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[博士论文] 王华君
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:本研究共分为三部分:
  第一部分 Smac与内质网应激相关蛋白在白内障及正常人晶状体上皮细胞内表达的差异
  目的:
  观察白内障患者晶状体前囊片和正常的透明晶状体前囊片Smac及ERS相关标志蛋白和下游蛋白的表达差异。
  方法:
  白内障晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月来我院眼科中心行Phaco+IOL植入术的单纯老年性白内障患者33例(50眼),手术均由同一位手术经验丰富的教授完成。30例透明晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月于我院及外院行角膜移植捐献者。免疫组化半定量分级检测两组间Smac、Cyt-c、JNK、Caspase-9、GRP78、GRP94、Caspase-12、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4表达差异。
  结果:
  免疫组化结果显示:正常人晶状体上皮细胞除Cyt-c、GRP94表达为强阳性至阳性;Caspase-9、Caspase-12表达为弱阳性之外,余蛋白完全没有阳性着色,均不表达。白内障患者晶状体上皮细胞中,Smac、JNK、GRP78、CHOP、ATF4、Cyt-c、GRP94表达从阳性至强阳性不等,Caspase-9、Caspase-12表达为阳性,XBP1、GADD34表达从弱阳性至阳性不等。对比后可以发现,Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4这几种蛋白在白内障患者LECs中表达,在正常入LECs中不表达,这一结果表明Smac及ERS相关蛋白的表达与白内障的发生和发展具有相关性。
  结论:
  1.Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4在白内障患者LECs中表达,在正常入LECs中不表达。
  2.Caspase-12与Caspase-9在白内障患者LECs细胞浆内高表达,在正常人LECs细胞浆内仅少量表达。
  3.Smac及JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4、Caspase-12、Caspase-9的表达与白内障的发生和发展具有相关性。
  第二部分 Smac基因过表达及干扰慢病毒载体构建及体外转染HLE-B3的实验研究
  目的:
  构建Smac基因过表达及下调表达载体,进行慢病毒包装,体外转染HLE-B3进行表达,观察Smac的过表达及下调对HLE-B3增殖的影响,根据Smac表达情况及细胞增殖情况,筛选出稳定表达的Smac基因过表达及下调表达细胞系。
  CCK-8检测载体的细胞毒性;Western blot检测转染后各组中及传代后细胞中Smac及ERS相关蛋白的表达水平。嘌呤霉素筛选转染阳性细胞。
  方法:
  1.慢病毒介导的Smac基因过表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含NheⅠ和NotⅠ酶切位点的上下游引物, PCR扩增。载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。
  2.慢病毒介导的Smac基因干扰表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含Age1和EcoR1酶切位点的上下游引物,PCR扩增。载体pLenti-hU6-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。
  3.配制浓度分别为2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.0μg/ml和10.0μg/ml的嘌呤霉素筛选转染细胞。
  结果:
  1.经酶切和测序鉴定Smac慢病毒表达载体序列正确。HEK293TF细胞包装后获得了病毒储存液,GTP-SMAC过表达载体病毒的滴度为4×108TU/ml:PM7.1-SMAC-sh1、PM7.1-SMAC-sh2、PM7.1-SMAC-sh3病毒的滴度分别为3×108TU/ml、2×108TU/ml、2×108TU/ml。
  2.筛选2天后,8μg/ml嘌呤霉素组未转染成功的细胞刚好全部死亡,为最佳筛选浓度。
  结论:
  1.成功构建Smac过表达和干扰慢病毒表达载体。
  2.慢病毒转染对HLE-B3无细胞毒性。
  第三部分 Smac基因过表达及干扰对HLE-B3内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响及作用机制
  目的:
  以稳定的Smac过表达及下调晶状体上皮细胞系为模型,筛选合适的H2O2浓度构建氧化应激模型,探讨Smac基因过表达及干扰对HLE-B3增殖、内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响,并根据相关蛋白表达的差异,利用免疫共沉淀及质谱分析,寻找其中可能存在的桥梁蛋白及其可能的作用途径和作用机制。
  方法:
  1.加入H2O2后以CCK-8检测各组细胞的存活率,根据实验结果,选择200μM的H2O2作为实验浓度。
  2.细胞根据处理因素的不同分为两个大组:第一大组为无H2O2处理组,分为:空白对照细胞组HLE-B3、Smac过表达空载质粒组GTP、Smac过表达细胞组GTP-SMAC、Smac干扰空载质粒组PM7.1、Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组;第二大组为H2O2处理组,分为:H2O2处理空白对照细胞组HLE-B3、H2O2处理Smac过表达空载质粒组GTP、H2O2处理Smac过表达细胞组GTP-SMAC、H2O2处理Smac干扰空载质粒组PM7.1、H2O2处理Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组。
  结果:
  1.MTT结果显示:不同浓度的H2O2对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,呈剂量依赖关系,半数抑制浓度(IC50)为270μM,高浓度(1000pM)H2O2处理24h时见细胞几乎全部死亡,不同浓度的H2O2对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系。由于外源H2O2改变了细胞原有的大小和形态,且本实验同时对Smac进行过表达和下调,因此将浓度为200μM的H2O2作为推荐剂量构建体外氧化损伤模型。
  2.CCK-8结果显示:无H2O2作用时,HLE-B3组、GTP组、GTP-SMAC组、PM7.1组、PM7.1-SMAC-sh3组的存活率分别为(99.56±5.12)%、(98.61±4.22)%、(93.96±2.75)%、(97.86±3.97)%、(104.56±5.12)%,统计学结果与第二部分相同;加入200μM的H2O2后,5组存活率分别为(59.339±4.895)%、(63.943±5.125)%、(39.960±3.683)%、(61.193±33.065)%、(90.560±3.574)%。组间比较,差异有统计学意义(F=57.06,P<0.001);200μM H2O2+GTP-SMAC组细胞存活率低于正常细胞组,差异有统计学意义(P=0.001);200μM H2O2+PM7.1-SMAC-sh3组细胞存活率高于正常细胞组和GTP-SMAC组,差异均有统计学意义(P=0.001);200μMH2O2+HLE-B3组、200μM H2O2+GTP组、200μM H2O2+PM7.1组之间比较无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  1.Smac过表达或下调,对正常状态下的HLE-B3增殖率无影响;Smac过表达会加剧氧化应激下的HLE-B3凋亡,Smac下调对氧化应激下的HLE-B3凋亡起保护作用。
  2.正常状态下的HLE-B3,Smac过表达后能通过上调内质网应激相关蛋白的表达,加剧内质网应激,加重HLE-B3凋亡;而Smac下调后能够抑制内质网应激相关蛋白,对细胞的氧化损伤具有一定的保护作用,减少HLE-B3的凋亡。
  3.HLE-B3氧化损伤后,Smac过表达能通过上调内质网应激途径的效应蛋白来加剧内质网介导的细胞凋亡;Smac下调能通过下调内质网应激途径的凋亡相关蛋白,来抑制内质网途径介导的细胞凋亡。
  4.PDE1C、IGFBP5可能是Smac与ERS间的桥梁蛋白。
[博士论文] 刘超
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLE B-3,观察TGF-β2对晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响。
  2、观察不同浓度的NF-κB p65ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect对晶状体上皮细胞的影响。
  3、通过应用NF-κB p65ASODN在体外转染人晶状体上皮细胞,检测其对由TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响,研究NF-κB p65ASODN在体外对晶状体上皮细胞的影响。
  4、采用眼前房内注射法转移NF-κB p65ASODN至新西兰大白兔后发性白内障模型眼内,观察其对后发性白内障的作用,探讨后发性白内障的基因治疗方法。
  方法:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLE B-3,用不同浓度的TGF-β2处理后,在不同的时间点用细胞划痕法观察细胞的移行能力,ELISA法处理细胞爬片后,检测细胞爬片中的阳性细胞数和吸光度值,检测α-SMA蛋白的变化。
  2、将NF-κB p65ASODN行全程硫代磷酸化修饰,不同浓度的NF-κB p65ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect两两混合,探讨细胞活性不受明显影响的情况下,最佳的转染效率时所需的NF-κB p65ASODN的浓度和转染剂的剂量。
  3、细胞同步培养后分五组:(1)空白对照组(单纯FSM培养),(2)阴性对照组(HiPerFect转染试加入到FSM中共同培养),(3)TGF-β2组(T组)(10ng/ml TGF-β2),(4)TGF-β2加ASODN组(T+A组)(TGF-β2、HiPerFect转染试和ASODN加入到FSM中共同培养),(5)TGF-β2加MSODN组(T+M组)(TGF-β2、HiPerFect转染试和MSODN加入到FSM中共同培养)。不同组细胞继续培养,6h、12h、24h、48h四个不同时间点收集上清液检测α-SMA的含量,采用RT-PCR检测细胞NF-κB mRNA的表达情况。
  4、将16只新西兰大白兔进行晶状体囊外摘除术制作后发障活体眼动物模型,手术后随即分为四组,每组4只。A组:空白对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射BSS液100ul;B组:阴性对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul;C组:ASODN一次注射组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul;D组:ASODN两次注射组4只白兔8眼:术毕和术后第2天分别经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul。术后第7、14、21、28天用超声角膜测厚仪测量中央角膜厚度,用裂隙灯显微镜观察前房炎症反应和后囊膜的混浊情况,并于实验结束时行HE染色观察后囊膜的病理变化、检测α-SMA的表达和进行RT-PCR检测晶状体上皮细胞中NF-κB p65mRNA的表达。
  结果:1、TGF-β2是晶状体上皮细胞重要的促移行和转分化生长因子,其作用呈现明显的浓度和时间依赖性。不同浓度的TGF-β2作用48h后,移行距离随着TGF-β2浓度的增加而增加,当浓度为10ng/ml时作用最强;晶状体上皮细胞在10ng/ml TGF-β2作用下,其移行距离随着作用时间的延长而增加,在48h达到高峰。晶状体上皮细胞在TGF-β2作用下由单层立方形变为长梭形,伸出伪足,逐渐呈现纤维细胞样形态。不同浓度的TGF-β2作用48h后,细胞爬片中α-SMA的阳性细胞数和吸光度值随着TGF-β2浓度的增加而增加,当浓度为10ng/ml时数值最大;晶状体上皮细胞在10ng/ml TGF-β2作用下,细胞爬片中α-SMA的阳性细胞数和吸光度值随着作用时间的延长而增加,在48h达到最大值。
  2、NF-κB p65ASODN对HLE B-3细胞的导入率随时间的延长而增加,48h导入率可达60%以上,并且细胞的活性不受影响;随着浓度增加,NF-κB p65ASODN对HLE B-3细胞的导入率增加,10μg/ml的转染率最高,再增加浓度转染率增加不明显,对细胞活性影响不明显;当剂量≤3ul时,随着转染剂HiPerFect的增加,对细胞的转染率增加,无明显细胞毒性,当剂量增加为4u时,对细胞的转染率增加不明显,并且表现出细胞毒性。HiPerFect的剂量为3ul,ASODN的浓度为10nmol/L对细胞存活率影响小(80.4%),同时细胞的转染率可高达70.8%,为最理想转染条件。
  3、在6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T+A组上清液α-SMA的浓度增加不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与T+A组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);T组与T+M组上清液α-SMA的浓度之间的差异不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。NF-κB p65mRNA出现在364bp处。6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T+A组NF-κB p65mRNA的含量增加不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与T+A组相比,T组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);T组与T+M组NF-κB p65mRNA的含量之间的差异不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。
  4、眼前节炎症反应均在一周内消失,组间无统计学差异。术后1周左右,A、B组开始出现后囊膜混浊,随时间延长而逐渐加重,C、D组后囊混浊发生时间均迟于A、B组,混浊程度也较A、B组为轻,差异有显著统计学意义(P<0.05)。C、D组之间差异无统计学意义。HE染色后观察到A、B组后囊表面可见多层成纤维细胞生长,细胞排列较为紧密,囊袋周边部皮质增生,同时可见明显纤维素样物质沉积,C、D组后囊表面相对干净,仅有少量细胞增殖,细胞排列较为疏松。A、B组后囊膜α-SMA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。RT-PCR分析结果发现A、B组NF-κB p65mRNA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。
  结论:1、TGF-β2可促进晶状体上皮细胞的移行,同时反应细胞间质转分化的α-SMA蛋白的表达增加,应用TGF-β2刺激体外培养的晶状体上皮细胞可成功建立后发障的细胞模型。
  2、HiPerFect的剂量为3ul,ASODN的浓度为10nmol/L对细胞存活率影响小(80.4%),同时细胞的转染率可高达70.8%,为最理想转染条件。
  3、NF-κB p65ASODN可特异性阻断NF-κB p65mRNA的表达,抑制TGF-β2诱导的α-SMA的表达和晶状体上皮细胞出现移行和间质转分化。
  4、采用眼前房内注射法转移NF-κB p65ASODN可抑制新西兰大白兔后发性白内障模型眼内后囊膜上α-SMA的表达和NF-κB p65mRNA的表达,抑制后囊膜的混浊,并且不增加炎症反应和对角膜的影响。
[硕士论文] 龚元元
眼科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过分析享受政府“百万贫困白内障患者复明工程”资助的贫困白内障患者手术效果及其相关影响因素,为提高适宜有效、方便可及、费用低廉、可持续的贫困白内障手术效率提供依据。
  方法:
  运用回顾性分析方法,采用内容包括:基本信息、术前视力、白内障类型、核硬度、相关全身疾病、眼部其他疾病、视力差(年)、术中并发症、手术方式、术后早期并发症、术后3d视力、费用等信息的白内障临床效果调查表,随机抽取2012年4月至2012年2月在山西省眼科医院受“百万贫困白内障复明工程”资助行白内障手术治疗的贫困组205例205眼、非贫困组226例226眼进行术后效果、成本/效果的比较分析。所收集数据经过复核无误后,采用多重回归模型进行术后视力影响因素分析。手术医师、护理标准无区别,所有信息采集及信息录入由同一位具有一定专业知识人员完成。
  结果:
  1.贫困组和非贫困组术前术后视力比较:⑴贫困组与非贫困组术前视力比较差异有统计学意义(P<0.001),贫困组术前视力平均值低于非贫困组;⑵贫困组与非贫困组术后3d视力比较差异有统计学意义(P<0.001),且两组较术前视力提高程度之间差异有统计学意义(P<0.001),非贫困组较贫困组视力提高更为明显,手术效果好;⑶贫困组与非贫困组术前视力与术后3d视力比较差异均具有统计学意义(P<0.001),两组患者手术后视力均明显提高;⑷贫困组术后脱盲率为94.1%,脱残率为76.6%;非贫困组术后脱盲率为98.7%,脱残率为89.4%,达到国家扶贫白内障手术相关标准要求。
  2.贫困组与非贫困组术中术后并发症比较:⑴贫困组术中并发症有后囊膜破裂、玻璃体丢失、晶状体核沉入玻璃体1例及悬韧带断裂1例,非贫困组未见术中并发症发生,两组术中并发症发生率无明显差异(P>0.05);⑵贫困组术后38例有角膜水肿、2例有高眼压表现,非贫困组术后角膜水肿9例、黄斑水肿2例,两组术后并发症发生率差异具有统计学意义(P<0.001),贫困组术后早期并发症发生率高于非贫困组。
  3.贫困组与非贫困组术后视力影响因素分析:⑴贫困组术后3d视力影响因素有视力差(年)、白内障分类、核硬度及眼部其他疾病(P<0.05),而年龄、性别对术后视力无明显影响(P>0.05);⑵非贫困组术后3d视力主要影响因素有白内障分类及眼部其他疾病(P<0.05),年龄、性别及核硬度对术后视力无明显影响;⑶综合组术后3d视力影响因素主要有白内障分类、核硬度及眼部其他疾病(P<0.05),年龄、性别对术后视力无明显影响。
  4.贫困组与非贫困组多重回归模型对术后视力影响因素进行分析:⑴眼部其他疾病、核硬度是贫困组术后视力的影响因素,回归方程为Y=3.817-0.384X1+0.159 X2;⑵眼部其他疾病是非贫困组术后视力的影响因素,回归方程为 Y=2.793+0.15 X。
  5.贫困组手术成本及成本/效果分析:⑴贫困组患者总费用为(2098.707±353.478)元,非贫困组(5077.190±1753.448)元,差异具有统计学意义(P<0.001);⑵贫困组治愈的成本/效果为3284.362元,低于非贫困组治愈成本/效果6154.170元;⑶贫困组白内障患者手术脱盲的成本/效果为2220.854元,低于非贫困组白内障患者手术成本/效果5144.063元;⑷贫困组白内障患者手术脱残的成本/效果为2739.826元,低于非贫困白内障患者脱残手术成本/效果5679.183元。
  结论:
  1.白内障分类、眼部其他疾病、核硬度是贫困组影响术后视力的主要因素;2.贫困组手术费用低于非贫困组,且贫困组手术成本/效果较非贫困组低。3.贫困组术后视力较术前视力明显提高,效果确切。脱盲率为94.1%,脱残率为76.6%,达到国家相关对贫困患者复明手术的相关要求,“百万贫困白内障患者复明工程”是费用低廉、效果确切的白内障扶贫复明策略之一。
[硕士论文] 惠靖雯
临床医学;眼科学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  眼内炎是一种凶险的感染性致盲性眼后段疾病,常常造成严重的视力损害,内源性眼内炎是一种眼外感染后经过血源性播散引起的凶险的感染性致盲性眼病,起病急骤,一旦病原菌侵入眼内,迅速破坏眼内组织,症状严重,虽然总体发病率低,但常造成严重的视力损害。细菌或真菌通过血液循环播散进入眼内,引起脉络膜、视网膜、玻璃体等眼内组织的炎症,其中细菌性眼内炎居多,患病的危险因素主要包括糖尿病、免疫抑制、静脉导管滞留、长期使用抗生素等。在临床上,眼科医师掌握内源性眼内炎的病原分布及其致病特点对于疾病的诊断、治疗及预后改善至关重要。内源性眼内炎致病菌谱近年来不断发生着变化,新兴出现高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)引起的眼内炎,虽然最常见的症状亦是眼部肿胀、充血、视力模糊的突然发作,但其致病力明显高于经典肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumonia,cKP),更难治愈,视力恢复较差,预后不良,本研究将高毒力肺炎克雷伯菌与经典肺炎克雷伯杆菌的特性进行比较,探讨高毒力肺炎克雷伯菌毒力的相关特性及其对视网膜色素上皮细胞炎症相关因子表达的影响。
  方法:
  收集8株高毒力肺炎克雷伯菌及8株经典肺炎克雷伯菌,分成高毒力肺炎克雷伯菌组和经典肺炎克雷伯菌组,首先分别检测其高黏性特征、基因型特性、抗血清杀伤及抗巨噬细胞吞噬能力;再通过酶联免疫吸附实验检测细菌侵袭视网膜色素上皮细胞后炎症细胞因子的表达水平,具体如下:
  1.细菌毒力检测:
  ①粘液丝实验:将受试菌接种于5%羊血琼脂平板,于37℃孵育过夜,用细菌接种环向上挑起菌落,观察记录挑起的粘液丝长度;
  ②基因rmpA(regulator ofmucoid phenotype gene A)检测:提取细菌基因组DNA,按25uL反应体系和反应流程进行PCR反应扩增rmpA基因,检测两组细菌的基因表达情况;
  ③细菌抗血清实验:培养至对数后期的细菌107CFU/L,与血清按比例1∶1混合培养2h,将混合培养液梯度稀释检测细菌的存活数量,计算细菌的存活率;
  ④细菌抗吞噬细胞吞噬实验:将培养至对数后期的细菌107CFU/L,按感染复数(multiplicity of infection,MOI)100∶1比例与鼠源巨噬细胞Raw264.7混合孵育1h,检测细菌存活数量,计算巨噬细胞内细菌的存活率。
  2.酶联免疫吸附实验:两组细菌分别感染视网膜色素上皮细胞10h,通过酶联免疫吸附实验检测上清液中单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)及白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)两种炎症细胞因子产生的水平。
  结果:
  1.细菌毒力检测:
  ①高毒力肺炎克雷伯菌组在粘液丝实验中均表现为阳性,而经典肺炎克雷伯菌组均表现为阴性;
  ②rmpA基因检测结果显示:高毒力肺炎克雷伯菌组均有rmpA基因543BP的表达,而经典肺炎克雷伯菌组没有该基因的表达;
  ③细菌抗血清实验结果显示:高毒力肺炎克雷伯菌组的存活率(18.2%)明显高于经典肺炎克雷伯菌组的存活率(5.3%),且差异有统计学意义(t=1.872,P<0.05);
  ④细菌抗巨噬细胞吞噬实验结果显示:巨噬细胞胞内高毒力肺炎克雷伯菌组的细菌存活率(1.1%)明显低于经典肺炎克雷伯菌组(7.5%),存在统计学差异(t=5.434,P<0.05)。
  2.酶联免疫吸附实验:高毒力肺炎克雷伯菌组感染视网膜色素上皮细胞后,细胞上清液中MCP-1(1177pg/mL)、IL-6(119pg/mL)均高表达,而经典肺炎克雷伯菌组MCP-1(670pg/mL)、IL-6(54pg/mL)则低表达,RPE细胞被高毒力肺炎克雷伯菌侵袭后分泌的MCP-1和IL-6的量分别是被经典肺炎克雷伯菌侵袭后的1.76倍和2.20倍,差异有统计学意义(tMCP-1=5.670,tIL-6=3.968,P均<0.05)。
  结论:
  相对于经典肺炎克雷伯菌,高毒力肺炎克雷伯菌的毒力更强,感染视网膜色素上皮细胞后,可引起更严重的炎症反应。
[硕士论文] 陈丹丹
中医五官科学(眼科) 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过分析内障眼病,包括高风内障、视瞻有色及络瘀暴盲患者中医体质类型分布情况,观察其中医体质类型分布规律,初步探讨内障眼病与中医体质的内在联系,为临床病因病机分析及防治提供科学的思路与依据。
  方法:选择2016年03月至2017年3月间于江苏省中医院眼科确诊高风内障、视瞻有色及络瘀暴盲患者132例作为受试对象,指导其自主填写中医体质调查表中基本信息及相关问题,按《中华中医药学会标准—中医体质分类与判定标准》中相关标准进行体质类型判定,初步分析内障眼病与中医体质类型相关性。
  结果:1.高风内障患者性别与年龄间没有明显差异,视瞻有色患者集中在中青年男性,且男性发病时间略早于女性,络瘀暴盲患者发病人数随年龄呈递增趋势;2.对比正常人群,内障眼病患者的体质类型存在明显的偏颇倾向。高风内障病例除外未收集到痰湿质与特禀质,各体质比例由高到低依次为:阳虚质47.5%、气虚质20%、气郁质15%、平和质7.5%、血瘀质5%、阴虚质和湿热质均为2.5%。总体虚性体质共28例,占70%,显著多于实性体质者;视瞻有色病例除外未收集到特禀质,各体质比例由高到低依次为:痰湿质26.09%、气郁质21.74%、阳虚质15.22%、气虚质13.04%、湿热质10.87%、阴虚质6.52%、平和质4.35%、血瘀质2.17%。总体实性体质略多于虚性体质,分别为60.9%及34.8%;络瘀暴盲患者各体质比例由高到低依次为:血瘀质19.57%、痰湿质17.39%、气郁质15.22%、阳虚质15.22%、气虚质13.04%、平和质6.52%、阴虚质6.52%、湿热质4.35%、特禀质2.17%。总体病理体质实性略多于虚性者,分别为56.5%和34.8%。3.内障眼病患者中男性偏颇体质以阳虚质、气虚质及痰湿质为多,分别为15例、14例、14例,女性偏颇体质以阳虚质和气郁质为主,分别为18例和15例。各年龄段患者体质病理体质明显高于正常人群,均以阳虚质多见,青年患者痰湿质和气郁质者也较为多见。
  结论:内障眼病患者具有一定的体质偏颇倾向,总体以气虚质和阳虚证为主。高风内障患者存在明显的体质偏颇,主要为阳虚质;视瞻有色患者中偏颇体质以痰湿质和气郁质多见;络瘀暴盲患者的偏颇体质主要为血瘀质。偏颇体质的分布在性别和年龄上均有所差别,男性以阳虚质、气虚质及痰湿质为多,女性以阳虚质和气郁质为主,对比中老年患者,青年患者除阳虚质分布较多,痰湿质和气郁质也多见。
[硕士论文] 田静
眼科学 安徽医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  统计我院老年性白内障超声乳化手术中并发症的发生率,分析术中出现的并发症并探讨相关的影响因素及防治措施。
  方法:
  采用回顾性研究方法,收集2013年~2015年在眼科住院进行老年性白内障超声乳化手术的1260例患者的临床资料,统计术中并发症的发生率,比较硬核及非硬核手术中并发症的发生率有无差别,并对74例术中并发症进行临床分析。术中并发症主要有下列4种:后囊膜破裂、术中虹膜损伤、角膜后弹力层脱离、角膜内皮损伤。
  结果:
  1.1260例住院行白内障超声乳化术的患者中有74眼术中发生了并发症,发生率为5.87%。最常见的并发症是后囊膜破裂,发生率为2.38%。2.白内障超声乳化手术晶体核硬度不同,并发症的发生率也不同,硬核术中并发症的发生率最高为6.59%.3.74例并发症中,后囊膜破裂30例,其中硬核24例,占80%,经术中降低灌注压、粘弹剂填充及前段玻璃体切割处理,人工晶体顺利植入囊袋内或睫状沟;术中虹膜损伤23例,术中补充粘弹剂、辅助钩协助下挡住虹膜避免反复进入超声乳针头,顺利完成手术;术中后弹力层脱离11例,经术中前房注射消毒空气或全氟丙烷,成功复位;角膜内皮损伤10例,避免前房内超声乳化,使用高质量的分散型粘弹剂,尽量联合使用各种劈核技术减少超乳能量和超乳时间,顺利完成手术,无角膜水肿失代偿发生。各例均早期发现,预后良好。
  结论:
  1、后囊膜破裂是老年性白内障超声乳化术中最常见的并发症。2、红光反射欠佳的硬核白内障术中并发症的发生率最高,是后囊膜破裂和虹膜损伤的主要危险因素,前房内超声乳化是产生角膜内皮损伤的主要因素,应得到足够重视。3、术中并发症早期发现早期恰当的处理,一般预后良好。
[硕士论文] 李瑞英
眼科学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  玻璃体可以支撑视网膜,减缓外力冲击;也可以储存氧气、葡萄糖、抗坏血酸等,支持相邻组织代谢;还可以避免视网膜与眼前段之间的物质扩散;同时玻璃体也是眼内最大的屈光物质,一旦损伤即不可再生。发育异常、组织退变、眼内炎症、眼外伤、眼内出血及全身疾病如糖尿病等均可以导致玻璃体发生病理变化,从而导致患者视力下降甚至失明。玻璃体视网膜疾病可以通过玻璃体切除术获得有效治疗,术后常需要填充合适的材料来维持眼球体积,支撑视网膜。水凝胶由于高含水量,优良的光学透明度和流变性能成为了玻璃体填充物研究热点。本实验通过体外检测温敏性羟丁基几丁糖(hydroxybutyl chitosan,HBC)凝胶的光学性质、物理学性质、成胶时间和急性眼刺激情况,分析温敏性羟丁基几丁糖凝胶进行玻璃体填充的可行性,并将温敏性羟丁基几丁糖填充兔眼玻璃体内,进一步探索其是否适合作为玻璃体填充物。
  材料和方法:
  实验一:温敏性羟丁基几丁糖作为玻璃体填充物的基础性能研究
  温敏性羟丁基几丁糖浓度越高,透明度越差,成胶温度也越低。其中0.8%温敏性羟丁基几丁糖在溶胶及凝胶状态,均为透明形态,并且适合在37℃成胶,符合人体温度,可适用于玻璃体内填充,所以本实验选取0.8%温敏性羟丁基几丁糖作为实验材料。(1)、体外测量0.8%温敏性羟丁基几丁糖凝胶含水率、透光率、屈光指数、比重、酸碱度和存储模量、损耗模量,与自然玻璃体进行比较。(2)反复测量并记录其溶胶转变为凝胶的相变时间。(3)、将0.1ml、0.3ml的0.8%温敏性羟丁基几丁糖分别滴入6只兔眼结膜囊,72小时内通过裂隙灯观察结膜、角膜、虹膜是否有急性炎症刺激反应。
  实验二:温敏性羟丁基几丁糖填充兔眼玻璃体安全性实验研究
  36只白兔随机分为三组,右眼为手术操作眼,进行玻璃体切除手术,术后A组白兔填充温敏性羟丁基几丁糖(HBC),B组填充透明质酸钠凝胶,C组填充平衡盐溶液(BSS)。术后1、3、7、14、21、28天分别行裂隙灯、直接检眼镜检查术眼各部位(结膜、角膜、前房、晶状体、玻璃体、眼底)情况,眼压计测量眼压。术后4周、8周、12周分别行眼部B超、眼底照相及视网膜光学相干断层成像等检查,并随机从三组中选取部分实验动物进行眼球摘除,制作病理切片,通过光学显微镜和电子显微镜观察超微结构改变。
  结果:
  1、0.8%温敏性羟丁基几丁糖凝胶含水率为98.7%、屈光指数为1.3321、透光率为99.95%、比重为1.008 g/cm3,物理性质及光学性质均接近于自然玻璃体,pH值相较于自然玻璃体(7.0~7.5)稍低,为6.97,不排除操作误差及温度影响。温敏性羟丁基几丁糖凝胶状态下储存能量(弹性)平均值为267.08±0.78 Pa,损耗模量(粘性)平均值为17±1.12Pa,属于弹性材料。温敏性羟丁基几丁糖4℃到37℃相变(溶胶→凝胶)平均用时为59±2s。将0.8%温敏性羟丁基几丁糖滴入实验动物结膜囊内72小时,兔眼穹窿部结膜可见凝胶残余物和少许分泌物,未见结膜充血、角膜损伤、虹膜粘连,兔眼瞳孔对光反射正常。
  2、玻璃体切除术后,A组(温敏性羟丁基几丁糖组)、B组(透明质酸钠组)、C组(BSS组)三组白兔均出现了暂时性眼内炎症反应,后期发生晶状体混浊,其中A组2例(16.7%),B组3例(25%),C组1例(8.3%)。A组眼压于术后7天与术前比较有差异(P<0.05),B组眼压于术后2月时降低,与术前比较有差异(P<0.05)。术后眼后节检查可见A组兔眼玻璃体内不透明,呈现灰白色团块状混浊,随时间变化团块逐渐变小,眼底模糊无法窥清。B组玻璃体透明度欠佳,眼底细节隐约可见。C组玻璃体透明,眼底细节清晰可见。组织病理学显示三组兔眼角膜及视网膜超微结构未见明显异常,其中视网膜平伏,结构层次清晰,未发生视网膜脱离及增生,但B组兔眼视网膜神经节细胞层细胞有所减少。
  结论:
  1、0.8%温敏性羟丁基几丁糖凝胶的光学性质和物理性质及粘弹性可以模拟自然玻璃体。
  2、0.8%温敏性羟丁基几丁糖填充兔眼玻璃体显示出良好生物相容性,但是会引起玻璃体的不透明和灰白色团块状混浊,目前尚不是理想的玻璃体替代物。玻璃体内水凝胶药物递送系统通常仅占据玻璃体腔的一小部分,它们并不一定要求眼内呈透明状,温敏性羟丁基几丁糖在玻璃体内药物递送系统中可有进一步研究。
[硕士论文] 李舒凝
眼科学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察氧化应激对人晶状体上皮细胞(human lens epithelialcells,HLECs)中衰老标记蛋白30(Senescence Marker Protein30,SMP30)表达变化的影响,为今后研究其在人晶状体上皮细胞及白内障发生发展过程中的作用奠定基础。
  方法:用不同浓度过氧化氢(0、100、200、300μ M)刺激人晶状体上皮细胞24小时,建立不同浓度急性氧化应激模型,通过光镜、MTT检测分析细胞形态、状态,Western blot检测SMP30蛋白的表达情况。用不同浓度过氧化氢(0、25、50、75、100、125、150μM)刺激人晶状体上皮细胞2周,建立慢性氧化应激模型,诱导细胞衰老,通过光镜、MTT、β-半乳糖苷酶衰老细胞染色、细胞周期检测细胞氧化应激情况及评估细胞状态,用q-PCR、Western blot检测SMP30基因及蛋白的表达变化。
  结果:过氧化氢刺激HLECs24小时,随着过氧化氢浓度的增高,各处理组细胞在光镜下可见密度逐渐下降,变大变圆,300μM处理组细胞破碎,MTT结果提示细胞生存率逐渐降低,各浓度处理组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),SMP30在100、200μ M处理组的蛋白表达量均较对照组升高(P均<0.05)。过氧化氢刺激HLECs14天后25μ M处理组细胞形态与对照组无明显差异,50-125μ M处理组细胞密度逐渐下降,细胞呈衰老状态,150μ M处理组细胞碎裂。MTT结果提示25-50μ M处理组较对照组相比生长曲线逐渐下移,75μ M处理组仅维持细胞基本代谢活性,100-150μ M处理组生长曲线则在早期大幅下降并维持。β-半乳糖苷酶衰老细胞染色显示随过氧化氢浓度升高,衰老阳性细胞增多,75-150μ M处理组阳性细胞较对照组明显增多且>90%,细胞周期则提示50-100μ M处理组细胞增值阻滞于S和G2/M期,PI值逐渐升高。SMP30在25-100μ M处理组与对照组相比mRNA表达均下降(P均<0.01)。在25-50μ M处理组SMP30蛋白的表达量与对照组相比无明显差异(P=-0.695,P=-0.126)。在75-100μ M处理组SMP30蛋白的表达量均较对照组明显下降(P均<0.01)。
  结论:SMP30蛋白在处于急性氧化应激状态下的人晶状体上皮细胞中表达上调。而在慢性氧化应激诱导衰老的早期阶段SMP30表达无明显变化,随着氧化应激增加和衰老加剧,SMP30的表达减少。SMP30参与人晶状体上皮细胞氧化应激损伤过程,可能与细胞衰老及白内障的发生发展有关。
[硕士论文] 李雪
中西医结合基础 广州中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究石斛酚(gigantol)、丁香酸(syringic acid)与人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)相互作用机制,从单个活细胞的力学形态方面阐明石斛抗糖尿病性白内障(diabetic cataract,DC)的作用机制。
  方法:
  1.采用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)检测石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖(50mM)造模之后的HLECs的细胞内超微结构,对其细胞内的细胞核、线粒体、内质网等结构变化进行详细地考察;
  2.在活细胞条件下,利用原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)对石斛酚、丁香酸作用于高葡萄糖造模之后的单个HLECs细胞表面形貌变化进行成像,并通过单个活细胞的表面形貌计算药物作用之后的细胞表面粗糙度与细胞硬度等细胞力学形态性质的改变;
  3.利用表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS),分别对石斛酚、丁香酸作用于高葡萄糖造模时间24h与48h之后的HLECs细胞膜磷脂结构C-C链的链内与链间的结构变化进行考察,并通过拉曼光谱相对强度的变化计算石斛酚、丁香酸对HLECs细胞膜流动性的具体影响;
  4.利用细胞免疫荧光的检测方法,通过激光共聚焦扫描显微镜考察石斛酚、丁香酸作用于葡萄糖造模之后HLECs细胞的骨架蛋白F-actin的影响。
  结果:
  1.通过TEM实验考察结果显示:在正常组中,HLECs细胞内的结构呈现出正常细胞形态,细胞核的染色质均匀分布,并且线粒体嵴清晰、完整;在模型组中,利用高浓度葡萄糖对HLECs造模之后,HLECs内的细胞结构表现出明显病理特征,细胞质里面出现大量空泡现象,细胞核内的染色质发生明显沉积,颜色加深,而细胞器线粒体则表现出明显的肿胀现象,其线粒体嵴发生断裂,及纹路模糊的现象,内质网也呈现出明显的肿胀现象;而通过药物石斛酚、丁香酸作用于之后,HLECs细胞内结构的病理程度得到相应地改善,可以发现细胞核中染色质聚集现象减轻,分布较均匀,而线粒体与内质网的肿胀程度也得到相应地减轻,线粒体嵴恢复至完整状态,并且石斛酚药物组对高浓度葡萄糖造模之后HLECs细胞内结构病理变化的减轻程度优于丁香酸药物组。
  2.通过AFM在活细胞条件下对HLECs的细胞表面形貌进行考察之后,结果显示:在正常组中,细胞高度为3.5±0.35μm,细胞表面粗糙度Ra为112±3.25nm,Rq为155±2.98nm,细胞硬度为5.6±0.56KPa;在模型组中,HLECs细胞高度与细胞硬度发生了明显地变化,细胞高度为1.8±0.25μm,细胞表面粗糙度Ra为144±2.16nm,Rq为176±2.67nm,细胞硬度为11.6±0.91KPa,细胞高度明显降低,细胞粗糙度与细胞硬度明显升高,与正常组相比,差异具有统计学意义,P<0.01;石斛酚药物组,细胞高度为3.1±0.15μm,细胞表面粗糙度Ra为114±3.45nm,Rq为135±5.12nm,细胞硬度为7.5±0.45KPa,与模型组相比,细胞高度明显上升,细胞粗糙度与细胞硬度明显降低,差异具有统计学意义,P<0.01;丁香酸药物组中,细胞高度为2.8±0.25μm,Ra为132±4.12nm,Rq为161±3.91nm,细胞硬度为8.9±0.45KPa,与模型组相比,细胞高度明显上升,细胞表面粗糙度与细胞硬度降低,差异具有统计学意义,P<0.05;石斛酚与丁香酸药物联合组中,3.8±0.43μm,细胞表面粗糙度Ra为104±4.21nm,Rq为121±2.76nm,细胞硬度为7.51±0.31KPa,与模型组相比,细胞高度升高,粗糙度与细胞硬度降低,差异具有统计学意义,P<0.01。此结果显示出石斛酚、丁香酸可以在一定程度上恢复高糖造模之后的HLECs的细胞表面粗糙度、细胞硬度等细胞力学形态性质;
  3.通过拉曼光谱实验,结果显示:在模型中,HLECs的细胞膜磷脂结构中的C-C链内的纵向有序性参数Strans和横向相互作用参数Slat较正常组升高了25%和25.9%,细胞膜的流动性降低,差异具有统计学意义,P<0.01;在石斛酚组中,Strans与Slat较模型组降低了16%和20%,细胞膜的流动性上升,差异具有统计学意义,P<0.01;在丁香酸组中,Strans与Slat较模型组降低了2.9%和3%;石斛酚与丁香酸联合组中,Strans与Slat较模型组降低了5%和20.8%,细胞膜的流动性上升,差异具有统计学意义,P<0.01。由此,药物石斛酚、丁香酸可以在一定程度上有效地升高HLECs的细胞流动性。
  4.通过激光共聚焦对细胞免疫荧光检测之后,结果显示:在正常组中,细胞骨架蛋白F-actin的排列有序,靠近细胞膜;在模型组中,骨架蛋白F-actin的排列表现出弥散,杂乱现象,在细胞膜附近的比列减少;而在石斛酚、丁香酸药物组,使HLECs的细胞骨架蛋白F-actin的表达与排列有序程度得到一定程度上的恢复,显示出药物石斛酚与丁香酸可以在一定程度上恢复细胞HLECs的细胞骨架的有序性。
  结论:
  石斛酚、丁香酸能有效地降低高浓度葡萄糖所致的HLECs细胞内结构的病理损伤,以及高糖造模之后的HLECs细胞力学形态的变化。在此过程中石斛酚、丁香酸通过影响HLECs的细胞膜脂质结构的C-C链及细胞骨架结构的有序度达到增强HLECs的细胞流动性,进一步有效降低HLECs细胞膜表面粗糙度和细胞硬度,由此达到改善细胞力学形态作用。由此石斛酚与丁香酸可以通过改变HLECs的细胞力学形态进一步发挥抗糖尿病性白内障的药理作用,在单细胞动态成像水平上为石斛抗糖尿病性白内障提供基础资料。
[硕士论文] 冉灵霞
眼科学 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  鉴定采用基因打靶技术的TTR基因Gly83Arg突变小鼠模型是否是研究Gly83Arg家族遗传性玻璃体淀粉样变性的稳定模型,并确证该突变点是否为该病遗传学分子学特征。
  方法:
  饲养SPF级F3代小鼠15只(NEO-;FLP-;TTR+/-),6只雄小鼠,9只雌小鼠。对照组小鼠(C57BL/6)10只。每周腹腔注射一次2.5%水合氯醛(0.1ml/25g)麻醉,采用复方托吡卡胺滴眼液散瞳,裂隙灯观察小鼠屈光介质,发现玻璃体浑浊即处死小鼠,送肝脏组织行基因测序;随机数字表选实验组4只与对照组小鼠4只取心脏、脑组织、肝脏、肾脏、眼球做石蜡切片,采用刚果红染色及偏振光检测淀粉样物质,免疫组化定位检测TTR蛋白;研磨肝脏提取RNA与蛋白质,荧光定量PCR检测TTR基因mRNA表达、Western Blot检测TTR基因蛋白质表达。
  结果:
  送检测序的C57BL/6模型小鼠8只均发生基因突变,第3外显子的107位碱基处出现杂合突变,第83氨基酸的密码子由GGC突变成CGC,即Gly83Arg;刚果红染色及偏振光检测TTR突变小鼠玻璃体呈阳性,肝脏、肾脏、心脏、脑组织均呈阴性;免疫组化检测结果显示TTR对照组肝脏呈阳性,玻璃体、肾脏、心脏、脑组织为阴性,模型小鼠玻璃体呈阳性,肝脏、肾脏、心脏、脑组织均为阴性;荧光定量PCR结果显示模型小鼠mRNA表达低于对照组,差异有统计学意义(t=3.030,P=0.023);Western Blot检测模型小鼠肝脏 TTR基因蛋白质表达低于对照组,差异有统计学意义(t=3.224,P=0.018)。
  结论:
  1.TTR Gly83Arg确为家族遗传性玻璃体淀粉样变性的分子学特征且仅表现为眼部发病;
  2.TTR Gly83Arg突变的C57BL/6小鼠模型建立成功,该品系小鼠可用于家族遗传性玻璃体淀粉样变性的研究。
[硕士论文] 任含笑
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:白内障严重影响人类健康,是最常见的致盲原因之一。其中绝大部分是随年龄增长所引起的老年性白内障。目前国内外治疗老年性白内障的方法仍集中于手术治疗,缺乏有效的预防及早期治疗药物。因此,深入研究晶状体浑浊的发生、发展机制,筛选有效的抗晶状体浑浊药物,尤其提倡从早期预防着手、尽力降低低龄患者的二次手术率,不仅能减轻患者痛苦,而且具有重要的社会、经济效益。
  哺乳动物晶状体中的晶体蛋白,主要分为α、β、γ三大类。此前,文献研究大都集中在α族晶体蛋白类的研究,挖掘其“伴侣蛋白”对抗晶状体浑浊的作用。但是,进一步研究发现,βB2晶体蛋白的结构和功能均十分特殊,且在哺乳动物晶状体中该蛋白成分含量最高,故其结构及水溶性成分的水平对于维持晶状体的透明性和折射率至关重要。如能适度调控其表达,有望成为延缓晶状体浑浊进程的有效手段。因此,βB2晶体蛋白更加适合作为年龄相关性晶状体功能研究的靶蛋白。为此,探寻可调控βB2晶体蛋白表达的上游microRNA,并明确其调控机制,从而实现调控βB2晶体蛋白在晶状体中的表达量,进而延缓晶状体浑浊的进程。
  MicroRNAs是一类非编码单链小分子RNA,在胚胎发育、分化,细胞增殖、凋亡、代谢和适应环境压力等进程的转录过程中起重要作用。研究表明miRNAs在眼部组织,包括角膜、脉络膜小疣、视网膜、玻璃体、晶状体和中均有特异性表达,并可能通过调控晶体蛋白的表达,参与晶状体混浊的发生、发展过程。因此,探究特异性调控βB2晶体蛋白表达的miRNA,对老年性白内障的早期预防和治疗具有重要价值。
  本文探讨miR-326在人晶状体上皮细胞HLEC-B3中的功能及其调控Crybb2可能的分子机制,并验证了miR-326在硒性白内障模型大鼠晶状体中的治疗作用,为老年性白内障的早期预防和治疗提供了新途径。
  我们首先通过数据库的筛查和文献阅读,筛选出miR-326、miR-204-5p、miR-491-5p、miR-330-5p四个与βB2基因相关的miRNA。之后采用实时荧光定量PCR验证了miR-326、miR-204-5p在βB2基因敲除(KO)小鼠晶状体中的表达量与C57BL/6野生型(WT)小鼠相比明显下调。其中,miR-326的表达差异最显著,提示晶状体中miR-326水平可能与Crybb2的表达有某种相关。随后,我们在人晶状体上皮细胞HLEC-B3中,用双荧光素酶报告基因实验证实miR-326的下游靶基因为FGF1。进一步实验证实:在晶状体上皮细胞中抑制miR-326的表达可促使FGF1的表达量增加,进而上调Crybb2的表达量,最终有助于抗晶状体混浊的发生、发展。由此,初步阐明了在细胞中miR-326调控Crybb2的作用机制。此外,通过硒性白内障模型大鼠晶状体中的研究也支持上述结论。
  综上所述,本实验探寻出一条可以通过抑制晶状体内miR-326的表达,促使FGF1的表达、增加晶状体内βB2晶体蛋白表达量,从而有效延缓老年性白内障的新途径;并以此为基础申报了国家发明专利;拟开发以miR-326为中心的新型抗晶状体浑浊药物,为老年性白内障的“未病先防”提供理论及实验依据。
  第一部分 WT与Crybb2-/-小鼠晶状体中miRNA的筛查
  目的:筛查与βB2具有靶向联系,且在WT与Crybb2-/-小鼠晶状体中表达差异较大的miRNA。
  方法:通过小鼠基因鉴定技术,鉴定WT、Crybb2-/-小鼠;通过PicTar、SangermiRBase及TargetScan algorithms数据库及通路分析筛选出与βB2基因之间存在靶向性关系的miRNA;采用qRT-PCR验证上述候选靶基因在WT、Crybb2-/-小鼠晶状体中的表达差异。
  结果:(1)挑选出四个与βB2之间存在靶向性关系的miRNA: miRNA-326、miR-204-5p、 miR-330-5p、miR-491-5p;(2)通过qRT-PCR筛查发现miR-326、miR-204-5p在WT、Crybb2-/-小鼠晶状体中表达差异显著,尤其是miR-326的表达差异更为明显。
  结论: miR-326可能通过某种途径调控βB2晶体蛋白的表达。
  第二部分 MiR-326在晶状体上皮细胞(HLEC-B3)中调控Crybb2表达的机制探究
  目的:探讨miR-326通过何种通路影响下游基因、调控Crybb2表达。
  方法:(1)采取双荧光素酶报告基因实验,明确miR-326的下游靶基因;在HLEC-B3细胞分别转染miR-326 agomir(模拟物)和antagomir(抑制体)72h后,采用western blot、免疫荧光技术检测下游靶基因及Crybb2的表达情况;(2)在HLEC-B3细胞中分别转染FGF1因子及shFGF1,48h后采用western blot检测Crybb2的表达变化;(3)在HLEC-B3细胞中分别转染FGF1因子及shFGF1,2h后两组分别转染miR-326antagomir,培养72h后采用western blot分别比较上述FGF1因子组及shFGF1组与阴性对照组中Crybb2表达的变化;(4)在HLEC-B3细胞中分别转染miR-326 agomir和antagomir48h后,采用200μM H2O2处理HLEC-B3细胞24h,诱导细胞凋亡,采用流式细胞仪观察细胞凋亡率。
  结果:(1)实验证实miR-326的下游靶基因为FGF1;(2) FGF1可以有效调控晶状体上皮细胞中Crybb2的表达;(3)证实在HLEC-B3中抑制miR-326表达后FGF1的表达量上调,最终使Crybb2高表达;反之,在HLEC-B3中增加miR-326的表达量后,FGF1的表达量下调,最终降低Crybb2的表达;(4)在HLEC-B3中下调miR-326的表达量使FGF1表达上调,可以抑制晶状体上皮细胞的凋亡。
  结论:(1) miR-326通过与靶基因FGF1的3'-UTR结合而特异性抑制FGF1的表达,从而抑制Crybb2的表达;(2)在晶状体上皮细胞中抑制miR-326的表达可以抑制其凋亡,进而与晶状体浑浊的发生、发展相关。
  第三部分 MiR-326在硒性白内障模型大鼠晶状体内调控Crybb2表达并延缓白内障进展的探究
  目的:探讨miR-326在硒性白内障模型鼠晶状体内调控Crybb2表达并延缓白内障进展的作用。
  方法:9天龄SD大鼠皮下注射亚硒酸钠溶液(25μmol/kg),构建亚硒酸钠白内障模型鼠;左眼为阴性对照,滴加miR-326 antagomir(抑制体)的阴性对照,右眼为治疗眼,滴加miR-326抑制剂antagomir(抑制体),阴性对照与治疗眼,每天早晚两次滴药,每次100μl,每天每只眼球共用药1nmol,观察白内障浑浊进展;采用qRT-PCR检测晶状体内药物作用情况,并采用western blot技术检测晶状体内FGF1、Crybb2的表达变化。
  结果:(1)硒性白内障模型鼠眼滴miR-326 antagomir(抑制体)后,其晶状体内miR-326表达量下降,FGF1及Crybb2表达量升高。(2)滴加miR-326 antagomir(抑制体)的治疗眼与阴性对照眼相比白内障进程显著减缓。
  结论:实验证实在硒性白内障模型鼠晶状体内,通过miR-326的抑制剂antagomir靶向上调FGF1的表达,进而促进晶状体内Crybb2的表达,可以在一定程度上延缓白内障的进展。
  
[硕士论文] 丁慧芳
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:视神经是中枢神经系统的重要组成部分,随着哺乳动物中枢神经系统的成熟,视神经损伤后的再生修复将变得极其困难。临床上大多数创伤性视神经疾病、退行性视觉通路疾病或缺血性视神经损伤的患者将承受不可逆的视力损害,更严重的会导致视力完全丧失,因此关于视神经损伤后再生修复的研究对于患者视力的提高及生活自信心的增强有重要的实践意义。视神经的起始部是视网膜处的视盘,而视网膜的视盘处汇集了大量视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)的轴突。在高等动物中,视网膜视觉输出的相关细胞只有RGCs,所以关于视神经损伤后视网膜神经节细胞的探讨对视网膜的再生修复来说是很有必要的。目前,关于视神经损伤后修复再生的方向主要关注于如何在视神经损伤后保留更多的RGCs、如何使保留的RGCs轴突延长、如何恢复视觉靶点之间的联系和功能三个方面。
  晶状体损伤如何促进受损视神经的再生是当今科研范畴的一大热点和难点。国内外学者从调节各个细胞内信号通路、清除再生抑制因子、激活神经胶质细胞、单独或联合应用神经营养因子等方面进行了一系列深入的探讨,从不同方面都证明了大鼠视神经损伤伴晶状体损伤可以在一定水平上促进视神经的再生。本课题组对神经损伤后视网膜中Müller细胞、Nogo-AmRNA及Nogo-A的表达,巨噬细胞、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、锌指蛋白核转录因子4(Kruppel-like transcription factor4,KLF4)、白血病抑制因子(1eukemia inhibitory factor,LIF)的实验研究中,一方面从不同的角度运用了不同的方式探索了视神经晶状体联合损伤促进受损视神经的再生修复的机制,另一方面也为视神经损伤后的治疗策略的制定、治疗药物的选用、治疗效果的评估提供了新的思路。本次通过对视神经损伤伴晶状体损伤PKC活性与NF-κBp65蛋白表达量的研究,对晶状体损伤后促进视神经再生的机制进行更深一步的探索。
  目的:
  通过对单纯视神经钳夹损伤及视神经钳夹损伤联合晶状体损伤大鼠视网膜中PKC活性与NF-κBp65蛋白表达量的研究,初步探讨视神经损伤伴晶状体损伤促进视神经再生修复的作用机制,证实晶状体损伤可通过对PKC与NF-κBp65表达的调节来发挥保护视网膜神经节细胞的作用,为临床治疗视神经损伤提供新的靶点和思路。
  方法:
  清洁健康Wistar成年大鼠60只,雌雄不分,按随机数字表法分成四组:正常对照组6只(即A组),假手术组18只(仅暴露而不损伤视神经组,即B组),视神经钳夹损伤组18只(即C组),视神经钳夹损伤联合晶状体损伤组18只(即D组)。A组于正常饲养7d后麻醉过量处死大鼠6只,B组、C组、D组于术后7d、14d、21d分别麻醉处死大鼠各6只。各组每个时间点取2只大鼠行荧光金逆行标记后RGCs进行观察并计数,2只应用氚标记的二丁酸佛波醇脂(([3H]PDBu))检测各组大鼠不同时间点视网膜PKC的活性变化,2只行Western blot检测视网膜NF-κBp65蛋白的表达情况。
  结果:
  1.荧光金标记的大鼠视网膜神经节细胞
  在荧光显微镜下观察A组及B组大鼠视网膜铺片中荧光金标记的RGCs,可见被荧光金标记的RGCs的形态学特征具有特异性,呈金黄色,形状大多数为圆形或椭圆形,边界较清晰,大小不一,部分细胞突起清晰可见,A组及B组RGCs分布在各个时间点比较稳定。而C、D组视网膜铺片,随着钳夹损伤时间的增加,RGCs的分布逐渐稀疏,RGCs的形状缩小变圆,荧光着色增强,突起肿胀或消失。损伤后7d、14d、21d同一时间点C、D组与B组RGCs计数及标识率相比,差异均有统计学意义(均 P<0.05);同一时间点,D组RGCs计数高于C组,且差异均有统计学意义(均P<0.05);而A、B两组RGCs计数相互比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。
  2.各组PKC活化水平之间相互比较
  A组及B组PKC活化水平基本稳定,C组及D组视网膜在伤后7d、14d、及21d均可见PKC的活性增加,PKC的活性在视神经钳夹伤后7d后显著增加,并在视神经钳夹伤后14d达到高点,在21d在仍维持较高水平。B组暴露视神经后7d、14d、及21d的PKC活性与A组PKC的活性相比差异无统计学意义(P>0.05);C组及D组视神经钳夹伤后7d、14d、21d与B组同一时间点PKC的活性相比有统计学意义(P<0.05);同一时间点,D组神经钳夹伤后PKC的活性高于C组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。
  3.各组NF-κBp65蛋白表达量之间相互比较
  A组、B组NF-κBp65蛋白表达量相互比较,差异无统计学意义(P>0.05),C组及D组视网膜视神经钳夹伤后可见NF-κB p65蛋白表达量增加,在视神经钳夹伤后14d后达到高点后开始下降。在相同时间点C、D两组相互比较,C组神经钳夹伤后的NF-κB p65蛋白表达量高于D组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1.随着视神经钳夹损伤后时间的延长,RGCs计数不断下降,PKC活化水平及NF-κBp65磷酸化水平不断增高至最高点后开始下降。
  2.视神经钳夹损伤后,晶状体损伤可以上调PKC活化水平,下调NF-κB p65蛋白表达量。
  3.视神经损伤后,PKC及NF-κB可能参与了晶状体损伤保护神经节细胞的机制。
[硕士论文] 杨天恒
细胞生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:晶体后囊膜混浊(Posterior Capsular Opacification,PCO)是人工晶体植入术后导致视力下降甚至失明的最普遍并发症。白内障手术残留的晶状体上皮细胞的间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是PCO病理过程中至关重要的分子事件,对晶状体上皮细胞发生EMT的调控机制研究可为PCO临床药物的选择和研发提供新的切入点。
  AKT属于苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶家族,包含三个独立基因编码的异构体:AKT1、AKT2和AKT3,它们具有相似的蛋白质一级结构,以AKT1为例,氨基末端是PH结构域,中间是催化结构域,含有FPQFSY疏水基序的羧基末端,催化结构域中苏氨酸残基(Thr308)和疏水基序中丝氨酸残基(Ser473)的磷酸化修饰是激活AKT1的必要条件。尽管有研究指出PI3K/AKT信号通路与晶状体上皮细胞EMT的关联性,但AKT异构体是否均参与调控晶状体上皮细胞EMT,以及其调控EMT过程中基因表达改变的机制仍未被阐明。
  本实验室之前研究发现AKT1和AKT2在小鼠晶状体上皮组织中呈现主导性表达。为探索AKT1和AKT2调控晶状体上皮细胞EMT的分子机制,我们建立了TGFβ1诱导的人类晶状体上皮(Human LensEpithelium,HLE)细胞发生EMT的模型。当利用PI3K化学抑制剂LY294002抑制HLE细胞中内源性AKT蛋白激酶的激活时,TGFβ1诱导的EMT标志性基因Fibronectin等和转录因子SNAIL1的表达上调被显著削弱;进一步用特异性shRNA敲低AKT1以及AKT2所建立的稳定HLE细胞系研究发现AKT1和AKT2敲低能显著削弱TGFβ1诱导的Fibronectin和SNAIL1的表达上调;最后我们构建了AKT1和AKT2重组表达质粒,并利用定点突变技术构建了显性负性突变的突变体质粒: AKT1-T308A/S473A和AKT2-T309A/S474A。与转染空载体的HLE细胞相比较,过表达野生型AKT1或者AKT2的HLE细胞能够显著增加TGFβ1诱导的Fibronectin和SNAIL1的表达水平;但显性负性突变的质粒的过表达并不能显著增加TGFβ1诱导的Fibronectin和SNAIL1的表达水平。综上所述,我们证实AKT蛋白激酶异构体AKT1和AKT2能促进HLE细胞的EMT。
  我们进一步发现GSK3β并非AKT1和AKT2促进HLE细胞EMT的主要下游靶分子,我们正在深入研究可能的靶分子及其机制。我们的实验充分确定了AKT1和AKT2在晶状体上皮细胞EMT过程中的调控作用,为后续的分子机制研究奠定了良好的基础,为PCO的治疗策略提供理论指导。
[硕士论文] 倪宁
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:引言
  根据患者角膜球面像差选择不同球面像差的人工晶状体,满足患者对于视觉质量的要求,已经被许多专家认真研究和认可。本论文就是根据角膜球面像差为患者植入人工晶状体,以期达到术后最佳目标球差值,达到最佳视觉效果。
  目的
  植入不同球面像差的人工晶状体后,对比不同的全眼球面像差下人眼的视觉质量。
  方法
  收集2015年11月~2016年7月在郑州大学第一附属医院眼科本治疗小组接受白内障超声乳化+IOL植入术的年龄相关性白内障患者55例63眼,患者年龄范围为50~70岁,除了年龄相关性白内障以外,无其他眼部疾病,散光<1.5D。分别依据患者术前角膜球面像差(spherical aberration,SA)植入不同SA的IOL,根据术后全眼SA值,将患者分为三组,A组术后的全眼SA为(-0.2±0.05)μm, B组为(0±0.03)μm, C组为(+0.1±0.03)μm。比较三组术后3月的裸眼视力(uncorrected visual acuity,UCVA)、最佳矫正视力(best-corrected visual acuity, BCVA)、全眼总高阶像差( high order aberration, HOA)、调制传递函数值(modulation transfer function,MTF)以及患者满意度调查。
  结果
  三组术后3月的UCVA,差异无统计学意义(P=0.153);三组术后3月的BCVA,差异无统计学意义(P=0.999)。术后3月的全眼HOA比较,三组之间差异无统计学意义(P=0.268)。在5周/度(c/d)、10周/度(c/d)、15周/度(c/d)、20周/度(c/d)、25周/度(c/d)、30周/度(c/d)的空间频率下,三组术后3月的MTF值,A组<B组<C组,差异有统计学意义(P<0.05)。三组患者满意度调查A组<B组<C组,差异有统计学意义(F=19.700,P=0.000)。
  结论
  根据角膜球面像差个性化植入IOL,使得术后全眼球面像差为+0.1μm时,视觉质量较好,满意度较高。
[硕士论文] 孔德倩
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  白内障是世界范围内造成人类致盲的主要眼病。老龄人口的增长导致患病率也逐年上升。目前白内障复明的主要方法是手术治疗。白内障手术的普及和人工晶状体不断地更新和完善给千百万白内障患者重新带来光明,并且国家每年出资委派医疗队为贫困白内障患者免费手术治疗,这无疑增加社会的经济负担。由于我国人口基数大,部分偏远地区医疗条件差以及手术费用昂贵等诸多原因,仍有部分白内障患者无法得到有效的手术治疗。因此研究白内障的发病机理对防治和延缓白内障的发生发展具有重要意义。内质网在人体内发挥重要的调节代谢作用,当机体受到外界刺激,机体内环境发生相应改变,为对抗这种刺激便会诱发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),然而过强的ERS就会造成细胞损伤引起凋亡。近几年有不少学者研究ERS与年龄相关性白内障的发病机制相关。我们前期实验验证Smac高表达与晶状体混浊有关,然而缺乏进一步研究和探讨,本实验主要分为两个方面研究,一方面是探讨Smac与年龄相关性白内障晶状体混浊是否有关,另一方面是拟下调Smac表达后通过内质网应激途径对人晶状体上皮细胞产生的影响。
  目的:
  1.探讨Smac是否与白内障发生有关。
  2.研究Smac通过内质网应激途径对人晶状体上皮细胞的影响。
  方法:
  1.于本院收集人晶状体前囊膜组织,收集157例(169只眼)年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜片及5例正常人(10只眼)捐献的晶状体前囊膜。白内障患者晶状体的混浊类型根据Emery核硬度分级标准,检测Smac在人类晶状体前囊表达,并采用HE染色和免疫组化半定量法分析Smac和白内障发生发展的关系。
  2.选取对数期细胞株,通过RNA干扰技术使Smac的表达下调。用H2O2诱导内质网应激,实验分为四组:PBS组、H2O2组、siRNA-NC+H2O2组,siRNA-Smac+H2O2组。
  3.转染进行24h后采用蛋白印迹法(Western blot)筛选出最佳干扰质粒。
  4. CCK-8法(Cell Counting Kit-8)筛选出合适的H2O2浓度诱导细胞凋亡率接近50%,并检测下调Smac的表达后对人晶状体上皮细胞活力的影响。
  5.转染进行24-36h后,运用Annexin V-APC/PI法检测PBS组、H2O2组、siRNA-NC+H2O2组,siRNA-Smac+H2O2组的细胞凋亡率。
  6.逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)检测各组GRP78、CHOP、BAX/Bcl-2及caspase-3在mRNA水平的表达情况。
  7. Western Blot检测GRP78,CHOP,Bax/Bcl-2及cleaved caspase-3检测蛋白的表达情况。
  结果:
  1.免疫组化半定量结果表明,ARC患者的前囊膜中Smac的表达高于正常人对照组,轻度和中度白内障患者中Smac的表达与晶状体混浊没有统计学差异,重度和全白的白内障患者中晶状体混浊程度越重,Smac表达的阳性率越高。
  2.筛选出最佳干扰质粒为siRNA-Smac3,能够有效下调Smac的表达。
  3.CCK-8法检测出细胞凋亡率接近50%的H2O2的浓度为200μmol/L,作用时长为24h,下调Smac可增加LECs的细胞活力。
  4.流式细胞仪检测各组凋亡率依次为PBS组(1.7±1.2)%、H2O2组(40.1±3.9)%、siRNA-NC+H2O2组(45.3±4.4)%,siRNA-Smac+H2O2组的凋亡率(26.5±2.8)%,与H2O2组相比,Smac的下调能够使凋亡率下降(P<0.05)
  5.RT-PCR检测出siRNA-Smac+H2O2组比较H2O2组中的GRP78、CHOP、caspase-3及BAXmRNA表达减弱,Bcl-2在mRNA水平表达上调。
  6. Western blot检测各组细胞结果显示Smac下调后GRP78、CHOP、cleaved caspase-3、Bax蛋白水平的表达下降,Bcl-2相应增多。
  结论:
  Smac与年龄相关性白内障密切相关,下调Smac的表达能够抑制内质网应激途径阻止人晶状体上皮细胞的凋亡。
[硕士论文] 黄丙瑶
临床医学(眼科学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的
  对Balanced平衡能量系统的超声乳化手术与扭动超声乳化手术的临床应用进行对比研究,观察两者对白内障不同硬度核的临床效果。
  方法
  选取122眼(120例)核硬度在Ⅲ~Ⅳ级(EMERY分级)的老年性白内障纳入本研究,随机分为试验组(Balanced平衡能量系统)和对照组(扭动超声系统),试验组59眼(58例),Ⅲ级核31眼(31例),Ⅳ级核组28眼(27例);对照组63眼(62例),Ⅲ级核33眼(32例),Ⅳ级核30眼(30例)。术前常规眼部检查,行生物测量,利用IOLMaster或A超计算人工晶体度数后,完成超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术。观察对比两组术前和术后1d、1wk、1m、3m的裸眼视力(Uncorrectedvisualacuity,UCVA)、最佳矫正视力(Bestcorrectedvisualacuity,BCVA)及眼压(Intraocularpressure,IOP);术前和术后3m的角膜内皮细胞密度(Cornealendothelialcelldensity,ECD),计算角膜内皮细胞丢失率:(术前ECD-术后3mECD)/术前ECD×100%;记录术中累计消耗能量(Cumulativedissipatedenergy,CDE)、手术时间(Casetime,CT)、灌注抽吸时间(Aspirationtime,AST)及灌注液用量(Estimatedfluidused,EFU);记录术后1d裂隙灯观察情况。
  结果
  试验组和对照组术后视力均较术前明显提高,差异有显著统计学意义(P<0.01);试验组术后1d的BCVA(0.08±0.11)好于对照组(0.12±0.14),差异有统计学意义(P<0.05);其余时间段比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅳ级核比较中,试验组术后1d的UCVA、BCVA(0.15±0.10、0.09±0.14)均好于对照组(0.19±0.11、0.26±0.21),差异有统计学意义(P<0.05);其余时间段比较差异无统计学意义(P>0.05)。在对照组中,Ⅲ级核亚组术后1d的UCVA、BCVA(0.19±0.11、0.08±0.04)均好于Ⅳ级核亚组(0.23±0.12、0.14±0.21),差异有统计学意义(P<0.05);其余时间段比较差异无统计学意义(P>0.05)。试验组和对照组术后3m的ECD均较术前减少,差异有显著统计学意义(P<0.01);试验组术前、术后3m的ECD及角膜内皮细胞丢失率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅳ级核比较中,角膜内皮细胞丢失率试验组(4.63±4.10)小于对照组(6.63±4.49),差异有显著统计学意义(P<0.01);其余项目比较差异无统计学意义。两组组内Ⅲ级核亚组术前、术后3m的ECD及角膜内皮细胞丢失率与Ⅳ级核亚组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。术中CDE、AST及EFU的比较,试验组(12.04±6.36、144.51±38.71、36.84±8.44)均低于对照组(16.22±11.80、147.40±54.48、43.58±14.38),差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ级核比较中,试验组CDE(7.61±2.20)低于对照组(8.28±3.40),差异有统计学意义(P<0.05);Ⅳ级核比较中,试验组CDE、AST及EFU(17.33±5.81、168.56±37.22、41.31±7.87)均低于对照组(25.32±11.69、188.06±54.17、53.56±14.25),差异有统计学意义(P<0.05)。在试验组中,Ⅳ级核亚组CDE、AST高于Ⅲ级核亚组,差异有统计学意义(P<0.05);在对照组中,Ⅳ级核亚组CDE、AST及EFU均明显高于Ⅲ级核亚组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。术后1d裂隙灯观察情况:试验组所有患者角膜透明,房水清亮,IOL居中。对照组出现1例切口角膜水肿,3例房水混浊,其余患者均角膜透明,房水清亮,IOL居中。
  结论
  Balanced平衡能量系统的超声乳化手术与扭动超声乳化手术在处理不同硬度核老年性白内障时,都表现出较高的安全性及高效性,而前者可使超声乳化手术过程中的超声能量降低、灌注抽吸时间缩短及灌注液用量减少,在硬核的应用中具有更明显的优势。
[硕士论文] 韩玉彤
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  高度近视眼是指屈光度数>-600D的近视眼,高度近视眼通常伴有视网膜、脉络膜、及巩膜等一系列退行性病变的特点,临床上常见的高度近视合并白内障患者中以核性混浊和后囊膜下混浊居多,此类并发性白内障患者往往在并发的早期就有明显的临床表现,影响日常生活[1]。
  目前高度近视合并白内障患者的超声乳化吸除联合人工晶状体(intraocularlens,IOL)植入术已经在临床广泛展开,此种手术的安全性和可靠性已经经过临床的多次反复验证[1][2]。由于高度近视患者的眼轴长度通常>26mm,其晶状体的悬韧带往往存在松弛甚至断裂的风险,因此这些患者术后人工晶状体的稳定性的维持一直成为临床关注和研究的焦点[3][4]。近期相关研究提示:高度近视合并白内障患者在超声乳化吸除联合人IOL植入术中行囊袋张力环(capsulartension ring,CTR)植入术有利于支撑晶状体悬韧带从而对人工晶状体具有稳定的维持作用,但是缺少相关具体论证研究。本研究通过对郑州大学第二附属医院眼科高度近视合并白内障患者行超声生物显微镜检查后(ultrasonicbiomicroscope,UBM)观察术后人工晶状体在囊袋内的位置,探讨囊袋张力环对白内障合并高度近视患者术后IOL偏心量和倾斜度的差异。
  方法:
  本研究收录郑州大学第二附属医院2012年1月-2015年12月行白内障超声乳化吸除联合IOL植入术的高度近视合并白内障患者36例(40眼)纳入研究,其中男性患者17例(20眼),女性患者19例(20眼),患者年龄60~79岁,平均年龄69岁。术前常规行眼科A/B超检查和UBM检查后,选取纳入晶状体悬韧带无断裂的高度近视合并白内障患者,其眼轴长度26~28mm,平均眼轴长度26.88mm。排除标准:(1)外伤性白内障(2)确定为视网膜脱离者及不耐受手术者(3)既往行内眼手术史者(4)不能接受UBM检查者。根据术中是否植入囊袋张力环分为植入组(A组)和对照组(B组)。A组超声乳化吸除联合人工晶状体植入术中植入囊袋张力环(OPHTECB.V生产的276001G13/11)和B组常规超声乳化吸除联合人工晶状体植入手术。术后6个月复查最佳矫正视力,利用UBM测量并计算倾斜度和偏心量。UBM检查过程:被检查者完全扩瞳后选取仰卧位,盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后置入合适眼杯后倒入导入液,分别扫描水平方向和垂直方向两个位置的图像,获取多张二维图像,选取其中5次测量结果取取平均值。以视网膜色素上皮层作参考,分别记录人工晶状体直径的两个端点标记为A、B,测量A、B至参考线的距离。通过拟合图像利用几何运算得出人工晶状体在水平方位和垂直方位上的距离,计算出人工晶状体在水平位置、垂直位置及总体的倾斜度和偏心量[4]。
  本研究使用统计软件为spss17.0统计软件进行数据分析。两组矫正视力之间的比较采用卡方检验。两组人工晶状体偏心量、倾斜度采用两独立样本t检验。
  结果:
  1、最佳矫正视力比较:两组术后最佳矫正视力较术前均有所提高,两组差异无统计学意义(p>0.05)。
  2、人工晶状体倾斜度和偏心量的比较:植入组组在水平、垂直方位及总体的偏心量平均值分别为:0.15±0.07mm、0.30±0.40mm、0.11±0.02mm,在水平、垂直方位及总体的倾斜度平均值分别为:0.02°±0.11°、0.70°±0.25°、0.21°±0.74°。对照组组在水平、垂直方位及总体的偏心量平均值分别为:0.26±0.19mm、0.32±0.60mm、0.24±0.97mm,在水平、垂直方位及总体的倾斜度平均值分别为:0.11°±0.31°、1.09°±0.20°、1.24°±0.97°。两组人工晶状体水平方位、总体的偏心量和倾斜度以及垂直方位的倾斜度差异有统计学意义(p<0.01),垂直方位的偏心量差异无统计学意义(p>0.05)。
  3、所有患者在术后均有较高的满意度。依据患者自觉症状,术后1天,0.15%(6例)患者诉视物模糊,0.075%(3例)患者诉术后肿胀感,0.175%(7例)患者诉眼干;术后一周,0.05%(2例)患者诉视物模糊,0.00%(0例)未患者诉术后肿胀感,0.30%(12例)患者诉眼干,术后6个月,0.15%(6例)患者诉视物模糊,0.00%(0例)未患者诉术后肿胀感,0.425%(17例)患者诉眼干。
  结论:
  1、高度近视合并白内障患者在行超声乳化吸除联合IOL植入术后视力均较之前有提高。
  2、高度近视合并白内障术中植入囊袋张力环患者人工晶状体的倾斜度和偏心量小于未植入患者。
  3、囊袋张力环能够支撑高度近视合并白内障脆弱的悬韧带,对人工晶状体具有稳定作用。
  4、高度近视合并白内障患者行超声乳化手术有较高的满意度。
[硕士论文] 任鹏晓
眼科学 新疆医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:比较植入两种不同类型非球面人工晶体(intraocular lens)的老年性白内障患者术后的综合视觉质量。
  方法:回顾性分析自2015年6月至2016年8月于我院行手术治疗的老年性白内障患者64例,共70眼,年龄范围52-87岁,植入Adapt-AO人工晶体共34眼,植入TecnisZCB00人工晶体共36眼,分别观察术后一周、一月、三月裸眼视力,术后三月的视觉敏感度、主观视觉质量量表、生活质量调查问卷。
  结果:两组患者术后三月裸眼视力分别高于各组术前最佳矫正视力,差异有统计学意义(P<0.05),两组间患者术后一周、一月、三月的裸眼视力差异均无统计学意义(P>0.05),两组患者术后三月主观视觉质量量表及生活质量调查问卷差异无统计学意义(P>0.05),术后三个月30°视野下的平均敏感度, TecnisZCB00组优于Adapt-AO组,差异具有统计学意义(P<0.05),两组在60°视野下的平均敏感度差异无统计学意义(P>0.05)。
  结论:TecnisZCB00组在30°视野时的平均敏感度优于Adapt-AO组。Adapt-AO和TecnisZCB00两种人工晶体均能较好的提高远视力以及术后的生活及视觉质量。
[博士论文] 秦祯蔚
眼科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  白内障是全球最主要的致盲眼病之一,手术是目前唯一有效的治疗途径。随着我国老龄化的加剧,白内障手术的需求量每年大幅增加,由此给社会和家庭带来沉重负担。近期两个研究团队分别发现两个对白内障可能有治疗作用的药物,并在细胞以及动物模型上获得良好效果,由此为白内障的药物治疗打开新的思路,但由于人源的体外晶状体模型的缺乏,这类药物在人源上的验证未能实现。因此,本学位论文旨在利用人源诱导多能干细胞(h-iPSCs)定向分化获得人晶状体小体(LB),构建合适的具有晶状体光学特性的体外晶状体模型并在此基础上进行晶状体发育机制研究。
  方法:
  首先收集分离人尿液中的上皮细胞,用慢病毒做载体将“Yamanaka四因子”转入尿液细胞将其重编程获得iPSCs,通过碱性磷酸酶染色、多能干细胞标志物(SOX2、SSEA-4、Nanog、TRA1-81、OCT4)的免疫荧光染色及RT-qPCR、拟胚体形成实验以及畸胎瘤实验验证iPSCs的多能性。
  其次,我们创立了“荷包蛋法”将iPSCs诱导分化成成熟、具有光学特性的LB,通过免疫荧光染色及RT-qPCR检验LB分化过程的晶状体发育标志物(DLX3、SIX1、EYA1、PAX6、CRYAA、CRYAB、PROX1、FOXE3、SOX1、CRYB、CRYGC、MIP)的动态表达,验证LB分化过程和晶状体胚胎发育的对应性,用透射电镜和亚甲蓝染色等检测成熟LB的细微结构验证其与晶状体的相似性,通过“X”实验检测成熟LB的光学特性(透明度以及放大倍率)。
  最后通过基因芯片检测iPSCs和LB中mRNA和lncRNA的差异表达,用RT-qPCR对部分自噬相关基因及其对应lncRNA、晶状体发育相关基因及其对应lncRNA进行验证并从中筛选出lncRNA p10540做进一步功能研究。利用siRNA沉默lncRNA p10540表达,同时检测LC3B在mRNA和蛋白水平的表达变化。通过对老年性患者以年龄分组并提取其囊膜RNA检测lncRNA p10540和老年性白内障的相关性。
  结果:
  我们利用人尿液来源的上皮细胞成功重编程获得iPSCs,该iPSCs磷酸酶染色呈强阳性、表达多能干细胞标志物、能形成完美的拟胚体,将其注射入裸鼠中可获得有三个胚层组织和细胞的畸胎瘤。
  通过“荷包蛋法”诱导iPSCs可获得成熟LB,其分化过程有晶状体板期、早期晶状体期及成熟晶状体期,与晶状体胚胎发育一一对应。成熟LB表达晶状体纤维细胞标志物(CRYAA、CRYAB、CRYB、CRYGC、MIP),具有晶状体上皮细胞、晶状体纤维细胞以及囊膜等结构,且具有良好的透明性和1.7倍的放大倍率。
  自噬存在于LB分化过程中,该现象与小鼠晶状体胚胎发育相似。基因芯片结果提示自噬基因相对应lncRNA在LB分化过程中的差异表达,lncRNA p10540在LB分化过程中通过在细胞胞浆中增强LC3B向活化状态LC3BⅡ的转化而影响自噬作用,此外在年龄>75岁组中lncRNAp10540的表达明显下降。
  结论:
  人尿液来源的上皮细胞可以作为iPSCs构建的理想体细胞来源。利用“荷包蛋法”可将iPSCs分化成立体、直径可达3mm且具有光学特性的LB,是目前已知的最接近人晶状体的理想体外晶状体模型。自噬以及lncRNA在LB分化过程中具有重要作用,lncRNA p10540通过影响LC3B的活化影响自噬进而可能影响LB分化发育且其与老年性白内障发病相关。
[博士论文] 鱼音慧
眼科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  晶状体为眼球屈光间质的重要组成部分,其将光线准确聚焦到视网膜,并通过调节作用看清远近物体,从而形成清晰视力。成熟晶状体是由两类细胞按特定方式排列形成的透明光学结构:前表面的单层立方上皮和内部晶状体纤维细胞,在发育过程中其正确的运动和组织方式是形成这一有序结构的生理基础,任何影响其正确排列的因素都将导致晶状体发育异常,从而导致视力下降甚至致盲。细胞极性为生物体中广泛存在的一种生物学特征,对于胚胎发育、细胞迁移、上皮-间质转化、组织形态维持等诸多生物学事件都起到关键作用。近年来有研究表明,细胞极性在细胞粘连、运动和迁移中具有重要功能,晶状体发育过程中,上皮细胞可发生EMT,表现为细胞极性、细胞间连接消失,上皮细胞转换为间质细胞并具有迁移表型,在此过程中正确的细胞定位、黏附连接和迁移是保证晶状体功能的关键。在细胞极性建立和维持过程中,包括PAR,Crumbs和SCRIB在内的三类高度保守的极性蛋白复合物发挥了重要作用,这些复合物的定位和相互作用对于细胞极性的调节至关重要,但其在晶状体发育过程中的具体作用机制尚未明确。基于以上背景,本研究以斑马鱼为模型,系统地分析了顶端极性蛋白Crb和Par复合物对晶状体发育过程中细胞粘连、运动和组织分化的影响。
  研究方法:
  本研究以AB系野生型和顶端极性蛋白Crb2a m289、αPKCλ m567、Pard6gbfh266突变型斑马鱼为模型,利用体式显微镜照相、冰冻组织切片和免疫组化、高分辨率透射电镜等实验技术研究Crb和Par复合物在斑马鱼晶状体发育过程中的定位、表达时序、两种复合物的动态依赖关系,晶状体细胞状态转化时细胞粘连、运动和组织分化的规律以及极性紊乱对晶状体细胞分化、粘连分子的亚细胞定位重组和细胞运动组织等生物学事件的影响和机制,采用统计学方法定量分析了极性障碍对斑马鱼眼球和晶状体大小、晶状体上皮和纤维细胞数目的影响,并以野生型小鼠为模型,采用免疫组化的方法对不同种属晶状体细胞早期极性蛋白的表达和细胞运动方式进行了探讨。
  研究结果:
  研究结果表明,在斑马鱼晶状体发育过程中,Par复合物首先表达,且没有呈现出明显的极性分布,在Crb复合物表达后,才诱导细胞出现极性。当两种复合物丧失功能时,斑马鱼眼球和晶状体发育将出现异常,并影响晶状体上皮和纤维细胞的组织方式,表现为增殖区和分化区的细胞数目出现异常,增殖区细胞提前迁移到晶状体内部分化区,但晶状体细胞的分化不受影响。免疫组化和透射电镜结果表明极性障碍是通过影响细胞粘连的方式导致迁移异常,其可导致细胞粘连的解体从而使细胞运动的能力增加。本研究首次揭示了两种极性蛋白复合物在不同状态晶状体细胞中可调控的复杂动态关系,突破了以往领域内对两种复合物之间呈简单正相关联系的认识,并证实了在不同物种早期晶状体发育过程中,Crb复合物均与细胞绕圆心有序运动迁移的组织方式密切相关的结论。
  研究结论:
  本研究在斑马鱼上建立了极性基因突变的模型,首次系统地揭示了顶端极性蛋白在斑马鱼晶状体发育过程中发挥的不同功能以及两种复合物之间的动态可调节性:Par复合物介导细胞粘连的早期形成,Crb复合物介导细胞粘连的显微亚细胞定位,二者协同作用,共同调控晶状体两类细胞的运动和组织方式。本研究为探索晶状体细胞发育的机理建立了良好的实验模型,并为进一步研究晶状体疾病奠定了基础。
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