绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 9
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 180 条结果
[硕士论文] 李志锋
植物病理学 广西大学 2016(学位年度)
摘要:随着我国豆类种子进口量的飞速增长,种子携带检疫性细菌风险日益加大,严重影响我国豆类产业安全生产。本研究拟以豌豆细菌性疫病菌、菜豆晕疫病菌、菜豆普通细菌性疫病菌和菜豆细菌性萎蔫病菌等4种重要植物原细菌作为靶标菌,首次集成创新利用琐式探针和液相悬浮芯片两项技术优势,研究搭建豆类重要植物病原细菌快速高通量核酸检测技术平台,以替代过去对单个细菌进行逐一检测的传统方法,大幅提高检测效率,解决我国豆类种子进境过程种携带的外来有害生物入侵风险管理和预防控制,以及快速通关等难题。本研究主要成果如下:
  1)首次设计了豌豆细菌性疫病菌、菜豆晕疫病菌、菜豆普通细菌性疫病菌和菜豆细菌性萎蔫病菌等4种重要病原细菌的锁式探针,通过优化连接反应、消化反应、滚环扩增反应体系条件,构建了基于锁式探针的豌豆细菌性疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌和菜豆疫晕病菌等4种单重滚环扩增检测体系,并评估其特异性和灵敏度。结果表明:4种单重滚环扩增检测方法能够分别特异地检测对应的靶标菌,而其他阴性对照菌株均无法检出,有较高的特异性;其中豌豆细菌性疫病菌、菜豆晕疫病菌和菜豆细菌性萎蔫病菌单重滚环扩增检测灵敏度与常规PCR灵敏度持平,分别为600 fg/μL、600fg/μL和4.34pg/μL;而菜豆普通细菌性疫病菌单重滚环扩增灵敏度为38.3fg/μL,比常规PCR灵敏度高出1个数量级。
  2)首次建立了豌豆细菌性疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、菜豆疫晕病菌和菜豆普通细菌性疫病菌等4重滚环扩增方法并结合液相悬浮芯片检测技术,实现了在同一反应体系中同时、快速检测出4种细菌,评估其检测体系的特异性、灵敏度、稳定性。结果表明:该检测体系能够同时特异地检测到4种或其中某几种靶标菌,检测豌豆细菌性疫病菌的DNA和菌悬液灵敏度分别为4.85pg/μL和1.6×104cfu/ml,检测菜豆疫晕病菌的DNA和菌悬液灵敏度分别为874 fg/μL和1.5×103cfu/ml,检测菜豆普通细菌性疫病菌DNA和菌悬液灵敏度分别为486fg/μ L和2.3×103cfu/ml,检测菜豆细菌性萎蔫病菌的DNA和菌悬液灵敏度分别为1.06pg/μL和1.1×104cfu/ml;组内重复试验变异系数小于7.2%,具有良好的重复性。
  3)通过系列梯度浓度的纯菌悬液混合健康种子浸泡液检测试验中,常规PCR仅能检测到100倍菌悬液处理液的菜豆普通细菌性疫病菌,而其他稀释倍数的处理以及其他靶标菌的处理液均无法被检测出;而四重液相检测可以在一个反应内同时检出100、101倍菌悬液处理液中的豌豆细菌性疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、菜豆疫晕病菌、菜豆普通细菌性疫病菌,在102倍菌悬液处理液中检测到菜豆细菌性萎蔫病菌和菜豆普通细菌性疫病菌,结果表明该四重检测体系比常规PCR更适合实际带菌种子检测,且检测灵敏度和效率更高。
[硕士论文] 白宗师
植物保护学 华南农业大学 2016(学位年度)
摘要:水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyiChristie,1942)和菊花叶枯线虫(Aphelenchoides ritzemabosi(Schwartz,1911)Steiner&Buhrer,1932)同为滑刃属(Aphelenchoides Fischer,1984)的重要植物病原线虫,能分别危害多种作物,是一些国家或地区的植物检疫性有害生物。滑刃属线虫形态相似,传统形态学方法鉴定困难、操作复杂、耗时耗力,对检测鉴定人员的专业水平要求程度高,在检疫和监测工作中迫切需要具备这两种线虫的分子检测鉴定技术。环介导等温扩增(LAMP)具有快速、检测结果肉眼可见、不需要特殊仪器的特点。本研究基于水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的18S核糖体RNA基因分别设计对这2种线虫进行LAMP的特异引物,并利用这2个LAMP引物研究建立具有特异性强、稳定性好、灵敏度高和可操作性强的水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫LAMP检测方法,研究结果如下。
  获得了水稻干尖线虫LAMP引物 B77t和菊花叶枯线虫LAMP引物R81t,B77t包括了一对外引物、一对内引物和一对环引物共六条引物,R81t包括了一对外引物、一对内引物和一条环引物共五条引物;建立了基于引物B77t和引物R81t并采用钙黄绿素染料检测LAMP反应结果的水稻干尖线虫LAMP和菊花叶枯线虫LAMP检测方法。利用这2种线虫的LAMP检测方法能分别从不同目、不同科、不同属以及同属不同种类的线虫中特异的检测出水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫,能稳定的检测鉴定同种线虫的不同种群以及不同发育虫态的个体,对水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的检测灵敏度分别达到1/1000和1/100单条虫DNA;另外,这2个LAMP检测方法,还成功从种类混合的线虫样品中和植物组织样品中直接检测目的线虫,可以省略分离线虫的步骤,达到简便、准确和快速鉴定的目的。
  本研究为水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的快速鉴定和早期诊断提供了一个新的检测方法,其具有准确、灵敏、稳定、反应结果肉眼可见和实用性强的优势。为口岸检疫、调运检疫和产地监测中的水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的快速检测鉴定提供了有效的手段,对阻止这2种植物病原线虫的传播扩散具有重要意义。
[硕士论文] 高雪萌
农业昆虫与害虫防治 西南大学 2016(学位年度)
摘要:病媒生物是传染病传播的重要载体,它不仅在某一地区和国家发生危害,更可借助交通工具、集装箱、货物、邮件等在国际口岸间传播,对口岸地区的卫生安全造成严重威胁。浙江温州七里港码头和温州龙湾国际机场是浙南地区的重要国际港口,近年来出入出交通工具、人员、集装箱发展迅速,加之黄热病、寨卡病毒等虫媒传染病暴发,使疫情传入我国的风险不断增加。本学位论文为有效防止病媒生物及虫媒传染病经国境口岸传入和传出、维护国门生物安全,于2012-2015年在温州七里港口岸和温州龙湾国际机场系统地收集病媒生物,获得了温州口岸病媒生物的种类、数量、分布和季节变化等资料。同时,面对口岸病媒生物防控工作的新挑战,本学位论文利用高通量测序技术对重要病媒生物黑胸大蠊Periplaneta fuliginosa Serville和澳洲大蠊P.australasiae(Fabricius)进行了转录组测序和初步分析工作,旨在为今后深入开展相关研究提供基础数据。主要结果如下:
  1.温州口岸病媒生物本底调查
  2012-2015年间,在温州七里港码头共捕获病媒生物标本18866号,隶属9科23属33种。其中,鼠形动物72号,隶属2科4属6种,各年度平均密度分别为0.78%、1.31%、0.71%和0.46%,9月和12月是活动高峰期,优势种为臭鼩鼱Suncus murinus(Linnaeus,1766),占比75.00%。蚊类5436号,隶属2科4属6种,各年度平均密度分别为4.04号/(台*小时)、7.93号/(台*小时)、8.37号/(台*小时)和6.15号/(台*小时),夏季为活动的高峰时期,优势种为致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus Say,1823,占比69.24%。蝇类13355号,隶属4科14属20种,各年度平均密度分别为104.00号/笼、253.80号/笼、151.94号/笼和274.50号/笼,活动高峰为7月,以大头金蝇Chrysomyia megacephala(Fabricius,1724)、丝光绿蝇Lucilia sericata(Meigen,1826)为主,分别占比50.85%和28.79%。
  2012-2015年间,在温州龙湾国际机场共捕获病媒生物标本35515号,隶属10科19属29种。其中鼠形动物95号,隶属2科4属6种,各年度平均密度为1.08%、0.91%、1.67%和0.72%,高峰期集中在6-8月,优势种为臭鼩鼱,占比42.11%。蚊类5342号,隶属2科3属5种,各年度平均密度分别为6.56号/(台*小时)、7.49号/(台*小时)、7.47号/(台*小时)和3.22号/(台*小时),活动高峰集中在夏季,优势种为致倦库蚊,占比74.22%。蝇类20423号,隶属4科10属14种,各年度平均密度分别为312.61号/笼、257.00号/笼、276.67号/笼和288.33号/笼,活动高峰时期为7月,以大头金蝇和丝光绿蝇为主,分别占比59.91%和24.29%。蜚蠊9655号,隶属2科2属4种,各年度平均密度分别为8.36号/张、8.89号/张、8.83号/张和5.88号/张,发生高峰期为5-6月,优势种为德国小蠊Blattella germanica(Linnaeus,1767),占比96.99%。
  2.温州口岸输入性病媒生物调查
  2012-2015年间,在温州口岸入境集装箱共截获输入性病媒生物标本823号,隶属4目10科19属31种,以蝇类为主,占80.07%,其次为蜱(10.57%)和蜚蠊(8.51%),蚊类和鼠类占比较少。截获病媒生物的集装箱来源于35个国家和地区,其中占比最高的5个国家和地区为:宁波内支线、南非、美国、乌拉圭和澳大利亚,货物主要为盐湿牛皮。截获病媒生物的高峰集中在6-10月。发现9种非本地种的输入性病媒生物,分别为绯胫纹蝇Graphomya rufitibia Stein,1918、厚环黑蝇Ophyra spinigera Stein,1910、巴浦绿蝇Lucilia papuensis(Macquart,1842)、古铜黑蝇Ophyra aenescens(Wiedemann,1830)、凯氏酪蝇Piophila casei(Linnaeus,1758)、蓬勃花蜱 Amblyomma pomposum D?nitz,1909、图兰璃眼蜱 Hyalomma turanicum Pomerantsev,1946、丽表花蜱Amblyomma lepidum(D?nitz,1808)和彩饰花蜱Amblyomma variegatum(Fabricius,1794)。
  2012-2015年间,在温州口岸入境船舶上共截获输入性病媒生物标本80号,隶属2目6科10属14种,主要包括蝇类和蜚蠊,分别占52.50%和47.5%。截获病媒生物的船舶来源于10个国家和地区,船港籍为中国、中国香港和巴拿马的船舶携带输入性病媒生物较多,截获高峰主要集中在5-6月和9-10月。发现3种非本底种的输入性病媒生物,包括蓝翠蝇、厚环黑蝇和凯氏酪蝇。
  3.黑胸大蠊和澳洲大蠊转录组分析
  利用illumina测序技术对黑胸大蠊Periplaneta fuliginosa Serville,1839和澳洲大蠊Periplaneta australasiae(Fabricius)进行了转录组测序。其中,黑胸大蠊转录组信息数据量为13.63G,共获得54964个转录本,总长度57753395bp;进一步分析后获得39576个unigene基因,总长度32297597bp,最长27693bp,平均长度816bp。将unigene依次在Swiss-Prot、NR、KEGG、COG和Pfam等公共序列数据库进行比对,共获得61167个注释结果。黑胸大蠊SNP置换(transition)33955个,颠换(transversion)16561个,筛选获得2666条微卫星序列。澳洲大蠊转录组信息数据量为7.19G,共获得29160个转录本,总长度21385175bp;进一步分析后获得24404个unigene基因,总长度16583410 bp,最长10853bp,平均长度679bp。将unigene在Swiss-Prot、NR、KEGG、COG和Pfam等公共序列数据库进行比对,共获得45476个注释结果。澳洲大蠊SNP置换(transition)21234个,颠换(transversion)11154个,筛选获得1543条微卫星序列。
[博士论文] 卢劲竹
农业电气化与自动化 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:植物病害是指植物在生物或非生物因素的影响下,发生的形态、生理和生化上的病理变化,会阻碍植物正常生长、发育和结果的进程。精细化管理是全球农业发展的必然趋势,其技术基础是农田信息的获取。其中如何快速实时获取植物病害信息,是实现农业精细化管理,提高农业产量的关键问题。
  本文以果蔬植物(番茄、草莓)为研究对象,利用高光谱成像技术和荧光成像技术,选择容易在南方湿热地区传播的叶部病害(黄化曲叶病、晚疫病、轮纹病、疮痂病和炭疽病),通过连续4年(2012~2015年)的试验研究,实现了植物叶部病害的实验室和田间检测,包括4类侵染性叶部病害叶片的早期检测和病害不同程度的分类。重点研究了基于叶片的光谱、纹理和叶脉特征的检测理论,实现了以此三类特征为依据的无病症黄化曲叶病叶片的早期检测。基于实验室内的理论研究,提出了田间环境下基于光谱特征的叶部病害检测方法,搭建了田间光谱数据采集装置并实现了田间炭疽病叶片的早期检测和不同病害程度炭疽病叶片的分类。植物病害的精细化管理,对提高南方果蔬的产量和品质具有重要意义。本文得出的研究方法及结论为其他同类植物及其叶部病害的快速实时诊断奠定了较为扎实的理论基础。
  主要内容和结论为:
  (1)基于光谱特征的植物叶部病害的检测。
  应用高光谱技术,在实验室环境下采集了黄化曲叶病番茄叶片的反射光谱(400~1000nm),对叶片层面运用植被指数(vegetation indices,VI),提出了两类光谱特征的计算方法,结合二元线性回归(binary logestic regression,BLR),对比了两类光谱特征病害叶片的检测效果。结果表明:结合近红外波段的波长的光谱特征(720/840nm和NBNDVI),可以将健康和病害叶片的检测准确率均提高到85%以上。以番茄黄化曲叶病为例,提出了一种光谱特征的提取计算方法,并实现了基于光谱特征的植物叶部病害的检测。
  (2)基于光谱特征的植物叶部不同病害程度的分类。
  应用高光谱技术,在实验室环境下采集了感染不同种类病害(晚疫病、轮纹病和疮痂病)的番茄叶片的反射光谱,以光谱数据预处理-光谱特征计算-分类算法分类的光谱分析技术路径,利用主成分分析法(principal component analysis,PCA)对光谱特征进行筛选、组合,并比较了不同组合下K最邻近法(K nearnest neighbor,KNN)对病害不同病害程度的叶片进行分类。结果表明:采用光谱特征和PCA-KNN算法的分类方法,基于不同的光谱特征组合的最优结果中,健康叶片、病害早期叶片和病害晚期叶片的分类准确率均可以达到100%,对4类叶片的分类准确率和总分类准确率最高均高于90%。在实现病害检测的基础上,进一步以番茄晚疫病、轮纹病和疮痂病三种不同病害程度的叶片为对象,实现了基于光谱特征的植物不同病害程度的分类。
  (3)基于图像纹理特征的植物叶部病害的检测。
  在前期基于光谱特征的植物病害检测的基础上,进一步重点研究了基于图像纹理特征的植物病害检测方法。提取了特征波长和波长比值的图像,采用掩膜法分割背景提取叶片部位,分析了叶片部位图像的灰度直方图和全部样本的平均灰度值分布情况,运用了灰度共生矩阵(grey level co-occurrence matrix,GLCM)提取叶片图像的纹理特征,将Lenven检验选出的具有显著性差异的纹理特征作为分类算法的输入值,比较了ROC-约登指数法、K最邻近法(K nearnest neighbor,KNN)和逐步判别分析法(stepwise discriminant analysis,SDA)3种算法的检测效果。结果表明:受黄化曲叶病毒感染的叶片的灰度直方图中存在两个峰值,病害叶片灰度图像平均灰度值的分布比健康叶片灰度图像的更分散;3类分类算法中,ROC-约登指数法取决于单一的特征参数而缺乏唯一性,且该方法对于特征参数的评价标准较高,其结果受特征参数的影响较大;KNN算法的准确率较高(91.2%~100%),且该算法受特征参数的影响较其他两者更低;在SDA算法的计算过程中需要不断筛选、添加特征参数,从而综合各个特征参数的优缺点,得到最优结果,因而其分类准确率最高(100%),但是同时存在计算过程复杂、耗时等缺陷。以番茄黄化曲叶病为例,实现了基于图像纹理特征的植物叶部病害的检测,其中SDA算法的准确事最高,KNN算法受特征参数的影响较低,且该方法弥补了基于光谱特征方法中的感兴趣区域的限制性。
  (4)基于叶脉特征的植物叶部病害的早期检测。
  在光谱分析中发现了病害叶片的“红边移动”现象,创新性地提出了基于叶绿素荧光成像的黄化曲叶病早期检测分析方法。用430 nm的光源激发叶片叶绿素荧光,采集690 nm波段的叶绿素荧光图像。运用自动迭代阈值法分割背景,提出了击中/击不中变换(hit ormiss transiformation,HMT)和灰度共生矩阵(grey level co-occurrence matrix,GLCM)结合的叶脉特征的提取方法,通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)及曲线下的面积(area under the curves,AUC)筛选纹理和叶脉特征,并比较了筛选前后K最邻近法(K nearnest neighbor,KNN)、Fisher判别分析法(Fisher discriminant analysis,FDA)和二元线性回归法(binary logestic regression,BLR)3种算法的检测效果。结果表明:基于叶脉特征的KNN算法解决了基于纹理特征的健康叶片的分类问题,其分类准确率为90.9%。以番茄黄化曲叶病为例,提出了一种计算叶脉特征的方法,可以实现植物叶部病害的早期检测,同时引入KNN算法的叶脉特征的检测方法克服了基于纹理特征对健康叶片分类存在的问题。
  (5)田间环境下植物叶部病害的早期检测和不同病害程度的分类。
  基于实验室研究的基础,搭建了基于高光谱技术的田间试验设备,运用同一设备分别在田间和实验室环境下采集了草莓炭疽病叶片的反射光谱,计算叶片的光谱特征,采用判别分析法评价了田间和室内光谱数据的分布情况,比较了田间数据集中K最邻近法(Knearnest neighbor,KNN)、逐步判别分析法(stepwise discriminant analysis,SDA)和Fisher判别分析法(Fisher discriminant analysis,FDA)3种算法对田间采集叶片的分类效果,并与实验室环境下该方法的检测效果进行了对比。结果表明:在田间数据集中,3种分类算法对健康叶片的检测准确率均一般,但是对两类病害叶片进行分类时,基于平衡样本数量的KNN表现出明显的优势,尤其是对有病症叶片的分类准确率可以达到93.3%,即实验室数据集的分类效果。以草莓炭疽病为例,实现了田间环境下叶部病害的早期检测和病害不同程度的分类。
[硕士论文] 蔡怡
生物化学与分子生物学 宁波大学 2016(学位年度)
摘要:根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物病原线虫中分布最广、危害最严重的类群之一,几乎能侵染绝大部分高等植物。在我国,根结线虫(非中国种)已被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》,建立快速有效的检测方法对于防止外来物种进入我国有重要意义。本研究将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,同时分别以山茶根结线虫(M.camelliae)和苹果根结线虫(M.mali)核糖体DNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,建立了两种LAMP-LFD新技术,分别可于25min和45min内特异性地检出目标种。其针对山茶根结线虫和苹果根结线虫基因组DNA的灵敏度分别可达4pg/μL和1pg/μL,针对单条2龄幼虫的检测灵敏度为1/1000条2龄幼虫基因组DNA。在此基础上结合已经公布的象耳豆根结线虫(M.enterolobii)检测体系,确立了LAMP反应的统一体系和反应条件,据此筛选北方根结线虫(M.hapla)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和南方根结线虫(M.incongnita)的最佳引物组合。继而将LAMP技术与微流体芯片技术相结合,建立了可同时检测山茶根结线虫等7种根结线虫的等温扩增微流体芯片检测技术。利用该技术只需一次加样,即可在1h内完成7个指标的同步检测及结果判读,其针对目标种基因组DNA的检测灵敏度可达0.18~18.2pg/μL,针对单条2龄幼虫的检测灵敏度为1/100~1/1000条根结线虫的基因组DNA。实际样本检测结果表明,与传统的形态学检测相比,该方法的临床敏感性及临床特异性分别为93.75%和94.74%。本研究建立的重要根结线虫等温扩增碟式芯片检测体系对样本和试剂消耗少,操作简单,可实时同步检测7个病原指标,因此有望在各个基层的检验检疫机构中普及使用。
[硕士论文] 王玉生
入侵生物学 中国农业科学院 2016(学位年度)
摘要:粉蚧属半翅目Hemiptera、粉蚧科Pseudococcidae,是一类重要的世界性检疫性害虫。粉蚧类害虫种类繁多,已知种类2000余种;且体形微小、形态多样、寄主范围广、隐蔽性强,极易随国际贸易活动传播扩散,给农林业生产带来了巨大威胁。通常,口岸截获的粉蚧多为若虫或残体,加之隐存种/复合种的存在和较小的近缘种间差异,严重影响了基于形态学特征的粉蚧类害虫识别鉴定的准确性和时效性。本研究以线粒体COI基因和核糖体28S rRNA为靶标,研究探讨了双基因DNA条形码在粉蚧鉴定中的作用,评价了该技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧的鉴定有效性;同时,针对重大检疫性害虫木薯绵粉蚧研发出了其种特异性检测鉴定技术体系。具体研究结果如下:
  (1)粉蚧类昆虫全基因组DNA提取方法的评价研究。以雌性成虫、卵、各龄期若虫等为对象,分析比较了8种DNA提取方法,明确了SDS法最适于粉蚧类害虫高龄若虫和雌成虫DNA提取,DeBarro法适于卵和低龄若虫DNA提取,有效解决了粉蚧类害虫体表蜡质较厚,DNA得率不高的难题。
  (2)双基因条形码技术在我国常见粉蚧鉴定中的应用。以来自国外11个种群、国内93个种群的9属22种粉蚧461个个体为对象,以COI基因5’端和28S基因D2-D3区段为靶标,通过碱基序列测定和分析,以及种内种间遗传距离计算,并同时整合数据库中高质量的相关种的靶标序列,分别构建系统发育树。结果显示,22种粉蚧的COI基因5’端序列具有48个单倍型,而28S基因D2-D3序列则具有33个单倍型。当以COI基因5’端序列为靶标时,22种粉蚧的种内遗传距离为0.0000~0.0160,平均为0.0034;种间遗传距离均大于2%,为0.0220~0.1780,平均为0.0921;种间遗传距离是种内遗传距离的27.1倍;且种内遗传距离与种间遗传距离之间不存在重叠区域。在基于COI-5’序列构建的系统发育树中,各物种均具有独立的进化分支。当以28S基因D2-D3区段为靶标时,部分属内十分保守,种内遗传距离与种间遗传距离之间存在重叠现象,不能对部分近缘种进行有效区分;而属间变异相对较大。同时,研究还显示,大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧可能存在隐存种或复合种;而粉蚧属可能存在多起源现象。进而表明,COI基因较28S基因更适合于种间的物种鉴定;而COI基因和28S基因的联合应用,有利于提高DNA条形码技术对粉蚧类害虫的鉴定能力,实现对粉蚧类害虫的准确识别与鉴定。
  (3)DNA条形码技术对近缘种粉蚧-重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧和土著种柑橘臀纹粉蚧的鉴定有效性研究。以旅检截获的36头大洋臀纹粉蚧为对象、其近缘种柑橘臀纹粉蚧为参照,序列分析表明,当分别以 COI基因5’端和3’端序列为靶标时,截获大洋臀纹粉蚧的碱基序列与数据库中靶标种的序列相似性分别为100%和99~100%,而与近缘种柑橘臀纹粉蚧的相似性分别为97~98%和96~98%;且大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧分别存在5个和12个稳定的物种特异性鉴别位点;系统发育分析显示,截获的大洋臀纹粉蚧均与数据库中的靶标种聚为一支。当以28S基因D2-D3区段序列为靶标时,臀纹粉蚧属各物种间高度保守,无法区分大洋臀纹粉蚧与其近缘种柑橘臀纹粉蚧;种间遗传距离仅为0.004。此外,进一步的物种识别软件评价结果显示,基于COI基因5’端和3’端序列的鉴定结果完全正确,而基于28S基因D2-D3区段序列的鉴定结果却存在45.2~61.9%的模糊鉴定。表明,基于COI基因5’端和3’端的DNA条形码技术完全可用于大洋臀纹粉蚧的准确鉴定及检测监测,对有效阻截其入侵和进一步扩散蔓延意义重大。
  (4)重大潜在入侵害虫木薯绵粉蚧的快速PCR检测技术研究。基于测序获得的COI基因5’端序列,设计木薯绵粉蚧的种特异性SS-COI引物1对(PMSSZW-1F/PMSSZW-1R),其扩增片段大小为353 bp;以我国口岸经常截获的扶桑绵粉蚧等8种粉蚧为参照,研究验证该引物对的种特异性,以及检测灵敏性和检测阈值。结果显示,该引物对只对木薯绵粉蚧具有扩增能力,对我国口岸经常截获的其他8种粉蚧不具扩增效果;同时,对不同虫态、龄期、成虫残体以及来自不同寄主植物的木薯绵粉蚧亦具良好的扩增效果,其最低检出阈值为135.22±10.41 pg/μL(相当于1/20480头雌性成虫)。木薯绵粉蚧的种特异性快速检测技术具有快速、可靠、准确、灵敏的特点,能大大提高口岸检验检疫效率,该技术体系的建立为木薯绵粉蚧的检测、监测与有效阻截提供了技术支撑,对保障我国木薯产业的健康发展具有重要意义。
  本研究围绕粉蚧科昆虫种类多、体形小、存在多型、多态,对农林业生产威胁巨大,却难以快速准确识别的问题,研究构建了较为完善的粉蚧科双基因DNA条形码鉴定技术体系。而重大潜在入侵物种木薯绵粉蚧种特异性快速检测技术的研发与建立,及其与双基因条形码技术等分子鉴定手段的联合应用,必将在检疫性粉蚧类害虫的检测监测和风险预警中发挥巨大作用,并为“一带一路”区域农业绿色生产与健康发展,以及国家粮食安全与生态安全提供强有力的技术支撑。
[硕士论文] 徐洋
公共管理 哈尔滨工业大学 2016(学位年度)
摘要:黑龙江省是我国边境大省也是农业大省,随着进出口贸易的发展,进出境旅游、国际代购的不断升温,黑龙江进境植物检疫中有害生物入侵风险不断加大。有害生物入侵直接危害我省的生态环境和人民健康安全,目前我省进境植物检疫防控有害生物入侵风险模式存在诸多问题,如法律法规不健全、职能分散、权责不清、沟通不畅,缺乏科学的信息预警系统,因此无法有效防控进境植物检疫有害生物入侵的风险。而对于进境植物检疫防控有害生物入侵风险的研究大多是从农学、林学单一的专业角度,本文主要从公共管理的视角对黑龙江进境植物检疫防控有害生物入侵风险联防联控的新模式展开研究。
  本文对黑龙江进境植物检疫防控有害生物入侵风险新模式研究所涉及的相关概念做出界定,并对相关理论进行梳理。在此基础上,根据黑龙江进境植物检疫流程、法律法规、监管情况、业务数据、监测案例对进境植物检疫过程中有害生物入侵的风险进行分析,发现现行的黑龙江进境植物检疫有害生物入侵的防控主要是黑龙江检验检疫部门单线防控、海关和边防部门必要时给予协作的分散防控的状况。而黑龙江检验检疫部门内部执法尺度不统一、风险防控措施缺乏、有害生物截获能力不强、风险数据收集和分析工作不到位、执法和操作人员数量、能力不足;检验检疫行政执法相对人缺乏风险意识、配合执法意愿低;黑龙江进境植物检疫防控有害生物入侵风险的法律法规不健全、监管机构权责衔接不清、联防机制运行不畅通、缺乏风险预警系统等种种问题使得黑龙江进境植物检疫有害生物入侵风险会越来越高。从而得出现行单一的、分散的黑龙江进境植物检疫防控有害生物入侵风险模式无法实现有效防控的结论。
  本文针对现行的黑龙江进境植物检疫防控有害生物入侵风险模式存在的不足,借鉴发达国家有害生物入侵风险防控经验,运用系统理论、公共治理理论、危机管理理论提出黑龙江进境植物检疫防控有害生物入侵风险的新模式——由省政府牵头,检验检疫部门主导,科研院所技术支撑,行业协会配合作用,农业、林业、环保、海关、边防联动的联防联控高效防控模式。首先阐述新模式的内涵、特点和参与主体。然后,从三个核心运行机制阐述新模式的可行性,为黑龙江进境植物检疫防控有害生物入侵风险提供理论参考。最后从解决实际问题角度出发,为保证新模式切实发挥作用,探讨了新模式有效运行的推进步骤和推进措施,并结合主导机构黑龙江检验检疫部门的工作实际,从检验检疫内部管理、内部执法和外部宣传上提出具体的改进措施,对进境检验检疫工作具有一定的实践参考价值。
[硕士论文] 邵振宗
农业推广 石河子大学 2015(学位年度)
摘要:阿拉山口位于新亚欧大陆桥中国段的西桥头堡,是我国唯一的铁路、公路和石油管道三位一体的国家一类口岸,也是我国西北地区货运量最大、发展最快、效益最好的口岸,在新疆乃至全国的外向型经济发展中有着举足轻重的地位。阿拉山口口岸作为全年开关运行的口岸,进出境植物产品货值约占到口岸进出境货物总货值的8%,随着对外贸易速度的不断加快,进出境植物产品的种类、数量以及贸易额呈现逐年增多的趋势。新疆近60年来,外来入侵生物达79种,其中害虫50种,病害19种,杂草10种,最近十年间传入新疆的检疫性有害生物就达十多种,入侵规律呈现出间隔期越来越短,突发性疫情频率越来越高的特点,因此开展进境植物检疫现状研究分析的工作迫在眉睫。
  目的:通过收集2006年—2010年阿拉山口口岸进境植物产品检验检疫的大量数据和事例,了解目前阿拉山口口岸植物检疫的现状、存在的主要问题和风险,同时提出相对应的解决方案。加快口岸通关速度,进一步做好进出境植物检疫工作提供理论和实践依据。
  方法:采用数据统计分析,获得该口岸进境植物产品易携带的有害生物类型及检出率,初步掌握中亚五国及俄罗斯对我国输入植物产品的主要有害生物及检疫性病虫杂草。
  结果:通过分析5年的数据可知:阿拉山口口岸主要贸易国家有俄罗斯、土库曼斯坦、哈萨克斯坦、塔吉克斯坦、乌兹别克斯坦,其中哈萨克斯坦有害生物检出比例最高,共截获有害生物392批,占总检出批次的46.83%。该口岸进口的植物种类主要有木材、棉花、小麦、蚕茧和羊毛,进口总批次占到当年进口总数的90%以上。皮棉进口批次多,平均占进口总批次的70%以上。植物产品种类逐年呈现多样化的发展。目前口岸检测能力:蚕茧有害生物检出率较高。原木检疫快速检测鉴定体系相对完备。进口棉花本身所携带的检疫物非常少,检出率较低,2009年和2010年检出率仅为0.07%和0.03%。近五年来有害生物检出的总体情况:2010年有害生物检出率较2006年的2.13%显著提高至11.24%。有害害虫共11目36科78种,检疫性害虫3种,分别为斑皮蠹、齿小蠹及苹果蠹蛾。斑皮蠹全部来自蚕茧,齿小蠹全部来自木材,苹果蠹蛾主要集中在截留物的水果中。杂草检出比率逐年上升,共检出杂草20科82种,检疫性杂草有匍匐矢车菊、法国野燕麦、菟丝子属、意大利苍耳。首次在羊毛中检出检疫性杂草加拿大苍耳。然而真菌检测比率较低仅为1.35%,仅在2009年检出蚕微孢子虫。这主要是受到口岸实验室设备、人员等条件的限制。
  结论:目前阿拉山口口岸进境植物检疫面临的问题:1)位置偏远,植物检疫人员缺乏、技术落后,导致检测能力不足;2)外来入侵有害生物的种类不断增多;3)对于不同进口货物种类、国家的现场检疫缺乏针对性;4)植物检疫科室机构设置不尽合理;5)旅客对植物检疫意识淡薄;6)对潜在疫病疫情关注不够等。对策:1)加强口岸植检人员队伍建设,增强行政执法人员专业能力和实验室检测能力;2)加强植物产品全过程检疫管理;3)检疫工作应突出植物产品类别重点;4)检疫监管应突出国家地区重点;5)建立风险性大的检疫物指定入境口岸;6)以货物种类为导向设置科室职能;7)加大宣传力度,提高公众意识;8)建立疫病疫情大数据,关注潜在的风险。
[硕士论文] 杨苏
食品加工与安全 宁波大学 2015(学位年度)
摘要:民以食为天,食以安为先。宁波是我国重要的港口城市,宁波口岸监管进口粮食入境始于1987年,是我国重要粮食进口口岸,在长三角地区乃至全国都起着非常重要的作用,每年约有一百五十多万吨的粮食进口量,其进口大豆和谷物类的安全性对保障农业生产安全、保证国家生态环境安全、保障人民群众的生命安全起着十分重要的作用。目前宁波口岸大豆、谷物的进口量不断提升,但是疫情携带情况较为突出。随着进口量的增加,进口农作物的安全问题和质量控制也日益突出。
  本文对宁波口岸进口大豆和谷物过程中存在的品质不合格、携带有毒有害生物等安全问题进行了统计、分析,指出安全现状中所存在的若干问题并提出一组相关建议。具体工作及研究内容包括:(1)对近几年宁波口岸进口大豆和谷物的数据、检验检疫情况进行统计,代表性统计结果有:宁波口岸进口粮食主要种类为大豆、大麦、大米、高粱和玉米,其中大豆占主导,约占进口总量的七成;2012年进口粮食中有害生物截获率为87.65%,其中大豆、大麦和玉米的截获率均为100%,大米的截获率为67.35%;(2)对进口大豆和谷物的特点进行分析,例如:价涨量跌十分显著、进口大米持续增长;对其存在的问题进行探讨,例如:进口大麦频频截获检疫性有害生物、进口大豆量增或将影响国内食用油和饲料的供应。(3)充分结合目前国内经济形势和国际经济走势,通过对宁波口岸近年来从入境粮食中截获的大量有害生物的统计,分析进口大豆及谷物中夹带的有害种子、杂草、昆虫等对国内生态环境所产生的影响和对我国农业生产造成的潜在威胁,并根据这些情况提出进口大豆和谷物的质量控制措施及相关建议:加强长三角地区进境粮食检验检疫合作、加强进口粮食中混杂杂粮的检疫力度、完善口岸进口粮食有害生物防御体系。
  上述工作可以为进口农作物的质量安全控制提供依据,更好的发挥检验检疫在确保进境粮食质量安全中的职能作用,从而维护我国生态环境稳定。
[硕士论文] 郭梦湘
植物保护 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterterium carotovorum subsp.carotovorum,以下简称Pcc)寄主广泛,是引起多种经济作物及观赏性植物的细菌性软腐病的重要病原菌。目前尚缺少有效的防控方法,从而造成严重的经济损失。因此,近年来从分子生物学上对Pcc致病性的相关研究逐渐深入,以期为提出理想的防治方法提供依据。
  多胺广泛存在于动植物和微生物中,是正常细胞生长必需的一类以碳为骨架的天然脂肪族胺类物质。在生物体内的条件下,多胺以聚阳离子形态存在,且带正电荷,能与带负电荷的蛋白质、核酸等生物大分子带负电荷互作并影响生物体的各种生理功能,如DNA的转录和翻译、核酸的稳定性、细胞生长和繁殖、膜的稳定性等。微生物中多胺特异转运系统是亚精胺/腐胺ABC转运系统,包括potABCD系统和potFGHI系统。
  高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)具有分离效能高、灵敏度高、应用范围广、分析速度快等优点,在物质分离、分析、纯化等研究领域应用越来越广泛。用HPLC分析多胺的方法的运用越来越普遍,尤其是在动物、植物、环境、食物等的多胺含量。然而,在微生物尤其是细菌中用HPLC分析多胺的方法所报道文献并不多见。本研究通过从样品制备、流动相与流动相的选择与比例调整、检测波长的选择、流速和柱温的调整等方面优化,建立了Pcc中腐胺HPLC检测方法。为Pcc中参与多胺转运、合成相关基因的功能分析、研究提供支持。结果表明:以Agilent C18为分离柱(150mm×4.6mm,5μm),柱温30℃;苯甲酰氯为衍生化试剂,添加量为100μL(样品量为1mL);甲醇与水为流动相,采用梯度洗脱;检测波长为254nm,建立腐胺HPLC检测标准曲线和Pcc中腐胺检测。
  为了阐明相应多胺代谢编码基因的功能,本研究利用同源重组方法得到三株突变体ΔpotA、ΔpotD、ΔspeE,并进行致病性、相关水解酶类、生长曲线等表型测定。结果表明:与PccS1相比,ΔpotA、ΔpotD、ΔspeE三株突变体的致病能力、产生蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、碳青霉烯抗生素等方面的能力、生长速率等表型均没有变化。表明PccS1中几个与多胺代谢相关基因potA(PC1-2235)、potD(PC1-1859)、speE(PC1-3129)对致病性不具关键作用。
  本实验室前期得到腐胺代谢相关基因缺失突变体ΔpotF、ΔpotG、ΔpotH、ΔpotI,其中ΔpotG致病能力显著下降。本研究利用上述HPLC腐胺检测方法对这些菌株胞内腐胺进行了检测,结果表明,与野生型PccS1相比,ΔpotF、ΔpotG、ΔpotH、ΔpotI胞内腐胺水平没有明显差异。说明potFGHI腐胺转运系统在Pcc的腐胺代谢中并非必不可缺,是否存在相同功能的转运系统,需进一步研究。
[硕士论文] 李晓琪
植物保护 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:疫霉属(Phytophthora sp.)和腥黑粉菌属(Tilletia sp.)是日常检疫工作中的重点关注对象,疫霉属是包括大豆、马铃薯等在内多种作物的病原真菌,严重危害寄主植物的生长;腥黑粉菌属主要危害小麦等禾本科作物,造成严重的经济损失。本文通过对这两个属内较为重要的病原菌进行风险分析,旨在进一步了解进境植物携带疫霉属和腥黑粉菌属病原真菌的情况及其传入风险,明确该属下病原真菌的风险等级,并提出相应的风险管理措施,为今后更好的开展检验检疫工作提供参考。根据风险分析结果得出,疫霉属中有7种高风险检疫性有害生物,分别为:栗黑水疫霉(P.cambivora)、马铃薯疫霉绯腐病菌(P.erythroseptica)、大豆疫霉(P.sojae)、丁香疫霉(P.syringae)、冬生疫霉(P.hibernalis)、苜蓿疫霉(P.medicaginis)、多枝疫霉(P.ramorum);腥黑粉菌属中有3种高风险检疫性有害生物,分别为:小麦印度腥黑粉菌(T.indica)、小麦矮腥黑粉菌(T.controversa)、黑麦草腥黑粉菌(T.walkeri)。建议在进境植物检疫过程中应重点予以关注,特别是T.walkeri目前尚未列入我国进境植物检疫性有害生物名录,但通过风险分析我们得出,该病原菌的进入风险较高,定殖扩散可能性大,且经济危害严重,因此建议将其增列为我国进境植物检疫性有害生物。
  鉴于疫霉属和腥黑粉菌属的病原真菌存在种间形态极为类似,对检疫人员经验要求较高的特点,本文对上述2个属较为重要的病原种进行了基因条码检测技术的研究。DNA条形码试剂盒具有操作简便、结果可靠、不依赖检疫人员的经验技术等优点,同时可以实现对近似种的有效区分。本研究中,我们尝试将DNA条形码试剂盒技术用于疫霉属和腥黑粉菌属的检测,通过自行研发的疫霉属DNA条形码试剂盒(疫霉属基因条码检测网站,http://58.211.92.14:8080/myapp)、腥黑粉菌属DNA条形码试剂盒(植物有害生物检疫鉴定系统,http://58.211.92.14/sysinspect/kj.aspx)实现对这两个属内病原真菌的快速、准确的鉴定,有效解决对于实际工作中难以鉴定到种的问题。试剂盒以网站形式呈现,方便使用者的实际应用。实验结果表明,疫霉属基因条码试剂盒主要涉及疫霉属真菌的ITS、28S、60S、COX2四个基因片段,并相对应有用于疫霉属真菌DNA扩增的引物、PCR反应体系和条件。通过我们自行研发的分析软件,共找到特异性碱基位点238个,其中ITS片段86个,分属8个种;60S片段42个,分属13个种;28S片段44个,分属12个种;COX2片段66个,分属13个种。除掘氏疫霉(P.drechsleri)外,其它种均能找到不同数量的特异性碱基位点,可以基本实现对疫霉属中重要种的有效区分和鉴定。腥黑粉菌属DNA条形码试剂盒由于基因序列有限,目前主要尝试了ITS片段,通过自行研发的分析软件,共找到67个特异性碱基位点,包含6个种。通过条形码试剂盒仅可实现对部分种的区分,建议随着研究的不断发展,可以尝试在其他基因片段上寻找更多的标记碱基,进一步完善该属的条形码试剂盒。
[硕士论文] 宋必
植物保护 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:大豆是原产于我国的一年生的草本植物,现在世界各地都有栽培。大豆也是一种多病害植物,大豆根茎部病害是影响大豆产量和品质的重要因素之一,其分布广泛、病原菌种类复杂,危害严重,较难防治。特别是感病初期,症状相似度极高,不易区分。传统的诊断方法费力、耗时长,且容易造成误诊,不利于及时指导防治。所以急需要开发一些新技术对引起大豆根部病害的不同病原菌进行快速检测。目前对植物病原菌的分子检测需将田间采集的病害样本带回实验室用PCR仪来完成,耗时长,难以达到在田间现场对植物病害进行快速诊断的需求,不利于对病害进行指导及时防治。本试验研发了一套简便,快速,安全,且检测成本低能在田间现场快速诊断病害的LAMP方法,为实行田间现场快速诊断病害提供了必要的技术支持。
  1.应用本实验室研发的分别针对尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰孢菌(Fusarium solani)、层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)、木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)的7个LAMP检测体系对从江苏省、安徽省、湖北省和云南省采集的640份病害样本进行快速病害诊断。LAMP检测阳性率分别为:20%、27%、12%、7%、4%、10%和13%;安徽省和江苏省复合侵染情况比较严重,占检测阳性率31%,其中由两种病原菌侵染的病害样本和由三种病原菌侵染的病害样本分别为6%、24%,尖镰孢菌和茄腐镰孢菌为该地区的优势种,其次为层出镰孢菌和木赋镰孢菌。采用LAMP检测技术在实验室内完成病害诊断仅需1.5~2 h,与传统诊断、普通分子技术诊断相比较,该技术简便,快速,安全,检测成本低。在农业生产上十分有利于对病害进行指导及时防治。
  2.本试验根据LAMP检测技术在恒温条件下进行反应这一特点,通过反复探索设计了一套简易的,实用的用保温杯来替代PCR仪提供恒温(或近恒温)条件下完成LAMP反应的操作方法。试验结果表明:用保温杯替代PCR仪提供恒温(或近恒温)条件完成的LAMP检测灵敏度能达到LAMP检测灵敏度的要求,证明该方法可以应用到实际的病害快速诊断中。本试验还建立了一套简便,快速,安全,检测成本低的操作程序方案2-1b,具有不需要特殊仪器、可视化判断结果和可应用于植物病害田间现场快速诊断的优势,适合基层单位和检验检疫机构开展分子检测和病害诊断。
[硕士论文] 沈浩
植物病理学 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:大豆南方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.meridionalis,DPM)、大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora,DPC)和拟茎点种腐病菌(Phomopsislongicolla,PL)均为大豆上重要的茎部病原真菌。其中,大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌为我国公布的植物检疫性病原真菌,在欧洲和北美洲的国家广泛分布,严重影响大豆的生长和产量。大豆拟茎点种腐病菌是影响大豆生长的重要病原菌,每年对我国的大豆生产造成严重损失。对于三种病原菌的检测工作,当务之急就是一方面加强大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的口岸检疫,防止病原菌的入侵,另一方面要提高对大豆拟茎点种腐病菌的早期快速诊断技术水平,在病菌侵染初期准确诊断出病原菌的存在,降低经济损失。
  传统的以传统的以ITS(内转录间隔区)为靶序列的分子检测无法快速准确区分大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌等近似种。笔者在大豆北方茎溃疡病菌靶标序列筛选中,发现了翻译延伸因子(translation elongationfactor1α,tef1α)序列。翻译延伸因子是信使核糖核酸翻译促进多肽链延伸的蛋白质因子,其在原核、真核生物中均有存在,具有高度的特异性,常常被用于多种病原菌的分类鉴定上。通过目标病原菌与其相似种比对发现,三种病原菌在tef1α序列上都有很好的特异性,适合作为分子检测的靶标。基于环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),以tef1α为靶序列,针对三种病原物分别设计LAMP特异性引物,建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,在特异性的基础上分别进行了灵敏度验证、人工接种大豆植株检测试验和实际样本检测试验。
  在大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测中,64℃等温条件下进行核酸扩增反应60 min,反应结束后,加入SYBR greenⅠ染料,根据染料颜色变化判定扩增结果。引物特异性验证试验中,只有目标菌株中扩增到梯形条带,同时加入SYBR greenⅠ染料后可观察到绿色荧光的阳性反应;而在其他供试菌株中均没有出现梯形条带,加入SYBR greenⅠ染料后则保持橙色的阴性反应。该技术在大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的最低检测限为10pg·μL-1和1pg·μL-1目标菌纯DNA。在对分别人工接种了大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌病菌的大豆植株发病组织的检测中,DPM-LAMP和DPC-LAMP技术能够检测出所有人工接种发病大豆植株中的目标菌。笔者又对口岸截获的大豆病残体进行了人工添加子囊孢子的试验,DPM-LAMP和DPC-LAMP技术能够分别在10g进口大豆夹带的大豆植株残体中最低检测出大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的50个子囊孢子和10个子囊孢子。结果显示,该方法的建立为大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的检疫以及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。
  在拟茎点种腐病菌的PL-LAMP检测中,在扩增反应前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果,引物特异性验证试验中,54株分离自不同省份的拟茎点种腐病菌菌株能观察到天蓝色的阳性反应,而从其他真菌和疫霉中反应管保持紫色的阴性反应。在灵敏度检测中,PL-LAMP技术最低检测限为100pg·μL-1目标菌纯DNA。在对人工接种了大豆拟茎点种腐病菌的大豆植株发病组织的检测中,PL-LAMP技术能够检测出所有人工接种发病豆苗中的目标菌。在田间应用方面,对来自江苏、安徽和武汉的疑似发病的大豆样本进行检测。LAMP检测技术的阳性率为58/116(50.0%)、利用传统的病原分离法进行分离的阳性率为36/116(31.0%),结果显示,PL-LAMP技术明显的提高了检测效率。
  高通量检测是目前病原菌检测技术的发展方向,发展高通量的检测技术对于基层实验室和出入境口岸检疫具有重要的意义。对本论文关于我国口岸的两种植物检疫性病原物:大豆北方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.caulivora)、大豆南方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.meridionalis)的LAMP检测技术进行改良优化,连同南京农业大学吴旭东关于大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata f.sp.sojae)的LAMP检测技术,结合八连排反应管建立了一种能够同时检测一个样本中3种病原菌的高通量检测体系。在水浴锅内64℃扩增70min,加入染料HNB(羟基萘酚蓝),作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果,如果存在目标菌,反应管颜色变为天蓝色,如果不合目标菌,反应液为紫色。应用该检测体系,对口岸截获来自3个不同国家的进口大豆残体进行带菌检测,结果显示,9份样品中检测到了2份样品含有大豆北方茎溃疡病菌,1份样品中含有大豆茎褐腐病菌。本研究建立的高通量检测体系,具有快速、不需要特殊仪器和肉眼判断结果的优势,适合基层单位的实验室和检验检疫机构开展分子检测和病害诊断。
  综上所述,本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌,建立了一种快速、灵敏、特异、可视化的LAMP检测方法。LAMP检测方法在70min内可完成待检样品检测过程,显著的缩短了检测时间,降低了基层部门的检测成本,其非常适合基层和出入境口岸等大批量样品的快速检测。同时基于以上的研究,本研究进一步建立了LAMP技术和八连排反应管相结合的高通量检测技术体系,为多种不同检疫性病原菌的高通量检测提供了很好的技术平台。
[硕士论文] 赵红艳
植物保护 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一类由镰刀菌产生的次生代谢物,广泛存在于玉米、大麦、燕麦、小麦、大米和高粱等作物中。它不仅影响农作物的经济和营养价值,还对人畜有一定的毒害作用。目前,用于检测玉米赤霉烯酮的分析方法主要有色谱检测法、免疫检测法。其中,免疫检测法灵敏度更高,专一性较强,成本低,应用范围更广。免疫检测法中的胶体金免疫层析试纸条法可以快速检测,更方便实用。
  本研究是在实验室前期筛得的抗玉米赤霉烯酮杂交瘤细胞的基础上制备单克隆抗体,进一步制备可以快速检测玉米、小麦等作物中ZEN的胶体金免疫层析试纸条,对该胶体金免疫层析试纸条质量进行评价。
  本论文主要包括三部分。第一部分为包被抗原以及单克隆抗体的制备。包被抗原合成分两步,首先ZEN与羧甲基羟胺半盐酸盐一步合成半抗原,第二步活泼脂法与卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)偶联合成全抗原。半抗原的鉴定是通过薄层层析法(ThinLayer chomatography,TLC)和电喷雾离子化质谱法(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技术,全抗原是采用紫外光谱法进行检测。通过体内收集腹水法用实验室前期获得的杂交瘤细胞株3D10制备单克隆抗体,再用饱和硫酸铵沉淀法纯化得到单克隆抗体,效价为1×106,蛋白浓度约为3873μg/mL。
  第二部分为制备胶体金免疫层析试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为30nm的胶体金,通过肉眼观察法、可见光光谱法、透射电镜三种方法鉴定胶体金质量,结果表明胶体金粒径为30nm,颗粒均匀。制备金标抗体,通过肉眼观察法确定胶体金的最适pH值为7.5,偶联抗体的最适量为9.6μg。硝酸纤维膜millipore135为试纸条的检测区,检测限处包被抗原浓度及控制线处羊抗鼠IgG的最适浓度均为1mg/mL。将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装起来,制成胶体金免疫层析试纸条。
  第三部分为胶体金免疫层析试纸条质量评价与应用。对胶体金免疫层析试纸条的交叉反应性、最低检测限以及稳定性进行评价。该胶体金免疫层析试纸条与其他霉菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、HT-2毒素、T-2毒素、黄曲霉毒素B1(AFB1)无交叉反应性,特异性较好;与四种类似物α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL),β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL),α-玉米赤霉醇(α-ZAL)和β-玉米赤霉醇(β-ZAL)存在交叉反应性;最低检测限为30μg/kg;在37℃保质期为2d,在4℃条件下的保质期大于1周。使用该胶体金免疫层析试纸条和HPLC-MS/MS两种方法检测10份样品,7份样品ZEN浓度高于30μg/kg,试纸条检测呈阳性,检测结果与HPLC-MS/MS结果一致。
[硕士论文] 李鸿
植物病理学 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:宁波、广西和广东口岸对进境的种苗、花卉以及木包装材料进行检疫时,截获多种植物寄生线虫群体,由于这些线虫可对我国农作物以及林业生产造成潜在危害,因此本文对截获的线虫群体进行了形态学和分子生物学鉴定,旨为我国植物寄生线虫的鉴定提供参考资料,为进出境植物检疫提供理论依据,严防有害生物传入我国。
  通过对三个口岸截获的7个植物寄生线虫群体进行形态学特征分析和形态测计值比较,将宁波口岸从日本进境的鸡爪槭根际介质中分离到的一个孢囊线虫群体鉴定为旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista),将罗汉松根际介质中分离的群体之一鉴定为布林克曼隐皮孢囊线虫(Cryphodera brinkmani),将另一个群体初步鉴定为隐皮孢囊线虫属一个未知种(Cryphodera sp.)。将广西口岸从泰国花卉根际截获的剑线虫群体鉴定为巴西利亚剑线虫(Xiphinema brasiliense),其为非美洲剑线虫组成员,将宁波口岸从日本罗汉松根际介质分离到1个剑线虫群体鉴定为剑线虫属一未知种(Xiphinema sp.)。将广东口岸从台湾木包装材料中分离到1个伞滑刃线虫群体鉴定为吉拉尼伞滑刃线虫(Bursaphelenchus gillanii),将宁波口岸从新加坡阔叶木包装材料中分离到1个伞滑刃线虫群体初步鉴定为伞滑刃线虫属一未知种(Bursaphelenchus sp.),二者均为松材线虫组成员。
  基于核糖体DNA(rDNA)的28S D2/D3、ITS和18S区序列的系统发育分析,揭示出以上7个线虫群体的系统发育关系与其分类地位密切相关,分子特征分析为形态学鉴定结果提供了有力支持。
  旱稻孢囊线虫、吉拉尼伞滑刃线虫和3个未知种均为我国口岸首次截获。
[硕士论文] 朱林慧
生物化学与分子生物学 西南大学 2015(学位年度)
摘要:疫霉属真菌是水果及其种苗上一类非常重要的病害,其中丁香疫霉phytophthora syringae、冬生疫霉P.hibernalis、栗疫霉黑水病菌P.cambivora、草莓疫霉红心病菌P.fragariae、树莓疫霉根腐病菌P.fragariae var.rubi为我国禁止进境5种检疫性疫霉。疫霉菌侵染寄主植物引起根腐、茎腐、果腐、溃疡等症状,导致植物大量减产,甚至绝产、死亡,具有流行性和毁灭性。目前疫霉菌的常规检疫方法主要依据病原菌的形态特征、生物学特性等差异,而传统的形态学鉴定方法周期长,且步骤繁,已不能满足口岸快速检测的要求。因此,必须加大对进境水果及其种苗检疫性疫霉的口岸检疫力度,建立快速、准确、灵敏的检测方法,以保护我国水果产业的安全。
  目前国内外水果检疫性疫霉检测主要基于常规PCR、实时荧光PCR,鲜有关于多重PCR和多重实时荧光PCR的报道。本研究基于柑橘属、苹果属、李属及莓类4类水果及其种苗,以5种检疫性疫霉以及其近似种为研究对象,展开了疫霉菌的分子生物学等方面的详细研究。比较分析5种检疫性疫霉的18S rRNA、ITS、Heat Shock Protein90(HSP90)、Ras-like Protein(Ypt1)、nad9及Enolase等多个基因,根据序列位点差异,分别设计了疫霉菌通用引物,5种检疫性疫霉的特异性引物,冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的Taqman探针,建立了各类水果及其种苗上检疫性疫霉的多重PCR、多重实时荧光PCR检测方法。本研究取得了如下研究成果:
  1、建立了柑橘属、苹果属、李属和莓类水果及其种苗上检疫性疫霉的多重PCR检测方法
  通过疫霉属多个基因序列比对,利用Primer Premier5引物软件,针对疫霉属真菌18S rRNA基因设计了通用引物,根据5种检疫性疫霉的ITS、heat shock protein90、Ypt1和nad9基因分别设计了冬生疫霉、丁香疫霉、栗黑水疫霉、草莓疫霉红心病菌和树莓疫霉根腐病菌的特异性引物,优化反应体系,建立了四类水果及其种苗检疫性疫霉的多重PCR检测方法。利用建立的方法进行模拟检测试验,能够有效扩增目的片段,阴性对照没有扩增出条带。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳及EB染色,可直接读出检测结果。
  2、建立了柑橘属、苹果属和李属水果及其种苗上检疫性疫毒多重实时荧光PCR检测方法
  通过疫霉属多个基因序列比对,利用Prime Primer3探针设计软件,针对冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的Enolase、HSP90和Ypt1基因分别设计了3中疫霉菌的特异性探针和引物对,经过体系优化,建立了柑橘属、苹果属和李属水果及其种苗上检疫性疫霉的多重实时荧光PCR检测方法。建立的多重实时荧光PCR检测方法能同时检测出各类水果的检疫性疫霉。
  3、建立了冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的环介导等温扩增(LAMP)检测方法
  针对冬生疫霉Enolase、丁香疫霉的ITS和栗黑水疫霉Ypt1基因序列,运用引物设计软件(https://primerexplorer.Jp/e/)在线进行LAMP引物设计。经过体系优化,LAMP反应阳性样品在2%琼脂糖凝胶中电泳观察均出现各自的特征性梯状条带,通过肉眼观察到阳性反应呈白色浑浊,加入SYBR GreenⅠ荧光染料观察颜色均出现颜色变化。建立的冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的LAMP检测方法可直接检出反应结果。
  本研究建立的多重PCR、多重实时荧光PCR和LAMP检测方法可实现对带菌水果的直接检测。全部检测可在1d内完成。有效促进水果的快速通关,为口岸检测和病原菌的田间监测提供了可靠的方法。
[硕士论文] 李钊君
植物保护 四川农业大学 2015(学位年度)
摘要:四川是多种水果和蔬菜的重要产地,为了了解四川地区果蔬生产中植调剂使用情况及其残留水平,本文对四川常见果蔬上植调剂使用情况进行调查,并对植调剂使用较多的果蔬进行残留检测,优化了氯吡脲的高效液相色谱(HPLC)检测方法,主要研究结果如下:
  (1)采用问卷法,调查了四川省23个区县8种常见果蔬中25种植调剂使用情况。调查结果表明,氯吡脲在枇杷、葡萄、猕猴桃、黄瓜和西瓜种植过程中都有使用其中,98%的农户在猕猴桃上使用氯吡脲;23%以上农户在葡萄、西瓜、番茄和柑橘种植中使用赤霉酸;69%的农户会在番茄上使用2,4-D;个别农户在果蔬种植中使用芸苔素内酯;农户应用植调剂的剂量主要是凭经验或经销商的推荐,极少会严格按照说明书使用。
  (2)建立了HPLC快速测定果蔬中2,4-D残留量的方法,并测定了枇杷、番茄、葡萄等28份果蔬样品中的2,4-D残留量。结果表明,C18固相萃取法能准确提取和分离样品中的2,4-D,在0.5μg/ml-5μg/ml范围内线性良好,相关系数为0.998,在0.2 mg/kg-0.8 mg/kg的加标范围内,2,4-D的回收率为82%-116%,变异系数为1.8%-5.7%,检出限为0.001 mg/kg;28份样品中2,4-D残留量均未超标;建立了GC-MS法测定番茄、葡萄、黄瓜等14份果蔬样品中的乙烯利。结果表明,该方法线性范围、准确度和精密度均符合要求;乙烯利含量均低于国家标准;固相萃取-高效液相色谱法测定葡萄、枇杷、猕猴桃等22份果蔬样品中氯吡脲含量,在猕猴桃、枇杷和葡萄中检出微量氯吡脲。以枇杷为基质验证该方法,发现氯吡脲回收率不稳定,导致方法准确度和精密度不高,需进一步研究氯吡脲的前处理方法。(3)研究了基质分散固相萃取和QuEChERS前处理方法对HPLC检测枇杷果实中氯吡脲含量的差异,结果表明:基质分散固相萃取法的平均回收率明显低于QuEChERS法,准确度和精密度不符合要求。
  进一步研究QuEChERS前处理方法中不同提取剂及用量、提取时间、盐析和脱水剂比例及用量、净化剂及净化时间等条件对枇杷中氯吡脲提取的影响,最终确定优化的QuEChERS条件:16ml乙腈提取8 g枇杷果实20 min,无水硫酸镁/氯化钠=3/2(质量比)盐析脱水,PSA/C18=1∶1(质量比)净化3 min。经验证,氯吡脲与杂质分离效果较好,回收率稳定在80%-100%之间,RSD为3.1%-4.8%。
[硕士论文] 陶中云
植物保护 浙江大学 2015(学位年度)
摘要:Pseudomonas syringae pv.pisi和Pseudomonas syringae pv.maculicola分别为豌豆细菌性疫病和十字花科细菌性黑斑病的致病菌,在我国均被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。本研究自主设计了针对这两种病菌的特异性引物,建立了一套可靠、灵敏、快捷的分子检测方法,有望从源头上协助控制两种检疫性病菌的扩散,为我国的植物检疫提供技术支撑。
  本研究以150株包括两种靶标菌在内的植物相关细菌为模板进行了常规PCR扩增,结果表明两对特异性引物均没有出现假阳性和假阴性。灵敏度测试结果表明常规PCR测定豌豆细菌性疫病菌纯化DNA的检测限为103fg/μl,菌悬液的检测限为102CFU/ml。实时荧光定量PCR测定纯化DNA的检测限可达102fg/μl,菌悬液的检测限达10CFU/ml。豌豆模拟带菌活体样本的检测中,特异性引物能够分别从植物粗提物的102倍(常规PCR)、103倍(实时荧光定量PCR)稀释液中检测到靶标细菌。
  以十字花科细菌性黑斑病菌的纯化DNA及菌悬液梯度稀释产物为模板进行的灵敏度测试中,常规PCR以及实时荧光定量PCR的检测限均为102fg/μl和10CFU/ml。在模拟种子带菌的检测中,常规PCR对经种子浸泡液稀释过的菌悬液的检测限为105 CFU/ml,实时荧光定量PCR的检测限为103CFU/ml。模拟带菌种子抽样检测的结果表明,常规PCR可以检测出带菌率为5%的种子样本(即10 g种子中含0.5 g带菌种子),而实时荧光定量PCR可以检测出带菌率为2.5%的种子样本(10 g种子中含0.25 g带菌种子)。本研究通过对检测样本中的靶标菌进行富集培养后再进行检测,大大提高了检测精度,结果表明常规PCR和实时荧光定量PCR均可检出千分之一带菌率的种子。
[硕士论文] 杨秋夏
植物保护 南京农业大学 2014(学位年度)
摘要:为了进一步加强进境水果病害植物检疫工作,为我国水果病害植物检疫提供信息技术支持,本论文在资料和信息全面收集整合的基础上,对我国进境苹果可能携带的病原物进行了风险分析,提出了风险管理措施。并对其中的检疫性病害—牛眼果腐病进行了分离培养及形态学和分子生物学鉴定,另外对苹果上造成严重危害的轮纹病建立了实时荧光的检测方法。本文主要包括以下内容:
  (1)概述了我国苹果的分布,产量,对外贸易情况;简介了苹果的重要病害。
  (2)根据南京口岸和中国检验检疫科学院数据,统计出我国进境旅客携带的水果种类和数量,以及这些水果上所携带的病原菌的种类和数量。全面搜集了苹果上携带的病菌种类,了解这些病害的各种信息。共收集苹果上病害50种。以部分重要指标如该有害生物进入可能性,在我国的分布的有无以及是否得到官方治理等进行初步筛选,确定了有害生物风险分析的名单,总共有14种,通过有害生物的进入可能性,定殖可能性,扩散可能性,经济影响多指标综合评价法对14种有害生物进行了风险分析。分析结果发现,以苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)、核果链核盘菌(Monilinia laxa)、果生链核盘菌(Monilinia fructigena)、美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)、苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea sp.)、李属坏死环斑病毒(Prunusnecrotic ringspot virus)、苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)、苹果,梨球壳孢果腐病菌(Sphaeropsis pyriputrescecs)为代表的8种病菌风险最大,梨火疫病菌(Erwiniabniamyces pyri)、苹果锈病菌(Gymnosporangium clavipes)、梨波氏盘果腐病菌菌(Sphaeropsis pamylovora)、苹果,梨边腐病菌(Phialophora malorum)、苹果星裂壳孢果腐病菌(Phacidiopycnis washingtonensis)为代表的5种病害风险为中。丁香疫霉(Phialophora malorum)风险为小。并对上述的8种危险性最大的病害制定风险管理措施。
  (3)对苹果牛眼果腐菌进行了症状观察、分离培养、形态鉴定和分子生物学鉴定。对苹果轮纹病菌建立了实时荧光的检测方法,能够对苹果轮纹病菌进行特异性扩增,并且在轮纹病菌菌液模板DNA浓度为10 pg/L时仍有较好的扩增效果。
[硕士论文] 杨辉耀
植物保护 南京农业大学 2014(学位年度)
摘要:大豆茎溃疡病是大豆生产上的重要病害。大豆茎溃疡的病原菌分为大豆南方茎溃疡病菌[Diaporthe phaseolorum(Cke.& Ell.) Sacc.var.meridionalis Morgan-Jones](简称DPM)和大豆北方茎溃疡病菌[Diaporthe phaseolorum var.caulivora](简称DPC)。大豆南、北方茎溃疡病菌都属于子囊菌亚门、球壳目、间座壳科、间座壳属,无性阶段均为拟茎点霉属。能与大豆茎荚枯病菌和大豆拟茎点种腐病菌共同引起间座壳—拟茎点综合症,危害非常严重。由DPM和DPC分别引起的大豆南方茎溃疡病和大豆北方茎溃疡病在我国还未有发生的报道,这两种病害均为我国口岸的检疫病害。
  由于我国对大豆的需求量越来越大,而进口大豆中除大豆种子以外还混杂有豆荚、豆秆、碎叶片、以及田间的泥块等残渣,若这些成分中含有活着的大豆南、北方茎溃疡病菌,则很有可能由于目前口岸对这两种病原菌的检测技术较为落后而造成检测漏洞。若不能及时发现和阻止带菌大豆入境,使这两种病原菌在我国定殖、传播和危害,将会对我国的大豆生产产生严重影响。
  目前我国口岸对大豆南、北方茎溃疡病菌的检测技术还不是十分成熟,即使可以检测,也要花费较长时间,并且对人力、物力、所需仪器、实验条件等也有很高的要求。而口岸检疫最重要的一点就是病原菌的快速、准确的诊断。为此,本实验主要是基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立一种口岸DPM、DPC快速检测的技术体系。该技术体系由本实验室郑小波、沈浩等研发。
  由于进境的大豆残渣样本中含有豆荚、豆秆、碎叶片、多种微生物及田间的泥块等成分,那么该LAMP技术是否能在这些影响因素存在的情况下,准确的检测出材料中的DPM、DPC呢?所以我们首先在实验室条件下,采用向一定量的江苏省出入境检验检疫局提供的不含有DPM、DPC的大豆残渣样本中加入不同浓度梯度的DPM、DPC的孢子的方法对LAMP检测DPM、DPC的灵敏度进行研究。基于LAMP的DPM、DPC的检测灵敏度越高就越有利于提高在口岸检疫这两种病菌的检出效率。我们最终确定了在实验室条件下应用该LAMP技术检测DPM、DPC的灵敏度,分别为10~50个孢子/10g大豆残渣、1~10个孢子/10g大豆残渣。
  在确定了在实验室条件下研发的该LAMP的DPM、DPC快速分子检测随技术可应用于口岸截获的大豆残渣样本的检测后,我们就对江苏省出入境检验检疫局提供的口岸截获的11份大豆残渣样本进行DPM、DPC的LAMP实际检测。检测出该11份豆渣样本中有3份携带有DPC、均未携带DPM。
  病菌的传播是建立在活体的基础上。江苏省出入境检验检疫局提供的11份大豆残渣样本进行DPM、DPC的LAMP检测后,对DPC检测结果为阳性的有3份豆渣样本。但并不清楚是否含有DPC活菌。所以,我们对该3份大豆残渣样本中携带的DPC进行分离、纯化。最后从2号(巴西,201304005)大豆残渣样本中分离出了DPC。
  本实验应用环介导等温扩增技术对口岸大豆南、北方茎溃疡病菌进行检测的实际检测结果表明:LAMP技术对口岸大豆南、北方茎溃疡的检测是可行并且检测灵敏度较高的一种新的简便、快捷的检测方法。本实验成功的建立了一个基于LAMP技术、适用于我国口岸检验检疫进口大豆中DPM、DPM病菌的快速检测体系。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部