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[硕士论文] 罗瑞雪
神经生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:Kosfeld等研究证实由下丘脑分泌、脑垂体释放的神经肽催产素能增强人们对他人的信任感,能增强人们对他人观点的从众效应,从而增强人们的社会凝聚力。本实验研究首次使用真实社会情景实验范式,探究了在日常生活中的社会性问题的情景下,催产素鼻喷剂是否会影响人们对男性专家身份的建议者、女性专家身份的建议者——心理咨询师,或男性非专家身份的建议者、女性非专家身份的建议者——园林设计师,对他们所给予的解决这些社会性情景问题的选择性建议的接受率,同时我们也探究了催产素鼻喷剂对人们所能感知到的对专家身份建议者的面孔或非专家身份建议者的面孔以及新面孔的喜欢程度和信任感的影响,与此同时我们也研究了催产素鼻喷剂的效应是否能长时间维持。
  本研究的实验设计为双盲设计,被试间设计,对照实验设计。实验中我们邀请了男性和女性被试,总共160名被试随机使用了24IU的催产素鼻喷剂或安慰剂,休息45分钟后进行决策任务实验。实验结果表明与使用安慰剂鼻喷剂的被试相比,催产素能显著性增强人们对女性心理咨询师所给予的建议的接受率,但对男性心理咨询师、男性园林设计师以及女性园林设计师所给予的建议的接受率没有显著性影响。并且根据人们对建议者面孔和新面孔的喜欢程度和信任感评分结果显示与另外三位建议者相比女性心理咨询师为最具信任感的个人,但相对于安慰剂组,催产素对人们所能感知到的外显性喜欢程度评分和信任感评分没有显著性影响。同时实验结果表明催产素能显著性提高人们对女性心理咨询师所给予的建议的接受率的效应无法维持一周的时间,人们所接受的大部分的建议均返回到他们最初的选择。
  由此推断催产素能增强人们对最具信任感的个人的观点的从众效应,但无法增强人们所能外显感知到的对最具信任感个人的信任感或喜欢程度,因此催产素能短暂的提升人们对最具信任感的个人所给予的建议的接受率。总而言之,在日常生活中,催产素能通过增强人们对最具有信任感个人所给予的建议的从众效应从而增强人们的社会性凝聚力。
[硕士论文] 杨芳
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物排卵在雌性生殖活动中发挥重要作用,孕酮是开启排卵的关键因子,其主要通过孕酮受体(Progesterone receptor,PGR)产生生理作用,用PGR抑制剂或将其条件性敲除后均降低卵母细胞的数目,甚至出现不育现象。此外,在该过程中,因脉管脱落和重塑而形成间断的低氧环境,也能影响排卵事件的正常进行。因此孕酮和低氧在排卵过程中至关重要。近年来通过大数据分析筛选出大量的PGR下游基因,但在已知的基因中却很少发现孕酮响应元件,如参与排卵过程中卵泡破裂和炎症反应的Edn2、PPARγ。这两个基因是否受PGR和低氧的调控,如何进行调控,以及如何协调参与排卵过程等,这些问题均有待阐明。
  本实验以未性成熟的雌性昆明小鼠和人源KGN细胞为研究对象。1)用PMSG/hCG构建小鼠超排卵模型,联用PGR抑制剂RU486,收集小鼠卵泡中的颗粒细胞检测Edn2和PPARγ的mRNA的表达情况;2)在此基础上,辅以低氧模拟物CoCl2,探究低氧对颗粒细胞中Edn2和PPARγ的影响;3)进一步地,在KGN中超表达PGR、HIF1,以探究PGR、HIF1对Edn2和PPARγ的影响;4)为确认HIF1α的调控作用,采用CRISPR-Cas9技术在KGN细胞中构建HIF1α特异性敲除细胞系,辅以CoCl2处理,研究HIF1α介导PGR调控Edn2和PPARγ的机制;5)利用生物信息学分析孕酮调节信号中的网络节点。
  结果发现:1)PPARγ和Edn2在PMSG处理48h,hCG处理11h后表达量显著性增加,但经RU486处理后表达量却显著下降;2)经CoCl2处理12h后显著提高Vegfa、PPARγ和Edn2的表达量;3)在KGN细胞中超表达HIF1各载体发现其主要通过HIF1α调控下游基因,且可通过低氧响应元件调控Edn2;4)缺失HIF1α后Edn2和PPARγ的mRNA与蛋白本底水平在CoCl2刺激下均显著下降;而且超表达PGR致Vegfa、Edn2和PPARγ的表达升高因HIF1α缺失后受阻;5)通过芯片数据分析探索并初步证实孕酮调节信号网络通路中存在4个关键网络节点,并发现9个潜在受PGR调控的基因。
  总的来说,在排卵过程中PGR和低氧能够调节PPARγ、Edn2,且PGR对二者的调控依赖于HIF1α。孕酮调节信号网络通路分析为我们进一步了解在排卵过程中孕酮、低氧等因素如何通过基因调控来影响排卵进程奠定基础,而且也为理解哺乳动物排卵过程及相关疾病的发生机理提供一定的理论知识。
[硕士论文] 刘娟娟
生物化学与分子生物学 合肥工业大学 2017(学位年度)
摘要:脱落酸(ABA)作为关键的植物激素,广泛存在于植物体内,现研究发现ABA也存在于动物(包括人)组织中,且具有多种生物活性。ABA作为类胡萝卜素的直接衍生物,和视黄酸(RA)具有相似的分子结构,研究表明RA可以明显改善啮齿动物的空间记忆能力,但ABA对空间学习与记忆的影响及其分子机制尚不明确。
  目的:探究ABA给药对成年SD大鼠空间记忆的影响;探究ABA给药对SD大鼠海马树突棘密度及形态的影响,并从NMDA受体、Arc蛋白以及NDR1/2激酶途径来探究其可能的分子机制。
  方法:1.ABA给药实验:ABA给药剂量分别为5 mg/kg/day、25 mg/kg/day、50 mg/kg/day,给药方式为腹腔注射,给药时间为SD大鼠出生第七天开始一直到第八周进行水迷宫实验的前一天为止;2.Golgi-cox染色:观察ABA给药后海马神经细胞的树突棘形态,通过Western blot及荧光定量PCR检测NMDA受体、Arc蛋白以及NDR1/2激酶的蛋白表达。
  结果:1.行为学测试发现,中剂量ABA增加了大鼠在目标象限中花费的持续时间和在Morris水迷宫(MWM)的探测测试中进入的频率,并减少了于目标象限的等待时间。2.ABA能引起树突棘结构的显著变化,表现为增加树突棘的形态复杂性、树突棘密度和成熟蘑菇状树突棘数目的增加。3.此外,ABA对NMDA受体R1、R2及Arc蛋白的表达无显著影响,进一步研究发现,ABA能显著提高NDR1/2蛋白及下游基因Rabin3的表达量;离体的原代海马神经元转染NDR1/2 shRNA,研究发现NDR下游基因Rabin3表达的显著降低,即进一步验证了NDR1/2激酶途径参与了ABA对大鼠海马区神经元成熟过程的调节。
  结论:ABA通过NDR1/2激酶途径调节大鼠海马区神经元树突棘成熟过程,从而增强SD大鼠的学习记忆能力。
[硕士论文] 陈龙
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:排卵是雌性哺乳动物中非常重要的生理活动,而这一过程受到许多因素的协同调控,其中,由于激素调节广泛性和容易引起级联反应的特点被认为是排卵期主要的调控因素之一。排卵的正常发生除了要受到促卵泡激素,黄体化激素的调节,还会受到雌激素和孕酮的调节。哺乳动物体内雌激素和孕酮发挥生理作用几乎都要与其特异性受体结合才能实现。在对孕酮受体敲除型小鼠的各项研究中发现,当孕酮受体表达异常时,可直接影响雌性哺乳动物的诸多生殖功能的正常进行,特别是在排卵这一生理过程中,孕酮受体的正常表达变得十分重要。近年来,通过RNA-Seq和CHIP-Seq实验已经筛选出了大量孕酮受体的下游基因,其中,过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1被认为是孕酮受体在卵巢中介导排卵过程的关键信号分子。此外,排卵过程中,雌激素和孕酮的血液内含量呈现一定的相关性,是否彼此调控对方的分泌尚未清楚。同时,雌激素能够影响细胞内孕酮受体的表达已得到证实,但具体的分子机制还有待研究。
  随着雌性生殖研究的深入,大量研究结果发现,雌激素含量变化会导致部分miRNA出现差异性表达。此外,也有实验证实 miRNA是调控孕酮受体表达的诸多要素之一。miR-26a/b是一类常见的哺乳动物miRNA,测序数据显示在卵泡发育期间的颗粒细胞中,miR-26a/b维持高水平表达且在卵泡发育不同时期存在表达差异,这一现象说明miR-26a/b可能作为一种重要的调节因子参与排卵过程。本实验拟探究在排卵过程的正常进行,是否要依赖于颗粒细胞中miR-26a/b介导雌激素对孕酮受体的调控作用。研究结果显示,在小鼠原代颗粒细胞中,经雌激素处理24h后,通过RT-PCR检测pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,通过RT-PCR和Western Blot检测发现孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调。通过生物信息学分析miRNA调控孕酮受体3’-UTR序列的靶位点序列,构建双荧光报告载体以及位点突变载体。荧光数据显示,miR-26a/b可特异性结合到孕酮受体3’-UTR序列,并引起蛋白水平的下调。为了进一步证实miR-26a/b可介导雌激素对孕酮受体表达的调控,实验选取了人颗粒细胞系(KGN)作为实验对象。KGN细胞在经雌激素处理24h之后,细胞内pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调,结果与小鼠原代颗粒细胞处理组一致。通过采用雌激素受体拮抗剂,它莫西芬和雌激素受体干扰RNA,shER阻断雌激素信号通路,结果显示,细胞内pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著上调(p≤0.05),同时孕酮受体及下游基因在mRNA和蛋白水平显著下调。为了进一步证实miR-26a/b对于下游基因的调控,实验中采用miR-26a/b minics和miR-26a/b inhibitors分别处理KGN细胞,结果显示,miRNA minics处理后,孕酮受体及下游基因的表达受到阻遏;当用miRNA inhibitors处理细胞后,孕酮受体及下游基因的表达发生显著性上调趋势。为更加精确模拟miRNA在细胞内的成熟过程,实验通过构建pre-miR-26a/b表达载体以实现miRNA在细胞中长期稳定表达。瞬时转染miRNA表达载体,可抑制雌激素对孕酮受体的调控。
  综上,研究结果显示,在雌性哺乳动物颗粒细胞中,孕酮受体响应雌激素信号分子有可能是由miR-26a/b介导来实现的,这说明孕酮受体调控雌性哺乳动物排卵时并不单纯依靠孕酮的调控。这为进一步探索激素协同调控雌性哺乳动物排卵过程提供新的视角。
[硕士论文] 辛欣
妇产科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究甲状腺功能正常的不孕患者行体外受精/单精子细胞内注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)过程中应用长效促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist,GnRH-a)降调后促甲状腺激素(thyrotropin,thyroid stimulating hormone,TSH)的改变及后续的控制性促排卵(controlled ovarian stimulation,COS)过程中TSH变化趋势,并探讨不同TSH界值对妊娠结局的影响。
  材料与方法:
  本研究为前瞻性队列研究。选择2016年1月~2016年12月于河北医科大学第二医院生殖医学中心行 IVF/ICSI助孕的甲状腺功能正常(0.35mIU/L<TSH<4.5mIU/L;An-TPOAb<35IU/ml;2.76pmol/L<FT3<6.45pmol/L;8.75pmol/L<FT4<22pmol/L)且无甲状腺疾病史的患者207例。COS方案均选择长效促性腺激素释放激素激动剂长方案(long GnRH-a protocol,长效长方案)。根据基础血清TSH值分为A组(0.35mIU/L<TSH<2.5mIU/L,N=137人)和B组(2.5mIU/L≤TSH<4.5mIU/L,N=70人)。分别于6个时间点检测血清TSH水平:(1)COS前(月经2-5天,注射GnRH-a前)(2)Gn第1天(注射GnRH-a后)(3)Gn第5天(4) HCG日(5)移植后14天(6)移植后28天。观察长效GnRH-a注射前后血清TSH变化,分析GnRH-a降调对于甲状腺功能的影响,进一步连续观察使用促性腺激素(Gn)后血清TSH的变化,分析TSH值不同的助孕患者临床妊娠率和流产率,了解基础TSH值对于IVF/ICSI助孕结局有无影响。应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析,P<0.05表示差异有统计学意义。
  结果:
  两组患者的年龄、BMI、不孕年限等一般条件均衡可比(P>0.05)。(1)注射长效GnRH-a后血清TSH值比注射前升高,差异有统计学意义(P<0.05)。A组与B组均表现为注射后血清TSH升高,差异有统计学意义(P<0.05)。207例患者血清TSH升高者131人(63.3%),其中TSH>4.5 mIU/L者20人(15.3%);降低者76人(36.7%),其中2人TSH<0.35mIU/L(2.6%)。17人(8.2%)TPOAb高于正常值。A组血清TSH升高者79人(57.7%),3人(3.8%)TPOAb高于正常值,TSH>4.5 mIU/L者共4人(5.1%);TSH降低者58人(42.3%),TSH<0.35mIU/L者1人,伴随TPOAb高于正常值。B组TSH升高者52人(74.3%),13人(25.0%)TPOAb高于正常值,TSH>4.5 mIU/L者共16人(30.8%);TSH降低者18人(25.7%),其中1人TSH<0.35mIU/L。两组相比,B组TSH升高人数比例高于A组,有统计学差异(P<0.05)。(2)使用促性腺激素(Gn)过程中,A组与B组的血清TSH值均呈现出升高的趋势,高于血清激素基础值(time1),并于HCG日达到峰值,后略有回落。(3)A组临床妊娠率高于B组,结果有统计学差异(P<0.05),B组流产率低于A组,但无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  GnRH-a垂体降调节可使不孕症患者血清TSH升高。对于个体而言,血清TSH水平变化多种多样,严重者出现亚临床甲状腺功能亢进症、亚临床甲状腺减退症和自身免疫性甲状腺疾病等表现。血清TSH>2.5 mIU/L的不孕患者更容易受到GnRH-a的影响。使用促性腺激素后,血清TSH值呈现升高趋势。基础TSH<2.5mIU/L者,在接受IVF/ICSI助孕时可能获得更高的临床妊娠率。
[博士论文] 聂永伟
动物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:鸢尾素(irisin)是Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(FNDC5)的翻译后加工产物,可以结合白色脂肪细胞的未知受体,促进白色脂肪棕色化。目前关于irisin亚细胞定位机制的研究处于起步阶段,且其促进白色脂肪棕色化的作用机制有待进一步探索。本研究通过检测FNDC5信号肽和跨膜结构域的定位功能,了解其对irisin亚细胞定位的影响;针对FNDC5的剪切和N-连接糖基化修饰进行研究,揭示irisin的亚细胞定位机制;利用原核表达的GST-irisin处理小鼠白色脂肪细胞,探索irisin促进白色脂肪棕色化的作用机制。
  (1)FNDC5信号肽和跨膜结构域定位功能的检测
  为检测FNDC5信号肽和跨膜结构域的定位功能,了解信号肽和跨膜结构域对irisin定位的影响,本研究使用Phobius程序分析FNDC5信号肽,使用SignalP4.1 Server程序分析FNDC5的跨膜结构域。根据分析结果,分别构建信号肽表达载体pEGFP-SP、跨膜结构域表达载体pEGFP-TM和FNDC5表达载体pFNDC5-EYFP,转染HeLa细胞,观察融合蛋白的亚细胞定位。亚细胞定位结果表明:EGFP-SP定位在内质网,EGFP-TM定位于细胞膜,FNDC5-EYFP在细胞膜发出黄色荧光。以上结果表明FNDC5信号肽具有内质网定位功能,跨膜结构域能够将irisin定位于细胞膜。
  (2)FNDC5剪切作用及irisin分泌过程的研究
  为探索FNDC5可能存在的蛋白质剪切作用,检测irisin如何分泌到细胞外,本研究构建pEGFP-FNDC5和pDsred2-FNDC5-EGFP表达载体,转染HeLa细胞,分别观察融合蛋白及其剪切产物的亚细胞定位。使用GFP抗体对EGFP-FNDC5、FNDC5-EYFP和Dsred2-FNDC5-EGFP蛋白及其剪切产物进行Western blotting检测,观察融合蛋白剪切产物的相对分子量。结果表明:FNDC5在信号肽和跨膜结构域处发生两次剪切。切除信号肽的FNDC5在跨膜结构域的作用下定位于细胞膜,随后经过跨膜结构域处的剪切,irisin被分泌到细胞外。因此FNDC5的剪切是鸢尾素分泌的前提。
  (3)FNDC5蛋白N-连接糖基化修饰的检测
  为了验证FNDC5的N-连接糖基化修饰,本研究使用糖苷酶PNGase F和糖苷酶Endo H分别酶切肌肉组织总蛋白,使用irisin单克隆抗体对经糖苷酶酶切的肌肉组织总蛋白进行Western blotting检测。结果表明:FNDC5蛋白存在PNGase F和Endo H敏感的N-连接糖基化修饰,因此FNDC5是N-连接糖基化修饰糖蛋白。
  (4)FNDC5的N-连接糖基化修饰对irisin分泌影响的研究
  为探索FNDC5的N-连接糖基化修饰与irisin分泌的关系,本研究使用NetNGlyc1.0 Server程序分析FNDC5的N-连接糖基化修饰位点。根据分析结果,构建FNDC5的N-连接糖基化修饰位点点突变载体,转染HeLa细胞观察融合蛋白的亚细胞定位。使用GFP抗体分别对糖基化修饰位点点突变的融合蛋白进行Western blotting检测。亚细胞定位结果表明:第36位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白在内质网滞留,第81位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白的亚细胞定位与野生型FNDC5融合蛋白相同。Western blotting检测结果表明:与野生型的FNDC5融合蛋白相比,第36或81位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白的相对分子量均减小。经糖苷酶PNGase F酶切,野生型的FNDC5融合蛋白和第36或81位氨基酸突变的FNDC5融合蛋白的相对分子量均降至51kDa。因此FNDC5第36和81位氨基酸均为FNDC5蛋白N-连接糖基化修饰位点。FNDC5第36位氨基酸的N-连接糖基化修饰是FNDC5信号肽剪切及irisin分泌的重要保障。
  (5)白色脂肪细胞的分离和鉴定
  为研究irisin对白色脂肪细胞棕色化作用机制做初步的细胞准备,本研究采用胶原酶消化法,从C57BL/6小鼠腹股沟的白色脂肪组织分离白色脂肪细胞,肩胛间的棕色脂肪组织分离棕色脂肪细胞。以棕色脂肪细胞为对照,使用细胞免疫荧光、荧光定量PCR和Western blotting对白色脂肪细胞进行鉴定。细胞免疫荧光检测结果显示白色和棕色脂肪细胞均呈解偶联蛋白1(UCP-1)阳性,白色脂肪细胞呈溶质载体家族7成员10(ASC-1)阳性,棕色脂肪细胞呈ASC-1阴性。荧光定量PCR结果表明:白色脂肪细胞中UCP-1表达量为棕色脂肪细胞的0.47倍(P<0.05),α-tubulin的表达量为棕色脂肪细胞的1.41倍(P>0.05)。Westernblotting检测结果显示:白色脂肪细胞中UCP-1表达量是棕色脂肪细胞0.49倍(P<0.01),α-tubulin表达量是棕色脂肪细胞1.53倍(P>0.05),棕色脂肪细胞中未检测到ASC-1的表达。因此所分离的细胞为白色脂肪细胞,可以用于后续irisin对白色脂肪细胞影响的研究。
  (6)小鼠FNDC5组织表达谱的检测
  为了解FNDC5的组织表达,为FNDC5基因的克隆奠定基础,本研究通过荧光定量PCR和Western blotting技术检测小鼠心脏、肌肉、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、白色脂肪和棕色脂肪组织中FNDC5表达。荧光定量PCR检测结果表明:FNDC5在心脏表达量极显著高于肌肉、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、白色脂肪和棕色脂肪组织(均P<0.01)。Western blotting检测结果表明:FNDC5在心脏和肌肉组织总蛋白样品中出现特异性条带。因此FNDC5在心脏和肌肉组织中高表达。
  (7)FNDC5和irisin的原核表达
  为纯化FNDC5和irisin蛋白,本研究以心脏组织cDNA为模板,扩增FNDC5和irisin基因。将FNDC5和irisin基因与谷胱甘肽转移酶(GST)标签以C端融合的方式重组,构建重组质粒PGEX-4T-1-FNDC5和PGEX-4T-1-irisin,转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中,经1.0mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导表达后,使用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化GST-FNDC5和GST-irisin融合蛋白,并进行考马斯亮蓝染色和Western blotting检测。结果表明:IPTG可诱导GST-FNDC5和GST-irisin蛋白的表达,本研究所使用的irisin抗体能够与FNDC5和irisin发生特异结合。
  (8)Irisin促进白色脂肪棕色化作用机制的初步探讨
  为了解irisin促进白色脂肪棕色化的作用机制,本研究使用原核表达的GST-irisin(10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL)处理白色脂肪细胞6h后,利用荧光定量PCR检测UCP-1的表达量。结果表明:与对照组0ng/mL相比,三个处理组UCP-1的表达量均有升高,10ng/mL处理组与100ng/mL处理组和1μg/mL处理组UCP-1的表达量均有极显著差异(P<0.01)。100ng/mL处理组与1μg/mL处理组UCP-1的表达量差异不显著(P>0.05)。因此GST-irisin最佳使用浓度为100ng/mL。使用100ng/mL GST-irisin处理白色脂肪细胞,利用Western blotting检测蛋白激酶p38、ERK和AKT蛋白的磷酸化水平。结果表明:100ng/mL的GST-irisin激活蛋白激酶p38、ERK的磷酸化,不激活AKT蛋白的磷酸化。因此irisin的白色脂肪棕色化作用与p38、ERK蛋白的磷酸化有关,与AKT蛋白的磷酸化不相关。
化学;分析化学 东南大学 2016(学位年度)
摘要:内源性大麻素和糖皮质激素系统是人体中有序、必不可少的中枢调节结构,影响着许多生理过程,例如镇痛、降低体温、止痛、能量和食欲调节以及葡萄糖和脂类化合物的新陈代谢。目前主要研究的内源性大麻素是花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-AG),主要研究的糖皮质激素是皮质醇和可的松。头发基质可回溯性地记录生理功能产生时糖皮质激素和内源性大麻素之间的关联。但是,2-AG自发转化为同分异构体1-AG和OAEA自发重排成AEA,这是在头发中准确检测2-AG和AEA的重大障碍。本文旨在建立一种同时检测头发中2-AG、AEA、皮质醇和可的松含量的方法。此外,招募473名被试,探讨头发中2-AG、AEA的浓度与性别、身体健康指数以及糖皮质激素的关联。
  本文基于高效液相色谱串联质谱仪Q-Trap3200,在大气压化学离子源(APCI)正离子模式下,采用多反应检测(MRM)模式进行检测。实验采用甲醇作为孵育溶液,并利用甲醇和去离子水的酸性混合溶液作为流动相以避免OAEA的重排和2-AG转化为1-AG。实验利用配有5μm,150mm X4.6mm C18柱的安捷伦1200液相色谱系统进行物质的层析分离。流动相为甲醇和水(90∶10)的混合物,其中含有2mM的乙酸铵。流速为500μL/min。
  该方法AEA的检测限为1.5pg/mg,2-AG为6pg/mg,可的松和皮质醇均为0.5pg/mg。AEA的线性范围在2.5-250pg/mg之间,2-AG的线性范围在15-1250pg/mg之间,皮质醇和可的松的线性范围均在1-250pg/mg之间。所有待测物的日内、日间精密度都小于20%,回收率大于90%。人群分析显示,2-AG和AEA显著正相关,2-AG和皮质醇、可的松显著正相关;AEA和皮质醇显著正相关,但与可的松不相关。肥胖人群的2-AG和皮质醇含量高于正常人群。男性体内2-AG和皮质醇含量显著高于女性,但AEA含量却显著低于女性。
  本文建立了一种检测头发中内源性大麻素和糖皮质激素的新方法。该方法操作简单、可快速辨别,而且灵敏性高,能准确地检测头发中的2-AG、AEA和皮质醇、可的松含量。尽管这种方法只检测了这四种物质,但仍可用于同时检测其他分析物。
[硕士论文] 唐令利
生物医学工程 电子科技大学 2016(学位年度)
摘要:本文以半经验量子化学理论为主要手段研究 Beta-2肾上腺素受体与不同配体间的相互作用,期望发展更为精确的以量子力学为理论基础的分子对接打分方法。一方面,现有的基于经验、知识或力场的打分函数在处理电荷转移、强极化等复杂体系受限,需要发展更为精确的打分算法。另一方面,半经验的量子化学方法,如PM7模型,在近期的发展以及硬件性能的提高,使得快速求解蛋白质等大分子体系的量子力学方程成为可能,分子间的弱相互作用能更为精确地计算出来。本论文以MOPAC2012为主要软件工具,使用PM7理论模型,对Beta-2肾上腺素受体与多种配体之间的相互作用结合能进行了理论计算,初步实现对配体亚型的分类。主要工作如下:
  首先,建立了以半经验量子化学即 PM7模型为理论基础的打分方法来计算Beta-2肾上腺素受体与各种配体相互作用能量,区分出配体亚型。介绍了现阶段打分函数的发展、分子层面上的相互作用理论、自由能的计算方法、以及半经验量子力学理论中PM7模型中焓变的计算方法。利用现有的Beta-2肾上腺素受体复合物晶体结构,量子化学打分方法来计算选定的受体与不同配体之间的相互作用能量。基于这些不同配体亚型的相互作用分析,通过分子对接方法,得到多种复合物构象,再用打分方法来计算对接后受体与配体间的结合能。对接后的计算结果表明量化计算可以找到与受体最佳结合的配体构象,可以发展成分子对接打分方法。
  然后,针对于三种不同配体亚型,量子化学方法结合分子动力学模拟技术来研究 Beta-2肾上腺素受体与配体之间的相互作用,从而可以更完善研究课题。基于MM-PBSA理论基础和提出的计算方法,我们计算出了Beta-2肾上腺素受体与三种配体之间的结合能量,结合口袋附近重要残基的贡献能量。基于得到的不同帧结构,量化计算出结合能,结果表明三种亚型结合能存在着一定的差异。这对于以后的研究有着重要的理论价值与借鉴意义。
[硕士论文] 李玲霞
生物学 新疆大学 2016(学位年度)
摘要:骨质疏松(Osteoporosis)是指在骨形成过程中,破骨细胞增长速率大于成骨细胞的增长。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)是垂体前叶嗜碱粒细胞分泌的一种激素,主要作用为促进卵泡成熟,在绝经前和绝经后女性骨代谢调节方面发挥着重要作用。研究表明,FSH水平增高与性机能减退引起的骨质疏松有密切关系,并且FSH对骨质的作用不依赖于雌激素水平的变化,阻断FSH的作用不仅能通过抑制骨的再吸收而显著减少骨的流失,而且还能促进骨的重建。
  在成年人和动物中,FSHR主要表达在睾丸支持细胞和卵巢粒层细胞表面, FSHR也在成熟的人破骨细胞(OC)及破骨细胞前体即单核细胞表面表达,成为阻断FSH作用的潜在靶点。据报道,FSH与骨质疏松(OP)具有密切联系,在一定范围内阻断FSH水平的升高在骨质疏松症的治疗方面已经取得了一定效果。纳米抗体作为一种新型的单域抗体具有分子量小、稳定性好、可溶性高,易与受体结合等优势从而发挥一定的生理功能。本研究的主要目的在于制备抗FSHR纳米抗体,探讨FSHR抗体对实验大鼠骨质疏松症的治疗效果,主要包括以下几部分内容:
  1、噬菌体展示技术从骆驼免疫抗体文库中筛选抗FSHR纳米抗体
  对FSHR免疫的骆驼VHH噬菌体展示文库经过3轮淘洗筛选,获得了63个阳性克隆,其中选择丰度最高的2个克隆VHH-3F9与VHH-3F19,丰度较低的一个序列VHH-3F20以及单独序列中随机的2个VHH-3F8与VHH-3F10等5个VHH基因序列,将其构建至pET22b载体,IPTG诱导蛋白表达,Ni-离子亲和色谱纯化抗体蛋白,获得了以上5个抗FSHR纳米抗体。经ELISA验证只有VHH-3F9与VHH-3F19能与FSHR结合,且VHH-3F9结合能力较高,另外4个纳米抗体不结合。从而获得了可以在上清和胞间质均表达的抗FSHR纳米抗体VHH-3F9,且浓度及纯度较高。ELISA及Western Blot检测该抗体能与FSHR特异性结合,且VHH-3F9纳米抗体具有部分体外阻断能力,测定其温度稳定性得知在37℃处理12 h仍保留70%的活性。
  2、制备抗FSHR骆驼多克隆抗体
  以原核表达纯化的FSHR234蛋白为抗原,对新疆双峰驼进行免疫,每隔两周加强免疫,共免疫七次。在第七次加强免疫两周后,对骆驼进行免疫后采血,间接ELISA法测定抗FSHR多克隆抗体的血清效价达到128000大量收集骆驼免疫后血清,采用Protein A柱子亲和纯化骆驼未免疫血清与免疫后血清,获得抗FSHR骆驼多克隆抗体总IgG。ELISA测得骆驼抗FSHR多克隆抗体IgG的最低反应浓度为0.0625μg/ml。体外检测抗FSHR抗体与caov-3细胞表面FSHR的结合,细胞免疫化学实验结果表明VHH-3F9纳米抗体和抗FSHR骆驼多克隆抗体IgG与caov-3细胞表面的FSHR均有结合,且多抗IgG结合能力较高,VHH-3F9有部分结合能力。
  3、利用双侧卵巢切除建立SD大鼠骨质疏松症模型
  本研究中实验动物SD大鼠随机分为两组,分别是去势OVX组和对照SHAM组。去势后检测雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)等雌激素水平以及骨密度(BMD)以评价建立的骨质疏松症动物模型。实验结果发现10周龄大鼠去势2周后,与SHAM组相比,OVX组E2水平显著下降(P<0.01),且在2到5周内保持平稳状态。FSH及LH水平均显著增加(P<0.05),且在2到5周内增加趋势缓慢,达到相对稳定水平。继续饲养3周,即去势8周后测定SD大鼠骨密度(BMD)水平,结果表明OVX组骨密度显著低于SHAM组(P<0.05),从而验证骨质疏松症模型成立。
  4、抗FSHR抗体对SD大鼠骨质疏松症的治疗
  采用尾静脉注射治疗骨质疏松症SD大鼠,纳米抗体VHH-3F9以及骆驼抗FSHR多克隆抗体IgG,按相同剂量即2 mg/kg,亮丙瑞林(LE)按1.6 mg/kg,对照组注射200μl的PBS。各组每周均治疗2次,共治疗6周。采血进行血清各项指标检测,观察每组对SD大鼠骨质疏松症的影响。实验结果发现,与对照SHAM组相比,实验组E2水平均显著降低(p<0.05),而各组之间并无差异。随着去势后OVX组FSH水平的逐渐增加,VHH-3F9、IgG注射骨质疏松症SD大鼠明显抑制了FSH的增加,且IgG效果强于VHH-3F9,但是差异并不显著。OVX+LE组,随着注射LE时间的延长,FSH水平显著降低,发现LE的施加显著抑制FSH(P<0.05)。LH的变化与FSH趋势一致,但OVX+VHH-3F9组LH水平高于OVX+IgG组。从而通过抑制FSH而达到治疗骨质疏松症的目的。
  综上所述,本研究在建立SD大鼠骨质疏松症动物模型的基础上,通过从噬菌体免疫文库中筛选得到亲和力较高的抗FSHR纳米抗体,免疫骆驼得到效价较高的抗FSHR多克隆抗体IgG,并用于实验动物SD大鼠骨质疏松症的治疗,以亮丙瑞林作为抑制FSH激素水平的对照,以确定抗FSHR抗体对于大鼠骨质疏松症的治疗效果。为将来进一步预防骨质疏松筛选有效药物做一基础研究,以便用于临床诊断及骨质疏松症的预防。
[硕士论文] 罗满玲
生理学 汕头大学 2016(学位年度)
摘要:目的:探讨蛋白精氨酸甲基转移酶6(protein arginine methyltransferase6,PRMT6)在小鼠睾丸组织中的表达特征,研究 PRMT6是否受到雄激素及雄激素受体(androgen receptor,AR)的调控,以及研究PRMT6的相关功能。
  方法:运用反转录PCR、实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术,研究Prmt6在小鼠睾丸中的表达特征;通过睾丸组织免疫荧光染色技术和在细胞中转入pEGFP-C1-PRMT6融合质粒探讨PRMT6的亚细胞定位;运用双荧光素酶实验分析Prmt6的启动子活性是否受到AR的调控;在TM4细胞内转入Ar的干扰RNA siAr或Ar的过表达质粒pcDNA3.1-Ar,以观察AR是否调控Prmt6的表达;将Prmt6的干扰质粒 shRNA转入生殖细胞系中,并用细胞划痕实验及流式细胞技术探讨Prmt6对生殖细胞迁移和凋亡的影响。
  结果:PCR与蛋白印迹结果显示,与野生型(wild type,WT)小鼠相比,PRMT6在AR敲除(androgen receptor knockout,ARKO)小鼠中的表达水平升高,且在1-8周WT小鼠睾丸中的表达随年龄增长有下降趋势;睾丸组织免疫荧光结果显示在1-8周小鼠睾丸内 PRMT6主要定位于精原、精母细胞的细胞核内, EGFP-PRMT6绿色荧光蛋白同样也定位于TM4和COS7细胞的细胞核内;通过荧光素酶实验,我们发现在雄激素及AR处理的细胞中,Prmt6的转录受到抑制;当在TM4细胞中转入siAr或pcDNA3.1-Ar时,Prmt6的表达相应的增加或减少。划痕和流式细胞分析证明,用shPrmt6敲低Prmt6的表达可以抑制精原、精母细胞的迁移并促进其凋亡。
  结论:PRMT6主要表达于小鼠睾丸的精原细胞和精母细胞内,其可受AR的调控而表达下降,并在生殖细胞中促进细胞的迁移及抑制细胞的凋亡,其在精子发生中可能具有重要作用。
[硕士论文] 王大玮
生物学 天津医科大学 2016(学位年度)
摘要:目的:甲状腺激素(Thyroid hormones,THs)的化学本质是一种酪氨酸碘化物,它参与了机体很多很重要的生理过程,在动物的生长发育过程中发挥着重要作用。THs缺乏会引起一系列生理水平的异常以及病变,其中很重要的一部分就是影响脑细胞的正常增殖和分化,从而影响大脑功能,造成脑部相关的疾病。同源盒基因NKx6.1(NK6 homeobox1)首先发现在胰腺β细胞中表达,后来发现其在中枢神经系统的分化发育过程中起到重要作用。有实验研究表明刚出生大鼠的Nkx6.1基因的表达水平会因为母鼠喂食低碘粮而发生显著改变。本研究从甲状腺激素经典的基因组功能和非经典的非基因组功能两个方面来研究甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1的调控机制。为进一步研究同源盒基因Nkx6.1在甲减模型的具体作用机制方面奠定基础。
  方法:1.本实验利用实时定量PCR和Western Blotting技术在体外以星形胶质细胞为载体检测甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1表达的影响。正常培养细胞在用不含血清和双抗的RPMI1640培养基培养24小时进行脱激素处理之后,实验分组为低激素组:血清替代物和双抗的 RPMI1640培养基培养,正常组:5%血清和双抗的RPMI1640培养基培养,高激素组:正常组培养基中加入终浓度10-7M T3的培养基培养。每种处理分三个时间段进行培养,分别为12h,24h和48h。提取细胞总RNA和蛋白,利用实时定量PCR技术和Western Blotting检测NKx6.1表达水平。2.用PCR扩增大鼠脑组织NKx6.1的5’上游启动子片段2.4 kb,应用生物信息学方法预测该片段上潜在的转录因子 T3R结合位点,根据不同的结合位点作系列截短,获得3段长度不等的启动子缺失片段,分别克隆到荧光素酶报告基因表达质粒(pGL3-Basic)上,构建相应的报告载体。将报告载体和T3R共转染大鼠星形胶质细胞(Rat Astrocytes,RA),并检测报告基因荧光素酶的活性。3.利用Western Blotting以正常培养的星形胶质细胞为对照检测高激素培养的星形胶质细胞中Shh信号通路下游因子Gli1,PI3K/AKT信号通路磷酸化产物p-AKT和MAPK信号通路磷酸化产物p-ERK的表达水平的变化,来验证甲状腺激素对Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路是否有激活作用。用抑制剂分组处理Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路,利用Western Blotting检测抑制后Gli1、p-AKT和p-ERK的表达情况,来确定Shh、PI3K/AKT和MAPK信号通路之间是否存在交叉调控以及串并联关系。
  结果:1.实时定量PCR和Western Blotting结果显示对比于正常组,低激素组在48h表达显著下调,高激素组在12h和24h表达上调,48h表达下调。2.扩增NKx6.1第一个外显子的起始密码子的5'上游2325bp启动子片段。根据JASPAR在线预测转录因子T3R结合位点作系列截短,成功构建三个NKx6.1系列截短启动子报告载体pGL3-2.3,pGL3-1.8,pGL3-1.5,pcDNA-T3R对pGL3-2.3与pGL3-1.8的激活作用相当,而对 pGL3-1.5的激活作用显著下降(P<0.05)。3.Western Blotting结果显示,高激素培养的细胞中 Gli1、p-AKT的表达均升高。在抑制MAPK信号通路时,Gli1、p-AKT的表达没有显著变化,在抑制 PI3K/AKT信号通路时Gli1的表达下降, p-ERK的表达没有显著变化,在抑制Shh信号通路时p-AKT、p-ERK的表达没有显著变化。
  结论:1.甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1的表达有诱导作用。2.双荧光素酶报告基因活性检测表明T3R对NKx6.1启动子有明显调控作用,其中-1887bp~-1507bp活性最高,即存在关键顺式调控元件。3Shh信号通路可以影响甲状腺激素对同源盒基因NKx6.1的表达调控。但具体调控路径尚未搞清楚。
[硕士论文] 何芸
妇产科学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:【目的】探讨孕酮(Pro,progesterone)对人脐静脉收缩功能的影响及其相关机制。
  【方法】收集临床足月儿脐带(N=106),分离脐静脉,将分离后的血管剪成3-5mm长度的血管环,置于37℃5ml Krebs溶液恒温水浴槽内进行血管功能实验,研究孕酮对去氧肾上腺素(PE,phenylephrine)、五羟色胺(5-HT,serotonin)诱导的人脐静脉收缩的作用及机制。同时,本实验采取了RT-PCR及Western-blot技术检测了孕酮对人脐静脉中 L-Ca2+通道(CaV1.2)及孕酮受体(PR,progesterone receptor)的表达水平的影响。
  【结果】孕酮显著抑制PE及5-HT诱导的人脐静脉收缩,这种抑制作用不能被内皮一氧化氮(nitric oxide,NO)及前列环素(prostacyclin,PGI2)合成的阻断剂、血管内皮的去除及孕激素受体拮抗剂或钾通道阻断剂所拮抗。同时,在 Krebs溶液中,对 PE、5-HT、Bay-k8644(Pseudoginsenoside,氟硝尼啶,电压依赖型钙离子通道的激动剂)、KCl诱导的脐静脉收缩的抑制作用,以及在无钙 Krebs溶中,对CaCl2诱导的脐静脉收缩的抑制作用,孕酮与尼非地平(nife,nifedipine,特异性CaV1.2阻断剂)或孕酮联合尼非地平的作用无差异。但是,mibe(mibefradil,米贝地尔,L-Ca2+通道(CaV1.2)和T-Ca2+通道(CaV3.2)阻断剂)对PE及5-HT诱导的脐静脉收缩的抑制作用显著强于孕酮或(和)尼非地平。而且,在无钙Krebs溶液中,孕酮对PE、5-HT及Caffine(咖啡因)诱导的人脐静脉收缩无抑制作用。同时,脐静脉孵育60分钟孕酮不改变CaV1.2及PR的mRNA和蛋白表达水平。
  【结论】1)孕酮对人脐静脉的收缩有抑制作用,这种抑制作用主要通过阻断L-Ca2+通道,而不是T-Ca2+通道,从而抑制外钙内流,同时,孕酮不是通过促进血管内皮性舒张、与孕酮受体相结合、激活钾通道和抑制内钙释放来起作用。
[硕士论文] 张文静
环境科学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:在人们的日常生活及生产中,有机紫外线吸收剂被大量而广泛地使用,目前已在多种环境介质和生物样本中检测到它们的残留,关于其潜在的生物毒性和健康风险逐渐引起高度关注。本文选取两类常用的有机紫外线吸收剂——苯并三氮唑类(benzotriazoles,BZTs)和二苯甲酮类(benzophenones,BPs)——为主要研究对象,利用重组人雄激素受体基因酵母研究了其对雄激素受体(androgenreceptor, AR)的干扰效应;采用人肝微粒体(human liver microsome,HLM)和人细胞色素CYP3A4(cytochrome P3A4,CYP3A4)酶,考察了P450酶介导的代谢对这两类紫外线吸收剂AR干扰效应的影响,并对其代谢产物采用四级杆-飞行时间质谱并结合密度泛函理论(density functional theory, DFT)进行了鉴定。主要实验结果如下:
  (1)研究了八种典型BZTs(1HBT、UV-P、UV-234、 UV-326、UV-327、UV-328、UV-329、UV-350)对AR的激活或拮抗作用。八种BZTs均未表现AR激活效应。然而UV-P具有显著的AR拮抗效应,并存在显著剂量-效应关系(IC50=22.13μM)。另外七种BZTs在低实验浓度下无拮抗效应,但在较高浓度(500μM)下UV-234、UV-327、UV-328、UV-329、UV-350具有较弱AR拮抗效应。经过HLM或CYP3A4代谢后发现UV-P存在代谢解毒现象,而UV-328表现为显著的代谢激活,另外六种BZTs代谢前后的AR拮抗效应无明显差异。对UV-328的代谢产物通过QTOF进行了产物鉴定,发现主要代谢产物为一次羟基化产物,并存在少量二次羟化产物。采用DFT预测了主要代谢位点;
  (2)研究了六种典型BPs(BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-8、4HBP)对AR的干扰效应。六种BPs均未有AR激活效应,但BP-4、BP-8具有显著的AR拮抗效应且有显著剂量-效应关系(IC50分别为10.37μM和5.54μM)。BP-3只在较高浓度下对AR有一定的拮抗毒性,用HLM代谢后其AR拮抗毒性显著减弱,另外三种BPs(BP-2、BP-4、4HBP)代谢前后的AR拮抗效应无明显差异。
  综上,本研究发现UV-P、BP-4、BP-8具有较强的AR拮抗效应,且其毒性强弱顺序为:BP-8>BP-4>UV-P;经HLM或人CYP3A4酶体外代谢后,UV-P、BP-3代谢后AR拮抗效应减弱,而UV-328代谢的AR拮抗效应显著增加,表现为明显的代谢活化,发现代谢产物主要为一次和二次羟基化产物。因此在对该类化合物进行毒性风险评估时,需综合考虑生物转化对其毒性的潜在影响。
[硕士论文] 唐佳为
生理学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:目的:
  促肾上腺激素皮质释放激素(Corticotropin releasing factor,CRF)是由下丘脑PVN区神经元合成并分泌的一种应激神经肽,其受体包括CRFR1和CRFR2受体。它们在下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)的功能中起重要作用。
  类胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF)家族包括两种配体(IGF-1和IGF-2),相应的受体(IGF-1R和IGF-2R)及六种结合蛋白(IGFBP1~6)。IGF家族在调节细胞增殖、存活、分化和迁移等方面具有重要的生物学功能。
  我们实验室主要研究低氧神经内分泌网络调节机制,CRF及其受体起核心作用,低氧影响肝脏和脑组织的IGF家族表达,本实验通过整体动物和细胞学实验,研究低氧下CRF家族和IGFBP家族可能的调节机制,以及低氧对相关细胞因子的影响;利用敲除IGFBP2小鼠比较CRF家族和IGF家族的组织表达特异性;在AtT-20细胞系上研究了转录因子AP-1和NF-κB对CRFR1和IGF-1R受体转录的调节。
  整体水平上,本实验利用低压低氧舱模拟7 km低氧环境,研究大鼠暴露于急性低氧(1、4、8和24 h)和拮抗剂(PDTC,NF-κB拮抗剂和CP154,526,CRFR1拮抗剂)处理后,皮层和垂体CRF,CRFR1和IGF家族基因表达变化,并利用IGFBP2敲除的小鼠和正常野生型C57小鼠比较研究CRF家族和IGF家族在皮层和海马区的基因表达变化。
  细胞水平上,利用AtT-20细胞系,给予CRF孵育,研究转录因子AP-1和NF-κB对CRFR1和IGF-1R的转录调节。
  方法:
  整体实验:
  1.大鼠实验:大鼠暴露于低氧舱模拟的低氧(7 km,1、4、8和24 h),动物分组为:对照组,不同时间的低氧暴露组,拮抗剂组,低氧后收集垂体,皮层和血液白细胞。
  2.小鼠实验:不同发育年龄的C57小鼠和IGFBP2 knock-out小鼠,在出生15d和45d分别收集海马和皮层。
  细胞实验:
  利用小鼠垂体瘤细胞系(AtT-20),分为对照组,CRF处理组(10nM),拮抗剂组(AP-1或NF-κB inhibitor),拮抗剂+CRF组等。研究CRF通过转录因子AP-1和NF-κB调节CRFR1和IGF-1R转录。
  研究采用实时定量PCR和Western-Blot进行检测。
  结果:
  1.急性低氧呈低氧时间(7km,1,4和8h)相关地增加大鼠垂体CRF mRNA的表达,24 h时降低但仍高于对照水平;急性低氧1,4,8h显著降低大鼠垂体CRFR1 mRNA的表达,但24 h时回到对照水平。
  2.急性低氧7km8h明显降低了大鼠垂体和皮层IGF-1 mRNA表达;低氧4,8h增加了垂体和皮层IGF-1R mRNA的表达。
  3.NF-κB拮抗剂和CRFR1拮抗剂部分阻断了低氧诱导的垂体CRF mRNA表达增加;也阻断了低氧诱导的垂体CRFR1 mRNA表达的下降和垂体IGF-1R mRNA的增加。但是NF-κB拮抗剂不能阻断低氧诱导的垂体IGF-1 mRNA表达的下降;CRFR1拮抗剂可以阻断低氧诱导的垂体IGF-1 mRNA表达的下降。
  4.急性低氧呈低氧时间相关地(7km,1,4和8h)增加大鼠皮层和血液白细胞TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的表达。
  5.NF-κB拮抗剂阻断了低氧诱导的血液白细胞TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA表达的增加;CRFR1拮抗剂阻断了由低氧诱导的IL-1β和IL-6 mRNA表达的增加,但没有影响TNF-αmRNA表达的增加。
  6.在C57小鼠海马中,随年龄发育, IGFBP2,CRFR1和IGF-1R mRNA表达水平降低,而CRF,SPAR和NR-2B mRNA的表达无明显变化;在IGFBP2KO的小鼠中,与正常小鼠比较, IGFBP2,CRF,CRFR1,IGF-1R,SPAR和NR-2B的mRNA的表达量都显著的下降,但不同发育阶段无明显差异;在C57小鼠皮层中,随年龄发育,IGFBP2,CRF和NR-2B mRNA表达水平降低,而SPAR和IGF-1R mRNA表达上升,CRFR1 mRNA表达水平无明显变化;在IGFBP2KO的小鼠中,与正常小鼠比较, IGFBP2,IGF-1R,SPAR和NR-2B的mRNA的表达量都显著的下降,CRF的mRNA的表达量随年龄发育下降,CRFR1 mRNA表达水平无明显变化。正常小鼠海马组织的IGFBP2蛋白随年龄发育增加。
  7.在AtT-20细胞系中,常氧下CRF显著降低CRFR1mRNA表达,升高IGF-1R的mRNA表达,AP-1拮抗剂可以阻断CRF引起的CRFR1基因表达的下降,不影响IGF-1R基因表达;NF-κB拮抗剂不能阻断CRF引起的CRFR1基因表达的下降,也不能阻断CRF引起的IGF-1R基因表达的上升。低氧24h,CRF进一步升高了CRFR1和IGF-1R的mRNA的表达,AP-1拮抗剂不能阻断CRF引起的CRFR1和IGF-1R的基因表达的上升;但NF-κB拮抗剂可以阻断CRF引起的CRFR1和IGF-1R的基因表达的上升。
  小结:
  急性低氧垂体CRFR1和IGF-1 mRNA表达显著下降,而CRF和IGF-1R mRNA表达显著上升。
  急性低氧显著增加皮层和血液白细胞TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的表达,CRFR1和NF-κB参与其基因表达的调节。
  不同发育年龄小鼠CRF和IGF家族具有不同的表达模式,IGFBP2在海马神经元的发育中可能起重要作用。
  在常氧下,AP-1起负调节作用调控CRFR1基因的转录;在低氧下,NF-κB起正调节作用调控CRFR1基因的转录。
[硕士论文] 吕涛
化学 曲阜师范大学 2015(学位年度)
摘要:高效液相色谱法(HPLC)是一种高效的分离和分析技术,对于复杂样品中的不同组分能够实现快速分离,并逐一加以定性和定量分析。目前已经成为发展最快、影响最大、应用最广泛的现代分析方法之一,广泛用于分析化学、生物化学、临床医学、药物化学、食品卫生和环境监测等领域。液质联用(HPLC-MS)技术,以液相色谱作为分离系统,质谱为检测系统。该技术将色谱对复杂样品的高分离能力,与MS的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。然而,对于某些化合物,HPLC检测方法灵敏度有限。例如当待测物无紫外吸收和荧光或离子化效率很低的情况下,可以对其进行衍生化,生成易被检测的物质。化学衍生化技术在仪器分析中被广泛应用。分散液液微萃取(DLLME)是一种新型的、强效的样品前处理技术。DLLME因其简便、低消耗、高回收率、高富集因子(EFs)和萃取迅速,已受到特别的关注。目前该技术已广泛运用于不同基质中许多种类的有机化合物和无机化合物的检测。本论文建立了一种新型的超声辅助-分散液液微萃取(UA-DLLME)与衍生化联用技术,采用这种新型的联用技术对于环境雌激素和芸苔素内酯进行了有效的高效液相色谱-荧光(HPLC-FLD)分析检测,验证了联用技术的可行性。本论文合成了一种新型的罗丹明类衍生化试剂4′-羧基罗丹明,并应用于人参二醇的质谱增敏研究。本文具体工作如下:
  第一章:简述了高效液相色谱法及质谱法在现代有机分析测试中的应用。
  第二章:介绍了化学衍生化增敏技术与分散液液微萃取前处理技术研究进展。
  第三章:采用新型的衍生化与分散液液微萃取前处理技术应用于环境雌激素和芸苔素内酯的高灵敏检测,并成功用于实际样品中分析物的高灵敏、高选择性和快速检测。验证了所建立的衍生化与分散液液微萃取联用技术的适用性。
  第四章:合成了一种新型的罗丹明类衍化试剂,4′-羧基罗丹明并采用半制备液相色谱对合成产物进行纯化。
  第五章:利用4′-羧基罗丹明作为质谱增敏试剂,对人参二醇进行衍生化,并采用超声辅助分散液液微萃取技术对实际样品进行前处理。该方法成功用于人参药材和化妆品种人参二醇的高灵敏检测。说明本论文所建立的实验方法具有广泛的适用性,合成的衍生化试剂也具有广阔的应用前景。
[硕士论文] 狄志欣
生物工程 兰州理工大学 2015(学位年度)
摘要:随着糖尿病人的不断增多,人胰岛素做为最主要的治疗药物,其需求量越来越大。同时,做为糖尿病病因检查的人胰岛素检测试剂盒的需求也越来越广泛。重组人胰岛素是第一个批准的转基因药物,修饰重组胰岛素因其更为优越的治疗效果而在逐步占领糖尿病治疗市场。通过基因工程手段生产的重组人胰岛素主要以含人胰岛素原基因的大肠杆菌发酵得到。真核基因在大肠杆菌系统直接表达时往往产率较低,由此造成生产成本增加。本文以前期设计、合成的适合在大肠杆菌表达系统中表达的人胰岛素原基因为材料,亚克隆该基因至表达载体pGEX-3X和pET-32a,分析了该基因在E.coli中的适宜表达条件,获得了可高效表达人胰岛素原的工程菌株和培养条件。
  本研究主要内容包括:⑴使用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切重组质粒 pBluscript-hPINS,分离人胰岛素原基因片段,该片段的长度为275bp。将人胰岛素原基因亚克隆至表达载体 pGEX-3X,经 DNA序列测序核实获得的重组表达载体pGEX-Ins。该重组表达载体的大小为5227bp,所编码的重组融合蛋白大小为35kDa。⑵重组表达载体pGEX-Ins转化表达菌株E.coliBL21(DE3)和E. coliBL21 star(DE3),构成表达重组蛋白的稳定菌株。从表达菌株、生长温度、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间五个方面优化其表达条件,最终确定重组人胰岛素原蛋白的适宜条件为:表达菌株E. coliBL21 star(DE3)、大肠杆菌的生长温度30℃、诱导时的细菌密度OD550≧0.5、诱导温度为26℃、诱导剂IPTG的浓度为2mmol/L。大量表达重组人胰岛素原蛋白,收集菌体,超声破碎细胞,SDS-PAGE分析上述条件表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在。提取和纯化包涵体后,重组蛋白占包涵体蛋白的80.5%。重组蛋白的得率为38.8mg/L。重组蛋白经串联质谱鉴定后结果显示GST被诱导表达,而GST之后的人胰岛素原被一未知多肽替换,碱基序列再次测定后并未发现移码突变和碱基突变,其序列的基因顺序和起始重组质粒pGEX-Ins完全一致。⑶以重组载体pGEX-Ins为模板,PCR扩增人胰岛素原基因,扩增产物大小约为273bp。回收扩增产物后亚克隆至表达载体 pET-32a,构建表达载体 pET-Ins。该重组表达载体的大小为6173bp,所编码的重组蛋白大小为28kDa。⑷重组表达载体pET-Ins转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),含重组蛋白的菌株,从生长温度、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间四个方面优化其表达条件。重组人胰岛素原基因的适宜表达条件为:大肠杆菌的生长温度30℃、诱导时的细菌密度OD550≧0.5、诱导生长温度为26℃、诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L。大量表达重组人胰岛素原蛋白,收集菌体,超声破碎菌体细胞,SDS-PAGE分析表达重组蛋白主要以包涵体的形式存在。提取和纯化包涵体后,重组蛋白占包涵体总蛋白的89.9%。重组蛋白条带经串联质谱鉴定,结果显示该重组蛋白含有人胰岛素原。⑸将人胰岛素原基因克隆至pGEX-3X的GST标签蛋白之后BamHI和EcoRI位点,通过双酶切鉴定和测序鉴定,确定表达载体pGEX-Ins序列的准确性。将表达载体转化入大肠杆菌获得稳定表达目的蛋白的菌株。通过诱导该基因在大肠杆菌中高效表达,进而分离纯化得到重组人胰岛素原蛋白。该蛋白经串联质谱鉴定后发现 GST之后的目的蛋白被一未知多肽所代替。对表达载体重新测序鉴定后发现基因序列并未发生移码突变或碱基突变,其原因还需要进一步的研究。将人胰岛素原基因扩增后亚克隆至pET-32a的BamHI和EcoRI位点,通过双酶切鉴定和测序鉴定,确定表达载体pET-Ins序列的准确性。将重组质粒pET-Ins转化入大肠杆菌中,获得高效预期大小的重组蛋白的菌株。分离纯化后的重组蛋白条带经串联质谱鉴定后确定为含有人胰岛素原的重组蛋白。
[硕士论文] 蔡禹希
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2015(学位年度)
摘要:血液中的葡萄糖和胰岛素透过血管壁进入组织器官是维持人体葡萄糖稳态的重要步骤,若葡萄糖和胰岛素滞留在血管内无法到达组织发挥功能,则将导致机体的高血糖、胰岛素抵抗以及二型糖尿病。血管壁由单层或多层血管内皮细胞构成,血管内皮细胞对葡萄糖和胰岛素的转运能力是葡萄糖和胰岛素能否到达组织器官的关键。抵抗素自发现以来一直被认为与胰岛素抵抗、二型糖尿病相关。前期研究发现,抵抗素处理后的血管内皮细胞中葡萄糖和胰岛素的通透性下降,预示着抵抗素通过一条新的通路导致机体胰岛素抵抗,而这一作用的分子机制还未知。为了探究抵抗素降低血管内皮细胞对葡萄糖和胰岛素的通透性的作用机制,本研究以人脐静脉瘤融合细胞(EA.hy926)为体外血管壁模型,检测了血管内皮细胞转运葡萄糖和胰岛素必须的两种因子GLUT1和INSR的表达水平,并构建了GLUT1启动子载体,利用海肾双荧光报告系统检测了GLUT1启动子的转录活性,探讨了抵抗素调控GLUT1表达的分子机制。
  本研究主要内容包括:⑴用抵抗素刺激EA.hy926细胞,RT-PCR和western blot的检测发现,抵抗素可下调GLUT1和INSR的mRNA水平以及蛋白水平。⑵免疫荧光试验显示,抵抗素刺激使EA.hy926细胞GLUT1蛋白的荧光强度减少;而超表达GLUT1可回复抵抗素引起的葡萄糖通透性下调。⑶为了探索抵抗素下调GLUT1的机制,构建了GLUT1启动子载体,双荧光报告系统检测发现,PPARγ可特异的与GLUT1启动子结合,上调启动子转录活性,表明抵抗素是通过PPARγ调控GLUT1的表达。⑷研究证明,抵抗素通过PPARγ—GLUT1—葡萄糖转运信号通路调控葡萄糖在血管内皮细胞中的转运,从而影响葡萄糖进入血管内皮细胞,减少组织对葡萄糖的氧化利用。
[硕士论文] 徐俊丽
生物化学与分子生物学 南开大学 2015(学位年度)
摘要:人的促肾上腺皮质激素释放因子1受体(CRF1R)是一个B类的G蛋白偶联受体(GPCRs),它介导应激反应(response to stress)并且是治疗抑郁症等疾病的药物作用靶点。在 CRF1R晶体结构的基础上,我们研究两个不同的拮抗剂CP-376395和MTIP的结合机制以及拮抗剂结合诱导的CRF1R的动力学行为。通过分析发现了和两个拮抗剂都有相互作用的关键残基以及与各拮抗剂特异结合的残基。这两个拮抗剂与Asn283,Phe203,Met206,Leu280,Tyr316,Leu323,Leu287,Phe284,Val279,Leu319,Phe207,Gly210和Phe362都有相互作用,而CP-376395特异性的与Glu209和Phe160有相互作用,MTIP特异性的与Leu320,Leu213,Ile290,Phe162和Val313有相互作用。通过结合自由能的分析发现MTIP的自由能比CP-376395的低,这与实验数据一致。有拮抗剂结合的holo-CRF1R与apo-CRF1R的构象动力学行为有三方面的不同:(1) TM2中的Arg151和TM3中的Glu209之间的离子锁在apo-CRF1R中断裂,但在holo-CRF1Rs中形成(;2)TM3中的Phe203和TM6中的Tyr327在apo-CRF1R中互相接近,而在 holo-CRF1Rs中它们互相远离,造成 TM6的转移;(3) Tyr327/Leu323/Phe284三个残基构成“旋转异构开关”,这三个残基在holo-CRF1R与apo-CRF1R中有不同的旋转异构体构象。
[硕士论文] 杨阳
药学 济南大学 2015(学位年度)
摘要:背景:
  促性腺激素释放激素(GnRH)是由下丘脑所分泌的一种含有十个氨基酸的小肽类激素,经过下丘脑-垂体-门脉系统进入垂体前叶,作用于脑垂体前叶的促性腺激素分泌细胞,调节垂体前叶的两种促性腺激素:促黄体生成素和促卵泡生成素的合成与分泌,从而调节性腺的发育和配子的形成。
  GnRH类似物是人工合成的GnRH衍生物,对于脑垂体具有双向影响。GnRH类似物可与GnRH竞争受体。当小剂量短期给药时表现为促卵泡生成素和黄体生成素的刺激效应,大剂量长时间应用GnRH类似物后,可降低体内促性腺激素的分泌,进而对性腺功能产生抑制作用。由于对脑垂体激素的这种调节作用,GnRH类似物的研究和应用领域非常广泛,包括临床疾病的治疗和农牧渔业动物的繁殖。临床上的治疗主要包括子宫内膜异位症,乳腺癌,前列腺癌,子宫肌瘤,子宫内膜癌,多毛症以及促排卵等多个方面。由于临床上的应用及农牧渔业生产的需求日益扩大,特别是GnRH类似物的临床应用,其价格一直居高不下。因此,寻找一种成本低并且能够稳定的获得GnRH类似物的方法具有十分重要的意义。
  目的:
  目前,GnRH类似物的获得主要来自化学合成,但其成本较高,价格昂贵。本实验拟采用基因工程手段将多拷贝GnRH类似物串联基因转入大肠杆菌中,利用基因工程技术表达目的蛋白,为进一步研究GnRH类似物的获得探索一种新的方法。
  方法:
  (1)比较GnRH基因结构,设计、合成可行的多拷贝目的基因。
  (2)构建8拷贝GnRH analogue原核表达载体pGEX-2t-8GnRH analogue,转化大肠杆菌,经PCR、双酶切及测序进行鉴定。
  (3)构建16拷贝GnRH analogue原核表达载体pGEX-2t-16GnRH analogue,转化大肠杆菌,经PCR、双酶切及测序进行鉴定。
  (4)将原核表达载体转化入大肠杆菌BL21,实现目的蛋白的表达。
  (5)优化表达条件,提高目的蛋白表达量。检测、鉴定目的蛋白并对目的蛋白进行纯化。
  结果:
  (1)经过对比筛选,确定氨基酸序列EHWSYGLRPGKR(GnRH类似物)可作为基因工程表达的多拷贝基本单位、利于后期纯化酶切的序列。
  (2)构建的pGEX-2t-8GnRH analogue、pGEX-2t-16GnRH analogue原核表达载体,经PCR和双酶切以及测序鉴定证明已构建成功。
  (3) SDS-PAGE及Western-Blotting结果表明:大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,成功表达出多拷贝GnRH analogue的融合蛋白(GST-GnRH analogue)。
  (4)利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化连接有 GST标签的融合蛋白,初步纯化,得到GnRH analogue的八聚体小肽。
  结论:
  本实验已成功构建GnRH类似物多拷贝基因重组质粒,并可在大肠杆菌BL21中高效表达,经SDS-PAGE及Western-Blotting鉴定分析,得到GnRH analogue的八聚体小肽,批量发酵后,对目的蛋白进行纯化,得到GnRH analogue的融合蛋白,为多拷贝法生产生物活性小肽GnRH类似物奠定了基础。
[硕士论文] 袁婷
生物学 天津医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:甲状腺激素(TH)是哺乳动物脑发育过程中的关键物质,其在发挥作用的过程中与同源盒基因Nkxs具有相关性,我们之前实验已经证明Nkxs参与了低TH导致的脑发育迟滞,根据文献报道,TH、Nkx6.1各自与Shh信号通路具有一定联系,故本实验将Nkx6.1、Shh作为研究对象,选取中枢神经系统中数目最多的星形胶质细胞作为研究载体,旨在观察 Shh是否参与了甲状腺激素对Nkx6.1的作用,为进一步深入研究甲状腺激素影响同源盒基因NKx6.1的具体表达机制奠定基础。
  方法:本实验利用细胞原代培养法,从新生鼠大脑皮层中得到所需星形胶质细胞,采用恒温摇床振荡和差速贴壁的方法进行细胞纯化,倒置显微镜观察细胞形态数目变化,采用细胞免疫荧光法进行星形胶质细胞的鉴定及纯度检测,将细胞进行脱激素处理,分为三组培养,低激素组:含1%ITS-M、2%FBS及双抗的RPMI1640培养细胞,正常组:含10%FBS和双抗的RPMI1640培养基培养细胞,高激素组:含终浓度为10-7M T3的RPMI1640培养基培养细胞,每组分别分三个时间段进行培养,12h、24h、48h,收集细胞,提取总 RNA进行纯度鉴定。设计引物,实时定量PCR检测不同时间点、不同激素水平下Shh、NKx6.1 mRNA水平变化,制备蛋白样品,Western Blot检测Shh、NKx6.1蛋白表达。使用内源性Shh抑制剂(环杷明Cyclopamine)培养细胞12h、24h、48h,定量PCR、Western Blot检测不同激素水平、不同时间点NKx6.1的表达情况。
  结果:原代培养细胞置于倒置显微镜下观察,星形胶质细胞在初次种植24h后,大部分细胞均已贴附于培养瓶底,部分细胞开始铺展,胞体呈圆形,折光性高,细胞体积较小,培养第4-5d时,细胞体积明显增大,部分生长迅速的细胞胞体伸展,随着培养时间延长,细胞数量明显增多,胞体增大,培养物中星形胶质细胞的比例逐渐增多,位于底层;培养9-12d,细胞基本铺满整个培养瓶且以星形胶质细胞为主,细胞密集排列生长,胞体体积达到最大;将细胞进行传代后生长更活跃,培养4-6d即可铺满瓶底。细胞进行纯化培养后,星形胶质细胞形态更加突出,比例更高,利用GFAP细胞免疫荧光法进行细胞鉴定,每张盖玻片取十个视野进行阳性细胞计数,抗体标记阳性星形胶质细胞纯度大于95%。实时定量PCR、Western Blot检测Shh、NKx6.1变化,结果表明,正常组中Nkx6.1无明显变化,只是在48h的时候有一表达小峰;低激素组12h、24h培养时间里Nkx6.1无明显变化,与正常对照组相比差异不具有显著性(P>0.05),在48h表达量突然下降;高激素组培养12h、24h后Nkx6.1水平显著升高,在48h表达量突然下降且与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。另一方面,对照组Shh水平在所测时间里并无明显变化;低激素组12h、24h、48h培养时间里 Shh水平均显著下降,其中48h下降程度最大;高激素组培养12h、24h Shh水平显著升高,而在48h表达量降低且明显低于对照组。Shh与Nkx6.1相关性研究表明,抑制Shh后Nkx6.1水平随作用时间延长而下降,且与对照组相比具有显著差异(P<0.01)。
  结论:利用原代培养,成功获得纯度较高的星形神经胶质细胞,证实了不同剂量的甲状腺激素作用不同时间对Shh、Nkx6.1具有不同的影响,且Shh和Nkx6.1变化水平相近,通过进一步抑制Shh信号通路,发现NKx6.1表达下调,综上初步证实Shh参与了甲状腺激素对NKx6.1的作用过程,其很可能成为揭示该过程机制的关键因子。
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