAR1-p110的泛素化增加,并且具有剂量依赖效应,且IFNα诱导了ADAR1-p110发生48位赖氨酸(K48)泛素化修饰,而63位赖氨酸(K63)泛素化修饰水平则无明显变化。⑷SCFβ-TrCP是ADAR1的E3连接酶,且ADAR1-p110上的“DSG(XX)n+2S”序列在β-TrCP对其特异性识别中发挥了关键作用。⑸IFNα诱导ADAR1-p110的泛素化依赖于β-TrCP,IFNα能够增强两者的相互作用。⑹ADAR1-p110序列上的第574和576位赖氨酸是 IFNα诱导ADAR1-p110发生泛素化的主要泛素结合位点。⑺IFNα对ADAR1-p110的泛素化调控机制促进了IFNα介导的抗病毒效应。
  结论:IFNα能够增强ADAR1-p110与它的E3连接酶SCFβ-TrCP的相互作用,促进了 ADAR1-p110蛋白的泛素化降解,减弱了ADAR1对其抗病毒信号的抑制,最终促进了IFNα发挥有效的抗病毒功能。
[硕士论文] 陆小川
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:病毒侵入宿主细胞后,宿主通过胞内的病原分子模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别病原体,从而激活宿主的抗病毒天然免疫,诱导干扰素(interferon,IFN)、干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)及炎症因子的表达。MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)是RIG-I样受体(RIG-I-like receptor,RLR)信号通路下游的接头蛋白。目前已发现,MAVS可定位于线粒体(mitochondria)、过氧化物酶体(peroxisomes)以及线粒体相关质膜(mitochondria-associated membranes of the endoplasmic reticulum,MAM)。其中,过氧化物酶体MAVS(peroxisomal MAVS,MAVS-Pex)能够诱导IFN非依赖的立即早期ISG基因的激活,而线粒体MAVS则介导晚期的IFN及ISG的表达,两者相辅相成,共同抵御病毒。Viperin由Cig5基因编码的一种经典的ISG基因,它能抑制多种病毒的复制,包括仙台病毒(SeV),水泡性口炎病毒(VSV),伪狂犬病毒(PRV),日本脑炎病毒(JEV),登革热病毒(DENV),西尼罗河病毒(WNV)等。VP16是I型人类单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type1,HSV-1)编码的皮层蛋白,它的功能有:转录激活HSV-1立即早期(immediate early,IE)基因、下调病毒蛋白vhs(virion host shutoff protein)的表达以及参与病毒包装和逸出过程。
  本研究表明,HSV-1能够通过其VP16蛋白抑制过氧化物酶体诱导的早期ISG基因的表达,从而逃逸该天然免疫信号通路。首先,我们的初步实验证明,低MOI(multiplicities of infection)的野生型(WT)HSV-1感染能够激活MAVS-Pex介导的早期抗病毒反应,而高MOI的HSV-1感染则抑制该信号通路,表明HSV-1确实参与MAVS-Pex信号通路。接着,筛选实验发现,外源超表达的HSV-1皮层蛋白VP16可下调MAVS-Pex激活的viperin表达。最后,通过干扰VP16的表达,我们发现,无论是超表达还是病毒感染激活的viperin,其表达量均能有一定程度的恢复,说明VP16的确在HSV-1逃逸过氧化物酶体MAVS介导的早期抗病毒天然免疫中起了一定作用。
[硕士论文] 李文娜
免疫学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:哺乳动物的胶原蛋白含量非常丰富,约占总蛋白的25%-35%。胶原蛋白不仅负责维持组织的形态结构,而且在各种生理及病理过程中都有重要作用,其缺失或变异后会对机体产生严重影响,已知人类超过1300种疾病由胶原蛋白突变引起。目前,越来越多的报道显示了胶原蛋白和免疫系统的关系。但是目前的研究大多关注单个胶原蛋白对特异性免疫细胞的作用,而忽视了胶原蛋白网络作为一个高度交联的整体对组织免疫微环境的调节。秀丽线虫拥有175个胶原蛋白,大多集中在与表皮细胞顶膜相邻的外皮细胞外基质中,与哺乳动物具有很高的同源性。在本课题中,我们充分利用秀丽线虫简单保守的固有免疫系统和基因敲除的易操作性等优点,系统全面地解析胶原蛋白网络对上皮细胞固有免疫的调控作用。我们通过逐一敲除秀丽线虫外皮胶原蛋白,并用荧光报告基因检测固有免疫应答激活情况,我们发现仅有6个胶原蛋白的缺失会导致上皮细胞固有免疫应答的激活,而其它成员缺失则无显著影响。更有趣的是,这6个胶原蛋白的时间特异性表达曲线高度一致,预示它们之间很可能互相交联形成一个专门调控固有免疫的亚网络结构。这些结果显示生物体庞大的胶原蛋白家族中可能有少数几个具有基本的免疫监控功能,在健康的细胞外基质中负责抑制上皮细胞的固有免疫系统。目前已知秀丽线虫表皮相关固有免疫主要有四条高度保守的信号通路。秀丽线虫可以通过这些通路来对不同类型的侵扰产生特异性应答,并且激活下游抗菌肽,溶菌酶,凝集素等免疫效应分子的表达。
  本研究用遗传学手段,将可以控制表皮抗菌肽表达的通路中的基因一一敲除,来分别阻断每个通路,观察这些通路的阻断对胶原蛋白缺失引起的抗菌肽上调的水平变化。确定了这一调节作用所依赖的信号通路是经由顶部跨膜受体MUP-4和STAT家族蛋白STA-2传导的。再次,我们发现虽然这6个胶原蛋白无一与表皮细胞免疫调节受体MUP-4共定位,但缺失其中任何一个胶原蛋白都会严重扰乱MUP-4的胞外结合蛋白BLI-1的定位,导致其从MUP-4上的脱离。根据目前的研究成果我们认为细胞外基质中的胶原蛋白网络很可能通过一种二层级联模式来对细胞外微环境进行免疫监控:负责激活免疫应答的核心元素仅为一对胶原蛋白-受体复合体,同时为了提高预警敏感性,另有6个胶原蛋白间接控制核心胶原蛋白与受体的结合。而为了避免预警系统过于敏感,绝大多数胶原蛋白并不参与免疫应答的调控任务。本研究揭示了生物体细胞外基质对组织损伤造成的免疫应答进行调控的巧妙和精确性,为充分探究细胞外基质在免疫调节中的作用提供了新的思路。
[硕士论文] 黎维新
理论物理 广西师范大学 2016(学位年度)
摘要:生物膜界面水的性质对于生物膜的功能实现有其重要作用,磷脂膜的双分子层结构的自组装、水分子的渗透作用、药物分子的输运以及与细胞膜间的融合相联系的水合力等,都强烈地依赖其周围水溶液的性质。反过来,生物膜的存在会对膜界面水分子的组织形式和动态性质有着重要的影响,所以深入地理解生物膜界面水与磷脂膜的相互作用有助于我们更好地理解生物膜系统的结构和功能。随着计算机技术和分子动力学模拟技术的发展,人们已经发展了一系列的力场对磷脂双层膜进行计算机模拟,生物膜的分子动力学模拟促进了人们对生物膜的结构和功能特性的理解。但是目前提出的力场很少考虑膜与水分子的作用,所以这些力场对膜界面水分子的性质描述是否合理值得去探究。本文首先采用分子动力学模拟方法研究了不同力场下磷脂双层膜界面水分子行为的差异,然后利用我们认为更适合描述膜与界面水分子性质的力场,去研究存在不同阳离子的情况下阳离子对磷脂双层膜界面水分子的偶极取向的影响,本文内容安排如下:
  第一章主要是介绍生物膜的基础知识和生物膜界面水分子的相关研究背景及研究成果。
  第二章主要是介绍一些与分子动力学有关的重要基础理论知识和我们所使用的分子动力学模拟软件。
  第三章是对我们第一个研究成果的介绍,本章采用不同力场研究了磷脂双层膜界面水分子的性质,主要用分子动力学方法对DPPC分子的亲水端的8个氧原子形成的氢键能量进行了统计分析。分子动力学模拟结果表明:所用的力场都能很好描述磷脂双层膜的结构性质,与实验结果一致,然而在不同的力场下,磷脂双层膜界面处的水分子行为存在很大的差异。我们有以下几个发现:对于联合原子力场,在同一基团中双键氧的氢键能量要高于单键氧的氢键能量,对于全原子力场下只有磷酸基团的氧原子有类似结果,至于C=O1和C=O2基团,双键氧的氢键能量要低于单键氧的氢键能量,因为氢、氧之间作用出现了排斥力;相比C=O2、C=O1这两个基团,磷酸盐基团氧原子的氢键能量概率分布更广;在各种力场下,磷酸基团中O33和O34的氢键能量分布基本重合,展示了DPPC分子中磷酸基团上O33、O34氧原子结构的对称性;各个基团的氢键总能量概率分布曲线一般有多个峰,而且峰的个数与基团的氢键数量存在对应关系;通过分析不同力场下DPPC分子的各基团与水分子间的氢键能量概率分布和氢键数量,发现Berger和Slipid力场的模拟结果更接近实验结果。我们的结果有助于更细致的理解磷脂双层膜界面水的行为,同时为在相关生物膜的分子模拟中选择合适力场提供参考。
  第四章是对我们第二个研究成果的介绍,本章利用分子动力学方法研究了不同阳离子对磷脂双层膜的不同基团附近水分子的平均偶极取向的影响,我们发现阳离子对胆碱基团附近水分子的径向分布无明显的影响,对磷酸基团附近水分子的径向分布有较大影响,产生这种影响的原因是阳离子进入膜内部并在磷酸基团附近聚集的缘故;由于进入膜内的阳离子对水分子的氧原子有吸引作用,阳离子的存在会使膜界面局域结构内水分子的平均偶极取向有朝向体相水一侧的趋势;不同阳离子对膜界面附近水分子的偶极取向和水分子的驻留时间以及磷脂分子的平均面积的影响大小与阳离子的霍夫梅斯特逆序列一致,其原因是阳离子在磷脂双层膜内聚集程度也与阳离子的霍夫梅斯特逆序列一致;阳离子进入膜内部还导致磷脂分子脱水,进而引起磷脂膜界面氢键网络的重调整,改变膜界面附近水分子的偶极取向。
[博士论文] 李晔
化学工程与技术 北京化工大学 2015(学位年度)
摘要:生物膜作为细胞的天然屏障,能选择性调控物质的跨膜运输,参与细胞的胞吞、胞吐、信号传导等重要细胞活动。因此,研究物质跨膜运输的动力学过程对细胞生物学乃至生物医药应用都具有重要的价值。近年来,随着计算机技术的迅猛发展,分子模拟技术凸显优势,能够实现对生物膜体系的相关研究。基于此本论文采用分子动力学模拟方法,以纳米粒子跨膜运输的动力学过程为研究对象,对不同性质的纳米粒子跨膜运输的机理进行了系统而详细的研究。本论文的主要研究内容和创新点如下。
  1、纳米粒子的形状对其内吞动力学的影响。研究了长圆柱形状、短圆柱形状、圆盘形状以及球形纳米粒子的内吞动力学过程,发现旋转是形状各向异性的纳米粒子内吞过程的一个重要特征。通常纳米粒子的内吞过程分为两个阶段:下陷阶段和包裹阶段。在下陷过程中,为了促进配受体的结合,纳米粒子会通过旋转实现和细胞膜接触面积最大化。在包裹过程中,为了克服较小的弯曲能,细胞膜会进一步调节纳米粒子发生旋转。因此不同形状的纳米粒子在两个阶段均具有各自最适宜的下陷角度和包裹角度。研究结果表明形状各向异性的纳米粒子还会诱发膜的非对称性包裹内吞。
  2、纳米粒子的表面配体分布对其穿膜的影响。设计了三种不同配体图案(即,条纹图案的、补丁图案的以及随机图案)的纳米粒子并研究了它们的穿膜行为。发现当纳米粒子的尺寸和亲疏水配体比例相同时,亲水配体以较分散的方式分布在纳米粒子表面能有效降低纳米粒子的穿膜能垒,提高纳米粒子的穿膜能力。而对于多个亲水条纹带较宽的纳米粒子共同穿膜时,容易诱发细胞膜的破裂,进而产生细胞毒性。
  3、纳米粒子的硬度对其内在化路径的影响。我们设计了三种不同硬度的纳米粒子(即,聚合物、脂质体、以及刚性的纳米粒子),并研究其内在化的机理。结果显示刚性的纳米粒子能以内吞的方式进入细胞,而软的纳米粒子的内吞路径却受受到了限制。因为软的纳米粒子在内吞过程中容易变形且配体容易分布不均匀。软的纳米粒子主要是以穿膜的方式进入细胞,且在穿膜过程中伴随着亲疏水片段的重排。
  4、纳米粒子的带电性质对其与生物膜相互作用的影响。
  (1)不同带电图案的纳米粒子在生物膜表面的聚集。设计了5种不同带电图案的纳米粒子。研究发现纳米粒子的尺寸和带电图案都会影响其聚集行为。结果显示由静电作用诱发的纳米粒子的聚集需要最小的有效带电区域。当纳米粒子表面局部带电区域小于有效的带电区域时,则不能诱发纳米粒子的聚集。此外,纳米粒子表面的带电图案也会影响纳米粒子的聚集结构。因此对于不同的生物应用,可以通过调节纳米粒子表面的电荷分布,实现对纳米粒子聚集形式的调控。
  (2)膜电势对带电纳米粒子在细胞膜表面的粘附的影响。在真实细胞中,细胞膜内外常常存在膜电势,为此我们研究了膜电势对带电纳米粒子在细胞膜表面的粘附的影响。研究结果发现降低膜电势,会使阴离子纳米粒子在生物膜表面的粘附数量减少,而对阳离子纳米粒子在生物膜表面的粘附影响不大。这主要是由于阴离子纳米粒子在生物膜表面的粘附主要是膜电势诱导的,而阳离子纳米粒子在生物膜表面的粘附主要是受膜表面带负电的膜蛋白的作用。
  (3)多个带电纳米粒子的内吞路径。研究发现虽然同种电荷的纳米粒子之间存在静电排斥力,但仍然以协同的方式被膜共同包裹内吞。这主要是由膜的弯曲能诱发的同种电荷纳米粒子之间的吸引。同时,带电纳米粒子的内吞路径主要受到纳米粒子的尺寸、纳米粒子表面带电配体的密度、以及纳米粒子间的距离的影响。对于多个小尺寸的带电纳米粒子,主要是以协同内吞的方式进入细胞。而对于大尺寸的带电纳米粒子,纳米粒子能否协同内吞取决于纳米粒子带电配体的密度以及纳米粒子之间的初始间距。
  5、具有高效穿膜能力的穿膜聚合物的设计。基于以上的研究以及结合穿膜肽亲疏水的结构特性,我们设计出一种高效的穿膜聚合物。其中穿膜聚合物具有亲疏水间隔的链状结构。当穿膜聚合物的疏水片段长度接近膜厚时,其具有高效的穿膜能力。穿膜聚合物的穿膜方式主要是:“拉链式”和“协同方式”。通过将穿膜聚合物嫁接在亲水药物表面,发现穿膜聚合物能有效的协助亲水药物穿透生物膜。
  6、膜蛋白的聚集机理。膜蛋白作为生物膜的重要组成部分,对物质的运输,信号的传导,膜的变形等起着重要的作用。为此,我们研究了膜蛋白的聚集机理。继“亲疏水不匹配”聚集机理和“静电作用”聚集机理之后,提出膜蛋白“形状的互补性”也是诱发其聚集的一个重要原因。当形状互补的两个膜蛋白相互靠近时,膜蛋白之间的磷脂的构型熵会受到限制,因此磷脂会趋于离开膜蛋白之间的狭缝区域,而等效地诱导膜蛋白的聚集。
[硕士论文] 程然
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2015(学位年度)
摘要:在真核细胞中,胞吞途径中区室化形态结构是胞吞分子胞内分选转运的结构基础,而区室化形态结构之间的物质转运和信息交流依赖于囊泡的形成与转运。早期内涵体(early endosome,EE)作为胞吞途径中高度动态的区室化形态结构,是胞吞货物的分选平台。EE通过高度动态的管状结构进行货物蛋白的循环转运,或通过膜内陷形成腔内囊泡将胞吞货物转运到溶酶体中进行降解。胞吞物质在EE上的分选与转运是一个复杂而又精细的过程,需要多种蛋白和脂质的参与,它们共同调控EE上胞吞物质的分选与转运囊泡的形成。前期研究表明,在哺乳动物细胞中,ACTIN与EE上物质的分选和转运囊泡的形成密切相关。然而,ACTIN在转运囊泡形成过程中膜的重塑,主要包括膜的成管和剪切作用机制仍不清楚。
  鉴于此,在本研究中,不同种属哺乳动物细胞COS-7和HeLa细胞作为研究载体;借助荧光标记和激光共聚焦荧光显微成像技术,观察ACTIN在COS-7和HeLa细胞内涵体/溶酶体系统上的定位情况。为了观察ACTIN和其调控因子WASH在EE上转运囊泡形成中的动态行为,在COS-7细胞上瞬时表达常激活型荧光标签RAB5蛋白(RAB5 Q79L)和LifeAct-mKate2或GFP-WASH;由于表达RAB5 Q79L,造成EE发生同源融合,从而形成空泡结构,形成的空泡结构有利于在荧光显微镜分辨率有限的情况下观察EE上的动态事件。通过药物处理抑制ACTIN动态组装实验探索了ACTIN在EE上转运囊泡形成过程中的具体作用机制;同时也借助药物处理实验进一步探究了ACTIN功能缺陷对转铁蛋白(transferrin,Tfn)和10 KDa Dextran在胞内转运的影响。最后,借助荧光三标记和活细胞实时成像技术,初步探索了ACTIN和WASH在EE上转运囊泡形成事件中两者在动态行为上的相关性。
  ACTIN胞内定位研究数据显示,ACTIN在COS-7和HeLa细胞中的定位呈现高度一致性,主要分布在EE上,在循环内涵体(recycling endosomes,RE)上有少量数量上的分布,且以离散型ACTIN微域的形式分布在EE膜上。荧光标记活细胞实时成像实验数据表明,在COS-7细胞中,ACTIN和WASH与EE上转运囊泡的形成密切相关。COS-7上药物处理实验表明,当使用Latrunculin B抑制ACTIN动态组装时,会造成EE上可能由于剪切功能缺陷而出现长膜管状结构;同时在HeLa细胞上药物处理实验表明,ACTIN功能缺陷会影响Tfn和10 KDa Dextran胞内转运,造成Tfn和10 KDa Dextran在EE滞留。本研究首次在不同类型哺乳动物细胞中初步探究了ACTIN胞内定位以及在EE上转运囊泡形成中的作用机制;同时通过荧光标记活细胞成像技术初步探索了ACTIN与其在EE上成核促进因子(nucleation-promoting factors,NPF)WASH在转运囊泡形成事件中两者在动态行为上的相关性;为以后有关ACTIN和WASH在EE上货物分子的分选以及转运囊泡形成的研究提供一定的理论依据。
[硕士论文] 王宛
物理学 苏州大学 2015(学位年度)
摘要:树枝形分子和富勒烯都是非常优异的材料,但又有各自的不足,将两者结合起来必定能使其发挥更大的作用,且实验上已经成功合成了他们的混合结构。当前,纳米粒子与生物膜的相互作用是软凝聚态物理研究的热门课题之一。本文采用粗粒化分子动力学模拟来研究末端嫁接不同数量富勒烯(C60)的PAMAM树枝形分子在水溶液中构型变化以及与生物膜的相互作用。我们发现在嫁接C60分子之后,树枝形分子在水溶液中的构型随着末端嫁接数目单调变小。而与膜作用后,分子的构型变化反而变得不单调了。同时,嫁接C60的树枝形分子在与生物膜作用之后会导致生物膜通透性增加。此外,我们还发现树枝形分子本身只是镶嵌在生物膜外层,C60分子由于其疏水性会进入磷脂膜中间区域。
[硕士论文] 王璀里
生物化学与分子生物学 杭州师范大学 2015(学位年度)
摘要:目的:⑴通过体内外实验明确WIP1在病毒感染中抗病毒作用;⑵通过体内外实验明确WIP1在病毒感染中对炎症的调节作用。
  方法:①用VSV病毒刺激野生型和WIP1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞。通过Western Blot法检测NF-κB以及MAPK通路的活化情况。同时采用Real-time PCR以及ELISA法分析IL-1β、IL-6和TNFα等炎症因子的表达情况,探究WIP1在VSV病毒感染引起的炎症中的作用。②用VSV病毒刺激野生型和WIP1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞,通过Real-time PCR和Western Blot法检测RIG-I及其下游的TRAF3、TBK1、MAVs、IRF3、IRF7、ISG15和ISG56的表达水平和活化情况,通过ELISA法检测IFNβ的表达情况。同时,检测病毒的滴度和扩增水平。明确WIP1是否通过调节RIG-I通路产生IFNβ从而控制病毒的复制增殖。③用VSV感染野生型小鼠,建立肺炎模型。取肺灌洗液,用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNFα和IFNβ的表达水平。取肺组织研磨,用Real-time PCR和Western Blot法检测 RIG-I和其下游的TRAF3、NFκB、TBK1、MAVs、IRF3、IRF7、ISG15和ISG56的表达水平和活化情况。同时取肺灌洗液检测病毒滴度,分析WIP1敲除对小鼠病毒清除能力的影响。用高滴度VSV感染野生型和WIP1敲除小鼠,计算小鼠死亡率,分析WIP1的抗病毒功能。④取野生型和WIP1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞,经VSV病毒刺激后,收取细胞培养上清,通过 ELISA法检测 IL-1β,caspase1的表达情况。并且,提取上清蛋白后用Western Blot法检测上清中成熟的IL-1β,caspase1的表达情况。⑤用VSV病毒刺激野生型和WIP敲除小鼠的腹腔巨噬细胞,分析炎症小体的活性。通过Real-time PCR和Western Blot法检测在细胞中NLRP3,IL-18,caspase1的表达水平和活化情况。
  结果:⑴WIP1敲除后,RIG-I通路、NF-κB通路表达水平降低,小鼠(或小鼠腹腔巨噬细胞)对病毒易感性增加,下游 IFNβ表达减弱,病毒扩增更多,滴度升高;⑵WIP1敲除后,小鼠(小鼠腹腔巨噬细胞)中炎症因子 IL-1β、IL-6和TNFα表达降低,炎症反应减弱;⑶在VSV病毒感染中,野生型小鼠炎症小体剪切活性增加,NLRP3表达升高,同时上清中成熟的IL-1β,caspase1,以及IL-18表达升高。
  结论:①WIP1提高小鼠抗病毒能力加强炎症反应;②WIP1增强RIG-I介导的I型干扰素IFN-β的产生;③WIP1促进VSV诱导的NLRP3炎症小体活性。
[硕士论文] 于雪
生物化学与分子生物学 河北大学 2015(学位年度)
摘要:家蝇以腐殖质为食,生存环境伴随有许多病菌的滋生,因此,家蝇拥有强大的免疫调控机制来抵御病菌的侵害。根据本实验室家蝇转录组和 NCBI公布的家蝇基因组两大数据库,分析核转录因子Nrf2和其抑制剂Keap1的生物信息,这两种蛋白在家蝇体内大小分别为858和924个氨基酸,Keap1的理论分子量为95.75 ku,理论等电点为7.68,Nrf2相对分子量为113.72 ku,理论等电点为5.73。二级和三级结构预测显示,Keap1主要具有BTB和Kel ch两个保守结构域,其中BTB和泛素连接酶3结合,Kelch与 Nrf2结合。Nrf2主要包含碱性亮氨酸拉链,用于结合特殊的DNA序列。选择保守结构域序列,构建原核表达载体,用于抗体制备和Western Blot检测。
  本研究采用实时荧光定量PCR对Keap1和Nrf2基因核酸表达量进行检测,实验组选取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌刺激刺激后6h、12h、24h、48h、72h五个点的家蝇幼虫作定量分析,对照组为未做菌刺激(0 h)的幼虫,结果显示,细菌刺激后Keap1基因呈下调趋势,Nrf2基因呈上调趋势。在组织定量分析,Keap1在脂肪体中表达量最高,具有显著性,在血细胞中表达量最低。Nrf2在肠道中表达量最高,在表皮中最低。用含有Keap1-dsRNA和 Nrf2-dsRNA的工程菌干扰家蝇幼虫,对干扰后目的基因RNA表达水平进行检测,检测结果显示,Keap1和Nrf2基因均被敲低,效果显著。幼虫被干扰后再次菌刺激,Keap1敲低组的幼虫在菌刺激6h的死亡率高于对照组,相反,Nrf2敲低组在菌刺激6 h的死亡率明显低于对照组。SOD、CAT、POD这3种抗氧化保护酶在热激处理15min,30min,1h时表现为活性升高,在恢复正常饲养温度1h、2h后活性恢复,可以推断热激处理对机体造成氧化损伤。通过Western Blot检测显示,热激处理时,Keap1蛋白表达量下调,Nrf2表达量上调。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部