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[硕士论文] 汤缓缓
生物医学工程;生物物理学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:NF-κB是一类广泛存在于多种细胞中的转录因子,参与调控炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等多种生理过程。当细胞受到刺激时NF-κB会被激活,活化的NF-κB与其顺式调控元件特异性结合,从而调节下游基因的表达。研究表明许多疾病的发生都与NF-κB及其信号通路的异常活化有关,NF-κB已成为疾病治疗和新药开发的重要靶点,因此针对NF-κB活性抑制剂的研究具有重要的生物医学应用价值。
  本论文利用NF-κB特异启动子和干扰NF-κB活性的miRNA共同构建一种NF-κB活性自控型分子,来调控细胞内NF-κB的活性。
  第一步,选择NF-κB家族的RelA基因作为靶点,设计并合成3对针对RelA基因的人工miRNA基因序列,将其连入到miR-155骨架中,构建稳定表达人工miRNA的干扰载体。通过与携带靶基因的报告载体的共转染实验,筛选出一个对NF-κB活性干扰效果最好的miRNA,即amiR533。
  第二步,基于NF-κB诱骗子策略设计NF-κB特异调控元件,将其与最小启动子一起构成一种NF-κB特异启动子。通过构建NF-κB特异启动子载体及转染实验,证明NF-κB特异启动子的转录活性显著受细胞内NF-κB活性的调控,而且此启动子上的NF-κB特异调控元件也可以作为NF-κB的诱骗子发挥其作用。
  第三步,用NF-κB特异启动子构建amiR533表达载体,制备一种细胞内NF-κB活性自控型分子。通过与携带靶基因的报告载体的共转染实验,证明NF-κB活性自控型分子对细胞内NF-κB活性的调控作用,且其调控活性远较常用强启动子CMV温和。NF-κB活性自控型分子功能的强弱取决于细胞内NF-κB的活性,既可抑制NF-κB过度活化,还可以避免损害NF-κB的正常生理功能。
  第四步,用NF-κB活性自控型分子转染HepG2细胞,通过荧光定量PCR检测细胞内NF-κB自身及其靶基因的表达水平。结果表明,NF-κB活性自控型分子既可以降低NF-κB自身表达,也可以降低NF-κB靶基因的表达。用NF-κB活性自控型分子转染293T和HepG2细胞,结果显示两种细胞的总凋亡率都相对较低,表明NF-κB活性自控型分子对两种细胞的细胞活性影响较小。
  因此,本研究构建的NF-κB活性自控型分子可以自控调节细胞内NF-κB的活性,温和抑制NF-κB及其靶基因的表达,但对细胞活性不产生显著影响。
[硕士论文] 彭鹏
麻醉学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:双孔钾离子通道形成二聚体形式发挥功能的特性导致针对其研究的任何操作都会涉及两个亚基,给研究带来诸多不便。本研究旨在探讨分别在两分子双孔钾离子通道TREK-1和TREK-2间加入柔性多肽连接构建串联二聚体载体的可行性。
  方法:利用PCR技术在两个单体TREK-1分子之间加入柔性多肽连接,构建其串联二聚体载体(pGH19-tdTREK-1)。将上述载体在体外转录成cRNA并显微注射至非洲爪蟾卵母细胞,培养24-48小时后采用双电极电压钳技术记录电流。观察细胞外钡离子和不同pH值外液对该串联二聚体通道表达的影响,并与天然二聚体通道的反应相比较。用上述方法构建TREK-2串联二聚体载体(WT-WT),观察2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-APB)和胞外酸(pH0)对TREK-2串联二聚体载体通道电流的影响。用蛋白印迹法检测TREK-2和TREK-2串联二聚体在爪蟾卵母细胞和HEK293细胞的蛋白表达。
  结果:串联二聚体TdTREK-1可在爪蟾卵母细胞中高效表达,该通道形成的电流可被胞外钡离子抑制,也可被胞外液酸化所抑制,并且该串联二聚体通道对这些胞外刺激因素的反应程度与天然二聚体相似。TREK-2串联二聚体载体的电流和药理学特性也与TREK-2天然二聚体相似,且表达出的蛋白确实为串联的二聚体,该二聚体未被降解为单分子形式。
  结论:人为加入柔性多肽连接序列构建TREK-1功能性串联二聚体和TREK-2功能性串联二聚体载体通道并不影响通道的表达及特性,证明该实验方案可行。这将为我们将来操作单个亚基,进而深入研究TREK-1、TREK-2的结构与功能打下良好的基础。
[博士论文] 郭蕊
生物化学与分子生物学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:钾离子通道能够控制钾离子选择性地并且高速地流入和流出细胞来改变细胞内外电压,从而使得细胞对外界刺激产生瞬间反应。钾离子通道的离子选择筛中的四个钾离子结合位点只能同时容纳两个钾离子,钾离子在离子选择筛中以1,3和2,4两种相互平衡的状态存在。
  钡离子是唯一一个能够阻断钾离子通道的碱土金属元素,钡离子和钾离子大小类似(钡的离子半径为1.35(A),钾为1.33(A)),然而钡离子却携带双倍的电荷。钡离子的大小使得它很容易进入钾离子通道的离子选择筛,然而它所携带的电荷使它在离子选择筛中的结合过于紧密,因而导致钡离子对钾离子通道的阻断效应。离子通道研究领域的先驱,布兰迪斯大学(BrandeisUniversity)的ChristopherMiller博士在上世纪八十年代通过对钾通道的钡阻断进行电生理学研究发现钾离子对于钡离子从钾通道逃逸存在三个效应:外部锁定效应(externallock-ineffect)、增强效应(enhancementeffect)和内部锁定效应(internallock-ineffect),他还前瞻性地推理出钾离子通道的结构,并在十几年后被钾离子通道的晶体结构所验证。然而钡离子和钾离子在钾离子通道中是如何相互作用而导致这些效应,至今仍然是离子通道研究领域争议的热点。
  以MthK钾离子通道为模型,通过多学科交叉,结合X-射线晶体学和电生理学两种研究手段,探讨了钡离子和钾离子在MthK钾离子通道内的相互作用,对上述三个效应提出了一个相应的模型。在没有钡离子时,钾离子在钾离子通道的离子选择筛中以1,3-和2,4-两种相互平衡的状态存在,此时,钾离子通道能够自由通透钾离子。钡离子从胞内侧进入钾离子通道离子选择筛,结合在4、3或2位点阻断钾离子通道。钡离子可以向外或向内逃逸出使钾离子通道畅通。钾离子从外侧进入位点1,将钡离子推至位点4,阻止钡离子向外逃逸(外部锁定效应);外侧钾离子浓度高时能将钾离子推至位点2,从而增强钡离子向内逃逸(增强效应);内侧的钾离子在中央空穴能阻止钡离子向内逃逸(内部锁定效应)。
[硕士论文] 刘国君
物理学 内蒙古大学 2015(学位年度)
摘要:结合人类基因间序列8-mer相对模体数随频次分布的三峰现象,讨论了酵母基因组8-mer分布形成单峰的原因.根据XY二核苷分类,把总体8-mer模体分成三个子集,讨论了8-mer模体使用的进化分离,分析了三个8-mer子集中m-mer(m=3,4)的使用差异,进而推测了含1CG和2CG8-mer的生物学功能.整个研究分为四部分,具体内容如下所示:
  一、前期的研究发现,人类基因间序列的k-mer(k>6)呈三峰分布,当k=8时分布更加清晰稳定.所以选取了人类1号染色体的基因间序列,得到8-mer相对模体数随频次的三峰分布.基于8-mer中包含XY二核苷的多少对8-mer模体进行分类,发现按CG分类的8-mer集合中,2CG、1CG和0CG的8-mer模体形成独立的单峰分布,且2CG、1CG和0CG的分布分别与总体8-mer分布的峰1、峰2和峰3分布严格对应,0CG的分布中心与随机序列的分布中心一致,1CG和2CG分布的频次远远小于随机分布或远离随机中心.表明含0CG的8-mer使用是随机进化的结果,含1CG和2CG的8-mer使用是定向进化的结果.而且1CG分布的最可几相对模体数远远大于0CG分布.结合这些8-mer序列的特征和实验对比,我们提出了三个理论猜想:(1)2CG模体是构成CpG岛序列的核心模体,(2)1CG模体是与组蛋白相互作用的功能片段,我们称之为核小体结合模体,(3)三类模体的使用分离反映了生物基因组之间的进化关系,是基因组内各类序列差异的根本原因.本文将基于人类基因组8-mer使用规律,研究酵母基因组中8-mer使用的进化分离现象.
  二、分析了酵母全基因组序列的8-mer相对模体数随频次的分布.发现总体8-mer分布是单峰分布,CG含量随着使用频次的增高而降低.对8-mer集合进行XY分类并结合人类基因间序列三峰分布特征发现,16种二核苷分类中只有CG分类后1CG分布的最可几相对模体数高于0CG分布,与人类分布一致,而造成8-mer分布呈现单峰现象的原因是由于0CG、1CG和2CG分布中心距离较近而导致的.从生物进化角度来看,在低等真核生物中从酵母开始已经显示了CG模体的进化分离现象,我们认为此分离现象在真核生物中具有普适性.计算了酵母基因组序列按XY分类后0XY、1XY和2XY子集中m-mer(m=3,4)的相对频率,与总体8-mer中m-mer的相对频率进行比较.发现在XY分类中,2XY子集的m-mer使用分离最大,1XY子集次之,0XY子集的m-mer使用分离最小;在1XY和2XY子集中,CG和GC子集的m-mer使用分离最大,表明这类模体是定向进化的.在0XY子集中,CG/GC/CC/GG子集的m-mer使用分离最小,即表明这类模体是随机进化的.
  三、运用新对称相对熵来定量描述m-mer使用的分离距离.与总体8-mer中m-mer使用相比,在0XY子集中,0CG子集的m-mer新对称相对熵最小,表明包含0CG的8-mer与总体8-mer的偏离最小.在1XY子集中,1CG子集的m-mer新对称相对熵最大,表明包含1CG的8-mer与总体8-mer的偏离最大.在2XY子集中,2CG子集的m-mer新对称相对熵最大,表明包含2CG的8-mer与总体8-mer的偏离最大.
  四、运用了角度差和距离差计算了子集与总体8-mer中m-mer使用分离的距离.其结果与新对称相对熵的结果总体一致,但在一些XY子集中存在差别.仔细分析三个参数的定义发现,在0XY子集中,造成0CG子集进化分离的主要因素是m-mer的使用偏好.在1XY子集中,造成1CG子集进化分离的不全是m-mer的使用偏好,相对频率小的m-mer使用偏离也是非常重要的.在2XY子集中,造成2CG子集进化分离的主要因素是m-mer的使用偏离.这些结论对于我们预测核小体定位和CpG岛序列具有重要价值.
[硕士论文] 张琪东
分析化学 湖南大学 2014(学位年度)
摘要:生命体就好比是一个复杂并且精确运行的工厂,而细胞作为完成生命活动的基础单元每时每刻都发挥着自己相应的作用。而活跃在各个细胞内的如活性氧化物、硫醇类物质等活性小分子通过发生化学生物反应过程参与了新陈代谢、细胞内信号转导等活动。在一定的浓度水平下,他们可以维持生物体正常生理活动;但其含量发生很大变化时,他们会导致新陈代谢的平衡打破,进而使生物体内生理功能紊乱,甚至引发重要的疾病。所以他们在体内浓度的高低经常作为一些疾病的诊断依据。因此检测这些活性小分子对了解生物体运转的机理和一些疾病的早期诊断有着重要的意义。基于生物活性小分子在生命体的重要作用,我们结合核酸探针和双光子探针在生命环境中检测的优势,主要开展了两个对生物小分子的研究工作:
  (1)基于时间分辨光谱的核酸探针检测生物硫醇:核酸探针的两端分别标记了一个芘分子。并且核酸探针上的T碱基可以与汞离子(Hg2+)作用形成T-Hg2+-T结构,使核酸探针的构型发生变化从而加大了芘分子的距离并产生了单芘分子的荧光信号。当生物硫醇存在时,它可与核酸探针上的T-Hg2+-T结构中的汞离子发生络合反应,破坏了T-Hg2+-T结构,使核酸探针构型发生变化,构型的变化拉近两个芘分子的距离产生双芘信号。同时由于体系中还有γ-环糊精可以与双芘分子发生主客体作用,使得双芘分子的荧光强度增强并延长其荧光寿命,从而利用长荧光寿命的特点实现了在复杂样品中对生物硫醇的检测。
  (2)基于双光子探针和环糊精主客体作用检测生物体内过氧化氢:将含有巯基的β-环糊精与金纳米颗粒相连;连有二茂铁双光子探针会因为二茂铁和β-环糊精发生主客体作用而相连,拉近了金纳米颗粒与双光子探针的距离,使其荧光猝灭。当体系中存在过氧化氢时在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下,过氧化氢与二茂铁发生氧化还原反应,使二茂铁中的二价铁被氧化成三价铁从而不与β-环糊精发生作用。连有二茂铁的双光子远离了金纳米颗粒表面后,荧光恢复。利用双光子荧光信号由无到有,检测体系中的过氧化氢。
[硕士论文] 周彬
基因组学 华中农业大学 2014(学位年度)
摘要:当前大量的公开数据库中已经积累了海量的小分子数据,其中包括药物相互作用数据、小分子的化学结构数据等,因此需要各种方法来挖掘这些数据中所包含的有用信息。本研究提出了两种小分子信息挖掘方法,这两种方法可以被应用于相关的医药研究。第一种方法利用了药物相互作用数据进行药物再利用的相关研究,而第二种方法利用了小分子的化学结构数据来预测癌症发生的相关蛋白。
  1.基于药物相互作用数据的药物再利用。由于传统的药物研发方式花费的时间很长,而且具有较高的风险,所以药物再利用(将现有药物用于治疗另外的疾病)得到了越来越多的关注。尽管已有许多类型的药物信息被用于药物再利用的相关研究,但是药物相互作用数据仍然没有得到有效利用,而这些数据中可能包含了药物的靶标或者生理效应的信息。在本研究中,药物在药物相互作用方面的相似性被用来推测药物在靶标或者生理效应方面的相似性。首先从数据库中收集了关于1074种药物的10835对药物相互作用,然后计算了其中700种药物之间的基于药物相互作用数据的相似性打分,并且将这些相似性打分转化成一个药物关联网络。该网络包含589个节点(药物)和2375条边(相似性打分),其中具有相似功能的药物倾向于聚集在一起,这表明药物相互作用与药物的生理效应之间具有显著的相关性。因此,该网络能够被用于推测药物的生理效应。然后本研究评价了该网络预测药物靶标的能力。结果表明该靶标预测方法对561种药物中的317种有效。最后将基于药物相互作用数据的靶标预测方法与基于药物化学结构的靶标预测方法进行了比较,发现这两种方法互为补充。综上所述,药物相互作用数据可以被用于药物再利用的相关研究。
  2.利用化学信息学预测癌症发生的相关蛋白。癌症给人类造成了沉重的负担。传统的癌症治疗方法有非常大的副作用,所以迫切需要开发出新的专一作用于肿瘤的分子靶向药物。而癌症发生的分子机制的阐明能够很大程度地促进相关药物的研发。因此,癌症相关蛋白的识别具有非常重要的意义。本研究尝试从一种新的角度对癌症相关蛋白进行预测。其利用化学信息学方法分析了已有的生物活性数据库中抗癌化合物与各种蛋白质对应的活性化合物之间的关系,从而找出癌症与这些蛋白质之间可能存在的联系。通过对最终预测得到的癌症相关蛋白的列表进行分析,发现该化学信息学方法具有较好的预测能力。根据检索到的文献报道,在排名最高的前31种蛋白质中,约一半与癌细胞的增殖、凋亡或分化相关。另外,在癌症相关蛋白的预测过程中,还产生了一个化合物-蛋白质矩阵。该矩阵由K-562癌细胞系的3160个活性化合物与进行预测的所有蛋白质所形成,包含了这些化合物与蛋白质之间可能的相互作用信息。这些信息对于药物发现有一定的作用。本研究表明化学信息学在癌症相关蛋白的预测中具有较好的应用前景,可以帮助揭示癌症发生的分子机制。
[硕士论文] 丁琼
应用化学 南昌大学 2014(学位年度)
摘要:血清白蛋白(SA)是人体中一种十分重要的蛋白质,它有许多功能,包括和药物小分子的吸收结合、与食品中有害小分子的作用等。纳米材料的特有尺寸,使其相对于其它材料有很多优异的性能,并在许多领域,包括化学、医学等得到广泛的应用。而将纳米材料用作某些药物的载体是研究比较前沿和科研工作者感兴趣的课题。本论文从分子水平上研究了几种常见的小分子,包括抗癌药物白藜芦醇、烟叶中有害小分子尼古丁以及常作为补铁剂的氯化血红素与牛血清白蛋白(BSA)的作用,通过荧光光谱法等测试手段获得这几种小分子物质与 BSA相作用的信息。我们还在该作用过程中引入纳米粒子,考察纳米粒子对该反应可能产生的影响,以对纳米粒子的应用作出一些有益的结论。本文的研究由三个方面组成:
  1.研究了烟草中主要致烟瘾物质尼古丁与BSA二者的反应情况,并在尼古丁和BSA的反应过程中加入银纳米粒子(Ag NPs),将得到的结果与之前未加入Ag NPs时的结果进行比较,可以看到在体系中加入Ag NPs后会抑制尼古丁与BSA的结合。进而考察了Ag NPs抑制BSA与尼古丁结合的原因,运用几种光谱学方法来研究BSA与Ag NPs的结合,结果表明Ag NPs与BSA的结合会引发BSA二级结构的改变,改变了尼古丁和BSA的结合状态。
  2.使用了荧光光谱、紫外吸收光谱以及微分脉冲伏安法研究补铁剂氯化血红素和 BSA的作用,将得出的结果与体系中同时存在单宁酸的情况进行对比,可以看到在实验体系中加入单宁酸后,氯化血红素和BSA的结合变弱,即结合常数变小,以及结合位点数减小, BSA二级结构的改变程度也变得更弱。另一方面还研究了单宁酸对氯化血红素和BSA之间结合力的改变情况,得出单宁酸的存在并不能改变氯化血红素和BSA的结合力类型的结论。
  3.首先根据文献合成聚乙二醇包裹的四氧化三铁纳米粒子(PEG-Fe3O4),并进行表征,运用荧光和紫外光谱法研究PEG-Fe3O4和抗癌药物白藜芦醇的吸附作用,结果显示纳米粒子会和白藜芦醇作用进而求得纳米粒子对白藜芦醇的载药量,随后研究了合成材料与BSA的相互作用,最后运用光谱法结合化学计量学研究了白藜芦醇与BSA的作用并考察了PEG-Fe3O4的存在对该结合作用的影响,验证了PEG-Fe3O4可以用作药物载体的可能性。
[硕士论文] 鲁卢
化学工艺 南昌大学 2014(学位年度)
摘要:本论文是基于适体技术化学发光检测生物小分子腺苷的研究,主要以腺苷为研究对象,羧基修饰的磁性微球作为分离载体,通过氨羧反应将适体连接于磁性微球上,再通过碱基配对原则连接上报告序列,由于配体腺苷的竞争作用,导致连接于磁性微球上的化学发光物质减少,信号减弱,从而间接实现腺苷的检测。论文通过实验构建了三种检测方法,具体实验方法如下:
  第一种检测方法是使用辣根过氧化物酶化学发光体系检测。实验优化了羧基修饰的磁性微球、氨基适体、和链霉亲和素修饰辣根过氧化物酶的量、考察了尿苷、胞苷及鸟苷对腺苷适体的选择性。结果发现腺苷浓度在1×10-9 mol/L~10-4 mol/L范围内,化学发光信号和腺苷浓度线性关系良好,腺苷的最低检测浓度达到1pmol/L;并对实际尿样也进行了检测和回收率实验,结果表明该法具有一定的可行性;
  第二种检测方法采用液溴-金纳米粒子化学发光体系检测,建立了基于适体-金纳米粒子化学发光检测腺苷的新技术,实验优化了羧基修饰的磁性微球、氨基适体、报告序列和金纳米粒子标记链霉亲和素金的量,最后在进行了选择性实验后对实际尿样中的腺苷进行了检测,此外论文中的金纳米粒子是通过柠檬酸钠还原氯金酸制备的,通过螯合反应制备链霉亲和素标记金纳米粒子。实现化学发光间接检测生物小分子腺苷;
  第三种检测方法是在上部分研究的基础上,建立了金纳米粒子经羟胺-氯金酸体系放大,使鲁米诺化学发光体系发光的催化能力显著增大,从而达到提高灵敏度的作用。同样对实验中所需反应条件进行了优化考察和选择性实验。同时在最优实验条件下实现了对腺苷的检测,其最低检测限高达到了100 fmol/L;并通过特异性实验、回收率实验证明这一检测方法的选择性良好,稳定性和重复性都符合要求。也实现了肿瘤患者实际尿样中腺苷的检测,获得满意结果。因此本方法操作简单、灵敏度高有望为临床诊断疾病提供有利分析数据。
[硕士论文] 张晓敏
制药工程 上海交通大学 2014(学位年度)
摘要:目的:LUHMES细胞可以被分化成为有丝分裂后细胞,并且在生化性质、细胞形态和功能等各方面都与多巴胺能神经元相类似。为了发现在治疗帕金森病方面具有神经元保护作用的化合物,我们建立了以分化后LUHMES细胞为基础,模拟多巴胺能神经元退行性变的模型。
  方法:LUHMES细胞在cAMP和GDNF的作用下分化。用MPP+或携带有α-synuclein蛋白过表达基因的baculovirus病毒处理分化后的LUHMES细胞,诱导细胞产生与多巴胺能神经元退行性变相似的细胞毒性。细胞的ATP水平以及caspase3/7的活性作为评价细胞毒的指标。CDK2抑制剂GW8510和GSK3β抑制剂SB216763作为文献报道的化合物处理细胞,考察其对MPP+和α-synuclein诱导的细胞毒的缓解作用。
  结果:分化过程中,LUHMES细胞逐渐能够表达多种多巴胺能神经元特有的标志物,生长出延长的突起并成为有丝分裂后细胞,与神经元相似。MPP+能够剂量依赖性地降低分化后的细胞ATP水平并升高caspase3/7的活性。两种化合物(GW8510和SB216763)均能够缓解MPP+诱导的细胞毒,且EC50分别为12 nmol/L和205 nmol/L。α-synuclein蛋白过表达同样能够有效降低细胞ATP水平及升高Caspase3/7活性,但其产生的细胞毒只能被GW8510有效缓解,SB216763作用不明显。
  结论:我们建立了两种帕金森病相关的细胞毒模型,并使用文献报道的化合物分别对两种模型进行了验证。为探寻或筛选治疗帕金森病方面具有神经元保护作用的化合物,相比于需要高技术要求及规模有限的原代多巴胺能神经元,分化后的LUHMES细胞将提供一种优良的平台。
[硕士论文] 任翔宇
生物化学与分子生物学 东北林业大学 2013(学位年度)
摘要:镍是植物体内一种必需的微量营养元素。它是脲酶的金属辅基,脲酶的作用是催化尿素水解,广泛分布于细菌、真菌、藻类及高等植物中。此外在某些微生物中,镍还是镍铁氢化酶、一氧化碳脱氢酶、乙酰辅酶A脱羧酶/合成酶、超氧化物岐化酶SodN和甲基辅酶M还原酶的必须组分。钴没有被定义为必需的营养元素,但在许多种植物中均发现了这种元素。大量研究都表明加少量钴对作物产量有积极作用,因此将其定义为有益元素。
  金属离子转运蛋白在细胞、组织和器官水平上担负着吸收及运送金属离子功能。目前从拟南芥中克隆到的金属离子转运蛋白家族主要有ZIP家族、YSL家族和NRAMP家族。对微生物的研究中,发现了高亲和性的镍钴离子转运蛋白。这种高亲和性镍和钴的吸收过程主要依赖于ABC转运系统和其他一些次级转运蛋白。目前在植物体内镍钴离子的吸收转运过程尚不清楚,几乎没有有关镍钴转运蛋白的研究报道。本研究从模式植物拟南芥中,克隆得到一个基因(At4g35080),该基因编码一个假定的高亲和性Ni2+/Co2+的转运体(a putative high-affinity nickel/cobalt transporter)(简称AtHAN)。经测序AtHAN基因开放阅读框(ORF)长为1098bp,编码365个氨基酸,对其氨基酸序列进行了功能域分析,预测AtHAN的140-364个氨基酸具有高亲和地转运镍钴离子的功能,是有5个跨膜区的跨膜蛋白。
  将pREP3-AtHAN重组质粒和pREP3空载体转化到酵母镍离子吸收缺陷型菌株△nic(l)p中,使用原子吸收光谱法测定了转基因酵母中镍钻离子的含量。结果表明AtHAN参与了酵母细胞对于镍离子和钻离子的吸收过程。但是在添加不同浓度镍离子的培养基上,转基因酵母的生长相对于对照没有明显差别;添加0.6mM钴时转基因酵母的生长差于对照。我们推测酵母细胞对于镍离子的需要量很低(nM级别),培养环境中充足的镍源足以保证酵母细胞的正常生长。过量的添加镍离子对转基因酵母和对照均具有胁迫作用,故生长没有明显的差别。酵母中的亚细胞定位研究表明,AtHAN蛋白定位于酵母细胞内质网上。
  对AtHAN基因的表达特性的研究表明AtHAN基因在花和根中的表达量较高,基因的表达受环境中镍离子和钴离子含量的影响。将AtHAN基因构建到植物表达载体pBI121,并转化到拟南芥中鉴定得到AtHAN过表达植株。相对于野生型植株过表达拟南芥对较高浓度的钴表现出敏感性,而镍处理下没有表现出明显的表型特征。40μM、150μM CoCl2的处理条件下,过表达拟南芥植株叶中Co2+的积累量大于野生型,根中积累量基本相同。而NiSO4处理条件下根和叶中的Ni2+的积累量基本相同。推测AtHAN可能参与了钴离子的运输,使过表达拟南芥植株的叶中积累了高浓度的钴,进而影响了了植株的生长。
[硕士论文] 闫潇娜
分析化学 河北大学 2013(学位年度)
摘要:近几十年,蛋白质与药物小分子的相互作用研究已成为生物、医学和化学领域科研人员的关注热点,该研究有助于探索小分子配体的结构和性质对蛋白质的结构和功能的影响。本文以牛血清白蛋白和牛血红蛋白作为研究载体,探讨了某些药物与蛋白质间的相互作用,并在此基础上进一步研究了共存金属离子对该体系的影响。研究内容共分以下五部分:
  第一章:综合介绍了药物在生物体内发挥药效的过程及蛋白质分子在这种过程中的重要地位。在分子水平上深入研究药物小分子与蛋白质的结合机理能够帮助人们理解蛋白质与小分子的作用原理,为筛选及研发药效高、应用广及毒副作用小的新药提供丰富的理论依据。对蛋白质与药物小分子相互作用的研究方法、研究进展进行了综述,共引用参考文献82篇。
  第二章:利用荧光猝灭、同步荧光及圆二色谱法研究了不同温度下牛血清白蛋白(BSA)与头孢匹胺钠(CPMS)的相互作用及常见金属离子(Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Ni2+)对BSA-CPMS体系的影响。结果表明CPMS能使BSA的荧光发生猝灭,其过程为静态猝灭并伴有非辐射能量转移;CPMS通过静电引力与BSA结合,结合常数为104数量级,结合位点数约为1;结合主要作用于BSA的亚结构AⅡ中,结合距离r≈2.60nm,Hill系数nH略小于1,表明CPMS对后继配体有弱的负协同作用。同步荧光光谱和圆二色谱均表明CPMS使BSA构象发生变化。
  第三章:利用光谱法研究了不同温度下牛血红蛋白(BHb)与头孢匹胺钠(CPMS)的相互作用及常见金属离子(Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Ni2+)对BHb-CPMS体系的影响。结果表明CPMS能使BHb的荧光发生猝灭,其过程为静态猝灭并伴有非辐射能量转移;CPMS通过静电引力与BHb结合,结合常数为104数量级,结合位点数约为1,结合距离r≈3.08nm,Hill系数nH约等于1,表明CPMS对后继配体无协同作用。同步荧光光谱和圆二色谱均表明CPMS使BHb构象发生变化。
  第四章:利用光谱法研究了不同温度下牛血红蛋白(BHb)与黄藤素(PMT)的相互作用及常见金属离子(Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Ni2+)对BHb-PMT体系的影响。结果表明PMT能使BHb的荧光发生猝灭,其过程主要为静态猝灭并伴有非辐射能量转移;PMT通过静电引力与BHb结合,结合常数为104数量级,结合位点数约为1,结合距离r≈2.44nm,Hill系数nH约等于1,表明PMT对后继配体无协同作用。BHb与PMT的结合率对PMT的浓度有依赖性,对BHb的浓度无依赖性,Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Ni2+的加入使得BHb与PMT结合减弱,结合常数的减小。同步荧光光谱和圆二色谱均表明PMT使BHb构象发生变化。
  第五章:利用光谱法研究了不同温度下牛血红蛋白(BHb)与水杨酸(SA)的相互作用及常见金属离子(Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Ni2+)对BHb-SA体系的影响。结果表明SA能使BHb的荧光发生猝灭,其过程为静态猝灭并伴有非辐射能量转移;SA通过静电引力与BHb结合,结合常数为103数量级,结合位点数约为1;结合主要作用于BHb疏水腔内的β-37色氨酸,结合距离r≈3.31nm,Hill系数nH约等于1,表明SA对后继配体无协同作用。同步荧光光谱与圆二色谱均表明SA改变了BHb色氨酸残基所处的微环境,使BHb构象发生变化。
[硕士论文] 兰伟
计算机应用技术 广西大学 2012(学位年度)
摘要:随着人类基因组计划的完成,生物数据增长的速度非常快。传统的生物实验的方法在庞大的数据前显得十分乏力。如何快速而又准确的利用生物信息学方法准确,高效的从生物数据中挖掘内在生物特征和规律,成为当前的热门话题。近年来,由于miRNA在生物发育、成长过程中起着重要的调控作用,miRNA的研究得到广泛的关注。各种生物信息学的应用miRNA的研究,包括miRNA预测,靶基因的预测,二级结构的研究等,获得很好的效果。
   本文通过深入分析已有miRNA的建模方法,总结前人的miRNA的研究的优势和不足上,提出两种miRNA建模方法。一种是利用茎区和环区对miRNA建模,只关心在各个茎区和环区里碱基的个数。另一种是考虑在各个位点上,出现某种特定碱基和结构。
   本文针对现有的方法对miRNA之间相互作用关系研究不足,提出一种结合二级结构和联合熵的方法来挖掘相互作用miRNA对。通过利用二级结构,保证本文的方法在生物上更加准确。利用RMS来度量miRNA的结构相似性。利用联合熵的方法来找出可能有重要的相互作用的miRNA对。文中最后利用阈值的方法,去掉不重要的相互作用的miRNA对,提高了算法的效率。并通过大量实验验证,本文的方法不仅能够能找到已知的相互作用miRNA,而且可以发现一些未知的但是可能存在重要的相互作用的miRNA,通过和现在流行的序列比对算法对比,表明本文的算法在时间复杂度上更优于现有的算法。
   本文针对现有算法对成熟体miRNA位点研究的不足,提出一种利用信息熵来分析成熟体miRNA保守位点的方法,包括单碱基信息熵和联合碱基信息熵。信息熵越低,位点更保守,那么该位点可能具有更重要的功能。和传统的方法不同的是,该方法不但考虑了序列信息,而且还考虑结构信息,以此来保证该方法能够充分的反映miRNA信息。实验结果表明,该方法能够发现已知的保守位点,而且还可以发现新的未知的保守位点。
[博士论文] 王远强
生物化学与分子生物学 西南大学 2012(学位年度)
摘要:抗生素因抗菌效果显著得以在临床上广泛应用乃至滥用,致使大量细菌对其产生耐药性。抗生素本身是细菌为保护其免受病原菌攻击而产生的一类化学物质,因而病原菌也能通过产生水解酶或药泵、基因突变、改变细胞膜性质等方式形成耐药。目前,耐药菌已遍布全球,严重威胁人类健康。尽管科学家针对耐药菌不断改进抗生素,但细菌总能以更聪明的方式形成耐药,使得抗生素的开发难度与日俱增。抗菌肽(AMP)是生物体为抵御外源性病原菌入侵而产生的一类多肽物质,也是自然免疫的重要组成部分。由于抗菌肽的作用机制与传统抗生素存在显著区别,因而具有抗菌谱广、杀菌快速、耐药性低等传统抗生素无法比拟的优点,有望开发成为一类高效、低毒的新型抗菌药物。
   鉴于抗菌肽的固有特点及其广阔的应用前景,研究人员基于抗菌肽的阳离子性和两亲性结构特征,通过序列模板法和组合肽库法设计并筛选获得了多个具有较好活性的抗菌肽。然而,规模化生产成本高、耐酶稳定性差、潜在溶血毒性是制约抗菌肽进入实际应用的瓶颈。小分子抗菌拟肽及其类似物的研究使其向实际应用迈进了一大步,然而天然抗菌肽与其类似物仍存在抗菌活性不理想及潜在溶血毒性等问题。目前,由于没有可靠的理论模型用于抗菌活性与溶血毒性的准确预测,因而难以从理论上指导抗菌肽的设计与筛选,极大增加了抗菌肽的理论设计与应用开发难度。因而,通过建立理论预测模型指导抗菌肽的合理设计与虚拟筛选,有望发现抗菌活性好、耐酶解能力强、溶血活性低的小分子抗菌肽,可为低耐药性抗菌药物的应用开发奠定理论与物质基础。综上所述,本文基于定量构效关系(QSAR)研究建立抗菌肽的理论预测模型,指导基于天然氨基酸的抗菌五肽及抗菌四肽的组合设计与虚拟筛选,最后通过抗菌活性与溶血毒性实验验证理论模型的可靠性,取得了如下研究结果:
   1.本文使用来自数据库的89种氨基酸物理化学性质用于抗菌肽的结构表征,并使用逐步回归(STR)与多元线性回归(MLR)相结合的方法(STR-MLR)成功建立了系列合成抗菌肽(R2=0.793,Q2=0.751)、novispirin抗菌肽(R2=0.970,Q2=0.872)和表面粘附抗菌肽(R2=0.686,Q2=0.639)的QSAR模型。本文所建QSAR模型的稳定性与预测能力与文献相当甚至更优。STR-MLR模型的标准化系数不仅可用于分析抗菌肽的优势位点,而且能用于计算氨基酸贡献值以发现优势氨基酸,进而指导抗菌肽的理论设计或结构改造。STR-MLR模型具有稳定性好、预测能力强、物理化学意义明确、操作简便、易于实现等优点,可有效用于抗菌肽的虚拟设计与高效筛选。
   2.本文使用STR-MLR方法分别建立了六肽和五肽对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)抗菌活性的QASR模型,通过模型标准化系数并结合保守残基分析,发现了抗菌六肽和五肽的优势位点与优势氨基酸。同时,使用比较分子力场分析(CoMFA)与比较相似性指数分析(CoMSIA)方法分别建立了该系列抗菌肽基于N-端和C-端公共骨架叠合的三维构效关系(3D-QSAR)模型。CoMFA与CoMSIA对E.coli和S.aureus抗菌活性所建模型的交互检验复相关系数均高于0.400,表明所建模型具有较好的稳定性与预测能力;而且,CoMFA与CoMSIA等值面图可为抗菌肽的合理设计及结构改造提供可视化信息。本文基于小分子抗菌肽的STR-MLR模型及3D-QSAR研究结果,以牛乳铁素片段LfcinB6(RRWQWR)为模板,结合抗菌肽的阳离子性、两亲性、优势位点、优势氨基酸等信息,确定抗菌肽的虚拟组合设计方案,并据此虚拟设计540条理论抗菌五肽。首先根据阳离子性与两亲性的结构特征初步筛选121条抗菌肽,然后使用STR-MLR、CoMFA、CoMSIA模型预测并筛选出4条理论抗菌肽,最后通过抗菌活性与溶血毒性实验验证抗菌肽理论设计与筛选方法的可靠性。此外,为了探索序列更短的多肽是否仍具有抗菌活性,本文基于LfcinB6、结合保守残基分析与QSAR研究,定向设计一条抗菌四肽进行实验研究。
   3.本研究分别使用使用固相合成方法合成、反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化及质谱(MS)鉴定已筛选的抗菌五肽,高效液相色谱(HPLC)分析结果显示,固相合成抗菌肽的纯度达到95%以上,质谱测定与理论计算分子质量完全相符,达到抗菌活性与溶血毒性实验研究的要求。
   4.本文为验证已筛选抗菌肽的抗菌效果,首先通过琼脂平板法测定抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的生长抑制作用,然后使用微量稀释法定量测定抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)。琼脂平板实验结果表明除“RWQWR”外,其他抗菌肽均具有较模板肽(LfcinB6)优异的抗菌活性,而且抑菌斑在7天内不缩小,表明抗菌肽的抗菌效果较为持久。抗菌肽对比实验显示,设计抗菌肽的最佳抗菌活性仅为庆大霉素的50%左右,因而还有待进一步提高抗菌活性。抗菌活性定量测定结果表明,设计抗菌肽对4种细菌的MIC在16-128μg·ml-1之间,与文献报道小分子抗菌肽的抗菌活性基本相当,有必要在此基础上通过结构修饰等方法进一步提高其抗菌活性,进而提高其实际应用潜力。对比实验测定与模型预测抗菌活性发现,三种定量预测模型均可较准确的预测抗菌肽活性。总体而言,CoMFA模型对抗菌活性的预测能力最优,而STR-MLR模型的预测能力稍差,可能与STR-MLR建模样本数较少有关。
   5.溶血毒性是抗菌肽能否进入实际应用的重要前提,本研究分别使用平板法与微量稀释法测定设计抗菌肽的溶血活性。平板实验显示设计抗菌肽在72小时不出现溶血现象,相比48小时就出现溶血的模板肽(LfcinB6),设计抗菌肽的溶血活性并不明显。微量稀释法所测定的抗菌肽溶血百分率显示,设计抗菌肽在100μg·ml-1时才出现溶血效应,且浓度在1 mg·ml-1时的溶血率均低于5%,表明设计抗菌肽具有良好的安全性,具有进一步开发利用的潜力。
   6.本文设计抗菌四肽对4种菌株的MIC在8-64μg·ml-1之间,表明更小分子的抗菌肽同样具有优异的抗菌活性,为设计与筛选化学合成容易小分子抗菌肽奠定了基础。然而,该抗菌肽在32μg·ml-1时出现溶血效应,且在1 mg·ml-1时的溶血率百分率高达25%,因而有必要将其作为先导化合物进行结构改造,以进一步提高其安全性。
   本文将生物信息学、化学信息学与生物化学有机结合,通过抗菌肽的QSAR研究以及保守残基分析,建立了抗菌肽设计与筛选的理论方案。根据抗菌六肽、五肽的二维及三维QSAR研究结果,结合抗菌肽的阳离子性与两亲性的结构特征,虚拟组合设计并高效筛选获得4个理论抗菌肽,最后通过抗菌活性及溶血毒性实验研究,获得3个抗菌活性较好、溶血毒性小的抗菌五肽。本文设计抗菌肽的理论预测与实验测定抗菌活性相当接近,说明基于QSAR理论预测模型的抗菌肽设计与筛选方法高效、可靠、易行。本研究不仅成功建立了抗菌肽理论设计、高效筛选与实验验证的完整技术方案,而且筛选获得3个小分子抗菌肽先导物,为抗菌肽的理论研究与应用开发奠定了良好基础。
[硕士论文] 李娟
分析化学 山东大学 2012(学位年度)
摘要:本论文的研究内容主要包括以下几个方面:
   1.聚天冬氨酸/纳米金修饰电极对多巴胺、抗坏血酸和尿酸三者的同时测定
   本文制备了纳米聚合物膜掺杂纳米金粒子的修饰电极。修饰过程包括首先在电极表面电化学聚合天冬氨酸,然后利用电沉积法,再将金纳米粒子还原到电极表面上。最终所制备的修饰电极(聚天冬氨酸/纳米金修饰玻碳电极,PAA/nano-Au/GCE)分别用扫描电子显微镜(SEM)和电化学阻抗(EIS)表征。与其它电极相比,该修饰电极结合了金纳米粒子灵敏度高和有机聚合物膜选择性好的优点,它不仅可以有效催化AA、DA及UA的电化学氧化,同时可将三者的氧化峰明显分离开,他们的出峰电位分别是0.0V、0.20V、0.35V。采用伏安法可实现对三者的同时测定。测定的线性范围分别为5.0×10-7-1.0×10-4mol/L(对DA)、5.0×10-6-2.0×10-3mol/L(对AA)和5.0×10-6-1.0×10-3mol/L(对UA);三者的检测限分别为DA6.5×10-8mol/L,AA5.6×10-7mol/L,UA3.0×10-7mol/L(S/N=3)。实验结果表明在PAA/nano-Au/GCE上,DA、AA和UA三者的氧化过程是独立的,相互之间没有干扰,在这种前提下,对三者的同时测定更为精确。另外,在小牛血清和胎牛血清样品检测中也获得了满意的实验结果。
   2.聚磺基水杨酸/纳米金修饰电极上抗坏血酸存在下的多巴胺的选择性测定
   通过电聚合作用制得了聚磺基水杨酸修饰玻碳电极(PSA/GCE),再用一步电沉积的方法将氯金酸直接还原为纳米金并修饰于聚磺基水杨酸修饰的玻碳电极上,制备了聚磺基水杨酸/纳米金修饰玻碳电极(PSA/nano-Au/GCE)。我们选用铁氰化钾与吡啶钌分别做为阴离子、阳离子电化学探针对修饰电极进行表征。带正电荷的DA被电极表面呈负电性的聚合物吸引,而带负电的AA被排斥,基于此DA更容易被富集到电极表面。实验研究了在2000倍的AA共存时,先将电极置于DA与AA混合的溶液富集,再转移至空白底液中对DA进行分析测定,可达到将AA的干扰最大限度地去除;在100μmol/LAA存在下,DA在50nmol/L-5μmol/L范围内呈良好的线性,DA的检测限达7nmol/L。实验还对多巴胺盐酸注射液进行样品测定,结果满意。
   3.基于吡啶钉掺杂二氧化硅纳米颗粒构建谷胱甘肽电化学发光传感器
   实验采用反相微乳液法合成了Si02掺杂Ru(bpy)32+的纳米颗粒,Ru-DSNPs。透射电子显微镜镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)分别用来表征该纳米颗粒,其直径大小约为58±4nm。包裹在二氧化硅中的Ru(bpy)32+分子可以保持其自身的电化学和电化学发光性质;同时由于静电作用,外部的多孔二氧化硅外壳可以有效地防止Ru(bpy)32+分子浸到外部溶液中。基于Ru-DSNPs构建了谷胱甘肽(GSH)电化学发光(ECL)传感器。实验发现Ru-DSNPs的ECL强度比单个发光分子(Ru(bpy)32+)有显著的增强。实验结果表明对GSH的测定有很高的灵敏性,加入GSH之后体系的电化学发光强度的改变与GSH浓度呈线性关系;在1×10-9mol/L-1×10-3mol/L范围内线性良好(R=0.9978),检测限可低至0.7nmol/L。该电化学发光生物传感器的灵敏度和稳定性令人满意。
   4.基于电化学还原石墨烯氧化物修饰玻碳电极的还原性辅酶Ⅰ(NADH)安培传感器
   由石墨氧化物(GO)直接电化学还原制备石墨烯(GR),克服了传统化学还原法的一系列弊端,如过程复杂、步骤费时、所用的还原剂对环境有污染等,同时电还原的石墨烯直接修饰在玻碳电极(GR/GCE)上,用其可进行辅酶NADH的安培测定。该修饰电极有以下优点,简单易制备,价格低廉、电子传递速率快以及可防止表面污染钝化,其展现了对NADH良好的催化性能,这些都是基于GR独特的二维空问结构及电极有效表面积的增大。GR/GCE用于对NADH高灵敏分析检测,线性范围宽(10-1000μmol/L),检测限低至1.3μmol/L,灵敏度为8.9μAmM-1;实验还研究了GR/GCE对NADH分析测定的稳定性与重现性;其在生物物质测定和免疫分析中有深远的应用价值。
[硕士论文] 何彬
生物医学工程 电子科技大学 2012(学位年度)
摘要:小分子直接作用受体的预测在药物设计、化学生物学等领域有着重要应用价值。传统实验测定获得了不同蛋白质作用受体的大量配体活性数据,被收集在欧洲生物信息学中心ChEMBL数据库和其它数据库中,如BindingDB和PubChem。但在计算机辅助药物设计和研究小分子对生物网络通路的调控作用等工作中,经常遇到未有实验报道的小分子和作用受体信息;基于知识数据库的机器学习方法可用来快速预测小分子作用受体,聚焦研究重点,提高研发效率。
  有研究表明银莲花素A、毛兰素、卡瓦胡椒素A/B/C能有效抑制肿瘤细胞生长。对银莲花素A、毛兰素、卡瓦胡椒素 A/B/C进行结构相似性检索和子结构检索,筛选出的小分子化合物按照作用受体分为作用受体类,对每个作用受体类的分子数进行统计排序,视分子数量较多的为可能的作用受体。通过对预测的作用受体进行分析发现,这些预测的可能作用受体大多都是癌症相关的作用受体。通过结构相似性和子结构检索筛选统计的方法能较好的预测分子可能的作用受体。
  根据作用受体已知配体,采用朴素贝叶斯分类方法,建立基于分子指纹的预测模型。该模型应用在DUD(Directory of Useful Decoys)数据集测试结果表明,大多数作用受体的真阳性和真阴性预测准确率大多数要高于90%。PubChem数据库作为建模背景,DUD数据集各作用受体类的活性分子作为训练集的活性分子建立朴素贝叶斯分类模型,分类效果优于DUD数据集建立的朴素贝叶斯分类模型。对DUD数据集中40个作用受体建立朴素贝叶斯分类模型并保存,对DUD数据集中所有的活性分子进行作用受体预测测试,DUD数据集40个作用受体类中有31作用受体类的预测准确性大于80%,结果表明,DUD数据集中大多数作用受体类的活性分子都有很好的预测效果。
  以PubChem数据库建模背景,ChEMBL数据库中ace类小分子化合物作为训练集的活性分子建立朴素贝叶斯分类模型能较好的将DUD数据集ace类的活性分子和非活性分子分开。对ChEMBL数据库中所有分子按照它的作用受体分为作用受体类,对每个作用受体类的化合物小分子进行筛选,并筛除分子数较少的作用类,对筛选后的所有作用类建立朴素贝叶斯分类模型,采用DUD数据集活性分子进行测试,测试表明,模型能较好的预测DUD数据集中大多数作用受体类的小分子化合物作用受体。
[博士论文] 梁丽娇
分析化学 西南大学 2012(学位年度)
摘要:磷酸根阴离子家族不仅是生命体重要组成成分,在许多生命活动中起着非常关键的作用,而且在许多工业生产中也有着广泛用途。最近几十年里,关于磷酸根阴离子家族的相关研究已经引起越来越多科研小组的关注和重视。其中,基于有机小分子荧光探针对磷酸根阴离子的识别十分重要,体现在操作简单、反应快速,能够高灵敏、高选择性实现靶物离子的识别和测定。另外,基于核苷酸修饰纳米颗粒的分子光谱识别方法能够将纳米粒子的等离子共振光信号转换为溶液颜色的变化,从而实现对目标分子实时原位的色度法检测,也有着较好发展前景。磷酸根阴离子家族结构上的相似性使得在针对某一种磷酸阴离子进行探针设计方面具有较大挑战性。本文合成了含有咪唑或吡啶的荧光有机小分子,成功应用于特定磷酸阴离子的荧光识别和检测,主要研究内容如下:
   1.合成了一种三吡啶的衍生物(4-甲苯-2,2’:6’,2”-三吡啶(简称mptpy)),并利用其锌离子络合物实现了对无机焦磷酸盐的选择性荧光识别和测定。由于三吡啶衍生物在合成上的方便易行以及容易与金属离子螯合等优良特性,该类衍生物大量报道用于溶液中金属离子的分析检测,仅有部分应用于阴离子的荧光识别和测定。我们发现锌离子与mptpy络合后会引起mptpy分子内电荷的转移,导致其荧光光谱红移;而焦磷酸盐的加入则会抑制锌离子所引起的分子内电荷转移,从而使得荧光光谱发生蓝移。据此,建立了焦磷酸盐选择性荧光识别和检测的方法。该方法简单、快速、易操作,且具有较高选择性,能够很好地将焦磷酸盐与其他结构相似的磷酸阴离子进行有效区分。
   2.建立了基于咪唑衍生物(1,4-二甲基咪唑苯)锌离子络合物(简称bix-Zn(Ⅱ))的荧光比率法高选择性识别GTP。由于基于两个不同波长处荧光信号的比值,荧光比率法不容易受pH、反应试剂浓度、光源强度以及仪器灵敏度等外部条件影响,具有较高选择性和灵敏度。本研究发现,当受到230 nm激发光照射时,bix-Zn(Ⅱ)在289 nm处特征荧光峰强度会随着GTP浓度增大而降低;同时,在34l nm处出现一个新峰,从而在300 nm处形成一明显等发射点。利用GTP与锌离子之间特异性荧光增强以及bix-Zn(Ⅱ)本身荧光信号的降低,我们成功实现了对GTP高选择性的荧光比率识别。此外,含有鸟苷碱基的单链DNA同样可以引起bix-Zn(Ⅱ)的荧光比率反应,从而使得其有可能发展成为DNA中鸟苷碱基特异性识别探针。
   3.建立了基于bix-Zn(Ⅱ)和Hoechst33342以及FITC染料之间的FRET体系。因为传感模式易于控制,FRET机制已被广泛用于生物大分子的结结构和动力学分析。为实现对GTP的选择性荧光识别,本体系利用供体发射峰与受体吸收峰之间光谱重叠与否成功实现了小分子间FRET过程的构建。相对于没有加入染料之前,该FRET过程的Stokes位移大大增加,荧光检测信号发生红移,有利于复杂生物背景下相关样品的测定。
   4.利用碱性条件下,锌离子对GTP的特异性荧光增强效应,成功实现了对GTP选择性荧光识别,并对金属离子引起GTP荧光增强的性质进行了研究和探讨。在很多生物体的生命过程中,都需要金属离子与核苷酸共同参与才能完成,这使得核苷酸与金属离子之间作用机制的研究越来越受重视。当用280 nm光源激发时,GTP仅在346 nm处出现一个几乎可以忽略的荧光峰;而锌离子的加入能够引起该荧光峰较大程度的增强。我们发现GTP和锌离子间特异性绑定作用的荧光光谱研究方法简单方便、反应迅速,具有较好选择性,能够将结构非常相似的GDP和GMP等磷酸阴离子进行区分。
   5.基于碱基U和三聚氰胺间特异性的氢键绑定作用,合成了UTP修饰的金胶(UTP-AuNPs)并成功实现了对三聚氰胺高选择性的实时识别和检测。其他核苷酸(ATP、CTP以及GTP)修饰的金胶并不具备同样性质。利用加入三聚氰胺前后金胶等离子共振吸收(LSPR-A)和等离子共振散射(LSPR-LS)光谱性质的变化,我们建立了一种基于UTP-AuNPs对水溶液中三聚氰胺简单、灵敏、高选择性的可视化检测以及散射光谱测定方法。
   总体来说,本文基于磷酸盐家族阴离子与不同有机小分子间特异性的结合作用,不仅建立了对无机焦磷酸盐以及生物核苷磷酸盐选择性荧光识别和测定的方法,而且还实现了基于核苷酸修饰纳米颗粒对三聚氰胺的分子识别和检测。上述光谱识别的方法具有简单快速、高灵敏以及高选择性等优势,具有较好应用前景。
[硕士论文] 王丽兰
分析化学 西南大学 2011(学位年度)
摘要:电化学手性分析是电化学分析技术和手性识别方法的有机结合,根据电化学响应信号差异进行手性识别研究,具备了电化学方法的高灵敏、响应快、低成本,易于智能化和微型化等优点,同时还具备了手性识别方法的立体对映选择性,在医学及药学、食品安全、农业化学药品应用和环境安全检测等研究领域具有重要的研究意义。本文在国内外手性识别研究基础上,利用氮氧小分子构建手性电极表面,探讨了手性表面与生物分子和药物中间体的手性识别作用,主要研究工作如下:
   1.研究了DNA分子在1,2-二苯基乙二胺(DPEN)对映异构体构建的手性表面上的立体选择性吸附作用。通过共价键合将(1R,2R)-或(1S,2S)-DPEN修饰到金基底电极上形成手性表面。采用循环伏安技术表征并研究了手性表面的修饰过程及其电化学性质。通过原子力显微技术、循环伏安、电化学交流阻抗和石英晶体微天平技术分别研究了DNA分子在两种手性表面上的立体选择性吸附行为。实验结果表明,(1R,2R)-DPEN手性表面与DNA分子的作用强于(1S,2S)-DPEN手性表面,表面的手性对DNA分子的形态及吸附量产生了不同的影响。
   2.研究了L-半胱氨酸修饰的金电极(L-Cys-Au),在Zn(Ⅱ)存在下对药物中间体扁桃酸(MA)对映异构体的手性识别作用。通过循环伏安和电化学交流阻抗技术研究发现,在Zn(Ⅱ)存在下,L-Cys-Au与R-MA溶液反应后的电化学响应明显强于S-MA溶液,且Zn(Ⅱ)是导致该手性识别的重要因素:L-Cys与MA对映异构体选择性形成锌金属配合物。利用该法制备的手性传感器能够简便、快速地识别不同构型的MA分子,且能检测MA对映异构体比例,进一步扩展了手性配体交换原理在类氨基酸物质中的应用。
   3.采用电化学聚合方法在玻碳电极表面制备了L-氨甲喋吟(L-Mtx)手性聚合膜,并采用差分脉冲和循环伏安技术,在优化的聚合条件下研究了该手性聚合膜的相关电化学性质。对比研究发现,在相同条件下,聚合膜的氧化峰电流和还原峰电流明显大于L-Mtx溶液,其值是L-Mtx溶液峰值的15倍左右。但实验表明L-Mtx聚合膜的电化学性质是不可逆的。该手性聚合膜的制备和性质研究为其在手性识别中的进一步应用研究打下了良好的实验基础。
  
[硕士论文] 汤桂成
生物化学和分子生物学 三峡大学 2011(学位年度)
摘要:目的:多胺是一类广泛存在于生物体内的小分子化合物,它与细胞的多种生命活动有关,细胞内多胺的聚集会加速细胞增殖分化甚至肿瘤的发生。临床上应用多胺类似物进行肿瘤的治疗已取得很好效果,为了进一步深入研究多胺代谢与肿瘤的关系,本课题重点研究多胺分解代谢途径中关键酶之一精胺氧化酶的启动子结构和功能。
  方法:用Trizol试剂法从小鼠成纤维细胞中提取总 RNA,应用RNA连接酶介导的5`-RACE法获得 mSMO的转录起始位点;巢式 PCR方法克隆含有 mSMO启动子的DNA序列,并由此构建5`端系列截短的mSMO启动子荧光素酶的报告质粒;将报告质粒瞬时转染 Cos7细胞后,用荧光素酶分析法测定启动子活性。
  结果:确定 mSMO基因至少有6个转录起始位点(+1,+4,+27,+31,+51,和+63),且均定位于外显子1中。克隆获得 mSMO基因转录起始位点上游大约2.1kb的DNA片断,以此片段为基础构建了11个5端系列截短的启动子报告质粒。报告基因分析证实,该上游 DNA片段具有启动子活性,截短至-615和-176bp时,获得2个启动子活性峰值,截短至-373bp时启动子活性最低。
  结论:mSMO基因含有多个转录起始位点,其上游-176~+124bp为 mSMO核心启动子区,-615~-176bp区为重要的转录调控区。
[博士论文] 王永
生物医学工程;生物医学工程 东南大学 2010(学位年度)
摘要:相对于传统的有机染料,量子点由于具有许多独特的光学性质,如激发谱宽、发射谱窄、发射波长随尺寸可调、荧光寿命长和光化学稳定性高等。由于这些优异的光学性质,量子点已在DNA和蛋白质分析、细胞标记以及生物组织成像方面展现出巨大的应用潜力。然而,目前量子点用作荧光探针对生物小分子进行检测的研究还比较少。在本论文中,我们制备了不同表面修饰的CdTe和CdSe量子点,考察了一些生物小分子对其荧光强度的影响,具体的研究内容如下:
   1.合成了巯基乙酸、巯基乙胺、巯基甘油修饰的CdTe量子点和巯基丙酸、β-环糊精以及油酸修饰CdSe量子点。通过调节反应时间可控制量子点的生长,得到不同尺寸的量子点,其发射波长从蓝光到红光可调。
   2.制备了裸纳米金、三苯基膦修饰的纳米金以及巯基丙酸取代三苯基膦修饰的纳米金。通过荧光滴定法研究了巯基乙酸修饰的CdSe量子点与纳米金之间的能量转移作用,结果表明此三种纳米金均会猝灭CdSe的荧光,且纳米金的浓度与量子点荧光强度的关系符合Stern-Volmer方程。
   3.用发散法合成了G1.0-G4.0扇形PAMAM分子,系统地研究了其荧光性质及其与量子点之间的相互作用。此四代PAMAM分子均发射蓝色荧光,且随着其代数的增加,其荧光强度呈指数规律增强,同一代扇形PAMAM分子的荧光强度与其浓度呈良好的线性关系;扇形PAMAM分子荧光强度随pH值可逆变化,而且在pH3-8范围内二者呈线性关系。这些结果表明扇形PAMAM分子的荧光行为与其分子内叔胺基团的质子化有关。扇形PAMAM分子的荧光强度随pH线性可逆变化的性质使其可潜在地用作荧光pH探针。扇形PAMAM分子对巯基乙酸修饰的CdTe量子点(CdTe-TGA)具有荧光增强作用,此性质使其可以和CdTe量子点相结合用作复合荧光材料。
   4.用荧光滴定方法测试了L-半胱氨酸、ATP、叶酸和多巴胺对CdTe-TGA量子点荧光强度的影响。L-半胱氨酸可显著提高CdTe-TGA量子点的荧光效率,且量子点的荧光强度随其浓度的变化符合Langmuir吸附等温方程;叶酸、ATP和多巴胺均对量子点具有荧光猝灭作用,并且在一定的浓度范围内,量子点的荧光强度随它们的浓度变化符合Stern-Volmer方程。这些结果表明CdTe-TGA量子可用作这些生物小分子的荧光探针。
   5.提出了一种水相中制备CdTe/CdS核壳结构纳米粒子的方法,并用微乳液(W/O)法在CdTe/CdS纳米粒子表面包被一层SiO2壳层,包覆SiO2后所形成的复合结构纳米粒子(CdTe/CdS)/SiO2的荧光强度较CdTe量子点提高了10%。TEM照片显示一个SiO2纳米球中包有一个或多个CdTe/CdS核,其粒径为42±3nm。
   采用MTT法测定了CdTe-TGA量子点对RAW264.7细胞的毒性,结果表明一定浓度的CdTe量子点能够抑制的RAW264.7细胞的生长。CdTe量子点对RAW264.7细胞的半数生长抑制浓度(IC50)为6.62μg/mL。而(CdTe/CdS)/SiO2纳米粒子对RAW264.7细胞半数生长抑制浓度为725.97μg/mL。相对于CdTe-TGA量子点,(CdTe/CdS)/SiO2纳米粒子对细胞的毒性大大降低,而且其表面的SiO2壳层易于修饰,因此(CdTe/CdS)/SiO2纳米粒子是一种用于细胞观察的较好的材料。
[博士论文] 姚镜
生物物理学 华中科技大学 2009(学位年度)
摘要:现代生命科学的发展改变着人们对生命获得过程的认识,而离子通道的研究不仅与信号发生、传递和转导紧密关联,同时也涉及到诱发各种遗传或非遗传疾病的分子机制。了解离子通道的精细结构,探讨离子通道的门控机制和动力学特性,弄清楚离子通道结构和功能之间的关系意义重大。本研究工作由两部分组成:第一部分探讨了钙和电压激活的大电导钾离子通道(Maxik 通道,又名BK 通道)的β2 亚基N 端失活域在由α亚基组成的孔道中的作用位点;文章第二部分则是讲述痛觉敏感型通道TRPV1的适应性调节的分子机制的。
   BK 通道广泛地存在于可兴奋细胞,特别是神经系统中,具有调节胞内钙浓度和膜电位等重要生理功能。目前,电压依赖型钾离子通道(Kv 通道)的研究已取得较大进展。BK通道与Kv通道在结构和功能上既存在某些相似之处又各具特点。如它们都结合有β辅助亚基,并由β亚基的N端疏水性氨基酸残基堵塞孔道引起N型失活。
   然而现有实验结果表明,K+通道的孔道阻断剂(如TEA、QX-314等)能够减慢Kv通道的失活过程,然而却不能减慢BK 通道的失活。为什么这两者如此不同?BK通道的β2亚基N端失活域是否进入由α亚基组成的BK孔道?两者究竟发生了怎样的相互作用?通道阻断剂为什么不和失活域在通道孔中相互竞争结合位点?本课题的研究目的之一即是要回答和解决这些目前仍然困扰我们的问题。我们将hβ2N端的前三个氨基酸FIW突变为FWI,发现hβ2的这一突变体hβ2-FWI对BK通道的失活没有影响,但通道的失活恢复曲线却由单指数转变为双指数。利用hβ2-FWI所引起的双指数恢复特性变化作为两者间相互作用的判定依据。通过丙氨酸扫描法(Alaninescanning),即将α亚基形成孔道的S6区疏水性氨基酸依次突变为疏水性较弱的丙氨酸,然后通过膜片钳实验记录分析失活后通道的恢复特性变化,进而了解两者间的相互作用。
   借助作为通道孔道阻滞剂的麻醉剂QX-314和TEA等药物进一步解释了BK通道失活的非竞争机制。我们得到了如下几个结论:
   (1)位于mSlo1孔道中的氨基酸Ile-323是失活过程中与β2亚基N端失活域有相互作用的主要位点。孔道内的另外两个氨基酸M314和V319 也参与了这一过程。
   根据hβ2-FWI 亚基N 末端的线性结构特点,我们推测mSlo1孔道与hβ2-FWI在BK通道失活过程中存在如下的相互作用关系:I323-I,V319-W,M314-F,其中I323起着主导性的作用。同时进一步明确了β2亚基的失活域的确进入了BK通道的孔道从而引起通道的失活。
   (2)通道阻滞剂QX-314和TEA在BK孔道内均无特异性的结合位点。因此它们不会像其它胞内阻断剂那样在抑制Kv 通道电流的同时还减慢通道的失活,这是因为β2 N 端失活域的作用位置比较靠近孔道口,即孔道内的最后一个疏水性氨基酸Ile-323,而QX-314的作用位置位于孔道内,因此QX-314不会与失活域竞争相同的作用位点,从而不会影响β2 引起的通道失活过程。根据实验结果,我们提出了一个全新的非竞争模型,该模型不仅可以很好的解释我们的数据,而且为进一步阐释BK通道的结构和门控机制提供了重要的实验和理论支持。
   (3)我们的实验结果还显示:与野生型mslo1 通道电流相比,突变型I323A不管是单通道还是宏观电流均有明显差异,表现为出现了野生型通道所不具有的外向整流特性。形式上突变型I323A的单通道出现了非常像噪声的电流,同一电压下可以同时记录得到几个不同大小的单通道电流,即是说Ile-323A 还引起了BK 通道电导的改变。据此我们推测Ile-323对BK 通道具有双重作用,既是β2 失活域在孔道中的作用位点,同时还能调节BK 通道的门控特性。另外还发现一个非常有趣的现象,312位点的Leu 亮氨酸残基的突变能够极大地改变BK 通道的电压依赖性。我们研究小组在后续的两篇文章中分别证明了这两点推测:Ile-323 确实为BK 通道的关节所在,323 点的氨基酸残基疏水性降低,会使得“关节”变得松弛,进而导致通道开放时四个亚基间协同性的不一致和开放几率的改变(Guo et al,Biophys J. 2008 May 1;
   94(9):3714-25)。而Leu312位点则可以极大地增强BK 通道的电压敏感性(Wu et al.,J Biol Chem. 2009 Aug 28;284(35):23353-63)。
   适应性调节是大部分感觉器官共有的一种性质,但是痛觉适应性产生的根源和机理仍然不为人们所知。文章的第二部分在受体水平探讨了伤害感受器TRPV1 通道的适应性调节的分子机制。我们发现通道在脱敏反应发生后,仅改变了通道对激动剂的敏感性,而不影响最大电流的响应,据此,我们在脱敏感念的基础上提出了痛觉适应性调节概念。该部分我们主要得到以下几个主要结论:
   (1)Ca2+经由开放的TRPV1 通道内流引起脱敏反应的发生,脱敏反应发生后仅改变了通道对辣椒素的敏感性,浓度敏感性降低了14 倍,但这一改变并不影响通道的功能。
   (2)通过联合应用全内反射荧光显微技术和膜片钳记录技术,我们证实了PIP2参与了TRPV1 通道脱敏反应的发生,PIP2 分解的速率和量的变化都足以改变通道对激动剂的响应。借助药物Rapamycin 专一性降低细胞内PIP2含量作为研究工具,通过测量通道对辣椒素浓度依赖性曲线,我们进一步量化了PIP2对脱敏反应的贡献,约占60%。
   (3)我们还发现TRPV1 通道对激动剂敏感性的改变依赖于刺激强度,不同的刺激强度得到不同程度的脱敏响应。我们推测有两种可能性:一是通道蛋白有记忆功能,这种可能性比较小;二是不同刺激强度作用下的TRPV1 通道离子通透性不同,因此,内流Ca2+的量和分布特性不同,导致PIP2 分解量不同,从而引起不同程度的脱敏反应。
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