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[博士论文] 特发叶·沃酷
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文试验研究由三部分组成。第一部分分析肝配蛋白A5(EphrinA5)在小鼠颗粒细胞中的生理作用和信号转导途径;第二部分探讨肝配蛋白A5的全基因组效应;第三部分分析鼠源肝配蛋白A5及其受体蛋白结构。
  实验Ⅰ:肝配蛋白A5对小鼠原代颗粒细胞凋亡和增殖的调控作用及新的信号通路
  最新研究结果表明,肝配蛋白A5除了作为神经发生因子发挥生理作用外,还在雌性小鼠繁殖过程中具有重要生物学作用,但在颗粒细胞(GC)中的生物学作用尚不清楚。GC是研究卵泡发育基因功能和调控网络的理想模型。本研究结果表明,肝配蛋白A5的表达在各年龄组小鼠GC中有差异。干扰肝配蛋白A5基因引起mRNA水平和蛋白质水平表达下调,同时抑制E游受体EphA5、Epha3、Epha8和Ephb2的mRNA表达。在体外水平,肝配蛋白A5的下调表达抑制小鼠GC细胞凋亡过程。为了揭示肝配蛋白A5在调控GC凋亡中的作用,本研究进一步分析凋亡因子mRNA和蛋白水平的表达情况,发现Bax、Tnfα、Caspase-8和Caspase-3表达下调,而Bcl-2表达上调。这些结果表明,肝配蛋白A5通过Caspase-8介导的内源性途径参与细胞凋亡。进一步敲低肝配蛋白A5的表达水平,引起Pcna表达上调,随后激活p-Akt和p-ERK途径来,促进GC增殖。此外,抑制肝配蛋白A5可增强BMH15、VEGFA和雌二醇mRNA表达水平,并且在不影响孕酮表达水平的情况下抑制GDF9表达,说明其参与卵泡血管生成和卵母细胞发育调控。综上所述,肝配蛋白A5调节雌性小鼠卵泡颗粒细胞凋亡、增殖和类固醇生成过程,因此是雌性生育障碍的潜在治疗靶标。
  实验Ⅱ:小鼠颗粒细胞肝配蛋白A5干扰后的转录组分析
  肝配蛋白A5是一种肝配蛋白-乙二醇苯醚(ephrin-Eph)信号分子,主要是神经元因子。但最近的研究表明其生理作用超过了神经发生,其在雌性生殖功能中尤其在卵泡发育中的作用日益受到关注。肝配蛋白A5与繁殖相关的研究处于初始阶段,目前尚未从转录组水平报道肝配蛋白A5在卵巢颗粒细胞中的作用。本研究研究利用肝配蛋白A5的siRNA处理小鼠颗粒细胞,然后进行转录组测序(RNA-Seq),以探索肝配蛋白A5干扰后颗粒细胞的全基因组图谱。RNA-Seq分析结果表明,在小鼠颗粒细胞中检测到16389个基因,与阴性对照相比,siRNA处理的细胞中有208个基因失调。其中,149个基因下调,59个基因上调。失调的基因主要富集在细胞外过程、钙结合和细胞粘附。此外,它们主要参与了PI3K-Akt信号转导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局灶性粘附和Rap1信号转导途径等过程。总体而言,干扰肝配蛋白A5改变了调节卵泡发生的十多种基因的转录水平、调控网络和生物学过程。本研究为肝配蛋白A5在神经生物学外的雌性生殖中的作用研究提供了新的线索和研究思路。
  实验Ⅲ小鼠肝配蛋白A5及其受体的结构分析
  蛋白质结构对于细胞功能至关重要,因此结构的缺陷可能导致细胞功能紊乱。肝配蛋白A5受体属于介导细胞通讯过程中最大的一类酪氨酸激酶家族。通过NCBI和蛋白质资源数据库中检索肝配蛋白A5(Efna5)、肝配蛋白A5受体3(Epha3)、肝配蛋白A5受体5(Epha5)和肝配蛋白A5受体B2(Ephb2)的氨基酸序列,评价和鉴定其蛋白质结构并预测候选蛋白的三维(3D)结构。候选蛋白预测结构存在轻微的构象变化,采用ProSA软件3D分数进一步分析预测模型的精度。Efna5、Epha3、Epha5和Ephb2的Verify3D分数分别为92.75%、94.77%、89.87%和85.96%,说明预测模型结构在可接受质量范围内。蛋白质结果无序性分析表明Efna5、Ephb3和Ephb2分别存在32.89%、25.4%和27.07%的残基紊乱。配体结合位点分析结果表明,Efna5、Epha5、Epha3和Ephb2分别存在3、5、4和2个不同的氨基酸残疾数目的配体分子。此外,预测到候选蛋白非结合区的3个结合位点。距离波动分析发现一些氨基酸残基在下降和上升的波动中均存在。应用互相关函数进一步分析发现这些候选蛋白均存在突变结构。相互作用和通路分析发现鉴定的40个蛋白中有15个蛋白不属于肝配蛋白A5受体家族。CpG岛分析结果表明,候选靶蛋白存在甲基化位点,其中Ephb2预测分数最高。计算机模拟分析靶蛋白的3D结构,为进一步结构分析提供直观信息。此外,候选蛋白一些已经证实结合位点区域为分子嵌合和新药物分子设计提供有力的证据。
[硕士论文] 张杨
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:细丝蛋白B(Filamin B,FLNB)由第3号常染色体上的基因编码,是细胞骨架蛋白,它与肌动蛋白交联形成三维细胞骨架网络并维持细胞形态,在细胞中参与多种生理生化活动,包括转录调控和细胞增殖等。近年来的研究表明,细丝蛋白A和细丝蛋白B在肿瘤发生、骨骼疾病、细胞迁移以及粘附过程中起关键作用;本实验室以前的研究表明,细丝蛋白A(FLNA)能够抑制RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)指导的基因转录,并且通过细胞特异性的调节方式抑制RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)指导的基因转录,进而抑制细胞增殖。由于FLNB和FLNA都属于细丝蛋白家族,初级结构上具有80%的同源性,且在细胞内共定位,因此,在本课题中,我们试图了解FLNB是否也参与PolⅠ和PolⅢ基因转录过程并影响细胞的增殖和迁移功能。
  为了完成以上研究目标,首先,我们制备了FLNB shRNA慢病毒表达系统,利用制备的慢病毒表达颗粒侵染293T和HeLa细胞并筛选出FLNB shRNA稳定表达细胞系。利用RT-qPCR分析这些细胞系中PolⅠ和PolⅢ指导的基因转录,结果表明,FLNB敲低能够显著降低所检测的一部分基因的RNA表达水平;提示FLNB是PolⅠ和PolⅢ指导的基因转录所需要的。为了确定这一发现,利用293T和HeLa细胞过表达FLNB,结果表明,FLNB过表达显著增加核糖体RNA,U6snRNA以及7SL RNA表达水平。这些结果证明FLNB是维持PolⅠ和PolⅢ正常基因转录所必需的。由于FLNA敲低能促进细胞中PolⅠ和PolⅢ基因转录,因此,在FLNB敲低的基础上再次敲降FLNA是否挽救因FLNB敲低导致的基因表达抑制,利用FLNB-FLNA双敲低细胞系以及qPCR方法,数据表明,一部分受FLNB敲低抑制的基因的表达水平有不同程度的上调。这一结果提示FLNB与FLNA在调控PolⅠ和PolⅢ基因转录功能上起着相反的作用。
  由于PolⅠ和PolⅢ基因转录和细胞增殖密切相关,因此,我们试图确定FLNB表达水平的改变是否影响细胞增殖。通过对上述细胞株在不同时间进行细胞计数和MTT实验发现,FLNB敲低抑制细胞增殖,而FLNB过表达则促进细胞的增殖。FLNB是否调节细胞的迁移还不清楚,因此我们通过细胞划痕和Transwell实验分析FLNB表达水平的改变对上述细胞迁移能力的影响。结果表明,FLNB敲低抑制细胞迁移,而FLNB过表达促进细胞迁移。进一步对FLNA敲低细胞系及FLNB-FLNA双敲低细胞系的增殖和迁移功能的分析表明,在293T、HeLa细胞中,FLNA与FLNB在调控细胞增殖和迁移功能上起相反的作用;FLNA抑制细胞增殖和迁移,而FLNB促进细胞增殖和迁移。与FLNB敲低细胞系相比,虽然FLNB-FLNA双敲低细胞系的增殖水平表现出一定程度升高,但双敲低细胞系的迁移能力则表现出的下降趋势。这一结果显示,当同时敲低293T、HeLa细胞中的FLNB后再敲低FLNA,FLNA在细胞迁移方面起正调控作用,提示FLNA对细胞迁移的调节作用依赖于FLNB的表达。综合以上数据,本课题发现,FLNB是维持细胞PolⅠ和PolⅢ正常基因转录、细胞增殖和细胞迁移所必需的,而FLNA对细胞迁移的调节取决于FLNB是否表达。这些发现对我们进一步探索FLNB对基因转录和细胞迁移的调节机制奠定了基础。
[硕士论文] 夏阳
模式识别与智能系统 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:针对基于生物电阻抗对人体腹部内脏(腹内)脂肪面积(VFA)的预测,本文采用基于半监督学习的ABC-SVR预测模型对人体腹内脂肪面积进行预测,以克服训练样本有限与标准值相关性不够高的问题。通过测试样本集进行标准差和相关性计算仿真实验,结果表明,该模型具有较强的非线性函数逼近,能有效对人体腹内脂肪面积的预测。
  论文的主要研究内容如下:
  1、构造了预测人体腹内脂肪面积的特征属性。通过将人体腹部等效为椭圆柱导体模型,给出了一种人体腹部生物电阻抗的测量方法,并定义了与人群类型有相关的特征属性,构成了以腹部总阻抗Zt、腹部皮下阻抗Zs、腰围值w、腹部宽度a、腹部厚度b,体质指数B、体脂肪率T、腰臀比Y八种特征的人体腹内脂肪面积预测模型的输入量特征。
  2、构建了一种人体腹内脂肪面积的ABC-SVR预测模型。通过改进的人工蜂群算法对人体腹内脂肪面积特征属性进行全局寻优训练,找出最优特征向量的解。对最优特征向量进行支持向量回归机拟合,获得人体腹内脂肪面积的ABC-SVR预测模型。
  3、给出了一种人体腹内脂肪面积预测模型的半监督学习算法。通过对新采集的未标记样本进行优化标记,通过半监督学习算法对添加的新标记样本与原有的标记样本对ABC-SVR预测模型进行重复训练,并通过与已建立的预测模型进行赤池信息量准则性能比较,获取新的最优预测模型,解决训练样本可不断增加和模型可重复训练的问题。
  4、选用经典的最小二乘回归模型和ABC-SVR模型作为本文的半监督学习ABC-SVR模型的对比模型,并通过测试样本集的预测与比较分析,本文方法是可行与有效性的。
  本文运用Matlab对基于半监督学习的人体腹内脂肪面积预测模型以及测试样本进行仿真实验,通过相关性和标准差的分析结果表明,本方法的改进效果明显。
[博士论文] 曹艳丽
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上含量最为丰富的碳水化合物之一,丝状真菌是自然界中降解木质纤维素的主要微生物类别,而里氏木霉(Trichoderma reesei)是其中的典型代表。在纤维素等底物存在的条件下,里氏木霉能表达分泌大量的纤维素酶以实现对纤维素的高效降解,因此成为纤维素酶工业的主要生产菌株。
  目前对里氏木霉纤维素酶表达合成的研究主要集中在两个方面:一方面集中在纤维素酶基因的表达调控方面,以期从理论上阐释产酶调控机制,从而为通过菌株的遗传改造提升纤维素酶的表达水平提供理论支持;另一方面,通过对里氏木霉现有酶系组分的性能改善或合理复配以提高其酶解效率。在纤维素酶基因表达调控方面,目前已经鉴定到了多个直接参与酶基因表达的转录因子包括正调控因子及负调控因子。研究发现,不同的转录因子在启动子上具有各自特定的结合位点及生物学功能,这意味着纤维素酶基因的诱导转录是一个多转录因子参与,从而响应不同环境信号的复杂过程。为了更为深入地了解这一复杂过程,有必要筛选鉴定纤维素酶基因表达过程中涉及的其他未知转录因子及辅功能因子,从而解析里氏木霉纤维素酶基因的转录调控网络。
  此外,作为真菌的里氏木霉,其染色质结构的变化包括重构和核小体共价修饰可能也是纤维素酶基因诱导表达过程中的重要影响因素,系统阐述此种变化在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用对全面理解相关调控机制也极为重要。因此,论文工作主要从上述几个方面展开,取得相应结果如下:
  一、鉴定了一个新的纤维素酶基因转录抑制因子Rce1,其通过与Xyr1在纤维素酶基因启动子上竞争性结合参与纤维素酶基因的表达调控
  以里氏木霉主要的纤维素酶基因启动子(Pcbh1)为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中筛选获得了真菌典型转录因子Ga14类型的转录因子Rce1。细胞定位分析发现Rce1主要位于细胞核。对rce1的缺失及过表达分析表明,Rce1在纤维素酶表达过程中发挥抑制作用。通过体外的凝胶泳动迁移(EMSA)及DNA足迹保护(DNAse Ifootprinting)实验鉴定了Rce1在cbh1启动子上的结合位点,发现其与纤维素酶基因的关键转录激活因子Xyr1具有相似的结合位点。进一步通过体外竞争及染色质免疫共沉淀(ChIP)实验分析发现,Rce1在纤维素诱导表达过程中与Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子,进而实现对纤维素酶表达的抑制作用,而xyr1过表达可以解除rce1对纤维素酶的表达抑制。综上所述,我们通过酵母单杂交筛选到一个转录抑制因子Rce1,通过与转录激活因子Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子来调控纤维素酶的表达。
  二、发现泛素结合酶TrUbc4在里氏木霉纤维素酶表达过程中发挥重要作用
  以纤维素酶基因启动子cbh1为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中还筛选获得了一个属于UBC超家族的泛素结合酶TrUbc4。细胞定位分析发现TrUbc4定位于细胞核。TrUbc4编码基因的敲除显著降低了里氏木霉纤维素酶基因的诱导转录和表达。突变体回补实验发现,TrUbc4的活性位点C85在纤维素酶表达过程中发挥着重要作用。在Xyr1过表达菌株中缺失Trubc4并分析表型发现,Xyr1的过表达并不能恢复Trubc4缺失对纤维素酶表达造成的的下调。进一步的ChIP分析发现,Trubc4缺失导致Xyr1在纤维素酶基因启动子区的占据水平显著降低,这种降低即使在Xyr1过表达的情况下仍然存在。以TrUbc4为“诱饵”进行酵母双杂交文库筛选,获得了具有SWIB/MDM结构域的蛋白TrSnf12。该基因的缺失表型及蛋白细胞定位与TrUbc4类似,但是我们并没有检测到TrSnf12的泛素连接酶活性。综合上述结果,我们发现Trubc4在纤维素酶基因诱导表达过程中发挥着重要作用,此种作用是特异性的,并且依赖于其泛素结合酶活性。
  三、泛素修饰组学初步分析TrUbc4可能参与里氏木霉多种生理调控过程
  对TU6以及Trubc4缺失菌进行了泛素化蛋白质组学定量研究,鉴定到位于1385个蛋白上的2563个泛素化位点,其中941个蛋白的1623个位点包含定量信息。以1.5倍为变化阈值,在具有定量信息的泛素化位点中,△Trubc4/TU6比较组中有396个位点的修饰水平发生上调,298个位点的修饰水平发生下调,△Trubc4缺失导致里氏木霉整体的泛素化水平升高。进一步分析发现与TU6相比,有295个位点,258个蛋白在△Trubc4缺失菌中未检测到,这些蛋白涉及了转录因子、泛素结合酶、蛋白激酶、转运蛋白以及SAGA复合物,这说明Trubc4可能参与里氏木霉多种调控过程。
  四、Xyr1招募SWI/SNF复合物参与纤维素酶基因的表达调控
  酵母双杂交及体外GST-pull down实验发现,所鉴定的里氏木霉潜在的SWI/SNF复合物同源亚基TrSnf12与Xyr1的转录激活结构域(activation domain,AD)区存在相互作用,并且TrSnf12与同源核心亚基TrSwi1也存在相互作用。Trswi1及另一个同源核心亚基编码基因Trsnf5的缺失对里氏木霉的生长及生孢均具有严重的影响,并且使得纤维素酶的表达性能丧失。ChIP实验结果表明,在纤维素诱导条件下,TrSwi1及TrSnf5均能被招募至纤维素酶基因启动子区。进一步分析发现,在Xyr1过表达背景下,即使在非诱导条件下,TrSwi1也能被招募至纤维素酶基因启动子区,这说明Xyr1可能通过与TrSnf12之间的相互作用,通过靶向募集TrSwi1来介导纤维素酶基因启动子区的染色质结构变化,进而调控纤维素酶基因的表达。然而,对OExyr1Δswi1/snf5的表型分析发现,在xyr1过表达的条件下,无论是诱导条件还是非诱导条件,Trswi1及Trsnf5的缺失对纤维素酶表达的影响程度都很小,这说明在xyr1过表达的条件下,纤维素酶基因的表达可能摆脱了对Trswi1及Trsnf5的绝对依赖。综上,在里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达过程中,染色质重塑复合物SWI/SNF发挥着重要的调控的作用。Xyr1可通过与TrSnf12亚基的相互作用招募TrSwi1/TrSnf5亚基到纤维素酶基因启动子区,从而调控纤维素酶的表达。
[博士论文] 张浩
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:等离子体广泛存在于宇宙中。地球环境中也存在丰富的等离子体及现象,如雷电产生的等离子体、电离层、等离子体发射的极光等,这些环境等离子体对地球生态产生重要的影响。近年来人类的生产活动产生的等离子体日渐增多,不仅广泛用于工业(电子加工、材料、光源等)和在生产中产生(如高压长距离输电线路等),而且发展到用于农业、环境治理,且在生态环境和生物医学领域具有潜在的重要应用前景。
  大气压放电冷等离子体在室温状态下具有极高的化学活性、可在开放环境中工作,逐渐被应用于生物领域,如公共场所灭菌、空气净化、污水处理、生物育种、生物医学等领域,并成为目前等离子体在和生物、医学交叉学科的一个研究热点。在等离子体应用于生物、医学的初期研究首先从物理学层面研究不同类型的低温冷等离子体对多种微生物的杀灭效果以及对人体细胞的凋亡效应。一些研究者随后开始尝试从生物学角度探究等离子体的作用机理,并且普遍认为等离子体引起的活性氧(ROS)在等离子体诱导的多种生物学效应中起到关键作用。但关于等离子体与微生物和细胞之间的相互作用机制仍不清晰。现有研究中从分子水平探究等离子体作用机理的尝试很少,尤其是功能蛋白的结构变化、表达水平变化等方面的研究匮乏。基于目前的研究现状,本文从分子学角度初步探究等离子体与蛋白质、细菌和细胞之间的相互作用过程。一方面深入研究了冷等离子体对体外功能大分子的影响,给出可能的分子作用机制,另一方面探索等离子体对细胞内功能分子的影响,并初步从分子水平探究等离子体诱导的灭菌以及细胞凋亡的机制。
  第一部分,本文主要对低温等离子体诱导溶液中蛋白质的变性及相关机理进行了研究。本文选用乳酸脱氢酶(LDH)作为蛋白分子模型,利用介质阻挡放电等离子体,以氦+氧(0.5%)为工作气体,对乳酸脱氢酶溶液进行处理。通过检测等离子体引起的几种长寿命ROS的含量以及处理前后乳酸脱氢酶的活力和结构变化,分析了等离子体诱导乳酸脱氢酶变性的可能机理。实验结果表明一定剂量的等离子处理可以诱导体外生物功能蛋白发生部分变性,而且蛋白变性依赖于等离子体产生的ROS、尤其是长寿命ROS的作用。
  第二部分,本文探究了等离子体对膜蛋白和胞内可溶性蛋白的影响。该论文以膜蛋白YgaP和胞内蛋白Swc-7作为分子模型,通过基因重组和诱导表达技术,将模型蛋白在大肠杆菌内过度表达,并提纯等离子体处理前后的细菌内的模型蛋白,通过对模型蛋白的结构变化分析,证实了等离子体同样可以影响细菌体内生物分子的结构,且这种等离子体诱导的结构改变对放置时间存在依赖性,等离子体处理后,膜蛋白比胞内蛋白更早受到影响。另外通过分析等离子体对大肠杆菌的杀灭效率,我们推断出细菌膜蛋白的改变或损伤在等离子体诱导的灭菌过程中起主导作用。
  第三部分,本文探究了不同细胞周期阶段的HeLa和MCF-7细胞对低温等离子体的敏感差异性。结果表明等离子体可以诱导细胞形态变化、抑制增殖能力、促进凋亡,尤其S和M相的HeLa和MCF-7细胞比G1和G2相细胞更易受到等离子体的损伤;蛋白质表达水平分析结果等离子体诱导的S和M相的HeLa和MCF-7细胞凋亡受caspase家族蛋白的调控。另外,等离子体处理可以诱导不同周期阶段的HeLa和MCF-7细胞内ROS积累,而ROS清除剂NAC可以显著抑制等离子体诱导的ROS生成,并减弱等离子体的抗癌效应。
[硕士论文] 张建波
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:在蛋白质工程中,通过在蛋白质的特定位点进行拆分或插入新的结构域可构造出不同的调控元件,但如何发现蛋白质中特定的改造位点限制着这些调控元件的构建。因此,找到一种合适的方法来筛选目的蛋白中的改造位点就显得尤为重要。
  在我们的研究中,我们构建了基于转座子的体外转座反应体系,经优化后能够快速、高效地构建转座子随机插入文库,且构建的随机插入文库满足多样性和均一性的要求。在目的蛋白的选择上,我们将激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)蛋白作为研究对象,AID蛋白的脱氨作用能够实现碱基C→T的特异性突变,利用AID蛋白及其同家族成员的脱氨特性构建的单碱基基因编辑工具能够实现单碱基的精确编辑,由此了解AID蛋白中的插入突变耐受位点对其后续利用有着重要的意义。
  为此,我们构建了转座子随机插入到AID蛋白中的文库,通过后续的酶切连接分别将(GGGGS)2片段和(EAAAK)2片段插入到AID蛋白中,最终通过基于利福平抗性的鉴定方法筛选出AID蛋白中的两个耐受插入区域:loop7和C端,并在此基础上结合易错PCR和循环富集筛选的策略筛选出了一系列活性较野生型AID蛋白不同程度提高的、带有插入突变的易错PCR突变体,这为后续改造和利用AID蛋白提供了实验基础。
[硕士论文] 查双凤
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:整合素是脊椎动物细胞表面一类非常重要的细胞黏着分子,由α、β两个亚基构成。整合素通过与胞内骨架蛋白的相互作用介导细胞与胞外基质间的黏着。整合素不仅是细胞外基质与细胞内骨架之间的物理连接桥梁,同时是细胞信号转导中的重要组分。由整合素介导完成的一系列信号事件是细胞了解环境并作出反应的重要途径之一。Talin蛋白是重要的整合素激活因子,能够结合并激活整合素。同时作为连接细胞骨架与跨膜受体整合素的桥梁,在细胞粘附、迁移等过程中发挥着关键的调控作用。
  此研究是在实验室前期研究的基础上进行的延伸和拓展。实验室研究组在2012年解析了Talin-F2F3/R9复合物晶体结构。该结构显示,在自抑制状态下,Talin上的整合素结合位点F3与其尾部片段R9(1654-1822 a.a.)结合,此时整合素不能被活化。这一自抑制复合物结构为我们认识Talin的自抑制调控机制提供了新的视角,但是仍然无法揭示Talin自抑制状态下的全长结构。
  作为一个270 kD的蛋白,Talin除了F3和R9以外的部分在自身的活化过程中如何协同发挥作用,至今仍是未知的。此外,Talin蛋白可以通过C端最后一个α螺旋形成二聚体,而Talin蛋白到底是单体内自抑制还是二体内的两个分子互相抑制,目前不清楚。我们从体外重组表达和天然组织提取两个方面着手,以获得高质量的Talin蛋白样品。考虑到Talin蛋白整体难于结晶,我们尝试结合负染色技术和冷冻电镜三维重构的方法,获得Tlin蛋白处于自抑制状态下的整体结构。原核表达的Talin蛋白在负染电镜下观察蛋白状态不均一。我们通过结合生物交联剂和密度梯度离心的方法,蛋白状态的均一性得到了很大程度的提高,负染电镜图片质量较高,且图像衬度高,蛋白颗粒明显。但遗憾的是并未得到高质量的冷冻电镜图片。天然组织提取方面,我们采用硫酸铵沉淀法将大量粗制剂中的部分目的蛋白沉淀下来。再结合各种分离能力不同的阴离子交换柱、分子筛、疏水柱、阳离子交换柱,最终得到了较为纯净的Talin蛋白样品,负染电镜下能够看到蛋白颗粒。
[博士论文] 杨玲娜
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:特异性的RNA-蛋白质相互作用在基因表达调控过程中扮演着重要的角色,包括转录的调控,RNA加工和运输,mRNA降解和翻译的调控等。RNA结合蛋白通常都是通过RNA结合结构域来与他们的RNA靶标发生相互作用。主要的RNA结合结构域包括双链RNA结合结构域(dsRBD),RNA识别基序(RRM),锌指(ZnF)以及核不均一核糖核酸蛋白K同源结构域(KH)等。
  KH结构域最早是在核不均一核糖核酸蛋白K中发现的。KH结构域广泛存在生物三域系统中,也是最丰富的RNA结合结构域之一。KH结构域通常都是以多重拷贝的形式存在于同一个蛋白质中,共同识别RNA靶标。这种串联识别RNA靶标的方式不仅可以提高蛋白质-核酸的结合亲和力,还可以提高识别特异性。KH结构域大约由70个氨基酸残基组成,这些氨基酸残基折叠形成三段α螺旋和一个由三个反平行的β-strand的β-sheet,并且这个β-sheet位于三段α螺旋的相对面。根据拓扑学排列的不同,KH结构域可以分为Ⅰ型和Ⅱ型两类,分别存在于真核生物蛋白质中和原核生物蛋白质中。Ⅰ型和Ⅱ型KH结构域都会形成一个疏水的裂缝,可以容纳4个非配对的核苷酸。根据文献报道知道,包含KH结构域的蛋白质行驶多种多样的细胞功能,并且蛋白质的KH结构域与RNA靶标之间的识别是其发挥调控功能的保证。
  线虫MEX-3蛋白质包含两个KH结构域,是包含KH结构域的蛋白质家族成员之一。根据文献报道,MEX-3是线虫早期胚胎正常发育和保持生殖细胞全能性所必需的。随后,在人和鼠中也发现了线虫MEX-3的同源蛋白质(MEX-3A,-3B,-3C和-3D)。哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,都含有两个RNA结合的KH结构域,除此之外,他们的C端还包含一个具有E3泛素蛋白连接酶活性的RING结构域。这四个哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,参与许多转录后调控。其中,MEX-3C已经被证明了与许多疾病的发生相关,包括高血压,能量代谢,免疫应答和癌症等。虽然许多研究证明了MEX-3C参与许多mRNA的翻译调控,但是MEX-3C是直接地或者间接地结合其RNA靶标并不清楚。在报道的MEX-3C调控的mRNA中,HLA-A2mRNA是目前唯一被证明了的与MEX-3C直接结合的mRNA。MEX-3C结合HLA-A2mRNA的3'非编码区,抑制该mRNA的翻译,此外,当RING结构域存在时,MEX-3C的结合还会诱导HLA-A2mRNA发生降解。然而,对于MEX-3C抑制mRNA翻译和诱发mRNA降解的分子机制,以及MEX-3C识别的RNA序列特异性并不清楚,需要进一步研究。
  在本论文工作中,我们解析了人源MEX-3C KH1-GUUUAG和KH2-CAGAGU两个复合物的晶体结构。基于结构分析,我们构建了一系列蛋白质丙氨酸突变体,通过等温量热滴定实验揭示了稳定RNA-蛋白质相互作用的关键的氨基酸残基。此外,我们还鉴定了MEX-3C KH结构域识别的RNA基序(hMRE),并且证明了HLA-A2mRNA的3'非编码区中含有该RNA基序。最后,通过荧光偏振实验,我们证明了人源MEX-3C K同源结构域可以高亲和力地结合存在于HLA-A2mRNA的3'非编码区的hMRE。
[硕士论文] 万定云
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:生物体由蛋白质、DNA、RNA等生物大分子组成,这些生物大分子在生物体各种调控通路中相辅相成,共同维持生命体的正常运转。它们主要通过DNA与RNA、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质相互作用进行生物信息的传递,最终完成生物体的一系列活动。
  其中,秀丽隐杆线虫MEX-3蛋白质的KH结构域与拟南芥PUF类蛋白质APUM5都是通过与mRNA的3'不翻译区相互作用,进而激活或抑制mRNA的翻译过程,调控整个生命进程。而斑马鱼精氨酸甲基转移酶PRMT9通过修饰某些蛋白质精氨酸的甲基化,使甲基化的蛋白质某种功能被激活或被抑制,进而影响生物体一系列下游调控过程。
  MEX-3蛋白质在秀丽隐杆线虫的P granule中被发现,具有串联的KH结构域,它通过结合RNA调控生殖细胞系全能干细胞的更新及早期胚胎发生时期细胞的分化。PUF类蛋白质存在于多种生物体中,拟南芥APUM5通过其PUF结构域结合病毒基因组从而实现自我防御的功能。而精氨酸甲基转移酶PRMT9通过甲基化剪接因子参与选择性剪接的相关调控。通过研究蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质作用的结构基础,能帮助我们进一步的了解生物体中各种调控过程的分子机制。
  我们主要利用大肠杆菌体外表达了秀丽隐杆线虫MEX-3 KH结构域、拟南芥APUM5 PUF结构域,昆虫细胞体内表达了精氨酸甲基转移酶PRMT9。通过NTA亲和层析柱、Hiload 16/60 Supdex 75/200、MonoS/Q等分离纯化手段获得纯度较高、状态良好的目的蛋白质。同时,我们也使用了核磁共振技术、动态光散射实验观测蛋白质状态。并采用等温滴定量热法验证了目的蛋白质与RNA的相互作用,由pull down实验验证了精氨酸甲基转移酶与SF3B2剪辑因子的相互作用。最后,通过晶体学实验筛选到拟南芥APUM5 PUF类蛋白质与烟草黄瓜花叶病毒的3 'UTR区RNA序列的晶体,但是由于晶体较小,分辨率较低,目前正在优化中。
[硕士论文] 李茜
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:GlmZ是大肠杆菌中非编码的小RNA。它主要参与调控glmS mRNA的翻译表达,全长207个核苷酸,并且在调控的过程中依赖分子伴侣Hfq蛋白质。当细菌在准备分裂时,细胞中会大量合成生物膜,合成生物膜的必要条件就是需要大量的葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P),而葡萄糖胺-6-磷酸需要葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)的催化。基因glmS就会被激活,转录出glmS mRNA。大肠杆菌中glmSmRNA的转录后调控是通过小RNA GlmZ来调控。
  在本实验中,我们试图通过SHAPE的方法研究小RNA GlmZ和RapZ蛋白质的相互作用,希望得到它们之间具体的结合位点。SHAPE的全称是Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,就是对2'-OH选择性标记,然后通过引物延伸的方法得到RNA的二级结构。为了建立这种方法,我们先以tRNA作为实验对象,成功的进行了摸索实验。从SHAPE的实验结果可以得出tRNA的二级结构是经典的三叶草模型。然而在进一步使用SHAPE研究GlmZ的结构以及它和RapZ的结合位点过程中,我们遇到了若干实验问题,最终未能顺利完成这部分研究。同时我们还通过晶体学方法得到了RapZ蛋白质的晶体,并且收到了2套分辨率在3A以内的衍射数据,但是由于晶体堆积上的问题,结构并没有解出来。在其它研究中,我们还使用SHAPE技术研究了rox2 R2H1RNA的二级结构。
  另外,大肠杆菌中的CsdA蛋白质是一类DEAD-box RNA解旋酶,它是由629个氨基酸残基组成的多结构域的蛋白质。主要功能是参与细胞内的许多RNA有关的代谢过程,例如: RNA降解,前体mRNA的剪切,翻译起始,核糖体的生物合成等等。在之前的实验工作中我们已经发现了CsdA是由两个串联的RecA-like组成保守的核心结构域,一个二聚体结构域(DD)和一个RNA结合结构域(RBD)以及C端的尾巴构成,而且在二体的形态下发挥功能,并且我们已经得到各个结构域的结构和功能。CsdA的核心结构域主要发挥解旋酶和ATPase的功能,我们通过解旋实验发现CsdA要想行使解旋功能必须形成二体,但是并不需要两个核心结构域。而且通过酶活实验和荧光偏振实验发现,CsdA的RBD结构域在它结合RNA的过程中起到了重要的作用。
[博士论文] 杨帆
生理学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:G蛋白偶联受体(GPCR)可以通过G蛋白及Arrestin将细胞外的刺激转变为细胞内信号。在这个过程中,G蛋白主要是通过调节细胞内第二信使的水平来发挥作用的;而Arrestin则是通过招募不同的下游蛋白,使受体发生脱敏或启动Arrestin自身的信号转导途径。最近的一些研究发现,GPCR的C末端磷酸化短肽或者是GPCR受体与Arrestin结合后都能够引起Arrestin发生较大的构象变化。在最近解析出的V2R受体磷酸化的C末端短肽(V2Rpp)与β-arrestin-1的复合物晶体结构中发现,V2Rpp的结合能够导致β-arrestin-1的N端结构域和C端结构域发生较大的旋转。通过电镜技术和氢氘交换质谱方法发现,当β2AR与β-arrestin-1结合后同样可以促使Arrestin发生较大构象变化。这些研究暗示Arrestin结构上的可塑性可能是其发挥不同功能的基础。
  然而该研究领域仍有一些重要的问题至今没有得到解决。其中,介导GPCR下游信号途径的关键因子只有20个G蛋白和4个Arrestin分子,它们是如何实现人类基因组所编码的800多个G蛋白偶联受体所具有的显著不同的功能?
  在本文的研究中,利用基因密码子扩展技术和19F-NMR方法研究了Arrestin与GPCR的C末端磷酸化短肽的相互作用,提出了Arrestin对GPCR的磷酸化编码的识别机制。首先,应用基因密码子扩展技术,把非天然氨基酸F2Y插入到Arrestin的七个特异结构位置和潜在的磷酸基团结合区域。19F-NMR位移变化和体外体内实验证明Arrestin能够通过其特有的、包括至少10个潜在的磷酸根结合位点的磷酸根结合凹槽来识别受体的磷酸化编码。研究发现不同的磷酸化编码模式能够产生不同的构像变化,从而引起不同的生物学效应。GRK2磷酸化的β2AR的C末端短肽可以和Arrestin上的磷酸根结合位点1-4-6-7结合,导致其发生构象变化,这种构象变化可以特异的招募网格蛋白Clathin,进而介导受体发生内吞。GRK6磷酸化的β2AR的C末端短肽可以和Arrestin上的1-5磷酸根结合位点发生相互作用,导致其发生构象变化,而这种构象可以特异招募下游的SRC蛋白。Arrestin通过其磷酸化结合位点来识别受体不同的磷酸化花样,引起自身的构象变化,并且将这种构象变化转换成不同的细胞功能。
  因此,提出了受体磷酸化编码的笛子模型:受体的磷酸化编码花样可以通过与Arrestin的10个磷酸化位点特异性的结合,就像手指按在笛子的孔上,不同的磷酸化组合可以带来不同的手指组合,从而形成特异的音符,并引起Arrestin的特异性构型变化。考虑到10个磷酸化位点的组合可以带来超过1000种变化(210-1=1023),这样受体C末端不同的磷酸化花样就可以引起超过1000种Arrestin的特异性构型,从而可以行使超过1000种功能。
[硕士论文] 朱盼盼
化学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:离子液体表面活性剂不仅具备离子液体的特殊性质还具有表面活性剂特性,可以通过改变阴阳离子、碳链长度来设计具有某种特定功能的离子液体以满足人们的需求。异喹啉类衍生物具有抗肿瘤、抗癌、抗血小板聚集、镇痛等生物活性,以异喹啉为母体的化合物在药物传递等领域中具有潜在的应用价值。不仅如此,异喹啉环还具有光活性,将功能型阳离子异喹啉环和烷基长链引入到离子液体中,研究其在溶液中的聚集行为,进一步探讨了[C12iQuin]Br与DNA的相互作用,研究两者的作用机理,在此基础上探讨[C12iQuin]Br对药物与DNA作用方式的影响。本论文还比较了不同链长的[CnQuin]Br胶束化行为,探讨了疏水性烷基链在压缩DNA过程中的作用。本论文主要包括以下几个方面:
  1、利用表面张力、动态激光光散射(DLS)、核磁(NMR)、等温滴定微量热(ITC),透射电镜(TEM),荧光等技术研究了[C12iQuin]Br在缓冲液中的聚集行为。研究结果表明,[C12iQuin]Br在浓度较低时(小于CMC)就出现了较大尺寸的预聚集体结构,并且这一独特的结构呈现球形,随着浓度的[C12iQuin]Br溶液的进一步增大,预聚集体结构逐渐向胶束结构转变。根据2D NOESY谱图分析,预聚集体与胶束结构的分子排列方式一致,异喹啉环部分地进入疏水性胶核,并且相邻的异喹啉以π-π堆积方式堆积排列。此外,研究了烷基链长及盐浓度对[C12iQuin]Br聚集行为的影响,结果表明烷基链越长的[CniQuin]Br形成预聚集体时所需要的[CniQuin]Br的量越少,越有利于预聚集体结构的形成。盐浓度的增加导致紧密的胶束结构提前形成,并且预聚集体的尺寸随着盐浓度的增加而略有减小。
  2、利用紫外光谱、动态光散射(DLS)、低温冷冻透射电镜(cryo-TEM)、圆二色谱(CD)、稳态荧光光谱和荧光探针取代实验、Zeta电势、傅里叶红外吸收光谱(FT-IR)、等温滴定微量热(ITC)、1H NMR和2D-NOESY等技术揭示了离子液体表面活性剂结合DNA后并将其压缩的关键因素。通过紫外光谱中的几个等电点说明[C12iQuin]Br分子缔合到了DNA上形成了[C12iQuin]Br-DNA复合物。稳态荧光和时间分辨荧光数据表明[C12iQuin]Br的荧光被DNA猝灭,属静态猝灭。荧光探针取代实验表明[C12iQuin]Br可能是AT碱基特异性小沟槽光敏分子。DLS结果显示DNA分子在[C12iQuin]Br浓度比较低时开始被压缩,随着[C12iQuin]Br浓度的增加逐步由线圈向球形结构转变,cryo-TEM印证了这一结果。[C12iQuin]Br的加入使得DNA的碱基堆叠和双螺旋发生了改变,但仍保持B型构象。另外,烷基链越长的[CniQuin]Br与DNA的作用力越强。FI-IR谱图说明阳离子异喹啉环通过静电作用与负电荷的DNA磷酸根基团发生作用,且[C12iQuin]Br分子的疏水碳链与DNA碱基间存在疏水作用。Zeta电势和ITC结果表明疏水作用在DNA结构转变过程中占主导作用。1H NMR和2D NOESY图谱表明光活性[C12iQuin]Br发生AT特异性小沟槽缔合。[C12iQuin]Br浓度较低时,[C12iQuin]Br分子可能平躺于DNA小沟槽,异喹啉环平面插入碱基间,且异喹啉环上的H7与DNA一侧链上的磷酸根基团之间只有几个埃的距离,而环上的H4在DNA另一侧链的糖环1'H质子附近。当[C12iQuin]Br浓度大于0.24 mM,[C12iQuin]Br在DNA的小沟槽处缔合达到饱和。继续增加的[C12iQuin]Br分子可能结合在DNA表面,异喹啉环在DNA的磷酸根附近,疏水链与DNA表面有一定的角度。这种独特的缔合特性构筑了新的功能型的[C12iQuin]Br-DNA复合物,因此有望在光动力学治疗和基因传递中得到有效地应用。
  3、利用紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、时间分辨荧光等技术揭示了抗癌药物盐酸巴马汀分子与DNA之间的缔合模式。巴马汀与DNA结合后,荧光发射峰强度、吸光度、时间分辨荧光、圆二色谱图等光谱参数产生了变化。盐酸巴马汀本身荧光较弱,但随着DNA浓度的增加,荧光强度显著增强。实验证明盐酸巴马汀分子与DNA之间存在着静电作用和嵌插作用,二者之间形成的是动态复合物。利用紫外光谱、荧光光谱、时间分辨荧光、等温滴定微量热等技术研究了离子液体表面活性剂[C12iQuin]Br对DNA与盐酸巴马汀相互作用的影响。实验表明随着[C12iQuin]Br含量的增加,使得盐酸巴马汀分子逐渐从DNA的碱基对间排除,取代了巴马汀分子与DNA发生作用,实现了抗癌药物从DNA中的解离。
[硕士论文] 徐双斌
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:环状RNA在三十年前就已被报道。最近随着高通量测序技术的发展,研究人员在越来越多的物种中发现环状RNA,但在硬骨鱼中却仍鲜有报道。大黄鱼是我国一种重要的海水养殖鱼类,本研究通过利用大黄鱼基因组模拟得到的数据,对现有的两种挖掘环状RNA的生物信息学流程进行评估,从中选取合适的流程对实验室原有大黄鱼的真实转录组数据进行环状RNA的挖掘,并进行了大黄鱼雌雄鱼性腺环状RNA的测序、挖掘,比较了两者之间环状RNA的表达差异。主要的研究结果如下:
  1.利用模拟数据对目前常用的两种环状RNA挖掘流程,从不同的环性与线性转录本测序量方面进行评估,发现在环性转录本较低的条件下,其中的一款流程CIRCexplorer检测到的环状RNA的准确率较高。但在环性转录本较高的情况下,另一款流程CIRI检测到的环状RNA的准确率有所升高,挖掘到的环状RNA的数量也较多,但CIRCexplorer的准确率仍高于CIRI,挖掘到的环状RNA的数量仍低于CIRI。
  2.根据模拟数据的评估结果,利用CIRCexplorer对大黄鱼多组织混合样本的RNA seq数据进行环状RNA挖掘,检测到了975个环状RNA分子,其中65.95%来自编码基因的外显子;随机挑选3条进行验证,其中2条得到了确认。对挖掘到的外显子环状RNA来源基因进行GO以及KEGG富集分析,结果显示,这些来源基因主要富集在结合、翻译起始因子、细胞质内大分子代谢、翻译等通路中。对其进行microRNA靶点预测的结果显示,大黄鱼环状RNA中有丰富的miRNA的结合位点,其中有363个环状RNA具有超过5个潜在的microRNA结合位点,22个具有10个以上的miRNA-430与let-7家族的结合位点。
  3.进行了大黄鱼精巢和卵巢环状RNA测序,从测序数据中,共检测到环状RNA6115个,其中2693个在精巢中特异表达,1053个在卵巢中特异表达;余下2369个在精巢和卵巢都有表达的环状RNA中。表达差异分析结果显示,有1065个环状RNA的表达量在精巢相对上调,而有621个表达量在精巢中相对下调。对这些差异表达的环状RNA的编码基因进行GO富集分析,结果表明这些基因主要富集在神经系统发育(GO:0007399 nervoussystem development)、蛋白质结合(GO:0005515 protein binding)以及谷氨酸受体活动(GO:0004972 NMDA glutamate receptor activity)等GO术语上。KEGG代谢通过分析结果显示,雌雄性腺环状RNA的编码基因在脂类代谢途径(Ubiquitin meditated proteolysis)、孕激素介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)以及泛素介导的蛋白酶解(TNF signaling pathway)等代谢通路中具有明显差异。性腺中检出的环状RNA具有丰富的miRNA结合位点,网络分析结果显示大黄鱼性腺中的circRNA-miRNA-mRNA可能具有复杂的调控网络。
[硕士论文] 王龙
信号与信息处理 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度大于200核酸的非编码RNA。随着高通量测序技术的广泛应用,已在生物体内发现大量lncRNA,其中有相当一部分的lncRNA具有重要的生物学功能,如参与胚胎干细胞凋零、细胞循环控制等细胞过程。在lncRNA的调控机制研究方面,已有一些模型被提出,如lncRNA能够招募或驱赶蛋白质对DNA的绑定、作为蛋白质复合体的骨架等。然而,lncRNA的机制和功能研究尚处于起始阶段。与蛋白质编码基因不同,大部分lncRNA不能用于产生蛋白质。同时,lncRNA与蛋白质编码基因或其转录产物——信使RNA(Messenger RNA,mRNA)有许多相似之处。在基因层面,lncRNA与蛋白质编码基因具有相似的组蛋白修饰轮廓和剪接信号;在转录过程中,lncRNA往往也是聚合酶的产物。基于长非编码RNA和蛋白质编码基因的特征和功能差异,推测两者的转录机制也有可能不同,进而影响功能表现。
  本文从预测和分析lncRNA的转录因子绑定位点(Transcription Factor Binding Site,TFBS)入手,研究lncRNA的转录过程。首先全面综述了TFBS预测算法和TFBS模型数据库。在此基础上,提出了名为lncRScan-TFBS的生物信息学方法,该方法根据来自染色质免疫沉淀——高通量测序实验(ChIP-Seq)的数据,分析与lncRNA关联的TFBS。lncRScan-TFBS的功能主要包括:报告输入ChIP-Seq峰和基因的基本统计信息、转录起始位点(Transcirption Start Site,TSS)与峰之间的距离,分别针对lncRNA和蛋白质编码基因的TFBS进行基序查找和富集度分析等。
  将lncRScan-TFBS应用于小鼠干细胞(Mouse Embryonic Stem Cell,mESC)的ChIP-Seq数据,实验结果表明调控因子c-Myc、 n-Myc、Esrrb、Klf4和Tcfcp2l1与CTCF的TFBS有重叠,说明它们共同参与转录调控过程。特别是,c-Myc和n-Myc的TFBS几乎完全重叠,并且它们都与CTCF的TFBS有较大的重叠,这表明它们可能通过这些相关的TF与CTCF紧密相互作用。实验结果并没有发现lncRNA特异性的转录因子绑定位点,但发现部分转录因子在调控lncRNA转录时,比调控蛋白质编码基因转录有更长的距离,这可能是lncRNA表达量较低的潜在原因。综上,lncRScan-TFBS可用于有效分析lncRNA的TFBS,进而帮助推断lncRNA特异性的转录模式。
[硕士论文] 洪海燕
计算机技术 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质是组成生物体的一切细胞、组织的重要成分,是生命的物质基础。蛋白质参与了机体的所有重要组成部分。一般来说,将蛋白质经过基因剔除式突变并将其移除后造成了生物体的功能丧失,并使生物体致病甚至无法生存,该蛋白质即为关键蛋白质。由于生物体的存活和后代的繁衍都离不开关键蛋白质,因此生命科学中一项重要的研究内容就是识别关键蛋白质。本文在蛋白质相互作用(PPI)网络拓扑结构的基础上,将融合多源生物信息来预测关键蛋白质,主要内容包括以下三个方面:
  (1)提出了基于改进的PageRank算法EPP(Essential Proteins Predict)识别关键蛋白质。该算法将PPI网络看成是一个不确定的、顶点带有属性的网络,然后在该网络中将重要性排名在前P%的顶点作为关键蛋白质。该方法首先需要计算顶点(即蛋白质)间的相似度,对于相似度的计算,我们综合考虑了蛋白质的可信度及语义相似度信息;其次,对于PPI网络中的每一个顶点我们还考虑了顶点的邻居信息,即计算它的邻域相似度;最后利用上述提出的可信度及语义相似度来计算顶点的重要性。本文提出的算法综合考虑了PPI网络的拓扑信息和蛋白质的生物信息,因此具有复杂度低、识别准确率高的优点。我们利用标准数据集进行测试,实验结果表明,所提出的算法能更准确地识别出更多的关键蛋白质。
  (2)提出了基于改进的PSO算法EPPSO(Essential Protein PSO)识别关键蛋白质。在该算法中,我们提出了衡量top-p关键蛋白质的整体性指标,而不是评估蛋白质关键性的单个指标。EPPSO算法采用选取候选解的方法,每一个候选解含有P个蛋白质,我们整体度量这P个蛋白质的关键性即可。对于整体关键性,我们采用这些蛋白质与其他蛋白质间的联系的紧密度来衡量,即为算法中提出的适应度函数。然后根据粒子群的算法思想,通过跟踪全局最优值及个体最优值来更新该函数。为了评估算法的性能,我们在酵母数据集等标准数据集上运行该算法,实验结果表明与其他经典算法相比,本文算法识别准确率明显优于其他方法。此外,由于本文算法只需识别出P个关键蛋白质即可,而不必根据某种指标逐个计算每个蛋白质的关键性,因此具有较低的计算量。
  (3)在以上工作的基础上,本文设计了一个基于WEB的在线关键蛋白质识别系统。该系统可以把预测的结果通过图形化的方式体现在系统上,方便高效。经测试该系统运行稳定,界面美观,具有良好的经济价值和社会价值。
[硕士论文] 郭宵
发酵工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:小麦芽富含阿拉伯木聚糖(AX),AX及酶解产物分子大小及结构会对麦汁及啤酒的粘度、浊度、过滤速度等产生重要影响,还具有抗肿瘤、提高免疫力等保健作用。β-1,4-木聚糖内切酶是降解AX主链改变AX溶解度、粘度、浊度等特性的关键酶。本文对小麦芽中β-1,4-木聚糖内切酶进行了分离纯化,并研究了β-1,4-木聚糖内切酶对植物源阿拉伯木聚糖的降解作用。主要研究结果如下:
  (1)经硫酸铵沉淀(ASI)、阴离子交换层析、疏水交换层析(HICIII)、凝胶过滤层析,获得了分子量为27.8 kDa,SDS-PAGE电泳条带单一的β-1,4-木聚糖内切酶(E-WMA)。纯化倍数为12.08倍,比活力为4.47 u/mg,回收率为1.45%。
  (2)液相串联质谱分析发现分子量为14.0 kDa的 SDS-PAGE电泳条带也存在与β-1,4-木聚糖内切酶相匹配的肽段,小麦芽中可能存在分子量为14.0 kDa的β-1,4-木聚糖内切酶。
  (3)在40 ℃将硫酸铵沉淀后的β-1,4-木聚糖内切酶(简称ASI)作用于纯小麦芽麦醪,与对照相比,麦汁浊度明显降低,在30 min、90 min、120 min分别降低了7.16%、38.01%和22.22%;水溶性阿拉伯木聚糖(WEAX)含量增高;重均分子量为1.85×103 Da的组分含量变化最显著,作用时间低于30 min时将水不溶的阿拉伯木聚糖(WUAX)转化为重均分子量为1.85×103 Da的WEAX的速率占主导,高于30 min降解1.85×103 Da的WEAX的速率占主导作用。
  (4)在纯小麦芽协定糖化初始阶段加入 ASI,降低了终麦汁过滤时间;但麦汁粘度没有明显变化;ASI使浊度降低30.36%~50.00%。ASI添加量低于0.9 mg/mL时,将WUAX转化为重均分子量1.92×103 Da的WEAX的速率占主导;添加量高于0.9 mg/mL时,降解1.92×103 Da的WEAX的速率占主导。
  (5)疏水层析后得到的β-1,4-木聚糖内切酶(简称HICIII)可将玉米芯中WUAX转化成WEAX,主要产物分子量为1.54×106 Da。HICIII对甘蔗渣中AX有显著降解作用,可将甘蔗渣中WUAX转化为WEAX,还可将WEAX中组分1.20×106 Da降解为组分2.81×104 Da和组分2.18×103 Da。
  (6)E-WMA对低中高粘度的小麦源WEAX都有降解作用,对高粘度的WEAX降解效果最为显著。三种WEAX溶液的浓度为2 mg/mL,高粘度WEAX粘度为2.42 mPa·s,酶解后粘度下降9.92%,Mw由2.07×106 Da的组分降解为3.37×105 Da的组分;低粘度和高粘度WEAX粘度分别为1.77 mPa·s和2.09 mPa·s,酶解后粘度分别下降了5.65%和8.13%。此外,E-WMA可将小麦源的WUAX转化成WEAX,体系粘度增高了1.89%;E-WMA还可以将转化成的WEAX进一步降解,其Mw下降20.77%。
[硕士论文] 刘玉姣
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素在自然界中广泛存在,而且含量丰富,是一种可再生资源,对解决能源短缺和资源枯竭具有重要意义。但是,我国的纤维素利用率很低,造成大量的浪费。在纤维素的分解过程中,纤维素酶发挥非常大的作用,将纤维素最终分解为葡萄糖,使得纤维素能够得到充分的利用。嗜热革节孢是一种嗜热真菌,能够产生热稳定性酶,是纤维素的分解者之一。
  本研究对来自嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因cbhk和β-葡萄糖苷酶基因bgk进行克隆,并在毕赤酵母中进行表达,得到CBHK和BGK重组酶。对重组酶进行分离纯化, SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量,外切葡聚糖酶CBHK的表观分子量为72kDa,大于理论分子量50kDa,可能是糖基化造成的;β-葡萄糖苷酶BGK的分子量大小为55kDa与理论的分子量大小基本一致。
  改善酶活性对提高纤维素的降解具有十分重要的作用。基于嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶HiBG的结构,本研究对嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶活性位点进口端的12个氨基酸残基进行定点突变。通过同源建模,对来源于嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因进行四个位点的定点突变。并将它们在毕赤酵母中进行了突变基因的高效表达。与野生型外切葡聚糖酶相比,突变体的酶活性都有所降低,其中W163H酶活性降低最多,降低了50%;E429D和Q459T分别降低了40%和35%;突变后W397H活性完全丧失。与野生型β-葡萄糖苷酶相比,所有突变体的酶活力都降低了,其中A260N、F348G、Y179F和F180H酶活性降低较少,分别降低了20%、20%、30%和30%;D237S、L173Q酶活性分别降低了55%和60%;而突变W168H、N335F和W349G的酶活性完全丧失。
  在纤维素的分解过程中,β-葡萄糖苷酶起着关键作用,酶的催化存在产物抑制现象,大多数酶都存在产物抑制现象,但是一些酶对葡萄糖具有耐受性。嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶对葡萄糖具有耐受性,但是具体的作用机制尚不清楚。本研究,通过对嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的12个进口端位点进行定点突变,研究这些位点对于嗜热革节孢第一家族β-葡萄糖苷酶酶活性及葡萄糖耐受性的影响。突变L173Q丧失葡萄糖耐受性,突变Y179F在高浓度葡萄糖时丧失葡萄糖耐受性。初步证明进口端位点对于酶活性及葡萄糖耐受性都具有一定的影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。
[硕士论文] 陈铭
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。
  嗜热子囊菌( Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40~50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases, PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。
  本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列, PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。
  将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。
[博士论文] 于康
有机化学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:糖类化合物是地球上结构最为丰富的一类有机物质,广泛地分布于自然界各种动植物以及微生物中,与核酸、蛋白质一起并称为生命体三大基本物质。糖通常与蛋白质或脂类物质缀合,以糖蛋白或糖脂等糖缀合物的形式存在。糖类化合物作为生命体所必需的物质,在生物合成、细胞识别、细胞黏附等生命活动中发挥着重要的作用,与疾病的发生、发展关系密切。
  目前,临床上治疗细菌感染的方式主要是使用抗菌药物,特别是抗生素。但随着抗生素及抗菌药物的长期使用和不合理应用,细菌耐药性问题已变得日益突出。为寻找和发展新的治疗和预防方法,疫苗作为一种预防细菌感染的重要手段以及控制耐药菌扩散的重要措施之一,开始备受人们的重视。
  长期的研究发现,细菌细胞表面被一层糖质所覆盖,被称作细胞糖萼。糖类分子作为细菌表面结构的重要组成物质,在细菌的生存、生长、感染、致病及宿主免疫反应过程中都发挥着重要作用。同时,细菌细胞表面的糖类分子暴露在细胞表面,并具有高度的保守性和一定的免疫原性,因此成为了疫苗研制的理想靶标抗原。
  然而,糖类物质的免疫原性通常较弱,且不能刺激T细胞发生免疫应答,只能与B细胞作用诱导出较弱的免疫应答反应,且不具有免疫记忆效应。这些问题严重阻碍了以细菌表面多糖为靶标抗原的糖疫苗的研发。随着科学技术的发展和研究的深入,上述一些问题得到了有效的解决。例如,研究发现将多糖分子与具有较强免疫原性的蛋白进行共价链接所得到的糖缀合物,能刺激机体产生T细胞依赖的免疫反应,从而发挥良好的免疫效果。目前临床上使用的糖类疫苗多为多糖蛋白缀合物疫苗。
  目前用于制备糖缀合物疫苗的糖分子大多是从细菌的细胞提取获得的。其结构的微观不均一性和杂质的不确定性为糖类缀合物疫苗的构效关系研究、质量控制和安全性研究都带来了困难。此外,天然多糖往往需要通过化学降解方法活化之后,才能与载体分子结合,这进一步提高了用于制备糖缀合疫苗的糖分子的结构不均一性。为克服上述问题,化学合成法已成为一种获得糖抗原的有效途径。本论文对23F血清型肺炎链球菌荚膜多糖和艰难梭菌细胞表面磷酸酯多糖LTA重复单元及其衍生物进行了设计与合成,以便进一步研究这些多糖的结构-免疫学活性之间的关系,以利于寡糖缀合疫苗的研发。论文主要包括以下三部分内容:
  一、首先简要介绍了肺炎链球菌和艰难梭菌的流行病学研究、诊断、治疗和疫苗研发的现状,并对它们细胞表面多糖重复单元的具体化学结构以及其重复单元的衍生物的合成与性能研究工作进行了详细的综述。
  二、23F血清型肺炎链球菌荚膜多糖生物学重复单元的3-氨基丙基寡糖苷的化学合成。目标化合物SP-2由一个分支四糖和一个磷酸甘油侧链组成。首先,我们应用连续糖苷化法策略构建得到了重要四糖中间体SP-5,即:以SP-6作为受体,依次与单糖供体SP-7、SP-8和SP-9进行糖基化反应,从而构建得到四糖骨架。在四糖SP-5的合成过程中,分子内的β-鼠李糖苷键的构建是通过2-甲基萘基(NAP)参与的分子内糖苷配基转移反应来实现的;同时利用苯甲酰基在糖基化过程中的邻基参与作用来实现1,2-trans糖苷键的高效构键。接着,我们又应用亚磷酸三酯法将磷酸甘油侧链SP-4链接到四糖骨架SP-5上,得到全保护四糖SP-3。最后,脱除SP-3分子内的苄基和苄叉基,并将叠氮基还原为氨基,得到目标产物SP-2。目标化合物SP-2的还原端基上含有一个游离氨基,为后续基于SP-2糖缀合物制备及生物学研究提供了便利。
  三、艰难梭菌细胞表面磷酸酯多糖脂磷壁酸(LTA)衍生物的化学合成。基于艰难梭菌细胞表面磷酸酯多糖LTA的具体结构,我们设计了[2+3]和[2+2+3]的合成策略来高效地构建两个LTA目标衍生物,即LTA五糖CD-1和七糖CD-2。其中,重复单元二糖CD-5和CD-6中α-氨基葡萄糖苷键都是通过使用2-叠氮基取代的葡萄糖胺三氯乙酰亚胺酯作为供体与相应的受体反应得到;而在还原端三糖CD-7的合成中,分别尝试了连续糖苷化法和预活化一锅法来合成CD-7,其分子内的β-糖苷键是通过苯甲酰基的邻基参与作用实现的。目标分子中不同寡糖模块间的磷酸二酯键的构建是经由H-膦酸酯法实现的。同样,目标化合物CD-1和CD-2的还原端三糖末端含有一个游离氨基,为后续制备基于CD-1和CD-2的寡糖缀合物奠定了基础。
[硕士论文] 开思琪
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:本实验通过构建模型生物膜体系,并利用和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)等多种表征手段,在形态学、反应动力学和分子结构等方面全面探究磷脂酶A2与生物膜的作用,从现象到分子层面对磷脂酶A2的水解作用提供一个深入、一致的系统性解释,为磷脂酶的生物学研究提供一个较为完整的模型。
  本文通过三种光学技术——和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)和衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR),研究了平面磷脂双分子层在钙离子依赖性蜂毒磷脂酶A2(bvPLA2)作用下的水解过程。研究采用荧光共定位的方法,通过LSCM观测,追踪水解的动态过程和形态学变化,半定量以及定性地阐释了水解产物的空间分布情况。结果表明,水解产物之一的脂肪酸大部分从界面上脱离并游离到溶液介质当中,而另一个水解产物溶血磷脂则在界面上形成了稳定的自组装微管结构。ATR-FTIR实验的观测结果同样佐证了这一动态过程。SFG实验明确地揭示了钙离子在水解过程中发挥的作用,即通过连接磷脂膜和吸附在其表面的磷脂酶,诱导磷脂酶分子取向发生变化,从而有效激发界面上磷脂的水解反应。本研究以界面磷脂水解反应为例,建立了一个基于现代光学技术、能够在分子和微观层面上表征界面信息的实验体系,对于探究和理解磷脂水解的这一重要的生物物理化学过程有很大的帮助。
  此外,为了优化和扩展实验体系,本文在其他荧光标记手段上和多种模型双层膜制备上有所尝试,制备出可用于荧光标记且不易淬灭的新型硅量子点,并制备了软基底的磷脂分子双分子层和二氧化硅微球支撑双分子层,使本文研究方法在将来能够继续拓展,以在基础研究方面开发出更大的价值。
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