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[博士论文] 王东恩
化学生物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:作为一类独特的共轭聚合物,聚联乙炔具有在外界刺激下产生由蓝到红的颜色变化,并伴随无荧光到有荧光发射的性质。这种特殊的光学性能使其在生物和化学传感器领域具有广泛的应用前景。目前,基于聚联乙炔的比色和荧光传感器已成功实现了对病毒、细菌、蛋白质、金属离子、有机溶剂等多种生物和化学分析物的识别检测。随着时代的进步,在社会发展的各个领域,越来越多不同种类的分析检测对象层出不穷,这对聚联乙炔型传感器提出了更大的挑战,同时也提供了更多的发挥空间。因此,进一步发挥聚联乙炔材料优异的传感性能,构建更加灵敏高效的聚联乙炔识别体系,扩展其检测对象和应用范围是该领域发展的必然趋势。本论文以新型聚联乙炔传感器的构建为出发点,选取生物和化学中一些重要的分析物为检测对象,通过对二乙炔单体合理的设计和合成,成功地构建了几类基于聚联乙炔功能性组装体的传感体系,在实现对这些分析物识别检测的同时,通过对聚联乙炔检测体系和机理进行改进和创新,克服聚联乙炔传感器自身的一些局限,从而提高聚联乙炔传感体系的灵敏度和稳定性。所取得的主要研究结果如下:
  1.构建了功能化聚联乙炔脂质体传感体系,通过酶引发分子内自降解反应的方式实现了对β-葡萄糖醛酸酶(β-GUS)简单、快速和实时的分析检测。在该研究中,首先设计合成了一个新的二乙炔单体PCDA-GlcA,该单体包含一个β-D-葡萄糖苷酸基元作为亲水端基,将其通过一个能发生分子内自降解消除反应的4-羟基-3-硝基苄醇化合物与氨基化的二乙炔单体相连。利用该单体和10,12-二十五烷二炔酸(PCDA)以摩尔比率为3∶7制备的聚联乙炔脂质体能够灵敏地实现对β-GUS活性的实时可视化分析检测。机理研究表明,该体系对β-GUS的识别机理是酶特异性水解β-D-葡萄糖苷酸基元所引发分子内的自降解反应和随后的一系列分子间的相互作用导致了聚联乙炔共轭骨架构象的变化,而产生光学信号的响应。最后,为了验证其实际的应用价值,所构建的检测体系成功用于对酶抑制剂的抑制效率测定,测定结果与文献报道具有较好的一致性。
  2.构建了包裹有聚联乙炔脂质体的凝胶微球传感体系用于对铅离子(Pb2+)更加灵敏和非侵扰性的检测。在该研究中,首先设计合成了一个多巴胺改性的聚联乙炔脂质体PCDA-DA,利用该单体和PCDA以摩尔比率为1∶9制备的聚联乙炔脂质体传感体系不仅能够实现对水中Pb2+比色和荧光的检测,并且具有非常好选择性。检测机理实验表明,其对Pb2+的识别机理可能是多巴胺基团和羧基基团对Pb2+强的络合作用而引起聚联乙炔产生光学响应。为了克服聚联乙炔脂质体传感体系的局限(如稳定性差、灵敏度低),我们进而结合微流控芯片液滴技术,将聚联乙炔脂质体溶液与海藻酸钠水溶液混合制备成液滴,利用海藻酸钠遇钙离子形成凝胶的原理,将混合液滴进行固化,从而构建了包裹聚联乙炔脂质体的海藻酸盐凝胶微球。首次利用该聚联乙炔脂质体的固定化凝胶微球传感体系,在提高稳定性的基础上,实现了对Pb2+更加灵敏的检测,可视化检测限可达200 ppb,并且凝胶微球在检测完成后能够从样品中移除,实现一种非侵扰性的检测。
  3.构建了一类新型的具有荧光信号自放大效应增强的聚联乙炔脂质体传感体系,并将其用于灵敏和选择性检测阳离子表面活性剂(CS)。在该研究中,设计合成了一类链端带有萘酐衍生物荧光基团的二乙炔单体,将该类单体与PCDA经共组装制备了二乙炔脂质体结构,在该脂质体未聚合之前,表现出源自于萘酐衍生物荧光团强烈的绿色荧光,通过光引发二乙炔脂质体聚合,该荧光基团的荧光可发生猝灭,而聚联乙炔的热致变色又可使其荧光恢复,从而实现了聚联乙炔传感体系荧光信号自放大效应的增强。对该现象的详细机理研究表明,引起荧光基团荧光猝灭的原因是受激发的荧光团向形成的共轭骨架之间的能量转移过程,荧光恢复则是由于热致变色引起了脂质体形态的变化,导致了荧光团与共轭骨架之间的距离增大,减弱了它们之间能量转移过程。进一步的研究发现,CS也能够引起该体系发生荧光恢复,并伴随独特的颜色变化,通过对其吸收和荧光变化的量化分析研究发现,所构建的新的聚联乙炔脂质体传感体系,能够实现对CS更加灵敏和选择性的检测,检测的灵敏度相比与传统的利用聚联乙炔红相荧光性质进行检测的灵敏度高出一个数量级。
  4.构建了苯硼酸和萘酐衍生物功能化的聚联乙炔脂质体传感器,研究了其光学性质,初步探索了其对细胞表面聚糖的标记和成像。在该研究中,分别合成了对羟基苯硼酸改性的二乙炔单体PCDA-pBA和萘酐衍生物取代的二乙炔单体PCDA-Nap,制备了系列两种单体不同摩尔率的二乙炔脂质体分散液。光聚合实验发现,单体PCDA-Nap在总的二乙炔单体中所占摩尔比率不超过10%时,萘酐衍生物荧光基团的荧光能够有效地被形成的聚联乙炔共轭骨架猝灭。热致变色研究发现,以苯硼酸功能化的单体PCDA-pBA制备的脂质体溶液具有温度可逆响应性质,而随着单体PCDA-Nap的引入,所得脂质体体系逐渐丧失了热可逆性。本研究还利用苯硼酸与唾液酸能够形成稳定硼酸酯结构的特点,构建了基于单体PCDA-pBA、PCDA-Nap和氨基化改性的二乙炔单体PCDA-EA的复合聚联乙炔脂质体,初步实现了对细胞表面含唾液酸残基的聚糖的标记和成像。
  综上所述,本研究通过对二乙炔单体的设计和合成,以及对检测体系的优化和改进,成功地构建了几类功能化的聚联乙炔组装体,实现了对几种生物和化学分析对象的灵敏和选择性的检测。该研究为聚联乙炔材料在传感器领域中的应用提供了研究基础和指导,同时也为构建更加灵敏和高效的聚联乙炔型传感器提供了新的方法和思路。
[硕士论文] 王娟
生物物理学 安徽大学 2016(学位年度)
摘要:随着纳米科技的迅速发展,以及纳米材料在食品、生物医药以及化妆品等领域的广泛应用,使其被释放进入环境的量逐渐增大,并在环境介质的作用下发生赋存状态、理化性质以及生物有效性的转变,进而对于人类健康和生态环境产生不可忽视的影响。
  纳米氧化锌(znic oxid nanoparticles,ZnO-NPs)作为当今社会中最具代表性的一类纳米金属氧化物,广泛应用于紫外吸收、防晒、促生长、抗菌抑菌以及光催化产品中。由于纳米氧化锌生产和使用范围之广,导致其在环境中的释放量逐渐上升,并不可避免的受环境中各种因素的影响,从而发生理化性质的转变,由原始态纳米氧化锌(pristine ZnO-NPs)转变为老化态纳米氧化锌(transformedZnO-NPs),最终可能引起生物毒性效应的变化。然而,现有的研究并未对原始态与老化态纳米氧化锌引起的毒性效应差异进行系统的、全面的研究。因此,本论文旨在研究原始态纳米氧化锌在纯水环境条件下发生老化,转变为老化态纳米氧化锌后,诱导人鼠杂交瘤细胞产生毒性效应的差异。
  研究发现,将原始态纳米氧化锌置于纯水环境中将会发生理化性质的变化,转变为老化态纳米氧化锌,这种理化性质的变化继而诱导人鼠杂交瘤细胞生物毒性效应性发生改变。经深入研究发现相较于原始态纳米氧化锌,老化态纳米氧化锌诱导人鼠杂交瘤细胞产生细胞毒性减弱;老化态纳米氧化锌诱导与细胞内源性凋亡密切相关的信号转导通路关键蛋白-活化的Caspase3蛋白表达量较原始态纳米氧化锌的诱导作用减弱;且诱导细胞内ROS产生较原始态纳米氧化锌有所增强。另一方面通过研究原始态与老化态纳米氧化锌诱导人鼠杂交瘤细胞的遗传毒性效应,我们发现与细胞毒性相反,原始态纳米氧化锌诱导人鼠杂交瘤细胞DNA双链断裂水平高于老化态纳米氧化锌的诱导作用,而细胞中含有的人11号染色体长短臂上的CD59基因协同其他基因的缺失现象降低。而纳米二氧化钛颗粒作为非可溶性纳米金属氧化物,深入研究原始态纳米二氧化钛在纯水环境条件下发生老化后诱导的毒性效应变化,发现原始态与老化态纳米二氧化钛颗粒并未诱导人鼠杂交瘤细胞产生明显的毒性效应差异。
  本研究明确原始态与老化态纳米氧化锌理化性质转变与其诱导人鼠杂交瘤细胞产生细胞毒性与遗传毒性的差异相关。纳米二氧化钛的结果暗示可溶性纳米金属氧化物与非可溶性纳米金属氧化物的致毒效应机制存在差异。本论文为进一步研究可溶性纳米金属氧化物纳米氧化锌诱导哺乳动物细胞产生毒性效应的分了生物学以及细胞生物学作用机制提供研究基础,为研究纳米材料潜在的环境健康风险提供一定的理论参考。
[硕士论文] 李南南
生物物理学 河北工业大学 2014(学位年度)
摘要:自上世纪八十年代起,离子注入诱变育种在农作物育种的研究中得到了广泛的应用,取得了很好的经济效益和社会效益。本研究利用离子注入诱变技术,在改良玉米作物种质方面做了有益的探索,在解决玉米育种产业中的育种周期长、种质资源狭窄等问题上做出了尝试。研究工作主要分为:采用郑州大学离子束生物工程省重点实验室的离子注入机和中国原子能科学研究院串列加速器核物理国家实验室的 HI-13串列加速器对19个玉米种质进行注入处理;通过田间种植,观察和记录其表观性状的变化,并利用生物统计学方法对注入后自交系的农艺性状进行分析;利用分子生物学实验技术研究了离子注入后玉米分子水平上的诱变效应。
  本研究主要内容包括:⑴离子注入后的玉米自交系经选择有益变异性状的材料,在 M3代中表现比较稳定,同穗种子之间变异性状一致,并能够在M4代稳定下来。⑵从M1代开始,离子注入玉米自交系的各种表观性状都有发生变化,主要记录和研究了辐射对发芽率、株高穗位、生育期、叶片形状和面积、抗性、穗部性状和遗传特性的效应,收集了大量有参考意义的第一手实验数据。⑶低剂量多次注入实验的自交系种子表现出比单次注入的自交系种子有益变异多,这说明二次及以上离子注入可以在小剂量下达到单次注入大剂量的理想效果,建议以后可以继续尝试二次或者多次注入实验。⑷应用研究:得到了新玉米自交系71份,并组配出“福生”系列玉米新品种,其中“福生14-8”参加了河北省2014年度夏播玉米联合测定试验。
[博士论文] 李向荣
物理化学 河南师范大学 2014(学位年度)
摘要:自由基是生物体内各种生化反应的中间体,由于存在未配对的电子,自由基具有很高的化学活性。正常情况下,自由基对生物体的生理调控必不可少。但是,当其产生过量或没有合理控制时,自由基就会表现出危险性,对脂质、核酸、蛋白质等生物大分子的结构和功能造成损伤。大量生物化学、生物学和临床医学研究表明,自由基对蛋白质造成的氧化损伤是许多慢性病的发病机理,也是导致衰老的主要原因。抗氧化剂可以提供氢原子或电子中和自由基的单电子。合理的补充抗氧化剂对维持身体健康、延缓衰老、预防或治疗疾病具有重要意义。自由基、抗氧化剂和蛋白质三者关系密切,自由基可以对蛋白质造成氧化损伤,而抗氧化剂可以清除自由基从而对蛋白质起到保护作用,同时抗氧化剂也可以与蛋白质相互作用导致蛋白质构象的变化。因此,研究抗氧化剂、自由基、蛋白质的相互作用机制十分重要。
  本文得到国家自然科学基金资助课题(No.21173071)和教育部高等学校博士点专项基金(No.20114104110002)资助,主要从以下四个方面开展研究工作:
  (1)抗氧化剂和自由基的相互作用;
  (2)自由基与蛋白质的相互作用;
  (3)抗氧化剂和血清白蛋白的相互作用;
  (4)抗氧化剂、自由基和蛋白质三元体系的相互作用。
  主要研究内容和结论如下:
  1.通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测定了HSA/BSA清除DPPH(2,2-二苯代苦味酰肼基)自由基的能力以及它们之间的相互作用机制。结果表明HSA/BSA清除DPPH自由基的能力和谷胱甘肽类似。DPPH自由基与HSA/BSA的荧光猝灭机理为静态猝灭。DPPH自由基和HSA的结合存在两类不同的结合位点,结合数约为2,即一分子的HSA可以和两分子的DPPH自由基反应。DPPH自由基和BSA只有一类结合位点,结合数约等于1,即一分子的BSA只能和一分子的DPPH自由基反应。DPPH自由基与HSA/BSA的相互作用对色氨酸微环境有一定影响,但对酪氨酸微环境的影响不明显。
  2.采用紫外-可见吸收光谱研究了抗氧化剂(L-抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素、虾青素、(+)-儿茶素、原花青素B3、谷胱甘肽、褪黑激素)清除DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基的能力,其中原花青素B3清除DPPH自由基的能力最强,虾青素清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力最强。
  3.在模拟生理条件下,通过等温滴定量热技术结合荧光光谱,紫外-可见吸收光谱,傅里叶红外光谱,圆二色谱以及分子模拟等方法,详细探讨了上述八种抗氧化剂与血清白蛋白的相互作用机制以及所引起的血清白蛋白构象的变化。研究结果表明不同的抗氧化剂与HSA/BSA的作用机制有所不同。L-抗坏血酸通过“非特异性”表面吸附结合到HSA/BSA的表面,结合位置位于HSA/BSA位置Ⅰ和位置Ⅱ的界面处,通过“作用域”猝灭HSA/BSA的内源荧光。α-生育酚与HSA/BSA为形成复合物的“特异性”结合,荧光猝灭机理为静态猝灭,结合在HSA/BSA位置Ⅱ的疏水空腔内。β-胡萝卜素和虾青素与HSA/BSA的相互作用均为熵变和焓变协同驱动的自发过程,疏水和静电的综合作用是其主要的作用力类型,结合位置位于HSA/BSA的位置Ⅰ和位置Ⅱ的界面处,部分插入位置Ⅰ的疏水空腔。(+)-儿茶素/原花青素B3与HSA的结合为有利的焓变和不利的熵变共同作用的结果,主要作用力是氢键和范德华力。(+)-儿茶素/原花青素B3与BSA的结合是焓变和熵变共同驱动所导致,静电和疏水作用是结合的主要作用力。(+)-儿茶素和原花青素引起HSA/BSA荧光猝灭机理均为形成基态复合物的静态猝灭,结合位置均位于HSA/BSA的位置Ⅰ。谷胱甘肽通过两类互不干扰的结合位点吸附到HSA/BSA表面。褪黑激素与HSA/BSA形成1∶1的复合物。虽然这八种抗氧化剂与HSA/BSA的作用机制不尽相同,但它们与HSA/BSA的结合常数均处于适中的范畴,利于其通过循环系统运输,并以合适的浓度到达各自的靶位置发挥药效。另外,这八种抗氧化剂与HSA/BSA的相互作用导致HSA/BSA二级结构中α-螺旋组分出现不同程度的降低,使血清白蛋白出现部分去折叠现象。
  4.通过荧光光谱研究了抗氧化剂、DPPH自由基和血清白蛋白三元体系的相互作用机制。研究表明三元体系的荧光猝灭机理为形成复合物的静态猝灭。结合常数和结合位点数与DPPH-HSA/BSA二元体系相比均有不同程度的降低,表明这八种抗氧化剂可以缓解DPPH自由基对血清白蛋白造成的氧化损伤,对血清白蛋白起到保护作用。
[硕士论文] 李俭
化学生物学 厦门大学 2013(学位年度)
摘要:微流控芯片技术经过近20年的发展,正处在从实验室技术向市场转化的关键时期。庞大、复杂的周边驱动系统与设备成为了微流控芯片进入市场的最主要障碍之一。基于离心力驱动的微流控芯片其驱动设备简单、流速稳定且能同时驱动多个微流通道,是目前微流控芯片在快检领域应用的最重要方向之一。
  本论文通过构建离心力驱动微流控芯片及驱动检测设备,优化、集成样品前处理步骤,并尝试进行面粉增白剂与生物免疫检测,以期建立快速、简单、高集成、低成本的食品安全或献血车“街边”检测方法。
  (1)建立了大面积玻璃基光盘芯片的制作方法,详细摸索了光刻胶与光刻方法的选择、Cr-Au牺牲层的厚度、腐蚀液配方等光刻及腐蚀条件,优化了激光打孔、高温键合的工艺参数。在直径100mm的高硼硅Pyrex7740圆形玻璃上,完成了芯片的构建,每片芯片上有六组平行通道图形。
  (2)建立了基于离心机改装的离心力驱动装置。设计制作的转速在200-10000rpm范围内可调,并且有点动功能,基本实现了对光盘式玻璃芯片的稳定、均一驱动。
  (3)利用微通道中的侧壁微结构,在芯片中实现了液滴捕获式液液萃取预富集,结合流体模拟,从理论上对液液萃取过程行了分析与验证。结果表明,该结构能有效的实现对罗丹明B的富集,获得了102-103倍的富集倍率。
  (4)针对拉曼检测方法,初步建立面粉增白剂的固相萃取柱前处理方案。考察了不同提取液、淋洗液和洗脱液对前处理效果的影响,结果表明,在优化的前处理条件下,对BPO的检测限可达到100ppm。
  (5)构建了用于面粉增白剂检测的光盘芯片,芯片中有4组集成有过滤、SPE柱体等单元的通道,摸索了离心力驱动转速对检测结果的影响,实现了对面粉中面粉增白剂的直接提取与纯化。
  (6)建立了基于免疫微珠凝胶的微流控芯片,优化了聚丙烯酰胺凝胶的浓度、微珠的大小、免疫反应的条件。成功实现了对乙肝表面抗原的免疫检测。
[硕士论文] 汪镇
应用化学 河南师范大学 2013(学位年度)
摘要:离子液体拥有许多独特的性质,如:几乎可以忽略的蒸汽压、超强的溶解能力、强大的可设计性以及可以与某些溶剂形成三相等,这些性质使得离子液体的应用范围不断扩大,主要涉及到的领域有:酶催化反应、萃取、有机合成等。
   本文利用亲油性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[Bmin]PF6,并借助混合表面活性剂形成了具有稳定中相的三液平衡体系。以离子液体、表面活性剂和盐的水溶液为三组分绘制了拟三元相图,研究形成三液平衡体系所需的各个组分的含量范围,结果表明在研究范围内存在较大区域的连续三相微乳液。利用拟三元相图,配制不同组成的三相微乳液,研究脂肪酶、底物以及产物等对其各相体积的影响,从而确定各相体积变化最小的三相微乳液为反应介质。在该介质中进行了脂肪酶催化水解4-硝基苯丁酸酯反应,并考察了反应条件对水解反应的影响,其中温度、pH、反应时间对酶活性有较大的影响,且在缓冲溶液的pH=8、温度为45℃时反应速率最大。在最优条件下,对三相微乳液与两相微乳液两个体系中的酶催化反应进行了动力学研究,根据米氏方程求得了两个人体系中的Vmax和Km值。其中,三相体系的Vmax约是两相体系的5倍,充分体现了三相微乳液在酶促水解p-NPB反应方面的优越性。为了进一步阐述三相微乳液在酶催化方面的优势,考察了酶在其中的稳定性,发现培育72h后脂肪酶的残余活性仍能达到72%,远远高于两相微乳液。通过红外光谱分析得出洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶在三相微乳液中的蛋白质酰胺Ⅰ带结构与水溶液中极其相近,这也就充分解释了其在三相微乳液中催化性能的显著。
   为了进一步探讨三相微乳液在酶催化领域的独特优越性,还以其为反应介质进行了酶催化手性拆分反应。以布洛芬为底物,皱褶假丝酵母菌为脂肪酶主要来源,采用酶促酯化的方法对其进行手性拆分。高效液相色谱建立了检测R-布洛芬、S-布洛芬及其酯的方法,其中R-布洛芬和S-布洛芬能够得到较好的分离,而布洛芬酯未能分离开。对两相微乳液和三相微乳液两个体系中酶法拆分反应进行了比较,三相微乳液中脂肪酶的对映体选择性和活性均高于两相微乳液体系,再一次体现了三相微乳液的优越性。此外,利用单因素法着重考察了醇种类、底物与醇摩尔比、底物浓度、酶浓度、盐浓度、温度以及总表面活性剂浓度等因素对酶促酯化反应的影响。结果表明,醇种类、底物与醇摩尔比、酶浓度等因素对反应有较大的影响。
[硕士论文] 王亚兰
化学生物学 河北师范大学 2013(学位年度)
摘要:ZnO由于它具有独特的晶体结构,在电学、光学和磁学等领域具有广泛的应用前景,是一种备受瞩目的半导体材料。近年来,使用生物分子作为合成ZnO的结构导向剂或模板已经成为研究者的关注热点。本论文分别选用生物大分子DNA、生物小分子山梨糖以及柠檬酸作为结构导向剂,采用简单的液相法在温和条件下制备出三种具有独特形貌和晶体结构的ZnO晶体。通过X-射线衍射仪、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、荧光光谱仪、紫外分光光度计等技术手段对产物的晶相、表面形貌、内部结构、光致发光性能和光催化活性作了表征。探究了不同的反应条件对产物表面结构、形貌、晶相、和光催化活性的影响。主要有以下研究内容和研究成果:
   (1) DNA(鲱鱼精DNA)作为结构导向剂合成蝴蝶状ZnO
   采用直接沉淀法,以Zn(Ac)2·2H2O溶液和NaOH溶液作为反应原料,在反应体系中添加浓度为1mg/ml的DNA,控制反应时间为10h,反应温度为70℃的条件下,制备出单分散蝴蝶状ZnO层级结构。利用XRD、FESEM等技术对产物形貌结构进行表征。实验结果表明,DNA在ZnO的形成过程中具有结构导向作用,它促进了ZnO纳米片和纳米棒两种组装基元的自组装。基于实验结果的综合分析,本文提出了一种可能的反应机理。此外,本文选用萘酚蓝黑作为模拟污染物,对合成产物的光催化活性进行检测,实验结果表明,DNA介导产生的ZnO具有较高的光催化活性。
   (2)山梨糖作为晶体调节剂合成海胆状ZnO
   在80℃反应条件下,采用直接沉淀法,以Zn(NO3)2·6H2O和NaOH作为反应原料,用水和乙醇1∶1的混合溶液为溶剂,控制反应时间为5h的条件下,制备出了海胆状ZnO晶体。本文探究了各反应参数如山梨糖加入量、反应时间、反应温度、反应溶剂、不同锌盐以及pH值等对产物形貌和表面结构的影响。实验结果表明,山梨糖对产物形貌有显著影响,它促使ZnO纳米针通过自组装形成海胆状结构。而且山梨糖的加入使反应体系的pH值能够维持在pH=7左右,此条件为海胆状ZnO形成的关键因素。本文对海胆状ZnO的成核和生长机理进行了探索。此外,本文还对不同反应条件对产物光致发光性能的影响进行检测。
   (3)柠檬酸作为晶体生长条件剂合成ZnO核壳结构
   在生物有机小分子柠檬酸的参与下,以Zn(NO3)2·6H2O和C6H12N4为原料,采用均相沉淀法,在ITO导电玻璃基片上制备出具有同质核壳结构的ZnO晶体。实验结果表明,柠檬酸的加入是合成核壳结构ZnO的决定性因素。整个反应是分两步完成的,只有加入了柠檬酸在反应的第一步才会得到实心球状结构的ZnO晶体。第二步反应的pH值是形成核壳结构ZnO的关键因素,在较低pH下,核壳结构的空腔不会形成;在较高pH时,合成产物就变成了空心结构。此外,反应时间也是合成目标产物的重要条件。反应时间过短,核壳结构不明显;反应时间过长,就会形成空心结构。同时,根据反应时间和溶液pH值对产物形貌的影响提出了核壳ZnO的一种成长机理。
[硕士论文] 徐可岭
有机化学 西南大学 2012(学位年度)
摘要:生物催化剂具有选择性高、条件温和、环保、经济可行等优点,已经被广泛应用于化学、医药、农药等有机合成中。然而自然界中酶的种类是有限的,而且酶具有专一性,只对一定的底物起作用,因此发现和研究生物酶的新催化功能成为一个极具挑战性和吸引力的研究课题。酶的催化多功能性,即酶的活性位点除了可以催化天然反应以外,还能够催化第二种甚至更多反应,它可以广泛的拓展现存酶的应用范围,同时也为化学的绿色合成提供了新的方法和途径。
   本论文首次发现蛋白酶催化形成C-C键的Michael加成反应。酸性蛋白酶作为一种有效的生物催化剂可以催化酮和硝基烯的Michael加成反应,并对一系列条件包括溶剂、溶剂体积、含水量、温度和投料比进行了优化。酸性蛋白酶同时可以催化较为广泛的底物发生Michael加成反应,并且可以得到相对较好的产率,最高可以达到84%的产率。SDS与NBS抑制的对照实验表明确实是酶催化,但是机理方面并不明朗,还需要进一步的研究。
   本论文还首次发现生物催化剂催化三组分的直接不对称Mannich反应,主要研究了粗蛋白和α-淀粉酶在有机介质中催化的芳香醛、芳香胺和酮三组分的Mannich反应。粗蛋白主要包括α-淀粉酶,脂肪酶和胰蛋白酶。我们对该粗蛋白的主要成分进行了催化对比,发现起主要催化作用并得到较高ee值的是α-淀粉酶。同时我们也对影响粗蛋白和α-淀粉酶催化的主要因素进行了探索,包括溶剂、含水量、温度、酶量、投料比以及pH等。通过实验我们发现粗蛋白和α-淀粉酶都可以催化较为广泛的底物得到目标产物,并且可以得到满意的产率和中等到较好的立体选择性。粗蛋白在1,4-dioxane中催化Mannich反应可以达到87%的产率,82%的ee值和84:16的dr值,并且通过实验发现一种酶在不同溶剂中催化同一反应所需要的含水量和温度都有所不同。Α-淀粉酶在1,4-dioxane中催化该反应可以达到87%的产率,81%的ee值和86:14的dr值。
[硕士论文] 马泽旭
化学生物学 厦门大学 2012(学位年度)
摘要:[背景]
   Rab/Ypt/Sec4家族是RasGTP酶超家族中最大的一个分支蛋白家族。其在调控细胞生长、运动、凋亡、细胞内蛋白质运输等方面起着重要作用。目前已经发现了超过70种Rab以及Rab-like蛋白。已经研究过功能的有36种Rab蛋白。本文研究的hRab29蛋白还未被研究过。
   [目的]
   明确Rab29蛋白在细胞中的亚细胞结构定位;确定Rab29分子在各个组织中的表达差异;制备和检测Rab29蛋白的多克隆抗体。
   [方法]
   1.运用分子克隆技术构建融合不同蛋白标签的Rab29野生型及突变型质粒。如GFP-Rab29WT、pDmyc-Rab29WT、pDmyc-Rab29T21N、pDmyc-Rab29Q67L、GST-Rab29WT-羧基端。
   2.利用质粒转染技术和免疫荧光技术确定Rab29蛋白的定位。
   3.通过聚合酶链式反应(PCR)技术以及利用人不同组织cDNA文库,对Rab29进行表达差异分析。
   4.运用GST-beads提取纯化Rab29抗原蛋白;利用抗原免疫家兔,制备Rab29抗体。
   5.运用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、免疫印迹技术、免疫荧光技术对制备抗体进行检测。
   [结果]
   1.构建的各个融合标签Rab29质粒测序正确。
   2.Rab29在所检测的各个组织中均有表达,其中在肝、胰、肾三种组织中表达量较高。
   3.Rab29蛋白与高尔基体标记蛋白TGN46、TGN38、GSl5、MANⅡ、GM130有良好的共定位。与其他细胞器诸如早期内体、晚期内体、溶酶体的标记蛋白EEA1、LBPA、LAMP1没有共定位。
   4.正确表达了抗原GST-Rab29WT-羧基端蛋白并成功免疫新西兰大白兔;获得约100mL抗体血清。
   5.成功检测Rab29抗体的特异性。
   [结论]
   1.Rab29分子在机体各组织有普适表达。在肝、胰、肾三种组织中表达量较高。
   2.Rab29定位于细胞中高尔基体中间膜囊和反面高尔基体片层结构。
   3.成功制备了Rab29蛋白抗体,该抗体可特异检测到外源以及细胞内源Rab29蛋白。
[硕士论文] 马琳琳
化学生物学 厦门大学 2012(学位年度)
摘要:Rab/Ypt/Sec4家族是RaS超家族中重要的一类小分子GTP酶,在调控细胞内膜泡运输途径方面发挥重要的作用。Rab39是Rab家族中的新发现的蛋白,包含两个亚型:Rab39A和Rab39B,两者分别定位于11号染色体和X染色体上,CDS序列具有较高的相似性。关于Rab39功能,目前还没有深入的研究报道。
   为了制备抗Rab39A抗体用于研究,分析了Rab39A氨基酸序列,选取Rab39A免疫原性强和特异性高的羧基端42个氨基酸(176-217aa)作为目的片段。通过PCR扩增Rab39A羧基端的42个氨基酸的DNA编码序列,构建了pGEX-4T-1-Rab39C42质粒。诱导表达、纯化获得GST-Rab39C42融合蛋白,免疫健康新西兰兔,制备了抗Rab39A的抗体。制备的抗体在免疫印迹中可以特异性地识别外源和内源的Rab39A,在免疫荧光中能够识别内源Rab39A。
   酵母双杂交是寻找与靶蛋白相互作用蛋白的一种非常有效的方法。为了研究Rab39A蛋白的功能,采用酵母双杂交的方法,以Rab39A作为诱饵蛋白,利用Gal4系统钓取文库中与Rab39A相互作用的蛋白。首先构建pGBKT7-Rab39A载体,将其转入AH109酵母菌。在检测其毒性和自激活能力后,与Y187文库菌进行杂交。最终通过DNA测序确定在文库中钓取的基因序列。在NCBI中进行Blast分析,获得克隆对应的蛋白信息。然后挑取感兴趣的基因重新转入Y187酵母菌中,与转入pGBKT7-Rab39A的AH109进行杂交,同时与pGBKT7 vector载体杂交作为对照,验证酵母双杂交结果。再通过免疫荧光和GST-pulldown实验进一步验证筛选出的蛋白与Rab39A的相互作用。
   结果:
   1.成功预测了Rab39A的特异性抗原表位,并制备了抗原。
   2.免疫新西兰兔,成功制备了抗Rab39A的特异性抗体,用于Western Blot和免疫荧光检测。
   3.通过酵母双杂交获得了一些与Rab39A相互作用的候选蛋白,为进一步研究提供了重要线索。
   4.通过酵母双杂交、免疫荧光和GST-pulldown实验发现Rab39A与AP4具有相互作用。
  
[硕士论文] 白利杰
生物化学与分子生物学 上海师范大学 2012(学位年度)
摘要:本文研究了生物催化条件下水溶性聚苯胺的模板导向合成。建立了三个聚合反应体系,包括:①不同的pH条件下辣根过氧化物酶(HRP)在十二烷基磺酸钠(SDS)正相胶束催化苯胺聚合;②在十二烷基苯磺酸(DBSA)胶束体系中血红蛋白(Hb)催化聚合反应;③在DBSA/环己烷/水反相胶束体系中,Hb为催化剂聚合反应。本文讨论了聚合反应的最优条件条件下并对各反应条件对产物的影响进行了分析。
   在第一个体系中,本文主要研究了pH值、过氧化氢及SDS浓度对催化剂HRP的活性影响,研究发现在pH1.0-2.0条件下能够合成水溶性导电聚苯胺,这一结果由uv双光束紫外可见分光光度计和电导率测定进行证实。结果表明,最适的pH值为2.0,最适宜的SDS和过氧化氢浓度均为20mM。结果表明在存在SDS及pH值低于2.0的条件下HRP迅速丧失活性。然而变性的HRP依然能够在SDS胶束体系中催化导电聚苯胺的生成。据推理在聚苯胺的合成反应中具有催化能力的是HRP的铁卟啉结构。
   在第二个体系中,本文探究了pH值、DBSA与苯胺(ANI)的比例以及过氧化氢等对聚合反应的影响。建立了正交试验设计的方法以找到生物催化合成聚苯胺的最适反应条件。研究发现在最适的反应条件下,Hb催化合成聚苯胺的最高产率可以高达126.9%。光束紫外可见分光光度计扫描、傅里叶变换红外(FTIR)以及X射线衍射光谱(XRD)表明合成的产物是DBSA掺杂导电聚苯胺。通过场发射扫描电镜(FESEM)、透射电镜(TEM)以及粒径电位分析仪对产物的形貌和粒径大小进行的研究。结果表明合成的产物PANI/DBSA是球形结果纳米尺寸的复合物。通过TGA和粒径电位分析仪对样品的稳定性进行了测定。结果表明所有的样品均具有较好的稳定性。FTIR和热重分析(TGA)的结果表明使用生物催化方法合成的产物相比化学法合成的产物具有更高的掺杂水平和更好的导电性。
   在DBSA/环己烷/水反胶束体系中本文重点研究了含水量(W0)对产物的导电性和产率的影响。本文还对DBSA与苯胺的比例以及过氧化氢浓度对聚合反应的影响进行了探究。为了找到最适宜的反应条件,我们设计了单因素、二因素以及正交试验。通过这些实验发现DBSA浓度是对聚合反应影响最大的因素。随着DBSA浓度的增大产率减小。紫外可见吸收光谱、FTIR、XRD、TGA、FESEM以及TEM的数据表明得到了纳米水平纤维状的DBSA掺杂状态的PANI.W0是影响产物尺寸的一个重要因素,随着W0的增加产物的粒径增大。因此,可以通过控制合成反应的W0值来控制产物的尺寸。通过与化学法合成的样品的FTIR和TGA图进行比较,可以得出生物催化方法合成的产物具有更高的掺杂水平和更好的热稳定性。利用化学法在反胶束体系合成PANI的方法已经有所报道,但是还从未有使用生物催化的方法在反胶束体系中合成聚苯胺的相关报道。因此我们建立了一种新的合成聚苯胺的方法。
[硕士论文] 张宝花
化学工程与技术 北京化工大学 2010(学位年度)
摘要:生物体系因其体系规模较大,具有明显的层次性和一定的规律性,是典型的复杂体系的代表。本论文着重考察两个复杂体系的生物物理化学行为,即人造螺旋生物体系和甲状腺前清蛋白(TTR)体系。
   1.人造螺旋生物体系
   螺旋结构在自然界中广泛存在,例如DNA、蛋白质、胶原质等。生物体系中的螺旋结构多样,发挥着各种各样的功能。受此启发,科学家们相继合成了许多人造大分子,并使其折叠形成多链螺旋结构。
   7-氨基-8氟-2-喹啉羧酸的聚合物(简写为QFn,n=4或8)可以用于构建人造螺旋。最近研究报道了QF4的四螺旋和QF8的双螺旋(简称QP_4和DP_8)的晶体结构。本文采用分子模拟方法构建了这两种螺旋的结构。为便于比较,同时构建了两种未被报道的螺旋结构即QF4的双螺旋和QF8的四螺旋(简称DP_4和QP_8)。在不同的温度条件下,采用动力学模拟的方法探讨了上述四种螺旋的稳定性和折叠机理。研究发现模拟温度达到480K时,QP_4表现出解折叠现象。结果表明这四种螺旋的在模拟过程中都经历了一定程度的链的滑移,并且四螺旋体系的滑移是以双螺旋滑移方式进行。QP_4和DP_4在高温下表现出螺旋手性翻转和链之间的活性滑移,且滑移发生于翻转之后。螺旋链之间的π-π相互作用对于维持螺旋的稳定发挥重要作用。
   2.甲状腺前清蛋白体系(TTR)
   TTR是血浆运输蛋白的一种,主要产生于肝脏、眼睛和脉络膜中。在人体血浆中,它是甲状腺素荷尔蒙的第二个传输者,并且作为维生素A结合蛋白的唯一传输者。在一些非自然条件下,TTR四聚体会分解形成单体,进而导致家族系统神经性疾病(FAP),家族系统心肌疾病(FAC)和老年淀粉化疾病(SSA)的产生。一些小分子抑制剂可以与TTR中央空腔特异性结合,阻止四聚体分解,从而达到治疗淀粉化疾病的目的。
   本工作从TTR蛋白质受体和小分子抑制剂配体两方面综合考虑出发,采用3D-QSAR结合分子对接的方法。首先,选取95个二芳基肟醚类小分子(BSE),采用Schr(o)dinger软件包中的Phase模块进行药效团和3D-QSAR建模及分析工作。选取抑制活性较好的12种化合物进行药效团的构建,所产生的药效团模型为AHRR。38种化合物作为训练集来构建QSAR模型,剩余化合物作为内部测试集检验QSAR模型的可靠性。计算得R2和Q2分别为0.9145和0.5638,证明了预测模型的合理性。为验证QSAR模型的外部预测能力,本文从其它的分子库中选取了9个化合物进行测试,Q2和Pearson-R分别为0.7132和0.8649,证明了所建QSAR模型的较好的外部预测能力。其次,选用DOCK程序对31种抑制活性较高的化合物与TTR中央空腔进行对接,其中19个小分子实现成功对接。通过分析小分子抑制剂与TTR中央空腔残基的相互作用,揭示其抑制作用模式,寻找生物活性高的小分子抑制剂。再次,对接成功的分子构象使用X-Score进行结合自由能的详细评估,给出细化的作用方式所对应的能量。本文所选用的方法科学有效、很好的解释了BSE系列分子的抑制活性,旨在设计筛选一系列生物活性高,选择性好,化学毒性低的小分子抑制剂。
[博士论文] 李宜明
生物有机化学 中国科学技术大学 2010(学位年度)
摘要:光敏掩蔽基团由于可以在较为精确的时间与空间位置调控活细胞或组织中的生物学过程已成为化学生物学领域的前沿课题之一。
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
[博士论文] 陈双扣
生物医学工程 重庆大学 2009(学位年度)
摘要:生物黏附是生命科学领域中普遍存在的一种现象,如肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附,海洋生物分泌的DOPA(3,4-二羟基苯丙氨酸,多巴)粘附单元与船体表面、海底管道表面粘附等。近年来,运用不同技术或研究方法阻断生物黏附的研究受到生物、物理等相关领域专家的关注,如用抗黏附分子CD44S抗体可有效阻断胃癌细胞与间皮细胞的黏附,延长腹膜种植性肿瘤裸鼠的生存时间,此研究方法可为药物开发开辟了新的思路。故对生物黏附阻断的基础理论,及其相关新技术、新方法的研究,将为生物制药、医学、新材料等学科领域提供新的研究思路或方法,开展这方面的研究具有重要的学术研究价值和潜在的应用前景。
   本文以海洋生物分泌的DOPA黏附单元为研究对象,利用量子化学、分子生物学和电化学等多学科的研究手段和方法,建立理论计算模型,从分子水平上探讨HOCl对黏附单元DOPA的修饰机制及其阻断DOPA黏附的相关机理研究;为验证理论研究结果,设计了可持续产生HOCl系统,并开展HOCl对单分子DOPA修饰的实验及其阻断海洋细菌和硅藻黏附的实验研究等。论文研究获得的主要结果如下:
   ①运用量子化学计算机模拟的方法建立理论研究模型并进行系统的研究,具体内容如下:
   1)采用量子化学的密度泛函理论(DFT)方法,对海洋生物分泌的粘液中的酪氨酸(Tyr)及其氧化物DOPA、多巴醌(DOPA-Quinone)的性质进行了理论计算,研究表明:与DOPA-Quinone分子相比,Tyr和DOPA具有较强的反应活性,易发生亲电取代反应;热力学性质计算表明,Tyr易氧化为DOPA,说明附着性海洋细菌的分泌物易产生黏性以及贻贝黏附蛋白中多余的Tyr易于转化成DOPA,从而增强黏附蛋白内与黏附蛋白间的黏附力;同时,Tyr转化为DOPA,导致粘液中DOPA含量增加,增强其与表面的黏附力;
   对DOPA与HOCl反应进行了热力学计算,研究表明:DOPA苯环可能与HOCl发生亲电取代反应,生成3-氯-4,5-二羟基-苯丙氨酸(DOPA-Cl),阻碍了超强黏附单元DOPA二联体的生成,降低黏附蛋白间粘性;DOPA侧链可能与HOCl发生亲电亲核反应,使DOPA侧链的断裂,降低黏附蛋白内粘性;
   对在电解海水环境下DOPA与HOCl反应进行了动力学计算,研究表明:对于DOPA的修饰有二个反应路径(图4.8),在不同的反应路径下,DOPA都倾向于发生亲电取代反应生成3-氯-4,5二羟基-苯丙氨酸而阻止了DOPA-DOPA二联体的生成,降低了内黏力;反应速率常数计算表明,C1+对DOPA修饰作用的速率常数要远大于HOCl对DOPA的修饰作用(表4.6),但是随着温度的升高,HOCl的竞争性也逐渐增强。理论计算表明,C1+在DOPA的修饰反应中起重要和直接的作用,但在电解海水的环境下,HOCl是形成Cl+的重要的条件。
   2)采用量子化学的从头算理论方法,在全局优化中确定贻贝黏附蛋白的强力黏附单元DOPA二联体的几何构型、各原子电荷分布及热力学参数,并对DOPA二联体与HOCl反应进行了热力学计算,结果表明:DOPA二联体可能与HOCl发生亲电取代反应生成2-氯-4-酮-5羟基-苯丙氨酸,破坏了贻贝内超强黏附单元DOPA二联体的结构,从而降低黏附蛋白内黏性。
   3)采用量子化学的密度泛函理论方法,对DOPA醌自由基分子经HOCl修饰前后与金属铜表面的不同位置的吸附模式进行了计算,研究表明:无论在哪种较强的吸附模式下,经过修饰后,吸附能下降,同时向金属转移的电荷数下降,导致与表面间的作用力下降,黏附能力降低,使DOPA醌单分子不易在表面黏附,从而达到阻断DOPA单分子黏附的作用。
   4)采用分子动力学的方法,建立黏附蛋白与表面相互作用的“双层结构”模型,对贻贝黏附蛋白Mefp-1,Mefp-3,Mefp-5大分子经HOCl修饰前后与金属铜表面相互作用能进行了系统计算,研究表明:经过修饰后,相互作用能下降,导致与表面间的作用力下降,黏附能力降低,使贻贝黏附蛋白大分子不易在表面黏附,从而达到阻断大分子黏附的作用。
   ②运用电化学知识构建了可持续产生次氯酸系统,并对产生次氯酸的载体导电涂层进行了研究和制备,通过表面电阻、耐酸碱盐和电化学等测试确定了导电涂层较佳的配比,结果显示当聚苯胺含量为14-25%,聚苯胺/掺杂酸的质量比为1∶1等条件时,根据现行国家标准和行业标准进行综合测试,导电涂层具有较好的机械性能、防腐性能和导电性能,具备可持续产生HOCl的能力。
   1)通过次氯酸产生系统生成的次氯酸对单分子DOPA进行修饰实验研究,结果显示:当电解电流密度为1mA/cm2时(通电时间为2min),DOPA开始发生显著的修饰反应(图6.3),当电解电流密度增大至100mA/cm2时(通电时间为2min),DOPA基本上完全被修饰成新的生成物(图6.4),结合理论计算分析和高效液相色谱谱图,DOPA发生了苯环上的取代反应,生成的新物质是3-氯-4,5-二羟基苯丙氨酸。
   2)通过次氯酸对海洋细菌和硅藻的黏附进行阻断实验研究,结果显示:当电流密度为20mA/cm2时,3天挂板后对海洋细菌黏附的阻断率达到99.98%;7天短期挂板后对硅藻黏附的阻断率达到100%;每天间歇式通电8小时,70天长期挂板后对硅藻黏附的阻断率也达到97.28%。实验结果表明:次氯酸能有效阻断海洋细菌分泌的包含DOPA黏附单元的附着;对硅藻的附着也有很好的阻断作用。
   从对影响次氯酸阻断因素的研究发现,次氯酸的阻断作用,与施加的电流密度、处理时间呈正相关,当电流密度为10mA/cm2,处理时间为6min时,对细菌的阻断率就能达到98.42%,次氯酸阻断效果比较理想,说明在这一过程中对引起黏附的因素DOPA起到了抑制作用,从根源上阻断了海洋细菌黏附的发生。
[硕士论文] 郭学林
微生物学 山西大学 2009(学位年度)
摘要:随着人们对手性化合物的深入研究,不对称合成成为生物化学和有机化学研究领域的一个热点。目前,手性化合物的合成方法主要有化学合成法和生物合成法,化学合成法由于产物光学纯度不高,试剂昂贵,反应条件苛刻,造成环境污染等缺点使其应用范围受到很大制约,而生物催化法由于其反应条件温和、效率高、立体选择性强而受到人们的广泛关注。目前,用于生物不对称合成的催化细胞主要有酵母细胞、霉菌细胞、植物细胞和蓝藻细胞等四类细胞,但是这些细胞在催化不对称加氢反应中都存在各自的不足。本实验室筛选得到一株不放氧光合作用的光合细菌(Rhodobacter sphaeroides),在催化苯乙酮不对称加氢反应过程中克服了其它生物催化剂的不足,但由于细胞的亲水特性,在游离细胞的悬浮液中加入大量有机底物对生物催化剂产生毒害作用,使生物催化剂的催化活性降低,甚至毒死细胞;并且用游离细胞进行催化,细胞只能使用一次,不能进行连续和大规模的生产。因此,本文的目的是对光合细菌进行固定化研究,旨在降低有机底物对生物催化剂的毒害,提高生物催化剂的稳定性和使用率,实现工业化生产手性醇类。
  其主要内容如下:
  (1)通过比较海藻酸钠、聚乙烯醇、海藻酸钠-聚乙烯醇混合凝胶的性能,选择海藻酸钠-聚乙烯醇混合凝胶作为固定化光合细菌的载体,并对载体的传质性能、机械强度、稳定性、透光性等因素进行了考察。
  (2)采用单因子和正交试验的方法,确定了最佳的固定化条件:载体质量浓度比8:2;菌体包埋量200g/L;固定化pH7.0;胶粒大小2mm;交联温度35℃。同时研究了固定化细胞的稳定性质,结果表明:固定化细胞的酸碱稳定性、热稳定性以及操作稳定性均有提高,连续重复反应8次,对映体过量值仍在90%以上,说明海藻酸钠-聚乙烯醇固定光合细菌能够有效提高稳定性和重复使用率。
  (3)采用气相色谱法为检测手段,考察了固定化光合细菌在水相介质中催化反应的特性,结果表明:催化苯乙酮不对称加氢的最佳反应条件为:底物浓度34mmol/L,固定化细胞用量0.3g/ml,体系的pH7.0,震荡速度180r/min。在该优化反应条件下,产物的收率和光学纯度分别高达90.5%和98.3%,且产物构型为(S)-苯乙醇。
  (4)采用气相色谱法为检测手段,考察了固定化光合细菌在水-有机两相介质中催化反应的特性,结果表明:催化苯乙酮不对称加氢的最佳反应条件为:水相与有机溶剂相体积比1∶1,初始底物浓度102mmol/L,固定化细胞用量0.2g/ml,振荡速度160r/min,水相pH值pH7.0,反应时间72h。在该优化反应条件下,产物的收率和光学纯度分别高达84.6%和97.5%,且产物构型为(S)-苯乙醇。
[硕士论文] 杨凯
生物化学与分子生物学 苏州大学 2009(学位年度)
摘要:本文对实验室现有的微藻进行含油量的测定,重点选择了7种微藻,筛选出脂肪酸含量较高的3种微藻,分别为微藻P9、CF5和微藻TH6(实验室编号)。微藻P9总脂含量为33.00%,微藻CF5总脂含量为20.00%,微藻TH6总脂含量为8.20%。以这3种微藻为实验材料,根据微藻培养及影响脂肪酸合成的关键酶(乙酰辅酶A羧化酶)的活性,选择硝态氮、IAA、柠檬酸和Mg2+等四种因子的变化研究其脂肪酸含量及组成成分的影响。 研究结果表明,氮浓度对三种微藻的脂肪酸含量都有一定的影响。其中对微藻P9的脂肪酸含量的影响最为显著(P<0.01),随着氮浓度的增加,微藻P9的总脂含量也在增加,在氮浓度为375mgL-1时,与对照组相比,总脂量增加了11.21%,软脂酸、亚油酸、油酸、硬脂酸含量分别增加了18.16%、11.67%、10.94%和11.56%;低氮(37.5 mgL-1)下微藻TH6总脂含量为20.69%,此时,软脂酸、亚油酸、油酸含量分别增加了19.85%、3.05%和3.75%,硬脂酸减少了0.07%;而微藻CF5在不同氮浓度培养下总脂含量几乎没有变化,从而显示不同藻株对氮浓度的反应不同。 IAA作为植物生长素的一种,能促进和刺激许多单细胞藻类的生长。本研究结果显示,IAA对微藻P9的脂肪酸合成没有促进作用,在没有加入IAA时总脂含量最高,达到33.12%。微藻TH6在IAA浓度为1.0 mgL-1时总脂含量最高达到19.75%,增加了约2倍,其中软脂酸、亚油酸、油酸和硬脂酸含量分别增加了13.40%、0.69%、1.01%和4.85%;微藻CF5在IAA浓度为0.5 mgL-1时总脂含量最高增加了16.62%,亚油酸、油酸含量分别增加了10.03%和16.74%,但软脂酸和硬脂酸分别减少了0.39%和4.05%。因此,IAA在微藻生长和脂肪酸合成中起到了一定的促进作用,但不同藻种对IAA的浓度有不同的要求。 柠檬酸是脂肪酸合成的重要前体,而添加外源柠檬酸可以提高脂肪酸合成的速率。本研究结果表明在加入不同浓度柠檬酸培养微藻时,微藻P9在柠檬酸浓度为100 mg/L时,总脂含量为28.04%,与对照组相比,总脂含量增加了13.86%,软脂酸、亚油酸和油酸分别增加了0.72%、3.04%和3.24%,硬脂酸含量减少了2.29%;微藻TH6在柠檬酸浓度为100 mg/L时总脂含量增加了6.37%,软脂酸减少了0.81%亚油酸、油酸和硬脂酸含量分别增加了2.59%、5.96%和7.53%;而微藻CF5在柠檬酸浓度为120mg/L时总脂含量最高达到17.50%,与对照组相比增加了3.75%,软脂酸、亚油酸和硬脂酸含量分别增加了0.82%、0.34%和4.55%,油酸的含量减少了0.64%。 Mg2+对浮游藻类的增殖有一定的促进作用,是藻类生物的许多生理过程中起着重要作用的金属元素。Mg2+对植物脂肪酸合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶的活性有一定对影响,浓度增加,酶活性也升高。研究结果显示,Mg2+对微藻脂肪酸合成有一定的影响,微藻P9在Mg2+浓度为1.8 mmolL-1培养下,与对照组相比,总脂含量增加了13.20%,其中亚油酸和油酸含量分别增加了2.18%和8.99%,而软脂酸和硬脂酸含量分别减少0.86%和0.1%;微藻TH6在Mg2+浓度为1.5 mmolL-1培养下,总脂含量增加了11.14%,软脂酸、亚油酸、油酸和硬脂酸含量分别增加了3.86%、4.19%、6.02%和7.65%;微藻CF5在Mg2+浓度为1.2 mmolL-1培养下,总脂含量为20.14%,软脂酸减少了0.56%,亚油酸、油酸含量和硬脂酸含量分别增加了4.38%、5.99%、和14.25%。 因此,微藻P9在氮浓度为375 mgL-1、柠檬酸为100 mgL-1和Mg2+浓度为1.8mmolL-1培养下生长最佳且总脂含量最高;微藻TH6在氮浓度为37.5 mg/L、IAA为1.0 mgL-1、柠檬酸为100 mgL-1和Mg2+浓度为1.2 mmolL-1培养下总脂含量最高;微藻CF5在氮浓度为150 mg/L、IAA为0.5 mgL-1、柠檬酸为120 mgL-1和Mg2+浓度为1.2mmolL-1培养下总脂含量最高。通过以上研究结果显示,微藻P9、TH6和微藻CF5都具有作为制备生物柴油的潜力。
[硕士论文] 周延菲
化学生物学 南开大学 2009(学位年度)
摘要:在自然界的各种生物中,植物、藻类、真菌、细菌和古细菌能够自身合成支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸),但是动物不能自身合成,需要从外界摄入。因此,参与支链氨基酸合成途径的各个酶就有可能成为除草剂(herbicides)、杀真菌剂(fungicides)、抗菌剂(antimicrobial)的作用靶标。而实际上,在过去二十年中广泛使用的除草剂中,有一些正是通过抑制支链氨基酸合成途径中第一个通用的酶——乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS,EC2.2.1.6)来发挥作用的。
   在细菌中,几乎所有的AHAS酶都是由两种类型的亚基组成的,即由分子量大约为60kDa的催化亚基和分子量大约为9-17kDa的调控亚基组成。一般认为,催化亚基含有全部的酶催化机制;调控亚基授予酶对支链氨基酸反馈抑制的敏感性,影响催化亚基稳定性并能稳定催化亚基的活性构象。
   酵母(Saccharomyces cerevisiae)AHAS催化亚基的晶体结构以及催化亚基同磺酰脲类除草剂的复合体晶体结构已解析;拟南芥(Arobidopsis thaliana)AHAS催化亚基与5种不同的磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)除草剂以及一种咪唑啉酮类(Imidazolinone,IM)除草剂结合的复合体晶体结构也得到解析;2006年Kaplun等报道了大肠杆菌AHAS III调控亚基的晶体结构,这是第一个调控亚基的晶体结构。
   本文成功得到E.coli AHAS I调控亚基的晶体并对其结构进行了描述;同时还得到11个AHAS II催化亚基突变体的蛋白晶体。除此之外,本文还对亚基间相互作用进行了初步探讨:我们利用基因突变技术在E.coli AHAS I调控亚基上找到了两个对亚基重组的活性影响最大的位点(Asp74andLeu72);我们还用不同长度的linker连接了AHAS II催化亚基和调控亚基,并比较了其与野生型大小亚基重组后的活性。
[硕士论文] 孙莹
发酵工程 江南大学 2008(学位年度)
摘要:生物催化的不对称还原反应中,辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。全细胞可以通过自身代谢为反应提供一定量的辅酶,但按照化学当量平衡,当底物浓度提高,反应所需的辅酶量增加时,辅酶的供给就成为主要的限制因素。本文根据大肠杆菌对密码子的偏好性,对近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCCM203011)的(R)-羟基苯乙酮还原酶基因rcr进行了密码子优化。用PCR的方法从博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)基因组中扩增出甲酸脱氢酶基因fdh,将两个基因克隆构建到共表达载体pETDuetTM-1后,转化稀有密码子优化型菌株EcoliRosetta,实现了(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的高效共表达。以高浓度(5g/L)的2-羟基苯乙酮和适量的甲酸钠为底物,0.1g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇,进行了不对称还原反应条件的选择,为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。主要研究结果包括: (1)以实验室保藏的C.parapsilosis基因组为模板,根据(R)-羟基苯乙酮还原酶基因序列和大肠杆菌密码子的偏好性,设计引物Rcr-F1和Rcr-R1,Rcr-F2和Rcr-R2,以及Rcr-F3和Rcr-R2,用PCR的方法扩增出目的基因rcr的前半段(约800bp)和后半段(约200bp),然后用重叠延伸PCR(splicingoverlappingextension-PCR,SOE-PCR)的方法连接两段基因获得密码子优化后的全长基因rcr。将rcr克隆到pMD19-T载体中,获得重组质粒T-rcr,测序结果表明rcr序列全长为1011bp,编码336个氨基酸。 (2)以实验室保藏的C.boidinii基因组为模板,根据已报道的C.boidinii的fdh基因序列(AccessionNo.AJ011046),利用DNAMAN软件设计引物Fdh-F和Fdh-R,PCR法扩增出基因fdj后连接到pMD19-T载体中,获得重组质粒T-fdh,测序结果表明rcr基因全长为1095bp,编码364个氨基酸。 (3)将rcr与fdh基因同时构建到共表达质粒pETDuetTM-1中,获得重组质粒pETDuet-rcr-fdh。将重组表达质粒转化密码子优化型菌株E.coliRosseta,获得(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的共表达阳性克隆。经30℃,1mmol/LIPTG诱导8h,SDS-PAGE结果表明(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶均有明显表达,其相对分子质量分别为37kDa和40kDa。通过摇瓶条件的研究,确定了重组蛋白的最佳诱导条件为:250mL的三角瓶中装液量20%,培养液的OD600值为0.8开始诱导,诱导温度为30℃,IPTG的浓度为0.8mmol/L,诱导16h结束培养。由于引物设计时插入了6×His标签,因而通过Ni2+离子柱亲和层析一步纯化,同时获得了较纯的两种酶蛋白。 (4)对重组菌全细胞催化2-羟基苯乙酮不对称还原反应的条件进行了选择,结果表明当底物2-羟基苯乙酮浓度为5g/L,细胞浓度为10%时,选择最适pH7.0,最适反应温度35℃,反应时间36-h,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度达到100%e.e.,产率可达74.0%。通过优化反应体系中辅助底物甲酸钠的浓度,并添加适量的ZnSO4,可使产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别达到100%e.e.和85.9%。
[博士论文] 陈兰美
化学生物学 中山大学 2008(学位年度)
摘要:本文设计合成了一系列水溶性较好的咪唑类钌(Ⅱ)多吡啶配合物,系统的研究了配合物与CT-DNA和人体端粒序列AG3(T2AG3)3的相互作用,以期了解配体的取代基效应、氢键效应、电子效应和立体效应等如何影响该类配合物与DNA的键合作用。另外,利用量子化学密度泛函及含时密度泛函理论(DFT/TDDFT)方法进行计算,合理解释配合物与DNA的键合规律及光谱特性。本文内容包括以下五部分(1)简要的介绍了核酸和G-四链体的结构、特征,以及与钌配合物相互作用的研究现状,研究方法。重点介绍了端粒DNA,G-四链体,端粒酶与肿瘤抑制之间的相互关系,系统的总结了以咪唑为配体的钌配合物作为抗肿瘤药物的历史,发展以及研究现状,表明了研究新型的钌多吡啶配合物与DNA双螺旋和G-四链体。DNA的相互作用的意义。 (2)合成并表征了两个具有较好水溶性的钌配合物[Ru(Im)4(dppz)]2+(1)和[Ru(MeIm)4(dppz)]2+(2)。系统的研究了它们与CT-DNA和人体端粒序列AG3(T2AG3)3的相互作用,结果表明与CT-DNA的键合能力1(Kb=2.5×106 M-1)>2(Kb=1.1×106M-1),且1可以诱导产生特殊的CD信号,可能与键合过程中形成了氢键有关。两个配合物有可能诱使AG3(T2AG3)3形成反平行的篮式结构,且可以稳定这种四链体的结构。通过DFT/TDDFT计算合理的解释了配合物的键合规律和光谱性质。 (3)把咪唑和噻唑环引入主配体的末端,设计合成了[Ru(MeIm)4(iip)]2+(3)和[Ru(MeIm)4(tip)]2+(4),通过紫外光谱滴定,圆二色谱,热变性实验等方法,研究了它们与CT-DNA和AG3(T2AG3)3的相互作用。结果表明3,4是以插入模式与CT-DNA键合,键合能力4>3。它们有可能促使AG3(T2AG3)3形成平行和反平行两种结构的G-四链体,且具有稳定G-四链体的能力。通过理论计算解释了配合物与DNA的键合规律并分析了1MLCT(metal-to-ligand charge transfer)光谱跃迁。 (4)设计合成了两个主配体具有较大平面面积的配合物[Ru(MeIm)4(aip)]2+(5)和[Ru(MeIm)4(pyip)]2+(6),通过实验和理论的方法研究了它们与CT-DNA和人体端粒序列AG3(T2AG3)3的相互作用,结果表明5,6均以插入模式和CT-DNA键合,键合能力6>5。5可能主要诱使AG3(T2AG3)3形成平行结构的G-四链体,6可能主要诱使AG3(T2AG3)3形成反平行结构的G-四链体。理论计算结果表明,在与DNA相互作用的过程中,配合物5,6的空间构型对其键合能力起决定性的作用,前线分子轨道能量在相互作用的过程中起次要作用。 (5)基于第四章的实验结果,合成并表征了下列三个配合物[Ru(MeIm)4(4mopip)]2+(7),[Ru(MeIm)4(pip)]2+(8)和[Ru(MeIm)4(4npip)]2+(9),通过紫外滴定,EB竞争结合,圆二色谱,DNA热变性实验,粘度实验,系统的研究了它们与CT-DNA的相互作用,表明三个配合物均以插入模式和CT-DNA相键合,键合能力:9>8>7,证实了理论预测的正确性。通过与AG3(T2AG3)3的相互作用,表明7,8可能具有同时诱使AG3(T2AG3)3形成平行和反平行两种结构的G-四链体的能力,9可能主要诱使AG3(T2AG3)3形成反平行结构的G-四链体。
[博士论文] 丰九英
化学生物学 中山大学 2008(学位年度)
摘要:工业生物催化是生物技术产业化的核心技术,被认为是继医药和农业后生物技术的第三次浪潮,其核心是高效生物催化剂的开发和生化反应过程的分子水平控制。酶作为一种高效生物催化剂,在常温常压和中性pH条件下,能够催化许多化学方法难以完成的反应。而且酶催化效率高、专一性强、可减少或避免副反应、符合绿色化学的要求。但是,由于酶对热、酸、碱、氧化剂、有机溶剂和重金属离子的稳定性差,同时酶在有机介质中的反应效率比在水相中低几个数量级,这些缺陷大大限制了酶的工业化应用。鉴于此,为了开发新型、高效的生物催化剂,作者在查阅并分析了大量国内外文献资料及发展动态的基础上,确立了以结构和性质研究的较为透彻的两种血红素蛋白(辣根过氧化物酶、肌红蛋白)为研究对象,以改善其稳定性和催化功能为研究目标,采用辅因子修饰法对两种蛋白进行了分子水平的改造,从动力学和热力学等多个方面研究了其稳定性和催化性能的改变,并通过波谱的方法对其催化特性得以改善的机制进行深入研究,取得了较为满意的结果。论文主要内容如下: (1)设计和合成了两个人造辅因子HeminD1和HeminD2,即分别在天然辅基血红素heme的每个丙酸基侧链的末端引入一个苯环和一个羧基或一个苯环和两个羧基;并通过电喷雾质谱和紫外-可见吸收光谱对其进行表征。 (2)分别把HeminD1和HeminD2与脱辅基辣根过氧化物酶重组,成功获得两个新颖的重组酶rHRP1和rHRP2。活性试验表明,辅因子修饰提高了辣根过氧化物酶的热稳定性和有机溶剂忍耐性。通过紫外.可见吸收光谱、圆二色光谱、荧光光谱和酶活性四种手段,测定了天然和重组辣根过氧化物酶的热力学参数,天然辣根过氧化物酶的解链温度为70.0℃,辅因子修饰后rHRP1的解链温度提高到75.4 ℃,而rHRP2的解链温度提高到76.5℃。动力学研究表明,辅因子修饰后辣根过氧化物酶在水溶液中和在一些有机介质中对酚类底物的亲和性和催化效率有所提高。这些催化行为的改变可能与活性位点的疏水性、活性位点的扩大及静电排斥等几个因素有关。圆二色及荧光光谱研究表明,辅因子修饰改变了辣根过氧化物酶血红素和色氨酸的微环境,提高了α-螺旋含量和芳香族氨基酸残基周围三级结构的含量。辅因子修饰后辣根过氧化物酶性质上的一些改善可能是由它构象上的变化引起的。对照组实验表明,本文所用的重组条件不会改变辣根过氧化物酶的构象和性质。 (3)通过辅因子修饰法对肌红蛋白进行分子水平的改造,得到两个新颖的重组蛋白rMb-HeminD1和rMb-HeminD2。动力学研究表明,辅因子修饰的肌红蛋白(rMb-HeminD1)在水溶液中对酚类底物的亲和性和催化活性均有所提高,导致催化效率(kcat/Km)提高大约3倍。圆二色及荧光光谱研究表明,辅因子修饰改变了肌红蛋白血红素和色氨酸的微环境,提高了芳香族氨基酸残基周围三级结构的含量。辅因子修饰后肌红蛋白性质上的一些改善可能是由它构象上的变化引起的。对照组实验表明,本文所用的重组条件不会改变肌红蛋白的构象和性质。
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