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[硕士论文] 姜鹤
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:β-防御素(3-defensin,BD)是一种富含半胱氨酸具有广谱抗菌活性的阳离子短肽。目前研究发现,BD可以趋化免疫细胞迁移,在机体免疫调节中发挥重要作用。本研究通过对团头鲂β-防御素1(MaBDl)进行表达和纯化,获得团头鲂β-防御素1重组蛋白,研究其对团头鲂白细胞,尤其是巨噬细胞的趋化作用和炎症细胞因子表达的影响。实验结果如下:
  1.构建原核重组表达载体pET-32a-MaBD1,通过IPTG诱导表达MaBD1重组融合蛋白。将该蛋白利用Ni2+亲和层析方法纯化后,再经肠激酶酶切及纯化,获得MaBD1重组蛋白。使用MaBD1重组蛋白进行抑菌实验,结果显示MaBD1重组蛋白对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌活性。
  2.采用Percoll非连续梯度离心法分离团头鲂头肾白细胞,再利用贴壁方法分离纯化巨噬细胞,采用光镜和透射电子显微镜进行鉴定,结果显示:团头鲂头肾白细胞主要包括:中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞。贴壁巨噬细胞铺展或伸长呈各种形状,细胞核圆形和椭圆形,多数偏于细胞一侧。巨噬细胞表面标志CD68在贴壁巨噬细胞中高表达。
  3.用Transwell法检测MaBD1的体外趋化活性,发现MaBD1重组蛋白对白细胞,尤其是巨噬细胞具有明显趋化作用。为进一步了解MaBD1趋化功能位点,分别合成N端(MaBDPl)和C端(MaBDP2)MaBD1多肽,N端的趋化活性显著高于C端。
  4.将MaBDPl注射团头鲂腹腔,观察MaBDP1对体内白细胞以及巨噬细胞趋化活性,结果显示MaBDP1对体内白细胞和巨噬细胞都有趋化作用。在2d500ng/mL MaBDP1对白细胞具有趋化作用。而在3d1000ng/mL MaBDP1对巨噬细胞趋化作用明显。qPCR检测MaBDP1对促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)表达影响结果显示:脾脏,头肾和体肾中IL-1β表达量在6h和72h表达量显著升高,肝胰腺中IL-1β表达量在6h表达量显著升高;脾脏,头肾和体肾中TNF-α表达量在72h显著升高,肝胰腺中TNF-α表达量在6h显著升高。表明MaBDP1可以促进IL-1β和TNF-α的表达,增强机体的炎症反应。
[硕士论文] TAN KIAN ANN
AQUACULTURE 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:乌鳢(Channa argus)是中国水产养殖里重要的土著鱼类品种,其生长速度快、适应性能力强、养殖产量高等特点。乌鳢在东南亚各国的市场需求不断提高,是中国水产养殖行业外贸出口的主要淡水鱼之一,经济价值较高。在自然环境中,乌醴生命力强,极少患病。随着乌鳢的水产养殖规模不断的扩大和养殖密度的提高,导致乌鳢的病害频发,受影响的范围越来越广,造成养殖户们巨大的损失。主要感染乌鳢发病的病菌原是鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae),又称结节病。诺卡氏菌(Nocardia sp.)是革兰氏阳性菌,此菌属兼性细胞内病原。被诺卡氏菌感染的病鱼起初的体表没出现明显的症状,其反应变得迟钝、食欲不断的下降、乌鳢一直上浮水面;随着病情越发严重,部分的鱼体表逐渐变黑、腹部不断膨大、鳍条出现充血症状,心、脾、肾、肝等内脏器官都会出现直径1-5mm的乳白色结节,有些病鱼还会有眼球凸起、肛门红肿和腹水等的症状。
  本研究以被鰤诺卡氏菌感染的乌鳢为研究对象,使用Illumina高通量测序技术对被鰤诺卡氏菌感染的乌鳢的头肾组织进行转录组深度的测序。应用短序列组装软件Trinity对测序结果进行从头组装,建立转录组数据库;将转录组数据与NR、KEGG、KOG和Swiss-Prot等蛋白数据库进行序列对比;将得到的序列进行GO功能注释和KEGG代谢通路分析;SSR重复序列注释和预测编码蛋白框(CDS)进行分析;对实验组和对照组的差异基因表达水平进行深度分析,筛选出与感染鰤诺卡氏菌相关的一些基因。然后对非特异性免疫系统的二个经典的信号通路进行分析,研究其信号通路Toll样受体的信号通路(TLR)和NOD样受体的信号通路(NLR)。主要研究结果如下:
  经过RNA-Seq测序,对照组和实验组分别获得35779908和36574025的clean reads,组装获得133999条最长16393bp和最短224bp的unigenes。其N50值和N90值分别是1460和315。所获得的unigenes与四大蛋白数据库进行blastx比对,发现有106319条unigenes(占79.34%)被注释,其中分别有5753unigenes通过GO功能注释(4.29%)、KEGG通路分析有5885条unigenes(4.39%)、NR有54886条unigenes得到注释(40.97%)、Swiss-Prot有39795条的unigenes(29.69%)。1509条的unigenes被归类到分子功能、生物过程以及细胞组成。49070条的unigenes被归类至KOG数据库的26个种类里。KEGG分析里有5885条的unigenes被注释到335个通路中,这些335个通路可以归类到代谢通路、环境信息处理通路、遗传信息处理通路、细胞进程通路、生物系统通路和人类疾病通路。本研究中所注重的Toll样受体的免疫应答信号通路和Nod样受体的免疫应答信号通路。通过blastx比对,预测到CDS的unigenes总共有40342条。利用SSR软件microSatellite(MISA)软件的分析,结果发现有6种碱基重复的种类。这六种碱基重复分别是单碱基重复(13849个)、2个碱基重复(9203个)、3个碱基重复(3222个)、4个碱基重复(433个)、5个碱基重复(55个)和6个碱基重复(15个)。通过转录组的差异表达基因分析,发现3912条的unigenes有显著的表达差异。其中有1552条的unigenes表达上调(39.67%)而2360条的Unigenes表达下调(60.33%)。Toll样受体的免疫应答信号通路发现有19个unigenes有显著表达差异,其中12条表达上调和7条表达下调。NOD样受体免疫信号通路中有10个unigenes表现差异,有3条unigenes表现上调而7条unigenes表现下调。
  随机选取7个toll样受体信号通路和9个nod样受体信号通路的基因进行qRT-PCR验证。Toll样受体途径的基因有TLR7,MAP2K4,NFKBIA,TAK1,IL8,FOS,和IL12,而Nod样受体途径的基因是IKKA,NF-KB p105,TNFAIP3,IL8,IL6,IL1B,HSP90A,ASC,和MAP3KIP1。经过qRT-PCR验证,结果表明了这些基因和转录组的差异基因几乎一致。通过组织病理学观察,被鰤诺卡氏菌感染后的乌鳢头肾发现有结节形成、肝细胞出现脂肪变性、脾脏组织的出现破裂、鱼鳃组织退化和分解、心脏组织发生病变和部分心肌组织出现退化。
[硕士论文] 刘岚萍
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:小G蛋白是重要的分子开关,可以调节细胞分裂、细胞骨架形成、囊泡运输、核质运输等多种细胞功能,在免疫中发挥重要作用。本研究克隆得到大黄鱼Rac1、Rac2、Rac3、Rab7和Rab5A(分别称为lycRac1、lycRac2、lycRac3、lycRab7和lycRab5A)的cDNA序列,通过与基因组序列图比对获得完整的基因序列,分析了这些基因的分子特征、组织表达特性,以及LPS、PolyI∶C、副溶血弧菌等刺激后大黄鱼肝脏、脾脏和肾脏中的表达变化并对利用免疫胶体金技术对肝脏中表达的lycRAC2进行亚细胞定位,利用GST-Pulldown和质谱鉴定研究了与lycRAB5A互作的蛋白质。主要结果如下:
  1、RAC蛋白包括3个类型,分别为Rac1、Rac2和Rac3。lycRac1的cDNA全长2329 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac2的cDNA全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac3的cDNA全长2182 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。氨基酸多重比对显示,lycRac1与海龟(Chelonia mydas)、斑马鱼(Maylandiazebra)和红鳍东方纯(Takifugu rubripes)的Rac1基因有高相似性;lycRac2与尖吻鲈(Lates calcarifer)、亚马逊花鳉(Poecilia formosa)和剑鱼(Xiphophorusmaculatus)同源性高;lycRac3与牛(Bostaurus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)和蓝鲶鱼(Ictalurus furcatus)有较高同源性。通过基因组分析发现lycRac1有6个外显子,5个内含子;lycRac2有7个外显子,6个内含子;lycRac3有7个外显子,6个内含子。进化树分析表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3均与鱼类Rac1、Rac2和Rac3聚成一支。利用荧光定量PCR技术检测三个基因在组织中的表达量,发现它们在所有检测的组织中均可以表达,其中,lycRac1在心脏中的表达量最高,血液和脑中也有较高的表达,头肾中的表达量最低;lycRac2在头肾中的表达量最高,肾脏和脾脏中也有较高的表达,肌肉中的表达量最低;lycRac3在血液中的表达量最高,脾脏和脑中也有较高的表达,肠中的表达量最低。大黄鱼受到Lpopolysaccharide,Polyinosinic Polycytidylic acid和VibrioParahemolyticus刺激后lycRac1、lycRac2和lycRac3在肝脏、脾脏、头肾中的表达量有不同程度的升高,纯化的lycRAC2蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。免疫电镜结果表明,lycRAC2亚细胞定位于细胞间质。以上结果表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3可能是与免疫相关的基因,它们在应对细菌感染中发挥不可或缺的作用,lycRAC2的亚细胞定位进一步说明lycRac2与信号传递有关。
  2、Rab7是属于Ras家族的小G蛋白,lycRab7的cDNA全长2218bp,开放阅读框(ORF)624 bp,编码207个氨基酸。氨基酸多重比对结果显示,lycRab7与斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)、家兔(Oryctolagus cuniculus)的Rab7基因同源性较高。通过基因组分析发现,lycRab7有5个外显子,4个内含子。系统进化树分析表明,lycRab7与其它鱼类可以聚成一支。实时荧光定量PCR结果显示,lycRab7在12个组织中均有表达,其中脑中的表达量最高,血液和心脏中也有较高的表达,胃中的表达量最低。大黄鱼受到LPS、polyI∶C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏和头肾中lycRab7的表达量均明显上调。纯化的lycRAB7蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。以上结果表明,lycRab7在抵御细菌入侵中发挥重要作用。
  3、Rab5A是Ras家族的一员,已得到纯化的lycRAB5A蛋白,根据GST pull down结果可知,lycRAB5A蛋白与腺苷三磷酸酶(Calcium-transporting ATPase)、肌酸激酶(Creatine kinase M-type)、肌动蛋白(Actin,alpha skeletal muscle)等蛋白互作。结果表明lycRAB5A与其他蛋白协同在机体免疫中发挥作用。
[硕士论文] 马辰婕
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:随着抗菌药物在水产养殖中的广泛使用,水产养殖源细菌的耐药性逐渐变强,耐药多样性也渐渐增加,进而促使动物细菌性疾病的控制效果变差。气单胞菌是主要的水产动物致病菌之一,容易引起败血症、疖疮和溃疡等出血性疾病。抗菌药物的使用,是诱导气单胞菌耐药性的主要因素。本文以水产养殖源气单胞菌为研究对象,对其耐药性、耐药基因的分布特征及传播机制进行研究分析。
  本研究中,49株气单胞菌对8类17种抗菌药物的药敏结果显示,对AMX的耐药率高达100%,对SMZ、TMP、SXT和RIF的耐药率介于60%~90%之间,而对CTX、NEO、DOX以及喹诺酮类的ENR、NOR和OFL的耐药率均低于15%;在所有菌株中,41株菌株对3类及以上的抗菌药物具有抗性,24株菌株对9种及以上抗菌药物具有抗性。
  最小抑菌浓度(MIC)检测结果显示,TMP和SMZ的MIC50值最高(2048μg/mL),其余按MIC50值高低依次为STR(64μg/mL)、CHL(32μg/mL)、NEO(16μg/mL)、TET(16μg/mL)、FFL(16μg/mL)、DOX(4μg/mL)、ENR(1μg/mL)。最小杀菌浓度(MBC)检测结果显示,TET、TMP、SMZ ENR和NEO的MBC50与MIC50相等,CHL、STR和DOX的MBC50(64、256、和8μg/mL)则高于MIC50。抑菌圈直径与MIC值的相关性研究发现,两者之间均呈对数或指数负相关。
  25种耐药基因的PCR检测结果显示,基因组中,blaTEM的检出率最高(83.7%);其次是sul1和aadA,检出率分别是69.4%和61.2%;再者是arr2/3、aphA1、tetC、sul2、dfrA5和floR,检出率均高于40%。质粒中,sul1的检出率最高,为51%;其次是aphA1与aadA,分别为40.8%和38.8%; blaTEM、tetB、qnrB、qnrS、dfrA7、cat1和cmlA均未检出,其余耐药基因检出率均在35%以下。
  5类可移动元件的PCR检测结果显示,在基因组中,intI1检出率最高(65.3%);其次是IS26、ISCR2和tnpU,分别是63.3%、57.1%和51%;其余均低于50%。质粒中,intI1检出率依旧最高,为57.1%;其次是IS26、ISCR2和merA,检出率介于20%~35%之间;其余均低于15%。在1型整合子的可变区中,共发现13种基因盒排列,dfrA12-orfF-aadA2比例最高。ISCR2的可变区主要为两种:ISCR2+glmM+sul2(10株)和ISCR2-like+ str+strA+ sul2(2株)。
  本研究中共获得16株大肠杆菌转化子、21株气单胞菌转化子和4株大肠杆菌接合子。转化实验结果显示,耐药基因aadA、aphA1、sul2、tetA和floR较易通过转化的方式传递给大肠杆菌,其中tetA基因阳性转化子均表达四环素抗性;维氏气单胞菌转化子新增表型以RIF抗性为多,嗜水气单胞菌转化子多新增STR、KAN和CHL抗性,结果表明这4种药物抗性较易通过转化在种内进行传播。接合实验结果显示,只有嗜水气单胞菌成功与大肠杆菌接合,基因strA-B和oR较易通过接合在种间进行传播,且基因型阳性接合子均表达出对应抗性。此外,所有的转化子与接合子中,ISCR2的检出率均是最高的。
[硕士论文] 孙保贞
动物学 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:抗菌肽是在甲壳动物先天性免疫中发挥重要作用的几类小分子肽的总称,其中crustin是很重要的一类抗菌肽。本研究中,我们旨在研究日本对虾(MarsupenaeusJaponicus)在感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)时,类甲壳肽(crustin-like)基因所发挥的免疫功能。通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE),从日本对虾体内克隆到一条全长为660 bp的cDNA序列,软件推测分析显示该基因的开放阅读框大小为507bp,编码一个含有168个氨基酸残基的蛋白,基因3'末端含有一条Poly(A)尾巴,5'和3'的非编码区分别为72 bp和81 bp,推测出蛋白质的相对分子质量为16.22 kDa,pI为8.37。氨基酸序列比对和进化树分析显示crustin-like基因主要存在于甲壳动物中的对虾及少部分螃蟹中,其中在日本对虾发现的crutstin-like与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)亲缘关系较近。
  通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测基因表达的组织特异性发现crustin-like在鳃内表达量最高,在血淋巴、肝胰腺、肌肉和消化腺内表达量较低。通过double-strand RNA(dsRNA)干扰技术,体外构建dsRNA表达载体,将纯化后的dsRNA注射到对虾体内,成功地抑制了crustin-like基因的表达。对已知重要的免疫相关基因的检测结果显示,在crustin-like被沉默后,对虾先天性免疫系统中多个免疫相关基因的表达受到影响,其中Immune deficiency homolog(IMD)、Rab7、L-lectin、mitogen-activated protein kinase(MAPK)、p53、prophenoloxidase(proPO)和Rho基因的表达显著下调,而nitric oxide synthase(NOS)、myosin及Tumor necrosisfactor-α(TNF-α)基因的表达显著上调。对虾免疫活性试验显示,在抑制crustin-like基因的表达后,对虾血细胞总数显著减少,酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著减低。以上结果说明crustin-like对细胞吞噬作用、凋亡和部分免疫通路有显著的影响。
  进一步研究发现,在感染溶藻弧菌后,crustin-like基因的表达显著上调。统计死亡率发现,沉默crustin-like基因的表达后,对虾感染弧菌后累计死亡率显著增加。结果说明对虾crustin-like有明显的抗弧菌的作用。血细胞吞噬试验结果显示,对虾crustin-like基因被沉默后,对虾血细胞对溶藻弧菌的吞噬率显著升高,血淋巴细胞凋亡率显著升高,结果说明溶藻弧菌在感染对虾时可能会利用crustin-like来逃避对虾血细胞对弧菌的吞噬作用,这一现象还有待进一步的研究。
  在感染WSSV后12-72 h,crustin-like基因的表达显著升高。WSSV拷贝数检测和Kaplan-Meier生存分析结果显示crustin-like基因被沉默后,WSSV拷贝数显著降低,对虾存活率显著升高。抑制crustin-like基因的表达后,对虾血细胞对WSSV的吞噬率显著降低,对虾血细胞的凋亡显著升高。以上结果说明对虾crustin-like可以抑制细胞凋亡,而WSSV有可能利用crustin-like抑制细胞凋亡的功能来促进病毒粒子在对虾体内的复制。本文首次揭示了类甲壳肽在对虾病毒感染中有着重要作用,为研究对虾的先天性免疫和WSSV感染宿主的机制提供了重要的理论依据。
[硕士论文] 李启蒙
兽医 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,我国贝类养殖种类和养殖模式越来越多样化,养殖技术逐渐成熟,养殖面积不断扩大,贝类产业已成为我国水产业的重要支柱。但是,以弧菌为主要致病菌的微生物对贝类养殖产业带来严重危害。夏季的7、8月份是贝类弧菌病的高发季节,由弧菌引起的水生动物疾病流行面积广,发病率高,对水产养殖业造成严重的经济损失,一直是水产领域研究的一大热点。
  本试验对山东省主要贝类养殖区的养殖贝类和野生贝类进行了弧菌的流行病学调查。通过细菌分离、生化鉴定、16s-rDNA的克隆以及序列分析比对等方法,对分离的弧菌的生物学特性进行了初步研究。掌握了贝类弧菌的流行特点及规律,为预防疾病的发生提供了依据。自潍坊寿光,威海乳山、文登,青岛胶南,日照,滨州无棣,东营河口等地区采集了不同的贝类,包括青蛤、文蛤、扇贝、椭螺、尖螺、竹蛏、织纹螺、四角蛤、牡蛎、沙蛤、蓝蛤、花蛤、毛蚶、魁蚶、扁玉螺、贻贝等。从样品中分离出27种弧菌,8种其它细菌,共222株。经测序分析比对,主要有哈氏弧菌(Vibrio harveyi),溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 Vibrio chagasii、Vibrio azureus、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、杭州弧菌(Vibrio hangzhouensis)等。结果显示,哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的检出率较高,分别占20%、18%、21%;其他弧菌相对较少。胶南地区副溶血弧菌和溶藻弧菌检出率较高;无棣哈氏弧菌和溶藻弧菌检出率较高,而副溶血弧菌检测率很低;河口、日照、寿光三个地区的三种弧菌的检出率都比较高,均在15%-35%之间。
  结果表明,弧菌是导致贝类发病的主要病原菌之一,对青蛤、文蛤、毛蚶、竹蛏、沙蛤的危害相对严重。其中哈氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌分离出的菌株较多;哈氏弧菌主要分离自青蛤、文蛤、竹蛏、沙蛤、毛蚶;副溶血弧菌主要分离自文蛤、竹蛏、沙蛤、花蛤、毛蚶,沙蛤最多。溶藻弧菌在青蛤、文蛤检出率较高,其次为毛蚶。不同弧菌在不同贝类中的检出率有很大差异,在不同地区中的检出率也存在很大差异。
  对分离的哈氏弧菌、副溶血弧菌及溶藻弧菌进行了药敏试验。抗菌药物包括:阿米卡星、庆大霉素、萘定酸、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、四环素、多西环素、头孢噻吩、头孢呋辛、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林、氯霉素、复方新诺明、氟苯尼考,共17种。结果表明,三种弧菌都对氨苄西林和阿莫西林的耐药率较高,对其他药物的敏感程度不同,也有耐药菌出现。
  本试验对哈氏弧菌和副溶血弧菌主要毒力基因进行检测,哈氏弧菌主要毒力基因为luxR、toxR、vhhA、vhhB、vhpA、vhpB、toxS、flaA、pap6;副溶血弧菌主要毒力基因为tdh、trh、ureC、vscC2、vcrD2。结果表明,80%的哈氏弧菌检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB;副溶血弧菌毒力基因tdh、trh和ureC的检出率在20%左右。
  本研究查明了2016年度山东省贝类弧菌病的流行情况,为贝类弧菌病的预警提供了依据;通过对哈氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌的药敏试验,探明了贝类弧菌的抗菌谱,为贝类弧菌病的防控提供了用药依据。
[硕士论文] 付天增
预防兽医学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:链球菌(streptococcal spp.)是水产养殖业中的重要病原菌之一,由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)所引发的细菌性疾病在世界水产养殖业中很普遍,由此带来了巨大的经济损失。目前预防和治疗链球菌病的主要方法仍是消毒剂和抗生素等,但是此种方法会存在食品药物残留、细菌耐药性等食品安全问题。
  细菌灭活疫苗是通过福尔马林杀死病原体所制备的一种生物制品。链球菌灭活疫苗能使罗非鱼产生有中和、清除病原微生物及其产生的毒素作用的抗体,产生的体液免疫的免疫反应,对细胞外感染的链球菌有较好的免疫保护效果。
  本文研究海豚链球菌灭活疫苗和无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫保护率,以及交叉保护效果。将制备的海豚链球菌灭活疫苗和无乳链球菌灭活疫苗采用腹腔注射的方式进行免疫,测定了血清抗体效价,酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶、溶菌酶的活性,白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、Caspase3等细胞因子在头肾、后肾和脾脏的的表达量和对罗非鱼的免疫保护率。罗非鱼第二次免疫14天后,免疫无乳链球菌灭活疫苗组和海豚链球菌灭活疫苗组抗体、ACP、SOD、LZM水平及头肾中Caspase-3、TNF、IFN,后肾中IL-1、TNF、IFN,脾脏中Caspase-3、IFN相对表达量显著(P<0.05)高于PBS组;罗非鱼攻毒试验7天后,试验组抗体、ACP、AKP水平及头肾中IL-1、Caspase-3、IFN,脾脏中Caspase-3、TNF相对表达量显著高于对照组(P<0.05);试验组存活率显著高于对照组(P<0.05)。
  无乳链球菌灭活疫苗和海豚链球菌灭活疫苗组具有良好的免疫保护率,相对存活率分别为92.9%和93.3%,并且二者具有交叉保护作用,无乳链球菌灭活疫苗组交叉保护作用显著高于海豚链球菌灭活疫苗组(P<0.05)。
[硕士论文] 王瑶
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:弹状病毒是一类具有包膜、单链、负义的RNA病毒,病毒结构多数呈子弹状,有时也会呈现杆状或棒状。病毒的核衣壳由病毒基因组RNA、核蛋白(Nucleoprotein,N)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,L)及磷酸化蛋白(Phosphoprotein,P)组成。基质蛋白(Matrix protein,M)包裹在核衣壳外表面,病毒粒子表面覆盖有糖蛋白(Glycoprotein,G)形成的钉状突起。弹状病毒科成员众多,目前已经明确报道的约为185种,其宿主范围极为广泛,能够感染哺乳类、鱼类、昆虫及植物等,并且导致所感染宿主患病或死亡,是重要的病原类群。已经报道的鱼类弹状病毒有20多种,严重影响鱼类的健康养殖,给水产养殖业带来了重大的经济损失。乌鳢水泡病毒(snakehead fish vesiculovirus,SHVV)是从患病杂交鳢上分离到的一株弹状病毒,对乌鳢的养殖业造成严重的危害。至今,还没有高效防控该病毒的措施。研究病毒的致病机理及宿主对病毒的防御机制,对病毒的防控具有重要意义。
  自噬是真核细胞利用囊泡结构将细胞内需要降解的大分子物质或是损伤的细胞器转移到溶酶体进行降解的过程,旨在维持细胞处于稳定的状态。细胞自噬在病原微生物入侵宿主过程中发挥着不同的作用,病毒诱导的细胞自噬可以破坏病毒结构蛋白形成过程,或者将病毒粒子转运到溶酶体进行降解,进一步抑制病毒复制。而一些病毒反而可以利用细胞自噬逃避宿主免疫系统的清除作用,从而利于自身的增殖。本研究主要围绕SHVV感染与细胞自噬间的相互关系及相关机制展开,主要结果如下:
  1.微管相关蛋白1轻链3β(Microtubule-associated protein1 light chain3-beta, LC3B)基因的克隆、生物信息学分析及抗体制备。
  LC3B是细胞自噬的重要标记蛋白。根据本实验室测定的SHVV感染条纹月鳢细胞系(SSN-1)的转录组数据,我们克隆了乌鳢LC3B基因开放读码框,长度为378 bp,编码125个氨基酸,预测出理论分子量是14.8 kDa,理论等电点是5.23。与其他9个物种进行了同源性分析,发现乌鳢LC3B基因与草鱼和大西洋鲱的LC3B基因相似度最高,达到93%。我们构建了pET-32a-LC3B重组质粒,诱导表达、纯化该融合蛋白,随后使用纯化蛋白对兔进行免疫,获得抗乌鳢LC3B多克隆抗体。
  2.SHVV病毒粒子结构的电镜观察。
  收集SHVV感染SSN-1细胞24 h后的样品,经过常规透射电镜样品处理,在透射电子显微镜下观察,我们观察到子弹状的病毒粒子,分布在细胞内和细胞外,大小约为70×120 nm。
  3.SHVV感染诱导SSN-1细胞自噬。
  细胞自噬研究方法主要分为透射电子显微镜观察、激光共聚焦显微镜观察及免疫印迹等方法。我们利用以上三种方法依次证明SHVV感染SSN-1后可以诱导细胞自噬产生。在透射电子显微镜下,观察到典型的囊泡状结构;荧光显微镜下观察到明显的YFP-SSN-LC3B荧光点聚集现象;通过western blot检测,发现LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化明显增强。
  4.细胞自噬抑制SHVV增殖。
  细胞自噬常用激活剂和抑制剂分别为rapamycin和3-MA。首先用药物孵育SSN-1细胞,随后使用SHVV感染处理过的SSN-1细胞,研究自噬对病毒增殖的影响。分别检测SHVV-N基因的mRNA和蛋白表达水平,并且检测培养基中成熟病毒粒子titer(TCID50)。结果表明细胞自噬抑制SHVV的增殖。
  5.SHVV诱导细胞自噬机制研究。
  使用紫外灭活的SHVV孵育SSN-1细胞,发现灭活病毒仍然能激活细胞自噬,表明诱导细胞自噬不需要病毒的复制;随后构建SHVV结构蛋白pcDNA3.1真核表达质粒,转染SSN-1细胞,发现SHVV编码的糖蛋白(G)可以单独诱导细胞自噬。为了研究G蛋白诱导自噬的机理,合成G蛋白上多段相应的多肽,并使用合成的多肽孵育SSN-1细胞,发现G蛋白受体结合区的p340多肽片段可以诱导细胞自噬。
[硕士论文] 王业大
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:SVC是由SVCV引起的一种重要的病毒性传染疾病,可引起多种鲤科鱼类严重的出血症状以及死亡现象,给养殖业造成了重大损失。TRIM家族蛋白具有多种生物学功能,其抗病毒活性引起较多关注。本研究拟从天然免疫角度探究TRIM47对SVCV的作用,以及采用RNA测序手段探究SVCV与其宿主的相互作用机制,为发现更多SVCV靶标奠定的理论基础。具体研究内容如下:
  一、鲤TRIM47生物特性分析及功能初步探究
  1)对TRIM47的序列特征进行比对和聚类分析,以及对鲤TRIM47的时空分布进行检测;
  2)体外SVCV感染可以显著抑制TRIM47 mRNA水平,但不影响TRIM47蛋白水平;
  3) TRIM47体外真核表达呈均匀点状分布在细胞质,亚细胞定位显示TRIM47部分定位在线粒体上;
  4)过表达TRIM47可以显著抑制SVCV-G mRNA的合成,在SVCV刺激下可显著上调IFN1 mRNA水平。
  二、SVCV感染斑马鱼转录组分析
  1)模拟自然感染的温度条件,将水温控制在17℃,斑马鱼腹腔注射SVCV,获得了良好的感染模型;
  2) SVCV感染斑马鱼转录组分析,在脑中检测到382个差异基因、脾中926个差异基因;
  3) SVCV感染斑马鱼后GO富集到Biological process、 Cellular component和Molecular function三类生物过程;
  4) KEGG信号通路分析结果显示:SVCV感染,在脑中主要与InfluenzaA和Herpes simplex infection通路有关,脾中主要与Tuberculosis和Toxoplasmosis通路有关;
  5) SVCV感染斑马鱼后,脾中的基因3'和5'可变剪接事件显著增加;
  6)荧光定量PCR检测结果与测序结果基因变化情况基本一致;
  7)初步验证了差异基因RSAD2的可变剪接情况,RSAD2发生可变剪接事件中的外显子跳读。
[硕士论文] 贾路路
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水经济鱼类,在我国多个地区大规模养殖。但是随着草鱼养殖业的大力发展,草鱼的各类疾病频繁爆发,目前尚无健康有效的治疗方法,这成为草鱼养殖难以突破的瓶颈,严重阻碍了草鱼养殖业的可持续发展。在抵御各种病原体的入侵时,天然免疫系统发挥着至关重要的作用。
  TRIM(tripartite-motif protein)家族是机体先天性免疫的重要成员,在细胞的增殖、分化、肿瘤的抑制、病毒的抑制等方面发挥着重要的调控作用。TRIM家族蛋白,也称为RBCC家族蛋白,从N端到C端依次是RING结构域、B-box结构域、Coiled-coil结构域。在哺乳动物中TRIM32的RING结构域具有E3泛素连接酶的作用,可以调节信号通路的传导,参与机体的天然免疫反应。
  本论文以草鱼TRIM32为主要研究对象,旨在为草鱼疾病的防御与治疗方面提供进一步的理论依据。主要研究内容包括以下几个方面:
  1.利用PCR技术从草鱼的肝脏组织中克隆草鱼TRIM32基因的编码区全长,并翻译成对应的氨基酸序列。结果显示,草鱼TRIM32基因共1980 bp,编码660个氨基酸。
  2.对草鱼TRIM32进行结构域分析、核苷酸序列比对以及遗传进化树分析。结果显示,草鱼TRIM32具有TRIM家族3个典型的结构域,与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高,且遗传进化树分析也与斑马鱼TRIM32聚为一支。
  3.对草鱼TRIM32进行真核表达载体的构建,并通过间接免疫荧光和Western blotting分析草鱼TRIM32的表达与亚定位情况。结果显示草鱼TRIM32可以在EPC细胞中成功表达,主要以点状分布在细胞质中,而细胞核中的表达量较少。
  4.采用qPT-PCR检测草鱼TRIM32的组织分布,分析结果显示草鱼TRIM32在被检测的11个组织中均有表达,其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织。
  5.采用qPT-PCR检测草鱼TRIM32在不同胚胎发育时期的表达丰度,分析结果显示,草鱼TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(p<0.05),随后表达量下降,直到出膜后表达量再次显著性升高。
  6.利用双荧光素酶报告系统检测草鱼TRIM32对NF-κB信号通路的影响。检测结果显示,实验组是对照组的1.66倍,说明草鱼TRIM32能够激活NF-κB信号通路,诱导下游的炎症反应。
  7.构建了草鱼TRIM32原核表达载体,并制备了高效价的抗草鱼TRIM32的多克隆抗体。
[硕士论文] 郭亚飞
生物化学与分子生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:在哺乳动物中,白介素6(IL-6)是一个具有广泛生物学效应的细胞因子,它在免疫系统,神经系统,肝脏的再生以及代谢调控中发挥着重要的作用。IL-6发挥生理作用必须先结合其专一性受体(IL-6R),再结合第二个受体 gp130形成三聚体,进而起始胞内信号。虽然IL-6及其受体的功能在哺乳动物免疫系统中已广泛研究,但在硬骨鱼中,这方面的研究还比较缺乏。本论文以草鱼为模型,以重组表达草鱼IL-6蛋白为工具,研究IL-6R的性质以及它在炎症中扮演的角色。同时,由于IL-6R存在着跨膜和可溶胞外区两种形式,本论文还重组表达了IL-6R的可溶性胞外区(sIL-6R),并对其异于膜形式的性质进行了探索。
  本研究用毕赤酵母真核表达系统表达了草鱼IL-6蛋白,并对其活性进行验证;同时克隆得到了草鱼IL-6R全长cDNA序列,该序列全长2223 bp,其中ORF共1785 bp,编码594个氨基酸。多序列比对显示草鱼IL-6R的氨基酸序列与其他物种的一致性仅有38.03%-45%。组织分布结果表明IL-6R mRNA在头肾中的表达量最高;本研究用原核表达和变复性的方法获得了草鱼sIL-6R蛋白;制备和验证了草鱼IL-6及IL-6R抗体,并建立了草鱼IL-6R的ELISA方法。腹腔注射嗜水气单胞杆菌能够明显上调头肾和中肾中IL-6R蛋白的表达;在头肾白细胞中,LPS,poly I:C能够上调IL-6R mRNA的表达,而且poly I:C可促进sIL-6R蛋白的产生。与此同时,体外结合实验表明重组IL-6与sIL-6R蛋白可特异性结合。在头肾白细胞中, sIL-6R可增强IL-6对TNF-?、IL-10和SOCS3的mRNA表达的调控。
  以上实验结果表明 IL-6R在病菌感染草鱼的过程中扮演着重要的作用。利用重组草鱼IL-6和sIL-6R蛋白,我们发现在草鱼免疫细胞中sIL-6R能够增强IL-6的免疫调节作用。该研究首次探索了 IL-6R在鱼类炎症中的调控,揭示了 sIL-6R对IL-6免疫功能的影响,为防治草鱼病虫害提供理论依据。
[硕士论文] 张醴溪
水产养殖学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:由鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)引起的鳜虹彩病毒病是危害鳜养殖产业最主要疫病,而疫苗接种是预防该病最为有效的技术手段。在疫苗制备过程中,安全性和效力是评价疫苗质量重要指标,而灭活快速检验及抗原含量测定是评价灭活疫苗安全性和效力的关键技术,因此本论文针对ISKNV灭活疫苗制备中关键问题,开展了ISKNV灭活快速检验及有效抗原含量测定方法研究及应用,旨在提高ISKNV灭活疫苗生产效率和疫苗质量,取得的主要结果如下:
  1、从ISKNV感染CPB细胞转录谱中筛选并验证病毒早期基因ORF099基因表达量最高,以该基因转录本作为靶标,建立了基于荧光定量RT-PCR监测病毒mRNA的灭活快速检测方法。首先,以含ISKNV ORF099基因质粒作为模板,采用qPCR方法绘制了CT值与质粒拷贝数的标准曲线,其线性方程为CT=-3.421gx+39.455(R2=0.998),最低检测限为3拷贝/μL,重复试验结果显示组间和组内变异系数均小于2%。病毒转录本灵敏度实验显示在第7d即可从接种1个拷贝病毒的细胞中检测出ISKNV ORF099转录本。采用该方法对0.1%甲醛灭活72 h后的ISKNV样品接种CPB细胞可检测到ISKNV ORF099基因转录本,而0.1%终浓度甲醛灭活ISKNV在CPB细胞盲传三代未出现CPE,鱼体安全试验显示接种鱼体后无临床发病症状和试验鱼死亡,表明该方法灵敏度高于细胞盲传法和鱼体安全试验法。
  2、通过将ISKNV感染CPB细胞后所获得的病毒Unigene与病毒基因组比对筛选获得可能存在内含子的病毒基因,经RT-PCR验证确认ORF003L含有80bp内含子,该内含子命名为IN-3。跨IN-3内含子设计巢氏PCR引物扩增ISKNV感染CPB细胞后cDNA,建立了基于跨内含子设计引物检测病毒mRNA的灭活快速巢氏PCR检测方法。结果显示在第7d可从接种1个拷贝病毒的细胞cDNA样品中检测出209bp和289 bp两条带,说明该方法可排除样品中病毒DNA残留影响。采用该方法对0.1%甲醛灭活样品接种CPB细胞可检测到ORF003L基因转录本,而细胞盲传实验中未出现CPE,鱼体安全试验中无临床发病症状和试验鱼死亡,表明该方法灵敏度高于细胞盲传法和鱼体安全试验法。
  3、用蔗糖密度梯度离心纯化ISKNV病毒粒子,采用常规杂交瘤技术制备特异性单克隆抗体。利用ISKNV重组MCP蛋白筛选获得2株特异性的单克隆抗体株,分别命名为1C81B9和3B126B3,制备这2株单抗腹水,其效价为1∶106~1∶103,收集后的腹水选用Protein G-琼脂糖亲和层析柱进行纯化。以单克隆抗体株1C81B9作为包被单抗,生物素标记的单克隆抗体株3B126B3作为检测抗体,建立了ISKNV有效抗原含量测定的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法检测线性范围为:4.69~300ng/mL,最低检测限为0.9 ng/mL的抗原。用建立的方法检测3个批次的ISKNV灭活疫苗有效抗原含量,结果与灭活前病毒滴度呈正相关。
  4、采用建立的灭活快速检验方法和有效抗原含量测定方法优化了ISKNV灭活条件,制定了抗原的保存期。采用二乙烯亚胺(BEI)、甲醛和β-丙内酯(BPL)3种化学灭活剂在不同条件下对ISKNV进行灭活,结果表明0.2%甲醛和4% BEI在30℃灭活72h、0.1% BPL在4℃灭活6h即可彻底灭活ISKNV;有效抗原含量测定结果表明BPL制备的病毒有效抗原含量均高于另外两种灭活剂,灭活条件为采用0.1% BPL在4℃灭活6h。将制备的病毒抗原液分别置于4℃和-80℃条件下保存1、3、6、12个月后检测有效抗原含量,结果表明-80℃条件下保存的疫苗有效抗原含更高,且在6个月内疫苗有效抗原含量稳定,初步确定抗原保存期以-80℃条件下6个月为宜。
[硕士论文] 任雨薇
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:在鱼类养殖中,细菌性疾病造成的经济损失严重。为了应对细菌引起的鱼病,人们在过去多年使用各类抗生素来抑制细菌的生长和繁殖,由于用药不当,从而导致细菌耐药性的产生和逐渐增强,在鱼体内形成药物残留,破坏水体生态系统。为了解决这一难题,大家将目光转向了能改善水体环境,无药物残留,提高鱼类生长性能和免疫力的益生菌。枯草芽孢杆菌是在水产动物中广泛使用的益生菌之一,本实验室在草鱼的肠道内筛选出一株对嗜水气单胞菌等水产病原菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Ch9菌株)。本文研究了该枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌的影响。
  分析比较了不同接种量的枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌产生生长抑制的适宜接种量。在共培养中,当枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌的初始接种量为1×108CFU/ml和1×106 CFU/ml时,枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌在共培养条件下与单培养相比,生长均变缓,但均未出现十分明显的生长抑制。而当枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌的初始接种量为1×109CFU/ml和1×108 CFU/ml时,枯草芽孢杆菌在共培养和单培养下的生长不受影响,而嗜水气单胞菌在共培养4h之后,细菌数量显著减少,与单培养相比,生长受到显著的抑制。因此,枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌的初始接种量为1×109CFU/ml和1×108 CFU/ml是适宜接种量。
  将初始接种量为1×109CFU/ml枯草芽孢杆菌与1×108CFU/ml的嗜水气单胞菌和共培养,对嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌在共培养和单培养条件下,嗜水气单胞菌毒力基因转录水平,溶血活性以及对细胞的毒性进行了分析。结果表明,当嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌共培养,通过分析荧光定量的结果发现,嗜水气单胞菌的毒力基因包括aer,ahyB,emp,hcp基因的转录水平都出现下降。在培养6h和8h时,嗜水气单胞菌aer基因在共培养条件下表达量与单培养相比分别下降了18.01倍和3.05倍。在培养6h、8h和10h时,ahyB基因在共培养条件下表达量与单培养相比分别下降了2.07倍、1.43倍和3.07倍。在培养4h、6h、8h、10h和12h,嗜水气单胞菌hcp基因在共培养条件下的表达量与单培养相比分别下降了10.99倍、218.48倍、830.28倍、565.48倍和481.34倍。在培养6h和8h,嗜水气单胞菌emp基因在共培养条件下的表达量与单培养相比分别下降了1.76倍和1.46倍。当嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌共培养,共培养上清液对血细胞没有出现溶血现象,而嗜水气单胞菌单培养上清液随着培养时间的增加,对血细胞的溶血活性也在增强。这说明,当嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌共培养,嗜水气单胞菌溶血活性减弱。
  当通过测定细胞乳酸脱氢酶的释放量,发现在嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌共培养情况下,共培养上清液对CIK细胞系的细胞毒性显著低于嗜水气单胞菌单培养上清液对CIK细胞的毒性,说明,嗜水气单胞菌与枯草芽孢杆菌共培养,嗜水气单胞菌的细胞毒性减弱。利用RT-PCR方法检测了嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌共培养,两者的luxS基因的转录水平。结果表明,当嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌共培养,嗜水气单胞菌的luxS基因表达量显著下调,而枯草芽孢杆菌的luxS基因表达量显著上调。表明,枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌生长毒力抑制的益生作用可能与群体感应相关。
[硕士论文] 詹柒凤
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:NK-LYSIN是机体自然杀伤细胞(natural killer cells,NKL)和毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)分泌的小分子阳离子抗菌肽,同人类颗粒溶素granulysin是同源多肽,具有广谱的抗菌活性,对细菌、真菌、病毒、癌细胞等均有生物活性。组蛋白H2A是真核生物体细胞染色质中的一种结构蛋白,是先天性免疫的组成成分之一,其衍生的多肽片段的杀菌作用已成为目前的研究热点。
  团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的淡水养殖品种,随着养殖规模的扩大,集约化程度的提高以及养殖环境的恶化,导致各类疾病频发。其中,对团头鲂养殖影响最大的疾病是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的细菌性败血症,可造成鱼体各部位充血、溃疡、腹腔积水和肝脏发白等症状,从而导致鱼体大量死亡。另外,现阶段还没有很好的药物可以控制,养殖业中则主要使用抗生素提高鱼体免疫力,但抗生素会造成药物残留和细菌耐药性,严重影响水产业的发展和人类健康,新型抗菌药物的研发成为热点。
  本研究从团头鲂转录组中钓取到2个NK-lysin基因(nkla和nklb)和1个H2A基因,通过PCR扩增和测序验证其ORF序列,并分析序列特征。采用荧光定量PCR技术检测其在团头鲂胚胎发育不同时期以及成鱼组织和嗜水气单胞菌感染后免疫组织中的表达。构建团头鲂2个NK-lysin基因的原核表达载体,转入大肠杆菌中进行重组表达,并对其表达条件进行优化,为进一步研究NK-lysin的功能奠定了基础。本研究的主要结果如下:
  1.团头鲂3个抗菌肽基因(nkla、nklb和H2A)的序列分析
  nkla ORF全长369bp,编码122个氨基酸,DNAstar预测其等电点为6.71,分子质量为14kDa; nklb ORF全长411bp,编码136个氨基酸,DNAstar预测其等电点为6.72,分子质量为15.6kDa。多氨基酸序列比对分析显示,nkla和nklb的N端均含有信号肽,6个高度保守半胱氨酸,可形成3对分子内二硫键,以及1个SapB结构域,序列分析发现它属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族成员。系统进化分析显示,团头鲂NK-lysin基因与斑马鱼亲缘关系最近,其次是半滑舌鳎和斑点叉尾鮰。组蛋白H2A基因ORF全长387bp,编码128个氨基酸,DNAstar预测其等电点为10.92,分子质量为16.2kDa。H2A氨基酸序列不含跨膜结构域及信号肽,且其序列十分保守,不同物种间序列相似性极高。
  2.团头鲂3个抗菌肽基因在不同发育时期及成鱼各组织中的表达
  荧光定量PCR结果显示,nkla和nklb在胚胎发育的不同时期广泛表达。在胚胎发育的初始阶段,nkla和nklb呈低表达,而在出膜期时,nkla和nklb表达量快速上升。其中,nkla在眼球色素出现期达到最高表达,nklb在出膜后1d时达到最高值。H2A也在胚胎发育期广泛表达,且在出膜后7d达到最高值。
  在健康团头鲂各组织中,nkla在脾脏中表达量极高,为其他组织中的数百倍,而在肌肉、血中表达量极低,在肝脏、脑、肾脏、头肾、肠、鳃和心中均有明显表达;nklb则在肠中表达量相对较高,在脾脏、头肾表达相对较低,在其他组织中均表达。nkla和nklb不同的表达模式暗示着不同的NK-lysin可能存在功能上的分化。H2A在血中表达量最高,脑中其次,其他组织中表达量相对较低。
  3.团头鲂3个抗菌肽基因在嗜水气单胞菌感染后的表达
  嗜水气单胞菌感染后,团头鲂nkla和nklb两个基因在不同组织中的表达变化模式相似:在头肾中,nkla在感染后表达显著性下降,nklb则在4h、24h及120h时呈显著下降水平;在肝脏中,均在4h时上升到最高水平,而后回落;在脾脏中,则在72h升到最高水平,120h恢复正常;在肠中,nkla和nklb表达量在4h时显著降低,并分别在72h和24h时达到最高值,120h回到正常水平。nkla和nklb在主要免疫组织中的表达变化,暗示着它们可能在团头鲂抵抗嗜水气单胞菌侵染过程中发挥重要作用。H2A基因在肝脏和肠中的表达量均呈上升趋势,在脾脏和肾脏中,H2A的表达则是先呈下降趋势,而后显著上升。
  4.团头鲂nkla和nklb的原核表达
  成功构建了3种nkla和nklb的原核表达载体,转入到BL21(DE3)宿主菌中,获得原核表达菌株,对IPTG浓度、温度和诱导时间等各条件进行优化。在pET32a-NKLA和pET32a-NKLB重组表达体系中,融合蛋白NKLA只在沉淀中表达,NKLB则在上清和沉淀中表达,但该表达体系不稳定。而对于pET28a-NKLA和pET28a-NKLB表达体系,NKLA没有表达,NKLB在沉淀中只有少量表达。在pGEX-NKLA和pGEX-NKLB表达体系中,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量分别为38.2kDa和39.7kDa,且该表达体系较稳定。选择诱导时间为8h,在不同IPTG终浓度和各温度条件下,融合蛋白表达量没有明显差异,其中融合蛋白NKLA在37℃下IPTG浓度为0.05mmol/L时,目的蛋白占菌体总蛋白比率最高,为33.8%;NKLB融合蛋白在37℃下IPTG浓度为0.02mmol/L时,这一比率最高,为48.8%。
[博士论文] 张文婷
预防兽医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:许多囊膜病毒都能够编码基质蛋白,包括副粘病毒、正粘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。病毒的基质蛋白也被称为病毒装配“适配器”,因为它能介导病毒包膜或糖蛋白与病毒核糖核蛋白(RNP)复合物的相互作用,从而促进病毒基因组组装进新装配的病毒中。正粘病毒家族所有的成员,包括流感病毒A、B、C、索戈托病毒属,以及Isavirus,都编码基质蛋白,并称为M1。在A型流感病毒中,基质蛋白1(M1)在病毒的囊膜下聚集成一层蛋白层,帮助形成感染病毒的形状以及维持其结构的完整性。研究表明,流感病毒的M1蛋白能介导核衣壳的核输出以及随后将其包装到新的病毒粒子中,还能够介导病毒的出芽。尽管对于A型流感病毒M1蛋白的研究十分广泛及细致,但到目前为止,只有其N端结构域的晶体结构被解析出来。
  传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是一种能够导致养殖的大西洋鲑鱼高死亡率的重要的正粘病毒。ISAV和流感在病毒结构、基因组成、生活周期以及病毒编码的各种蛋白的功能上都有很多相似之处,是研究流感病毒蛋白的结构与功能的一个很好的可供选择的模型。
  为了从整体上更好地了解正粘病毒M1蛋白的结构和功能,本研究解析了ISAV的M1蛋白(ISAV-M1)全长的晶体结构,分辨率达到了2.6(A)。这是国内外首次报道正粘病毒基质蛋白的全长晶体结构。ISAV-M1的晶体结构表明:其含有一个N端结构域(N-domain)和C端结构域(C-domam),整体呈现一个肘形。虽然ISAV-M1的N-domain与A型流感病毒M1蛋白的N-domain在序列上相似度很低,但其在结构上却是相似的。ISAV-M1的C-domain通过一个延伸的Loop结构与N-domain相连,并且折叠成一个含有4个α-螺旋的螺旋束。在晶体中,ISAV-M1的单体组装成无限的二维晶格,这种结构特征与流感病毒完整的病毒颗粒中与膜相连的基质蛋白的结构类似。通过脂质体浮选实验,发现ISAV-M1是通过静电相互作用与膜结合的,并且找出了关键的膜结合位点是在N-domain上的K63/K66/K68。同时也证实ISAV-M1具有RNA结合活性。此外,用低温电子断层扫面检测ISA病毒粒子,发现ISAV-M1在病毒的包膜下面形成一层蛋白基质。将ISAV-M1的二维晶格拟合到断层扫描图片中,能够很好地与基质蛋白层的密度厚度相吻合,这说明本研究的二维M1晶格很好地模拟了真实状态下感染颗粒中的基质蛋白层。
  有研究表明,ISAV的NS1和M2都是I型干扰素拮抗剂。而对于M1或NEP的特性认识却非常少。此外,之前的研究称热休克同源蛋白70(Hsc70)能够与流感病毒的M1和NEP蛋白相互作用,为病毒的核糖核蛋白(vRNP)通过vRNP-M1-NEP复合物的输出提供帮助。因此,本研究检测了在单独表达或共表达的情况下,ISAV的M1、NEP蛋白以及Hsc70蛋白的细胞亚定位情况。同时,这三个蛋白的相互作用也用pull-down实验进行了验证。本研究的目的是阐明ISAV的M1蛋白和NEP蛋白以及细胞的Hsc70的亚细胞定位以及相互作用。结果表明:当M1、NEP以及Hsc70蛋白单独表达在杂交鳢(SSN-1)细胞中时,发现M1是同时定位在细胞质和细胞核中的,NEP则是只定位在细胞质中并且在细胞核周围聚集,而Hsc70是遍布在细胞质中且细胞核中没有。当这三个蛋白两两共表达时,我们发现M1和Hsc70都分别能够与NEP共定位在细胞质中并聚集在细胞核周围。而M1和Hsc70共表达时,其定位情况与单独表达时类似。与此同时,本研究还进行了pull-down实验来验证三个蛋白之间的相互作用。结果表明,NEP能够分别与M1和Hsc70相互作用,而M1和Hsc70之间的相互作用也能观察到,但是相对于NEP与Hsc70之间的相互作用要弱很多。本研究阐明了ISAV的M1和NEP蛋白以及Hsc70的亚细胞定位和相互作用。这些数据将会帮助我们对于ISAV的生命周期尤其是vRNP的输出过程有一个更好的理解。
[博士论文] 陈文捷
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:鱼类神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)也称为β野田病毒(betanodavirus),是野田病毒(Nodaviridae)家族的一员。NNV感染导致的疾病称为病毒性神经坏死症(viral nervous necrosis,VNN)或者病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathy and retinopathy, VER),最初分离自患病的海洋鱼类,现在已在120多种不同的养殖和野生鱼类中被报道,严重危害着水产养殖业。近年来,越来越多的证据表明NNV开始在淡水鱼类中流行,感染实验也表明很多淡水鱼类容易受到NNV感染。虽然各国学者在NNV感染的预防和治疗方面投入了大量的研究,但对NNV致病的分子机制还没有完全阐明。通过研究赤点石斑神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)感染敏感细胞系的microRNA(miRNA)表达谱和转录组测序,可以获得大量RGNNV和宿主相互作用的信息,这些结果将有助于了解RGNNV的复制和致病机制,进而为VER的综合防控提供新的策略。虽然目前已经建立了一些对NNV敏感的细胞系,但来自鱼类神经组织的敏感细胞系还很少,因此,寻找来自鱼类神经组织的NNV敏感细胞系是十分必要的。
  本研究首先以斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)鳍条细胞系(Grouper fin cells,GF-1)为对象,利用RNA-Seq技术(Illumina)测定了GF-1细胞在RGNNV感染后3和24小时(hour,h)的miRNA表达谱。随后分别研究了GF-1细胞和来自纹月鳢(Channa striatus)鱼苗的SSN-1细胞(striped snakehead fish cells)在RGNNV感染后3和24 h的转录组,在转录组分析的基础上,进一步对NNV感染导致的细胞凋亡途径进行分析,并对两个转录组进行了比较研究。我们还采用鳜脑细胞(Chineseperch brain,CPB),研究了CPB对RGNNV的敏感性,并在此基础上研究了鳜对RGNNV的敏感性。研究结果如下:
  1.通过solexa深度测序研究RGNNV感染后GF-1细胞的miRNA表达谱,利用miRDeep2 v2.0.5软件将测序结果与斑马鱼基因组比对,一共鉴定出了220种已知miRNA,预测了18种新的miRNA。利用IDEG6软件,分别在RGNNV感染后3和24 h的GF-1细胞中鉴定到了51和16种差异表达的miRNA(Differentiallyexpressed miRNA,DE-miRNA);对DE-miRNA的靶基因进行预测、功能注释及分析,这些靶基因与广泛的生理调控有关,如转录调控、氧化还原、蛋白水解、细胞凋亡和免疫应答等。通过随机挑选了6个新预测的miRNA进行RT-PCR验证,结果表明这些新的miRNA在GF-1细胞中能够表达。通过随机挑选了6个DE-miRNA进行qRT-PCR验证,这些DE-miRNA的表达趋势与测序结果一致,表明miRNA组测序结果可信;验证了4个DE-miRNA(miR-1,-30b,-150,-184)对RGNNV复制的影响,qRT-PCR和Western blot表明过表达这四种miRNA可以显著地促进RGNNV在GF-1细胞中的复制。
  2.通过HiSeq2500测序,一共从四个GF-1细胞样品中获得127,259,258 cleanreads,经De novo拼接一共获得了111,860条平均长度为624 bp的unigene;通过blast比对,一共有35,390 unigene(31.64%)得到注释。差异表达基因(Differentiallyexpressed gene,DEG)筛选表明,感染后3和24 h分别有226和117个DEG。进一步对凋亡通路的DEG进行分析,推测RGNNV诱导GF-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的Bax和Drp1蛋白来进行;对5个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,结果与HiSeq2500测序的结果一致,证实转录组结果是可信的;通过发光法检测Caspase-3,-8和-9的活性,结果表明RGNNV感染可以导致GF-1细胞中Caspase-3,-8,-9活性的显著升高。
  3.经HiSeq2000测序,一共从四个SSN-1细胞样品中获得253,338,544 cleanreads,经De novo拼接一共获得了93,372条平均长度为829 bp的unigene。通过blast比对,一共有18,974 unigene(20.32%)得到注释。DEG筛选表明,感染后3和24 h分别有2,640和3,211个DEG;对凋亡通路的DEG进行分析,结果表明RGNNV诱导SSN-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的EndoG蛋白来进行;对7个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,与转录组测定的结果相符,表明测序结果是可信的;通过Annexin V-FITC/PI和DAPI染色,证实RGNNV感染或过表达EndoG可以导致SSN-1细胞的凋亡。
  4.比较RGNNV诱导GF-1和SSN-1细胞凋亡的途径,在RGNNV感染GF-1和SSN-1细胞的转录组研究中,外源性凋亡途径相关基因的表达都没有发生显著的上调。在内源性凋亡途径方面,RGNNV感染后GF-1细胞中Bax以及Drp1的表达水平显著升高,而SSN-1细胞在RGNNV感染后,EndoG的表达水平显著升高,这三种蛋白都参与线粒体介导的细胞凋亡。此外,在内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激反应方面,RGNNV感染后,Bip的表达水平在GF-1和SSN-1细胞中都发生了显著上调,最终导致线粒体介导的细胞凋亡。由此我们推测RGNNV感染可以通过线粒体和内质网介导的凋亡途径来诱导细胞凋亡,具体的机制还需要进一步研究。
  5.评估了来自淡水鱼类鳜脑组织的细胞系CPB对RGNNV的敏感性。qRT-PCR检测表明RGNNV在CPB细胞中可以良好地复制。Annexin V-FITC/PI和DAPI两种染色途径证实RGNNV感染可以导致CPB细胞的凋亡。进一步评估鳜对RGNNV的敏感性,通过眼球注射,RGNNV可以感染鳜并导致鳜出现神经症状,表现为游泳异常;对鳜脑组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察,感染的鳜脑组织出现大量的细胞空泡化;电镜(electronic microscope,EM)扫描发现在感染的鳜脑组织里有大量紧密排列的病毒粒子,并且大量线粒体出现了肿胀,这一现象与线粒体膜电位损失是否有关还需要进一步的研究。对RGNNV敏感的淡水鱼类脑细胞株CPB的发现,将为RGNNV的致病性研究提供有力的工具。
[硕士论文] 吴凡
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国的“四大家鱼”之一,也是重要的经济淡水养殖鱼类。但在养殖过程中由于各种病害的影响使其成活率极低,给养殖人员带来的严重的经济损失。其中,由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵袭而引发的细菌性败血症是在草鱼养殖过程中严重危害其机体健康的疾病之一。主要组织相容性复合体(MHC)存在于所有的脊椎动物中,是机体免疫反应中参与抗原呈递的重要组成部分,其中包含许多不同的基因。本文中通过本地Blast来获取草鱼MHCⅠ区的基因组信息,并将其与人类MHC以及其他鱼类的MHCⅠ区在基因组层面上进行比对分析,了解MHC在不同物种中的共同点有助于进化分析,采用RT-PCR技术检测MHCⅠ区基因在健康草鱼各组织的表达情况,并通过实时荧光定量PCR检测草鱼在嗜水气单胞菌感染后4、12、24、48及96h,MHCⅠ区免疫相关基因在脾脏和肾脏中的表达情况,以为草鱼的抗病育种提供理论基础和科学数据,本文主要研究结果如下:
  1.草鱼MHCⅠ区基因组成
  经分析得到草鱼MHCⅠ区共有21个基因,全长为350Kb,其中包含3个MHCIa基因、5个PSMB基因、3个TAP2基因、2个TAPBP基因以及BRD2、FABGL、COL11A2、RXRB、KNSL2、ZBTB22、DAXX、 FLOT1这8个基因。
  2.草鱼MHCⅠ区与其他脊椎动物的基因组比对分析
  通过人类、大西洋鲑(Salmo salar)、草鱼、斑马鱼(Danio rerio)、青鲻(Oryziaslatipes)以及日本河豚(Tetraodontidae)的MHCⅠ区基因组比对发现了两个比较保守的共线性区域,根据它们所在的位置分为在人类中经典的MHCⅡ区和延伸的MHCⅡ区,其中经典的MHCⅡ区包含PSMB8、PSMB9、PSMB10、TAP2、BRD2、FABGL、COL11A2以及RXRB在内的8基因,延伸的MHCⅡ区包含KNSL2、ZBTB22、DAXX、 TAPBP以及FLOT1这5个基因,其中KNSL2、ZBTB22、DAXX、 TAPBP这4个基因在鱼类中有共线性关系。
  3.MHCⅠ区抗原呈递相关基因生物信息学分析
  通过NCBI查找得到草鱼TAPBP的396个氨基酸序列,通过SMART在线预测及Clustal X2比对分析发现其存在TAPBP保守的Ig V和Ig C区域,在N-端的31位和106位都有保守的半胱氨酸,在Ig V和Ig C这两个区域存在典型的半胱氨酸和色氨酸(C192、W211、C270和C314、W327、C378),人类中115位的半胱氨酸在鸟类和鱼类中被丝氨酸所代替。用DNAMAN软件将草鱼PSMB9的cDNA序列翻译得到190个氨基酸,用SMART在线预测得到1-178的氨基酸为Proteasome的蛋白结构域,通过Clustal X2软件进行氨基酸比对分析发现鱼类、哺乳动物和两栖类的Proteasome结构域高度保守。在NCBI中查找得到草鱼MHCⅠ的342个氨基酸,用SMART在线预测得其结构域,1-16位为信号肽,17-192位为MHCⅠ蛋白结构域,208-281位为IGc1功能区,297-319位为蛋白质跨膜区。通过MEGA7.0进行TAPBP、PSMB9和MHCⅠ这三个基因物种间的进化分析发现,草鱼均与鲤科鱼类的关系最近,与其他鱼类关系较远,与其他脊椎动物关系最远。
  4.草鱼MHCⅠ区基因的组织表达特征
  用半定量RT-PCR方法检测了草鱼MHCⅠ区BRD2、KNSL2、RXRB、TAPBP、FABGL、MHC Ia、PSMB6、PSMB9以及TAP2等9个基因在健康鱼各组织的表达情况。除了FABGL和PSMB6基因在肾脏表达量最高外,其它基因都在血液中的表达量最高。其中参与MHCⅠ类分子抗原呈递途径的TAPBP、MHC Ia、PSMB9以及TAP2基因的表达情况基本相同,而且都在免疫组织脾脏和肾脏中有较高表达。
  5.草鱼MHCⅠ区BRD2、MHC Ia、PSMB9以及TAP2在细菌感染后表达量变化
  通过实时荧光定量RT-PCR检测看草鱼肾脏和脾脏中MHCⅠ区免疫相关基因在嗜水气单孢菌感染后的表达情况。BRD2表达量分别在感染后12h和24h在肾脏和脾脏中达到最高;MHC Ia表达量在脾脏和肾脏中都先上升后下降,并都在24h达最大值;PSMB9表达量在脾脏先上升后下降,在12h达最大值,在肾脏中则先下降后上升,在24h达最大值;TAP2在脾脏和肾脏中整体呈先下降后上升的趋势,在24h都达最大值,并最后都回调至正常范围。
  本研究结果初步获得草鱼MHCⅠ区基因组结构及基因表达特征,为后续草鱼疾病防治以及抗病育种等研究奠定了理论基础。
[硕士论文] 罗伟
水产养殖 广西大学 2017(学位年度)
摘要:罗非鱼是中国淡水养殖的重要品种,主要在广东、海南、广西、云南及福建等省份养殖。近年来由于规模化养殖模式的推广和养殖环境恶化,导致病害频发,其中以无乳链球菌病的危害最大。目前尚无报道罗非鱼感染无乳链球菌的途径及侵染靶器官。开展罗非鱼感染无乳链球菌后的动态病理学及免疫酶活性变化研究工作,可以为更深入研究无乳链球菌的致病机理和防控药物研发提供理论依据。本研究采用注射、灌胃、浸泡三种方式对吉富罗非鱼进行无乳链球菌(HN016菌株)感染,观察三种方式感染后病原菌在吉富罗非鱼体内的分布规律及病理变化,同时研究不同种群罗非鱼感染无乳链球菌后血液及肝脏组织中免疫相关酶的变化规律。主要结论如下:(1)采用注射、灌胃、浸泡三种方式对吉富罗非鱼进行人工感染,其中注射和灌胃均出现典型的无乳链球菌病临床症状,注射组的死亡周期最短,感染后12h出现死鱼,感染后24h出现死亡高峰,死亡率最高,达到92.5%;灌胃组感染后5h出现死鱼,感染后48h出现死亡高峰,死亡率为90%;而浸泡组感染后仅出现轻微发病症状,没有出现死鱼。(2)在吉富罗非鱼感染无乳链球菌后体内病原菌分离方面,注射组和灌胃组感染后2h在脾脏、肝脏、前肾、胃、腮、皮肤和肌肉组织中均可分离出病原菌,感染后5h在两组的脑组织中均可分离出病原菌,感染后8h两组均已表现出明显的发病症状,此时体内各组织的病原菌浓度达到峰值;而浸泡组感染后8h才在体内各组织中分离出病原菌,但它们的浓度均低于相同时期的注射组和灌胃组。(3)对吉富罗非鱼进行注射、灌胃、浸泡三种方式感染无乳链球菌,取感染后2h、5h、8h、12h、24h的鳃、肠、脾脏、肝脏组织进行苏木精-伊红染色法(H.E染色法)染色及免疫组织化学定位。H.E染色结果显示:三种方式在感染后早期(2-5h)鳃、肝脏、脾脏、肠组织均已经出现明显病变,其中鳃表现为基部上皮细胞增生及鳃小片坏死,脾脏为含铁血黄素增多、巨噬细胞弥漫性浸润以及血管变细,肝脏为出现空泡变性、毛细血管破裂,肠为肠绒毛断裂、黏膜下层细胞结构被破坏;三种方式的病变程度依次为注射组>灌胃组>浸泡组。免疫组化定位结果显示:灌胃感染后病原菌强阳性信号先在肠组织出现,注射组为脾脏组织,浸泡组为鳃组织。(4)采用腹腔注射方式对吉富罗非鱼抗病选育系、百桂品系吉富罗非鱼及奥尼罗非鱼感染无乳链球菌(HN016菌株),分析感染后三种罗非鱼血液及肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、总抗氧化能力(T-AOC)等免疫相关酶活性变化。结果显示:三个不同种群罗非鱼肝脏组织ACP、AKP、LZM、SOD、T-AOC酶活力均呈现先升高再降低的趋势,而CAT酶活力呈现先下降再升高的趋势;而感染24h后CAT、ACP、AKP、LZM活力在三种罗非鱼血液中均表现出上升的趋势。
[硕士论文] 张梦慈
农业推广渔业 广西大学 2017(学位年度)
摘要:鱼类脂肪肝病使罗非鱼容易遭受外源致病因子导致感染而大规模死亡,给养殖者造成极大的经济损失,阻碍了罗非鱼养殖业的发展。本实验通过投喂高脂饲料建立罗非鱼非酒精脂肪肝模型为基础,进行了垂盆草对该类模型罗非鱼保肝药效作用的研究及对肝细胞和肾细胞细胞凋亡抑制作用的探讨,为垂盆草在预防高脂投喂导致的脂肪肝病提供了实验依据。根据前期研究,将实验用的罗非鱼平均分为3个组,每组设3个平行组。分别为正常组、高脂组、垂盆草组。每日的9:00am和5:00pm,进行连续6周的投喂。3个组的罗非鱼在投喂6周后随机抽取每组15尾,采集血清、观察脏器官的变化并采集肝胰脏组织样本,检测6周后实验罗非鱼脏器官损伤程度的主要生理生化指标,利用H.E染色技术观察肝脏细胞的变化情况,判断垂盆草针对以高脂饲料为基础投喂罗非鱼所致脂肪肝病的预防效果。采用TUNEL检测方法对石蜡包埋过的三组罗非鱼肝脏和肾脏切片通过荧光显微镜观察细胞变化情况,通过计算得出凋亡率并作比较。所得结果如下:经过6周的喂养,高脂组罗非鱼与基础组相比,从血液指标的测定上来看:高脂组提高了罗非鱼血清中的AST、ALT、TG、CHOL、LDH、TBA以及MDA水平(P<0.05),同时提高了CAT、SOD、T-AOC以及GLOB、ALP免疫指标的含量(P<0.05);而降低了ALB的含量。从肝胰脏指标的测定上来看:高脂组罗非鱼提高了罗非鱼肝胰脏中转氨酶活性、MDA含量以及肝胰脏和肠道中消化酶水平(P<0.05),也提高了抗氧化指标CAT、SOD含量(P<0.05);从肝脏和肾脏细胞凋亡检测可知:高脂组罗非鱼不论是肝细胞还是肾细胞,凋亡率上均显著高于基础组(P<0.05)。实验6周期间相对高脂组罗非鱼,从血液指标的测定上得出:垂盆草组显著降低了实验罗非鱼血清中的AST和ALT水平(P<0.05),并抑制了高脂饲料造成血清TG、CHOL、LDH和TBA水平的升高(P<0.05),对于抗氧化指标和免疫指标测定存在显著差异(P<0.05);从肝胰脏指标的测定上得出:降低了罗非鱼肝胰脏中转氨酶活性以及MDA含量(P<0.05),并提高了CAT、SOD、T-AOC水平(P<0.05);从肝脏和肾脏细胞凋亡检测可得:垂盆草组罗非鱼不论是肝细胞还是肾细胞,凋亡率上均显著低于高脂组(P<0.05)。然而垂盆草组各项指标与基础组相比基本没有显著差异(P>0.05)。通过本实验可知,基础组与高脂组所测得的结果趋同,普遍显著高于高脂组,说明了往饲料中添加垂盆草能预防吉富罗非鱼脂肪肝病,且药效作用显著。体现在减轻了吉富罗非鱼肝胰脏组织的损伤、促进组织修复、降低了血脂浓度以及提高了机体的抗氧化能力,同时降低了肝脏和肾脏的细胞凋亡率。
[硕士论文] 刘丹
生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:急性肝胰腺坏死病(AHPND)是一种新出现的严重的对虾病,并且它是由含有毒性质粒的弧菌菌株引起的。该病已经造成了全世界对虾养殖业的大规模减产。所以一种高效准确的检测方法对于AHPND致病菌的检测和预防至关重要。在本研究中,基于副溶血弧菌OmpU建立了免疫磁珠捕获-PCR的方法用于检测AHPND致病菌株。得到的研究结果如下:
  首先通过对AHPND致病菌外膜蛋白OmpU进行基因克隆,得到基因序列,然后对弧菌OmpU进行生物信息学分析,发现其在弧菌中高度保守,并且种内的保守性更高,存在多个共同抗原表位,所以推测OmpU在弧菌中具有交叉免疫原性,可以作为弧菌免疫分离的靶标。
  进一步用已有的副溶血弧菌来源的OmpU的异源表达重组工程菌对目标蛋白进行表达纯化及验证后,制备多克隆抗体。然后用Western blotting和Whole cell ELISA分析副溶血弧菌OmpU在弧菌种内及种间的免疫学特性,结果显示副溶血弧菌OmpU抗体能与包括AHPND致病菌在内的弧菌产生种内、种间的交叉反应,与非弧菌细菌不产生或产生较弱的反应,同时Whole cell ELISA也证实了OmpU抗体能够识别弧菌的OmpU抗原表位。综合说明弧菌OmpU是一种交叉抗原,可以作为免疫磁珠分离的靶标,其抗体可以用来制备免疫磁珠分离弧菌。
  以外膜蛋白OmpU用作免疫捕获靶标分离AHPND病原体,然后以AHPND质粒的两个毒性基因(pirA和pirB)的特异性片段作为PCR引物,研究建立弧菌免疫磁珠捕获-PCR检测体系。本研究首先评价了该体系检测性能:对制备的免疫磁珠进行了捕获效率的检测,发现对于AHPND致病菌的捕获效率均大于90%,并且纯培养的检测灵敏度均为101CFU/mL;而干扰实验表明在捕获缓冲液pH为3至9和盐浓度为1%至5%之间时免疫磁珠捕获-PCR检测体系仍然稳定;在非AHPND致病菌存在的情况下检测灵敏度没有显著差异。
  进一步,通过实验室模拟建立水,沉积物和虾样品的人工感染模型,评价了免疫磁珠捕获-PCR检测体系的灵敏度仍然可达到相同的101CFU/mL。最后,在对实际环境样品检测的过程中,评价了该检测体系的可靠高效,并且在检测中分离患病对虾体内的细菌时得到两株AHPND致病菌株,经鉴定该菌株为哈维氏弧菌和副溶血弧菌。因此,该方法可用于海洋和水产养殖业中对于AHPND致病菌的快速检测,进一步实现预防和监测水产养殖中的AHPND传播。
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