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[硕士论文] 徐丹
生物安全 西南大学 2016(学位年度)
摘要:阔野螟属Patania Moore,1888隶属于鳞翅目Lepidoptera螟蛾总科Pyraloidea草螟科Crambidae斑野螟亚科Spilomelinae,其模式种为Botys concatenalis Walker,1866。全世界已记载约50种,我国已记载28种。本属一些种类在外部形态上较为相似,种类鉴定多依据外生殖器特征。本文结合传统分类学方法和分子生物学的技术手段,首次对中国阔野螟属Patania进行分子系统学研究,探讨基于线粒体及核基因的物种间亲缘关系,旨在揭示阔野螟属Patania的种间关系,为斑野螟亚科昆虫的系统发育与演化研究打下基础。
  本研究选用线粒体基因CO1长为658bp的片段,核基因CAD长为615bp的片段和核糖体基因RpS5上长为597bp的片段对中国阔野螟属进行基因组DNA的提取及目的片段的扩增,应用Clustal等软件进行序列的比对和分析,并采用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)3种方法构建系统发育树来推测系统发育关系。主要结果和讨论如下:
  1.使用DNA Barcoding技术成功的鉴定出阔野螟属27个种,结果显示每个种均能聚到一起,证明了使用通用引物LCO/HCO扩增出来的长为658 bp的基因片段,作为DNA Barcode序列来鉴定物种是有效的。
  2.使用MEGA5.05软件,基于Kimura-2-parameter模型,bootstrap1000次计算得到CO1基因在阔野螟属种内的平均遗传距离0.013。阔野螟属26个种基于CO1基因的种间平均遗传距离为0.101。种内平均遗传距离明显小于种间平均遗传距离。
  3.根据CO1基因序列构建的NJ树、ML树和BI树的结果表明,三者拓扑结构基本相同,中国阔野螟属26个种可以分为8支。此外,每个种的个体均能聚合,包括新种丁紫阔野螟Patania clava Xu et Du,与其相似种聚合成1支。
  4.根据CAD+CO1+RpS5基因联合序列构建的NJ树、ML树和BI树的拓扑结构基本相同,NJ树基于遗传距离建树所得种类聚类情况较ML树与BI树更粗放,在进行系统发育关系分析时,采用ML树与BI树的建树结果,认为中国阔野螟属17个种可以分为7支。
  5.综合分析外部形态特征、外生殖器特征和系统发育树的结果,最后,本研究将中国阔野螟属的27个种,包括1新种按亲缘关系分成7组。组内种间的亲缘关系相对组外的种较近。分组如下:1)四目阔野螟Patania inferior(Hampson,1898),窗斑阔野螟P.mundalis(South,1901),四斑阔野螟P.quadrimaculalis(Kollar et Redtenbacher,1844);2)橙缘阔野螟 P.costalis(Moore,1888),三纹阔野螟 P.harutai(Inoue,1955),暗黑阔野螟P.holophaealis(Hampson,1912),宽缘阔野螟 P.scinisalis(Walker,1859)和灰褐阔野螟 P.verecunda(Warren,1896);3)丁紫阔野螟P.clava Xu et Du,sp.nov.,紫褐阔野螟P.iopasalis(Walker,1859),黄褐阔野螟P.obfuscalis Yamanaka,1998和甘薯阔野螟P.plagiatalis(Walker,1859);4)枇杷阔野螟P.balteata(Fabricius,1798),三条阔野螟P.chlorophanta(Butler,1878),橙黑阔野螟P.nigriflava(Swinhoe,1894),栅纹扇野螟P.punctimarginalis(Hampson,1896),豆阔野螟P.ruralis(Scopoli,1763)和淡黄阔野螟P.sabinusalis(Walker,1859);5)橙纹阔野螟 P.orissusalis(Walker,1859),褐缘阔野螟P.sellalis(Guenée,1854),P.concatenalis(Walker,1866),暗纹阔野螟P.definita(Butler,1889),P.sp.和黑纹阔野螟P.xuthusalis(Walker,1859);6)二斑阔野螟P.deficiens(Moore,1887);7)亮斑阔野螟P.expictalis(Christoph,1881)和P.semivialis Moore,1888。
[硕士论文] 周菁
动物学 华中师范大学 2016(学位年度)
摘要:在漫长的进化历程中,昆虫逐渐具备了极其灵敏的嗅觉系统,并以此感知来自于外界的多种化学刺激并作出相应的生理行为反应,如寻找配偶、定位食物源和栖息地,两性交流,聚集产卵和趋避敌害等,由此可见,嗅觉及化学感受系统在昆虫的各项生命活动中发挥着重要功能。通过鉴定筛选靶标害虫信息素成分干扰和阻断昆虫的嗅觉识别行为,并将其成功应用于田间实践一直是害虫综合生物防控的重要措施之一。豆野螟是一种在世界范围内都具有较大危害的豆科作物害虫,其幼虫具有较强的钻蛀习性,化学药剂的大量使用不易杀死害虫,并容易导致农药残留超标,严重威胁各蔬菜基地豆类蔬菜产品的供应和食品安全。豆野螟主要分布在热带和亚热带地区,幼虫主要蛀食豆科作物幼嫩的花、叶和豆荚等,给豆科蔬菜生产造成了巨大的损失。
  基于课题组前期豆野螟触角转录组测序结果,我们克隆、表达并纯化了豆野螟MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1,采用RT-PCR技术分析检测这三个基因在豆野螟成虫的不同组织的表达情况。利用荧光竞争结合实验分析研究了MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1与寄主植物花挥发性化合物的结合,并利用三维结构模拟以及分子对接技术对MvitGOBP1、MvitC SP1蛋白与配体分子的可能的关键结合位点进行预测。主要研究结果如下:
  1.豆野螟MvitGO BP1、MvitCSP1、MvitOBP1的克隆、序列和进化分析
  克隆获得豆野螟三个嗅觉基因,分别命名为MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1,序列分析三个基因的ORF分别为486bp、387bp和471bp。多重序列比对显示,MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1均与鳞翅目其他昆虫的相应基因具有较高的相似性。系统进化分析发现,MvitGOBP1与CmedGOBP1聚为一支,MvitCSP1和CmedCSP,MvitOBP1和CmedOBP11分别具有较高序列相似性。
  2.组织特异性表达分析
  利用荧光定量PCR技术分析检测了MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟成虫不同组织的表达水平。结果表明,这三个基因主要在触角中高表达,在头、足和翅等组织中分别有少量的表达分布。
  3.MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1的原核表达及亲和层析纯化
  将构建好的原核表达重组载体转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中,不同IPTG条件诱导后破碎取上清,采用Ni柱亲和层析的方法来纯化目的蛋白,并利用肠激酶切除His标签。SDS-PAGE分析检测显示,这三个蛋白大小在25 kD到35kD之间产生特异性的条带。
  4.荧光竞争结合实验
  荧光竞争结合实验结果显示,MvitGOBP1对1H-Indol-4-ol(4-羟基吲哚)、Butanoic acid butyl ester(丁酸丁酯)和Limonene(柠檬烯)的结合能力较强;MvitCSP1对1H-Indol-4-ol和2-methyl-3-phenylpropanal(2-甲基-3-苯基丙醛)的结合能力较强;MvitOBP1对1H-Indo1-4-ol和Butanoic acid butyl ester的结合能力较强。
  5.田间诱捕试验
  基于嗅觉目的蛋白与寄主挥发物的结合特性分析结果,我们从17种豇豆花挥发物气味分子中选取了六种结合能力较强的化合物来进行田间诱捕实验,分别是Butanoic acid butyl ester、Limonene、1H-Indol-4-ol、2-methyl-3-phenylpropanal、Butanoic acid octyl ester(丁酸辛酯)和4-ethylpropiophenone(乙基苯丙酮)。田间诱捕实验结果显示,相对于空白对照组,这六种化合物均能够有效吸引雌蛾,产生类似产卵聚集效应,其中柠檬烯的诱捕效果最为显著。
  6.同源建模和分子对接
  通过构建目的蛋白三维结构模型与分子对接分析,我们发现MvitGOBP1和MvitCSP1的结合腔主要由疏水性氨基酸组成,促进两种嗅觉蛋白与寄主挥发物成分1H-indol-4-ol和2-methyl-3-phenylpropanal的特异性结合,推测可能的关键氨基酸位点分别是Asn83和Arg127,Thr26和Glu63。
  上述试验结果表明,MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟不同组织中分布广泛,结合特性分析和田间诱捕试验表明,MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟的寄主识别以及产卵定位等嗅觉生理活动中发挥着重要作用。
[硕士论文] 赵新威
生物学 重庆大学 2016(学位年度)
摘要:基因表达的差异被认为是导致近缘物种之间表型改变和进化的主要原因。而基因表达是由顺式调控元件(cis-regulatory element)和其相应的反式调控元件(trans-regulatory element)共同调控的,它们的变化均会导致基因表达的改变。一般而言,转录因子结合位点的变化只会影响单个基因或少数基因的表达,因此只会影响基因调控网络(gene regulatory network)上的某些节点的变化。相反,当转录因子发生改变后,其所有的靶基因的表达都有可能受到影响,这种大量基因表达的改变对生物体的生存是有害的。另外,转录因子是编码蛋白质的功能基因,相对而言,转录因子在进化过程中较为保守,先前的研究也表明转录调控进化主要是顺式调控区域的改变导致的。目前对一些特殊世系物种间转录因子条目变化及其可能的功能分化仍然知之甚少。
  本研究主要内容包括:①昆虫中转录因子数目差异较大。本文鉴定了35个物种中26808个转录因子,并将其分为65个转录因子家族(transcription factor family)。我们发现同一个转录因子家族其基因数目在不同物种中并不相同。尽管在世系内部其趋势可能有一部分相同,但在近缘物种中依旧有数目变化。这说明转录因子的变化的确存在,这些变化可能是物种之间基因调控网络和表型变化的重要来源。②世系特异转录因子的变化会导致基因调控网络的变化。为进一步研究转录因子重复后的功能变化,本文通过系统发生分析的方法系统鉴定了昆虫世系特异重复的转录因子。最终,鉴定了20个在昆虫世系间存在拷贝数特异改变的转录因子,其中6个世系特异的转录因子仅在果蝇世系中产生重复而在其他世系中并未重复。利用已有的黑腹果蝇基因调控数据,本文构建了这6对世系特异转录因子的基因调控网络,发现两拷贝之间的基因调控网络发生了分化,说明转录因子的变化会导致基因调控网络的改变。③世系特异重复转录因子间功能发生了明显分化。通过搜寻Flybase中6对世系特异重复转录因子等位表型数据,发现转录因子的不同拷贝对果蝇表型有不同影响。进一步用时空表达数据分析发现重复转录因子之间的表达模式的确发生了明显分化。
[硕士论文] 冯雪皎
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我国常见种类,分布广泛,携带多种病原体,严重危害人类健康和畜牧业的发展。因此研究我国不同地理种群长角血蜱遗传多样性,有利于了解长角血蜱在我国的生存状况和发展趋势,从而对长角血蜱更有效的进行防控。本研究使用COI基因、16S rRNA基因和ITS2基因对采自河北小五台山地区、贵州茂兰地区、甘肃兰州地区和湖北武汉地区的长角血蜱种群进行了种群遗传多样性分析,结果如下:
  本研究共获得93条COI序列,片段为802bp。其中变异位点79个,序列未出现插入和缺失,A+T含量大于G+C含量,具有AT偏倚性。转换高于颠换,转换比颠换值为4.256。获得75条16S rRNA序列,片段为406碱基,变异位点为17个。序列中出现了缺失位点,A+T含量高于G+C含量,具有AT偏倚性。转换大于颠换,转换比颠换值为4.711。获得79条ITS2序列长为671碱基,变异位点32个,序列存在插入和缺失,其中G+C碱基所占比值高于A+T。转换高于颠换,转换比颠换值为3.756。长角血蜱的COI基因单倍型48个,其中共享单倍型两个占单倍型比例为21.5%。单倍型多样性为0.958,核苷酸多样性为0.00847。小五台山地区单倍型多样性最高。16S rRNA基因检测出单倍型12个,其中共享单倍型一个占单倍型的比例为81.3%。单倍型多样性为0.33838,核苷酸多样性为0.00112。武汉地区单倍型多样性最高。ITS2基因单倍型26个,共享单倍型两个占单倍型比例为68.4%。单倍型多样性为0.76371,核苷酸多样性为0.000327。兰州地区单倍型多样性最高。三个基因片段共享单倍型较少独享单倍型较多有着丰富的单倍性多样性,说明长角血蜱适应能力较强。使用COI基因、16S rRNA基因和ITS2基因对长角血蜱四个地理种群进行了FST值分析。其中COI基因四个地区之间的FST值均小于0.25,说明种群之间出现了一定的遗传分化,武汉地区和小五台山地区分化程度最高。16S rRNA基因四个地区之间的FST值均小于0.25,说明种群之间出现了一定的遗传分化,茂兰地区和小五台山地区分化程度最高。ITS2基因的部分FST值大于0.25,遗传差异较大是由于ITS2进化速率较快导致的结果,武汉地区和茂兰地区分化程度最高。对长角血蜱的3个基因进行了分子差异(AMOVA)分析,三个基因的变异均来自种群内部而非种群间。使用COI、16S rRNA和ITS2基因构建单倍型网络图和贝叶斯系统发育树。三个基因的单倍型网络图中单倍型和地理单元之间没有明显的对应关系,不同地理种群的单倍型相互混杂分布,未形成明显的地理格局。通过对三个基因的单倍型分别构建系统发育树,拓扑结构显示所有长角血蜱单倍型聚集形成一个分支,但未按对应的地理单元进行聚类,相互混杂,没有明显的地理分化结构使用COI基因、16S rRNA基因和ITS2基因对四个种群联合进行中性检验和错配分析。中性检验中COI基因Tajima's D值不显著,16S rRNA基因和ITS2基因Fu's FS值不显著说明种群未出现近期的扩张。COI基因错配分析图为双峰说明种群未出现种群扩张,但16S rRNA和ITS2基因错配分析图为单峰表明种群近期经历过种群扩张。这与中性检验结果不一致,可能由于其分析数据量不足造成的结果。
[博士论文] 肖花美
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA基因,主要包括小RNA(如miRNA等)和长的非编码RNA(lncRNA)。研究表明,miRNA和lncRNA具有重要的功能。本文预测了五种昆虫的非编码RNA基因,通过基因家族分析发现了昆虫特异性的miR-14,进行了靶标预测及双荧光素酶报告基因验证,以及miR-14和其靶标基因的表达分析,过表达或干扰miR-14的表达等实验表明,昆虫特异性miR-14靶向蜕皮激素合成代谢通路中的9个基因,明显增强了对通路的调控能力,在昆虫蜕皮完成后抑制蜕皮激素的合成,维持了家蚕发育的稳定性和一致性。主要工作如下:
  1、5种昆虫非编码RNA基因的发现及特征分析
  将褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱5个物种卵、幼虫、蛹、成虫等不同发育阶段的个体分别混合,提取RNA,经测序获得5个物种小RNA序列,过滤后获得五个物种Uniq reads信息。构建miRNA预测流程,分别在褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱的小RNA文库中发现了110、76、64、108、118个miRNA基因。收集褐飞虱低繁殖力雌成虫、高繁殖力雌成虫、低繁殖力五龄若虫、高繁殖力五龄若虫、Mudgo品系脂肪体、TaichungNative1品系脂肪体、Mudgo品系唾液腺、TaichungNative1品系唾液腺、Izumo87品系、Chikugo89品系以及普通种群的转录组数据,构建了lncRNA预测流程,从12个转录组中共发现1,882个lncRNA基因。褐飞虱lncRNA主要为两个外显子的转录本,转录本长度显著短于蛋白质编码基因(841bp vs1106 bp,T-test,P<0.01)。19%的褐飞虱lncRNA发生选择性剪切。繁殖力与致害性种群中均存在特异性表达的lncRNA,且发现3个lncRNA基因与繁殖力密切相关的蛋白质编码基因发生重叠,表明lncRNA可能参与调控褐飞虱的繁殖力。
  2、昆虫miRNA基因家族分析
  依据物种进化关系,选取了5种脊椎动物(人、小鼠、家鸡、非洲蟾蜍、斑马鱼)、17种昆虫(二化螟、黑腹果蝇、意大利蜜蜂、丽蝇蛹集金小蜂、冈比亚按蚊、致倦库蚊、埃及伊蚊、诗神袖蝶、烟草天蛾、家蚕、赤拟谷盗、豌豆蚜、褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱)、水蚤、线虫和海蠕虫共25个物种的miRNA。基因家族分析发现,let-7、mir-1、mir-133等14个miRNA家族在所有物种中高度保守;bantam、mir-2、mir-263等9个miRNA家族在无脊椎动物中保守;mir-14、mir-277、mir-316、 mir-932等为昆虫特异性miRNA基因家族,其序列在昆虫中高度保守。
  3、昆虫特异性miR-14基因对蜕皮激素通路的调控
  选择昆虫特异性的miR-14基因开展功能研究。收集了12种昆虫的miR-14基因序列以及3'UTR数据,利用RNAhybrid和miRanda两个软件预测靶标,结果表明miR-14在所有昆虫中靶向蜕皮激素通路中的多个基因。为进一步分析昆虫特异性的miR-14基因在变态发育中的调控功能,通过文献挖掘构建了昆虫蜕皮激素的上游调控通路、合成通路及下游应答通路(以下简称为昆虫蜕皮激素通路),靶标预测发现家蚕miR-14可作用于通路中的12个基因。
  考虑家蚕3'UTR数据丰富及实验操作方便等优点,利用双荧光素酶报告基因载体系统验证了预测靶标,分别将12个预测为靶标基因的3'UTR克隆进pMIR-REPORT载体,与miR-14的mimics共转染HEK293T细胞,测定荧光含量。同时,对靶标基因的3'UTR进行了突变,检测mimics的干扰效果是否有影响。结果表明,miR-14的mimics对携带有InR、Akt、Erk、Torso、Nvd、Shd、EcR、E74和Brc等9个靶标基因3'UTR的载体荧光素酶活性具有明显的抑制作用,而当3'UTR的靶标位点被突变后,干扰作用消失。
  综合软件预测和靶标验证的结果,表明miR-14对昆虫蜕皮激素通路中的多个基因具有调控作用。分析认为,这种作用模式显著增强miR-14基因对蜕皮激素合成及其作用的调控能力。lnR、Akt、Erk、Torso分别位于诱导和刺激蜕皮激素合成的三条上游调控通路上,Nvd,Shd等位于蜕皮激素的合成通路上,EcR、E74、Brc,是蜕皮激素的受体及下游应答基因,通过对这9个基因的调控,miR-14可以成功地控制蜕皮激素的上游调控,合成及下游应答通路,实现对蜕皮激素的全面调控作用。
  4、miR-14及靶标基因的表达谱分析
  对家蚕头、前胸腺、中肠、马氏管和表皮五个组织进行了miR-14的表达分析。结果表明,两个miR-14成熟体(miR-14-5p和miR-14-3p)在五个组织中的表达量大致相似, miR-14为组成型表达的miRNA基因。对3龄第1天至蛹期第2天共18个样本进行了发育时期的表达分析,结果显示miR-14在龄期转换过程中呈规律性变化。miR-14-3p在每个龄期的第1天高表达,miR-14-5p在每个龄期的最后一天高表达。
  为更细致地研究miR-14的表达,对家蚕3龄第1天至4龄第1天每6h样共20个样本进行了表达量分析。结果表明,miR-14-5p于蜕皮前24h表达开始上升,蜕皮前12h表达量升至最高,其表达量变化与蜕皮激素合成具有密切的关系。在需要蜕皮激素的发育时间点上,miR-14基因表达量降低。而在不需要蜕皮激素的时间点上, miR-14表达明显升高。
  检测了InR、Ras、Spo、Shd、EcR、E74、Brc等靶标基因的表达情况,对3龄第1天至蛹期第2天共18个样本进行表达分析。结果表明,InR、Ras两个基因的表达无明显规律;E74基因在每个龄期最后一天高表达;Brc在蛹期高表达;Spo、Shd、EcR三个基因的表达趋势一致,在每个龄期蜕皮前2天高表达。分析了Spo在家蚕3龄第1天至4龄第1天每6h样本中的表达,发现Spo于蜕皮前30h左右表达量升至最高。Spo与Shd基因直接参与蜕皮激素的合成,EcR基因为蜕皮激素的受体基因,Spo、Shd、EcR三个基因的表达趋势与蜕皮激素滴度的变化趋势一致,与miR-14-5p的表达呈负相关。表达量分析结果,进一步证明了miR-14-5p对蜕皮激素通路的调控作用。
  5、过表达与干扰miR-14对家蚕变态发育的影响
  合成了miR-14的类似物agomir-14,注射3龄2天家蚕,过表达家蚕miR-14。定量PCR检测结果显示,在三个重复中,过表达24 h后的表达量分别上升了3倍、8倍和22倍,过表达48h后仍可维持高丰度。注射不同浓度的agomir-14-5p均可致家蚕蜕皮延迟,注射540 pmol agomir-14-5p致大约10%的家蚕个体蜕皮延迟,注射1080pmol agomir-14-5p导致大约60%的家蚕个体蜕皮延迟,而agomir-14-3p组蜕皮时间与NC接近,表明家蚕中主要以miR-14-5p起作用。
  合成了miR-14的抑制剂antagomir-14,注射3龄1天家蚕,干扰miR-14的表达。利用qRT-PCR检测干扰后24h和48h miR-14-5p的表达量,结果显示干扰后两个时间点miR-14-5p的表达量均下降,其中48h达到显著下降,表明注射antagomir-14达到了抑制miR-14表达的效果。antagomir-14-5p可致20-30%家蚕个体蜕皮延迟,而antagomir-14-3p蜕皮时间与NC接近。综合过表达与干扰实验结果,表明家蚕miR-14-5p通过调控蜕皮激素通路基因的表达,调控蜕皮激素的合成,进而影响家蚕的变态发育。
[硕士论文] 杨杰
动物学 南开大学 2015(学位年度)
摘要:蜻蜓目(豆娘和蜻蜓),是现生有翅昆虫中最古老的类群之一,包括差翅亚目Anisoptera、间翅亚目Anisozygoptera、均翅亚目Zygoptera。其中,差翅亚目Anisoptera包括5总科11科,344属,3011种;间翅亚目Anisozygoptera包括1科1属4种;均翅亚目Zygoptera包括4总科18科,308属,2941种。蜻蜓目高级阶元的系统发育关系至今仍未解决,尤其是3亚目的系统发育地位近年来备受人们关注。此外,均翅亚目色蟌总科“Calopterygoidea”的单系性也有待进一步研究,尤其是拟丝蟌科与其近缘的山蟌科的位置较混乱还需要进一步解析。近年来,核糖体DNA(rDNA)作为分子标记已经被广泛用于蜻蜓目高级阶元的系统发育研究中去。而事实上,除了依据 rDNA序列的这种一级结构信息外,相应的核糖体RNA(rRNA)的二级结构信息可以用来校正软件自动给出的序列比对结果,并且也可以在二级结构的长度变异区段(LVRs)找寻共有衍征。
  本研究通过总结GenBank中蜻蜓目nrDNA数据使用情况,发现蜻蜓目中同时具有18S全长、28S rDNA全长的数据并不多,仅有62条,而且都没有相应ITS的序列,因此,本研究选取蜻蜓目中,同时具有与18S全长、28S rDNA>2kb的序列共118条构建矩阵,其中包括蜉蝣目2条序列作为外群,另有8科10种数据由本研究提供。研究中首先结合序列初步比对结果,基于丽拟丝蟌Pseudolestes mirabilis全长rDNA簇的序列对蜻蜓目18S、28S rRNA二级结构模型进行重建,并根据得到的模型进一步校正序列比对结果,基于长度变异区段挖掘分子共有衍征,作为系统发育推断的新证据。研究初步得到以下结果:通过对蜻蜓目18S、28S rRNA二级结构模型重建,认为长度变异区可以作为共有衍征,包括类群特异性插入或缺失、相同的长度变异区段长度和类群特异性长度扩展。发现单系Anisoptera+Anisozygoptera中28S rDNA中可变区D2-9都具有1个碱基;18S rRNA中可变区B的5个碱基长度成为支持Zygoptera单系性的一个共有衍征;单系Perilestidae+(Lestidae+Synlestidae)在28S rDNA中可变区D2-5都有8个碱基,D3-1都有5个碱基,D5-1有9个碱基可以作为该单系的分子自有衍征;可变区D2-615个碱基的长度可以作为单系Euphaeidae+Lestoideidae的独征;蜻科Libellulidae18S rRNA可变区D都有3个碱基;大伪蜻科Macromiidae中,28S rRNA可变区D2-3也具有3个碱基的长度;春蜓科Gomphidae和澳蜻科Synthemistidae分别在可变区Da和D3-2都有4个碱基。基于18S+28S rDNA重建的贝叶斯树和ML树也支持上述衍征所在单系的可靠性。可见,尽可能多的得到蜻蜓目 rDNA的全长序列,结合二级结构和分子共有衍征两方面的证据,有望对蜻蜓目中系统发育关系不详的类群解析提供帮助。
[硕士论文] 王曼曼
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:灰飞虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]属半翅目,飞虱科,是一种非常重要的农业害虫。在世界上分布范围广泛。灰飞虱在我国各地均有分布,能够本地越冬,因此一般认为是本地虫源。
  本研究通过利用一段1368bp的线粒体DNA片段(包括769bp的COⅠ和599bp的COⅡ),对我国22个地理种群的灰飞虱进行种群遗传学的分析,这22个种群的地理位置分布在四个气候带中(中温带:moderate temperatezone(MT),暖温带:warmtemperatezone(WT),亚热带北部:northern subtropicalzone(NS),亚热带南部:southernsubtropicalzone(SS))。初步研究结果如下:
  (1)种群遗传多样性:整体上,我国灰飞虱种群的遗传多样性较好,但东北地区的灰飞虱种群多样性较差;在中温带地区(MT)的灰飞虱个体其单倍型多样性Hd及核苷酸多样性π均显著低于暖温带地区(WT)、亚热带南部地区(SS)、亚热带北部地区(NS)这三个温区的灰飞虱个体。此外,亚热带南部SS个体的核苷酸多样性低于暖温带地区WT和亚热带北部地区NS个体。
  (2)种群分化指数FST:种群分化指数FST在-0.078到0.442之间,平均值是0.075。从中温带到其余三个温区之间种群的FST平均值是0.176,相比较其他温区之间,种群分化指数FST较低,平均值只有0.016。主成分分析PCoA显示来自中温带地区的6个地理种群牡丹江、哈尔滨10、哈尔滨12、双吉、延吉11和延吉12与其他地理种群是显著分化的。
  (3)在1323个样本中,共发现107个单倍型,贝叶斯聚类及单倍型网络分支图均显示,107个单倍型很明显的分为两个单倍群,HGⅠ和HGⅡ,这两个单倍型的频率随着地理位置非随机分布。总体上,HGⅠ所占的频率(61.3%)比HGⅡ所占的频率(38.7%)要高,且在中温带地区占有绝对的优势。
  对于这种线粒体单倍型随环境出现非随机分布的现象,我们认为温度是形成灰飞虱线粒体DNA单倍型分布的主要原因,研究也发现线粒体单倍型HGⅠ的频率与冬季平均最低温度显著相关,单倍型HGⅠ在中温带具有显著频率优势的原因可能是由于HGⅠ比HGⅡ个体更能适应低温环境。
  为探索不同单倍型灰飞虱的抗寒性差异,对相同种群不同单倍型灰飞虱四龄若虫进行-1℃,2h处理后,测其冷冻昏迷恢复时间。结果发现,单倍型HGⅠ灰飞虱的个体低温冷冻昏迷后比HGⅡ单倍型个体恢复的快,说明HGⅠ这种单倍型灰飞虱的抗寒性较强。
  本研究比较了两种单倍型灰飞虱个体的线粒体COⅠ基因的相对拷贝数和低温处理前后雌虫线粒体DNA上编码蛋白的12个基因的相对表达量,结果发现:
  1)常温下,HGⅠ这种单倍型灰飞虱体内COⅠ基因的拷贝数明显多于HGⅡ单倍型灰飞虱个体。
  2)在-1℃低温放置2h后,HGⅠ单倍型灰飞虱雌虫个体与对照组相比,其12个线粒体基因表达量都是上升的,而对于HGⅡ这种单倍型灰飞虱雌虫个体来说,在低温-1℃放置2h后,nd1,nd2,nd3,nd4这四个编码NADH脱氢酶亚基的基因的表达量出现下降,其他基因的表达量都高于对照组。
  3)对照组中HGⅡ单倍型线粒体基因表达量都高于单倍型HGⅠ,但差异不显著;低温处理后,HGⅡ单倍型灰飞虱个体线粒体基因只有atp6,atp8,nd6基因表达量高于单倍型HGⅠ,而其余9个基因表达量都低于HGⅠ单倍型灰飞虱个体,其中cox2,nd1,nd2,nd4,nd5基因表达量显著降低。
  对HGⅠ,HGⅡ两种单倍型灰飞虱个体线粒体的全基因组进行测序及分析,结果发现,在ND2(第341个碱基),ND5(第277个碱基)和CYTB(第691个碱基)这三个基因上发生了非同义突变。用treeSAAP软件对系统发生过程中ND2,ND5,CYTB这三个线粒体基因序列进行适应性选择分析,结果发现这三个点突变带来的氨基酸的很多理化性质的改变等级在6-8级之间,说明这三个位点在进化过程中可能发生了适应性进化。
[硕士论文] 李秀荣
动物学 南开大学 2015(学位年度)
摘要:曼蝽属(Menida Motschulsky)隶属于半翅目异翅亚目(Hemiptera-Heteroptera)蝽科(Pentatomidae)蝽亚科(Pentatominae)。本文对中国曼蝽属进行了分类学研究,同时基于几何形态学Geometric Morphometrics对该属的种间亲缘关系进行了初步分析。
  本研究分为两个部分:第一部分为中国曼蝽属分类学研究,该部分介绍了曼蝽属在中国乃至世界范围的研究简况;详细描述了该属中国记载的18个种的形态特征;介绍了研究材料与实验方法;对本研究中所涉及的术语及量度进行了详细说明;本文提供了曼蝽属30幅成虫彩色照片和34幅生殖节图;亦给出了中国已知种类检索表,并对该类群的生物学特性及经济意义进行了简要概述。第二部分为基于几何形态学的种间亲缘关系研究,介绍了几何形态学在昆虫学研究领域的应用概况;以该属物种小盾片为样本,获取该属15个种小盾片的地标点、质心距离等信息,将所得数据进行了统计学分析,建立系统发育树,探讨了各种间亲缘关系。结果显示:宽曼蝽M. lata、华美曼蝽M. speciosa、斑驳曼蝽M. mosaica、北曼蝽M. disjecta能与其余各种较明显的分开,斑驳曼蝽M. mosaica与北曼蝽M. disjecta有交叉表明两种在小盾片形状和大小上有相似性,具有较近的亲缘关系。
[硕士论文] 侯洋
遗传学 合肥工业大学 2015(学位年度)
摘要:柞蚕是一种重要的经济昆虫,起源于我国,由于其蚕体较大,易于饲养,对光照敏感,长期以来一直是研究光周期、神经内分泌调控和分子遗传等方面的模式昆虫。性信息素合成激活肽(Pheromone biosynthesis activating neuropeptide,PBAN)作为FXPRLamide神经肽家族中的一员,主要功能是调节昆虫雌蛾性信息素的合成和释放,对昆虫的交配和繁衍继代起关键作用。PBAN受体(Pheromonebiosynthesis activating neuropeptide receptor, PBANR)属于G蛋白偶联受体。PBAN受体与配体结合后,将胞外信号跨膜传递到细胞内,调控细胞的行为。本论文克隆了柞蚕PBAN受体基因全长cDNA,并对其进行序列分析;通过与PBAN结合的Ca2+活性分析,对其进行鉴定,同时,获得结合活性高的不同模拟肽;最后,调查了PBAN与PBAN受体基因及与性信息素合成相关的基因的组织和在性腺中的发育表达。
  利用RACE方法,克隆获得柞蚕PBAN受体基因全长cDNA序列,柞蚕PBANR的ORF为933bp,编码311个氨基酸,5'端非编码区长330bp,3'端非编码区长171bp。柞蚕PBAN受体包含G蛋白偶联受体典型的7次跨膜结构域,与鳞翅目其他昆虫的PBANR相一致。系统发育分析表明,柞蚕PBANR与家蚕和烟草天蛾PBANR处于同一分支,且与烟草天蛾的相似性是83.9%,与家蚕和谷实夜蛾的相似性均为83.6%,与小菜蛾的相似性为73.1%。
  构建并获得含柞蚕PBANR的ORF的PCDNA5重组质粒,转染到CHO细胞株,与柞蚕PBAN进行结合分析。柞蚕PBAN与重组质粒结合后,能产生显著的Ca2+应答,并且产生的信号呈现剂量依赖型。PBAN和PBAN受体结合的EC50值为1.95nM,说明我们所克隆的基因就是PBAN的功能性受体。柞蚕PBAN的cDNA编码5个FXPRL家族神经肽与PBAN受体均出现不同程度的结合活性,其中Anpγ-SGNP的结合活性最高,Anpβ-SGNP、Anpα-SGNP和AnpDH与PBAN受体的结合活性依次减弱,表明PBAN神经肽C端的5个氨基酸对于其与受体的结合起关键作用。把柞蚕PBAN截短,保留C端的9个氨基酸,同时对C端的FSPRL依次突变,进行结合分析。C端的9个氨基酸的模拟肽与PBAN受体的结合活性几乎与PBAN相当;PBAN的C端的P、R、L3个氨基酸对于其与PBAN受体的结合能力起关键作用。另外,PBAN的C末端的酰胺化对于其发挥功能具有重要的作用。
  柞蚕PBAN受体基因在性腺中表达量最高,在脂肪体中也有相对较高的表达;PBANR在柞蚕不同发育时期的性腺中的表达量随着雌蛾羽化时间的增加,其表达量显著增大。柞蚕PBAN和DHR基因组织分布及在性腺中的表达模式与PBANR不同。
  对柞蚕蛹后期的个体进行转录组分析,明确与性信息素合成相关的15个基因的序列。对与性信息素合成相关的15个基因的组织分布和在性性腺中的发育表达进行调查。乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸2个基因在性腺中的表达量显著高于其他组织;醇脱氢酶、乙酰基转移酶等13个基因在中肠或脂肪体等组织中表达高于性腺。除3-羟基辅酶A脱氢酶基因外,所调查的其他14个基因在发蛾前后的性腺中表达量均产生显著变化,其中乙酰辅酶A脱氢酶基因、乙酰辅酶A氧化酶基因等8个基因在发蛾后2天的性腺中的表达量显著高于发蛾前2天。脂肪酸合成酶基因、脱饱和酶基因等6个基因在发蛾后2天的性腺中的表达量显著低于于发蛾前2天。
[博士论文] 张赞
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2014(学位年度)
摘要:转录组通常指所有信使RNA的集合。通过RNA-Seq技术,人们可获得大量的转录组序列信息,开展基因表达、功能分析、信号通路构建和分子进化分析等。本文以昆虫转录组为研究对象,开展了6种昆虫的比较转录组学研究,对昆虫转录组进行了分类,提出了两个评估昆虫转录组拼接质量的参数(Contigs containing the intact CDS,长度比率中住数LR50),开发了基于转录组的昆虫信号通路构建软件iPathCons,建立了昆虫信号通路数据库iPathDB。
  1、三化螟和稻纵卷叶螟的转录组测序分析
  将三化螟(Scirpophaga incertulas)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)的卵、幼虫、蛹、成虫等不同发育时期的试虫分别提取RNA,混合后进行转录组测序。分别获得2100万条三化螟的Reads,总共约15亿bp的转录组数据;4300万条稻纵卷叶螟Reads,约32亿bp的转录组数据。使用Trinity和SOAPdenovo拼接,经过比较,选用Trinity的拼接结果进行了表达丰度分析、基因注释、COG分析等。结果显示,三化螟和稻纵卷叶螟的转录组分别有45%和50%的序列能够被注释为蛋白编码基因,其余转录本无法注释,可能为非编码RNA序列或蛋白基因序列的非翻译区。
  2、六种昆虫的比较转录组分析
  从SRA数据库中下载了中华蜜蜂、丝光绿蝇、褐飞虱和烟粉虱的转录组原始数据,进行了拼接,使用nr数据库注释。然后对三化螟、稻纵卷叶螟、中华蜜蜂、丝光绿蝇、褐飞虱和烟粉虱等6个昆虫的转录组进行比较分析。丝光绿蝇转录组被注释为蛋白编码基因的比例最高,达到57%;其次为褐飞虱转录组,为56%;最少为烟粉虱,仅28%。利用双向Blast的最优匹配法进行直系同源搜索,长度比值在0.9~1.1之间的序列作为含有完整CDS的序列。在三化螟、稻纵卷叶螟、中华蜜蜂、丝光绿蝇、褐飞虱和烟粉虱等6个昆虫中分别发现了2,258、2,058、3,626、5,053、2,094和2,173条完整CDS的转录本序列。GO分析发现,6个昆虫在生化过程(Biological Process)中的差异最为明显,丝光绿蝇在发育过程(Developmental Process)中所占比例为44%,明显比其他五个物种多。在三化螟、稻纵卷叶螟、褐飞虱和烟粉虱等4个农业害虫中发现的细胞色素P450基因序列比丝光绿蝇和中华蜜蜂多,可能与农业害虫受到农药等环境因子更多的选择压力有关。丝光绿蝇中有一类特异的嗅觉蛋白(Odorant BindingProtein,OBP),表明蝇类具有更发达的嗅觉。在三化螟、稻纵卷叶螟、中华蜜蜂、褐飞虱和烟粉虱等昆虫中,发现了系统性RNAi相关的关键基因Sid-2,但是该基因没有在丝光绿蝇中找到。上述结果表明,不同昆虫转录组之间差异较大,一方面可能是由测序覆盖度的差异造成,另一方面也反映了物种之间的差异,显示转录组可用于分子进化和分子分类等研究,比较转录组学是将来转录组数据分析的发展方向之一。
  3、昆虫转录组数据拼接质量的评估软件开发
  转录组数据质量影响到后续分析的可靠性。目前主要根据N50的大小进行转录组质量评估,具有较大的局限性。为此,我们提出了两个指标来评估转录组的质量,包含完整CDS序列的百分比(CCIC)和长度比率中位数(LR50),其主要是通过转录组序列的完整性来评价转录组拼接质量。首先,将转录组序列分为四个类别:有完整CDS的序列、有5'UTR的片段、有3'UTR的片段和CDS片段。然后,计算转录组中的CCIC百分比和LR50。利用果蝇转录组数据进行模拟分析,表明CCIC百分比和LR50能够更加客观合理地反应转录组的拼接质量。使用LR50评估了6种昆虫转录组的拼接质量,发现三化螟和稻纵卷叶螟转录组的拼接质量不高。
  4、昆虫信号通路的构建软件iPathCons
  为了充分利用转录组数据,开发了iPathCons软件用于从昆虫转录组数据构建信号通路。以KEGG中20个昆虫的信号通路信息为模板,利用iPathCons分析了其他15个昆虫的基因组数据,构建了信号通路。因此,总共获得了35个昆虫的信号通路数据,以这些数据为模板,构建了iPathCons网络服务器,用于从转录组数据构建昆虫信号通路。进一步利用iPathCons从17个昆虫转录组数据中构建了信号通路,并进行了比较分析,发现72%的人类疾病相关信号通路在昆虫中能够被发现,表明昆虫可作为人类疾病模型开展相关研究。通过文献搜索,在35个基因组已知的昆虫中检索出翅发育相关的基因,构建了昆虫翅发育的信号通路。结果表明,9个昆虫的翅发育信号通路是完整的,16个昆虫缺失Ser基因,6个昆虫缺失Vg基因,4个昆虫缺失Ser和Vg两个基因。分析发现,在同等测序深度下,信号通路“淀粉和糖代谢(Starchand sucrose metabolism)”在中华蜜蜂中是完整的,包含了所有9个基因,而在其他昆虫中仅发现了3个基因,表明与糖代谢相关的基因在中华蜜蜂中的表达量很高,这可能与中华蜜蜂采集花蜜有关。
  5、昆虫信号通路的数据库iPathDB和在线分析网站
  构建了52个昆虫信号通路的数据库iPathDB,搭建了昆虫信号通路网站,提供昆虫信号通路数据的查询和下载,网站地址为:http://ento.njau.edu.cn/iPath。该数据库共包含了6个目,12,074个昆虫信号通路,98,813个基因的注释,414,895条序列。目前,分子生物学已经进入到系统生物学时代,从信号通路和基因网络的层次研究“基因与性状”之间的关系,是未来发展趋势,iPathDB的构建为从信号通路水平开展相关分析提供了可能和重要的参考。
[硕士论文] 李洋
植物保护 山东农业大学 2014(学位年度)
摘要:蝇蛹金小蜂Nasonia vitripennis,作为具有世界性分布的重要的遗传模式生物,是研究生物系统发育和进化的良好材料。关于其在北美洲和欧洲的不同地理种群的系统发育情况前人已进行调查,本研究结合已有调查结果,通过对中国蝇蛹金小蜂六个地理种群的线粒体COI基因进行序列分析,对我国蝇蛹金小蜂种群间的遗传多样性及遗传分化情况进行了初步研究,并与北美洲和欧洲种群进行比较。同时对所采集的不同地理种群的蝇蛹金小蜂Wolbachia感染情况进行了检测,分析了Wolbachia感染与其线粒体COI基因多样性的关联。研究结果如下:
  ⑴基于线粒体COI基因的不同地理种群的蝇蛹金小蜂的遗传多样性分析。为分析我国蝇蛹金小蜂不同地理种群的遗传变异情况,对六个地理种群48头蝇蛹金小蜂的线粒体COI基因片段进行了测序分析。在获得的619bp大小的线粒体COI基因片段中共发现63个单倍型和97个变异位点,其中包括30个简约信息位点和67个自裔位点。A+T含量为72.3%,G+C含量为27.7%,表现出明显的A/T碱基偏向性;基于线粒体COI基因的NJ系统发育树显示,整体上中国、欧洲和北美洲三个种群的蝇蛹金小蜂各自聚在一起,聚类结果与自然地理种群分布有明显的规律性和一致性,Mantel检验同样表明,各地理种群的遗传距离与地理距离间具有显著的相关性;总体上中国种群单倍型多样性指数Hd为0.856,核苷酸多样性指数Pi为0.00919,多样性水平明显高于北美洲,低于欧洲;和其他种群相比,新疆种群明显的表现出较高的多样性水平,接近欧洲和北美洲的种群;中国六个地理种群间的平均基因流Nm为0.65,总群体的固定系数Gst为0.277,表明中国蝇蛹金小蜂地理种群的基因流水平较低,种群间产生了一定程度的遗传分化,其中浙江种群和芜湖种群遗传分化程度较高。AMOVA分子方差分析结果表明,中国蝇蛹金小蜂地理种群的遗传分化主要来自种群内(68.36%);基于线粒体COI基因的不同地理种群蝇蛹金小蜂的中性检验结果显示,北美洲种群和欧洲种群的Tajima's D值均不显著(P>0.05),但我国Tajima's D值为显著的负值(P<0.05),说明我国蝇蛹金小蜂种群在过去可能出现过群体扩张和持续增长模式。
  ⑵Wolbachia感染与不同地理种群蝇蛹金小蜂线粒体COI基因多样性的关联。Wolbachia感染情况为新疆、芜湖和浙江种群全部感染,黑龙江、南岭、北京的感染率为62.5%、57.1%和71.4%。基于线粒体COI基因对黑龙江、南岭和北京三个种群的感染Wolbachia的个体和不感染Wolbachia的个体进行多样性分析,发现感染Wolbachia种群个体的多样性水平明显低于不感染Wolbachia种群的个体。
[硕士论文] 章钧凯
林业 浙江农林大学 2014(学位年度)
摘要:马尾松毛虫Dendrolimus punctatus Walker是最主要的松树害虫之一,主要危害马尾松Pinus massoniana Lamb.等松属植物。气候是影响马尾松毛虫个体发育和种群繁殖的重要理化因子之一。近几十年来,全球气候呈现明显的变暖趋势,极大地影响了林业生物灾害的发生。在一定条件下,温度、降水和日照时长对马尾松毛虫卵的发育历期和孵化率以及马尾松毛虫幼虫发育进度、化蛹率以及茧蛹重量、蛹的羽化率和成虫产卵量都会产生影响。本研究以马尾松毛虫为对象,在分析影响马尾松毛虫灾害发生的气候因子基础上,深入研究温度对马尾松毛虫卵和幼虫的发育,以及成虫繁殖能力的影响,主要得出以下结论:
  1.影响马尾松毛虫灾害发生的气候因子主要有温度和降水,其中第一年冬季和当年早春温度是第一影响因子,相互之间呈正相关关系,而夏季降水量是第二影响因子,相互之间呈负相关关系;
  2.强日照能够显著地缩短马尾松毛虫卵的发育历期,但对孵化率没有明显的影响;
  3.38℃以下的高温脉冲对马尾松毛虫卵的发育历期没有明显的影响,但41℃的高温脉冲能够显著地缩短卵的发育时间,同时也会降低卵的孵化率;
  4.在20-30℃范围内,随着温度升高,马尾松毛虫的发育进度加快,但化蛹率、茧蛹重量、怀卵量和蛹羽化率在27.5±1℃条件下最高,说明27.5±1℃最有利于马尾松毛虫的发育,从而引起种群增长和灾害的发生。
[硕士论文] 张亚南
森林保护学 浙江农林大学 2014(学位年度)
摘要:滞育是昆虫生长发育停滞的现象,是其适应不利环境条件的一种策略,外界环境诸如温度,光照,食料等的不适宜对昆虫滞育有诱导作用。本课题研究了温度对烟青虫滞育的影响,并从生理水平上阐明了滞育的生态适应意义。主要结果如下:
  1.烟青虫的冬滞育诱导、维持和终止:在20℃ L:D=8:16条件下诱导烟青虫的3、4、6龄幼虫,总滞育率分别为:92.22%、91.86%、59.55%;22℃下诱导烟青虫的3、4、6龄和预蛹期,总滞育率分别为:74.09%、60.13%、0.46%、0;24℃下的四个龄期总滞育率分别为:74.52%、25.15%、0、0。20℃下冬滞育期为170—495天,且近85.5%的滞育期长达240天以上;4℃分别保存冬滞育蛹30、60、90天,滞育解除期分别为16.5,15.3,17.5天,其中冷藏30天条件下滞育蛹的存活率最高。
  2.烟青虫冬滞育的生理特征:在化蛹后的12天内,冬滞育蛹的总失重量极显著低于未冬滞育蛹的,分别是:2.91 mg/头、10.41 mg/头;冬滞育蛹和未冬滞育蛹的脂类含量(mg/头)依次为48.77、36.99,糖原含量(mg/头)依次为4.67、2.80,冬滞育蛹的脂类和糖元含量均显著高于未滞育蛹。结果表明,烟青虫能通过冬滞育积累大量能量物质和维持低的代谢水平来度过漫长的冬季。
  3.烟青虫的夏滞育诱导、维持和终止:在33℃ L:D=16:8条件下诱导烟青虫的3、4、6龄和预蛹期,总滞育率分别为1.75%、4.10%、8.59%、0.92%,33℃为其夏滞育的临界温度;在35℃下的四个龄期总滞育率分别为25.96%、25.71%、22.76%、11.31%,各高温下各龄期滞育率差异显著,且雄性滞育率均显著高于雌性。35℃下夏滞育期为13.43天,27℃下解除夏滞育时间约3天。
  4.烟青虫夏滞育的生理特征:夏滞育亦然,滞育蛹未滞育蛹10天内总失重量分别是25.00 mg/头、50.38 mg/头;高温诱导的两类蛹的失重曲线与呼吸速率动态曲线均平缓,且显著低于未滞育蛹;夏滞育与未夏滞育蛹的脂含量(mg/头)为48.52、40.34,糖元含量(mg/头)为5.95、2.30,夏滞育蛹的脂类和糖元含量均显著高于未滞育蛹。结果表明,烟青虫能通过夏滞育维持低的代谢水平和积累大量能量物质来度过不利环境。
  5.烟青虫夏滞育的生态适应型:探讨了高温下烟青虫夏滞育蛹的羽化和繁殖情况,发现高温下烟青虫蛹的羽化畸形率为56.68%,极显著高于27℃的17.24%;通过不同组合交配实验发现,高温下产卵量和受精率都显著低于正常环境的,即高温不利于羽化,并会降低雌雄成虫的繁殖力。研究表明,烟青虫能通过夏滞育逃避高温对其不利影响,提高适合度。
[硕士论文] 陈亚娜
动物学 华中师范大学 2014(学位年度)
摘要:Wolbachia是一种胞内共生菌,主要存在于节肢动物和线虫体内,能够通过多种机制调节宿主的生殖,如细胞质不相容(CI)、孤雌生殖、雌性化、杀雄等。CI是Wolbachia对宿主产生的最普遍的一种影响。CI是指感染Wolbachia的雄性宿主与未感染Wolbachia的雌性宿主交配,或者是感染了不同种类Wolbachia的雌、雄性宿主之间交配后,其受精卵孵化率很低甚至完全不能孵化,但感染相同种类Wolbachia的雌、雄性宿主交配后就能够产生孵化率正常的受精卵。关于Wolbachia引起CI的分子机制,目前还不是很清楚。
  ATPsyn-b是果蝇体内编码线粒体膜上FoF1型ATPase Fob亚基的基因,参与果蝇体内氧化磷酸化过程,参与合成ATP,为果蝇的生命活动提供能量。为了研究CI产生的机制,本实验组前期研究发现,Wolbachia感染使得果蝇三龄幼虫精巢中ATPsyn-b基因的表达量发生了显著下调。另外,双链RNA注射成蝇后导致雄蝇的后代胚胎孵化率较对照组显著降低,该结果说明ATPsyn-b基因敲降能够影响雄蝇的繁殖能力。
  为了研究ATPsyn-b基因在果蝇生殖和生长发育过程中所起的作用,我们从清华大学果蝇模式中心购买了ATPsyn-b基因的RNAi转基因黑腹果蝇,该转基因果蝇在UAS-Gal4系统诱导下能表达发卡状结构(ATPsyn-b-hp)引起基因敲降,从而获得分别在精巢敲降或全身广泛敲降的突变体。首先,我们将ATPsyn-b RNAi转基因雄蝇与BamGal4 vp16品系处女蝇进行交配,获得ATPsyn-b基因在精巢敲降的果蝇(Bam-Gal4; ATPsyn-b-hp),同时以W1118与BamGal4 vp16品系处女蝇交配后的子代(Bam-Gal4;W-)作为对照。将ATPsyn-b在精巢中敲降和未敲降的1d雄蝇分别与Dmel T雌蝇交配,统计其后代胚胎孵化率。结果发现,ATPsyn-b基因在精巢敲降后,其后代胚胎孵化率为零,而对照组胚胎孵化率可达89.81%。因此我们得出结论:ATPsyn-b在精巢中敲降后造成了雄性不育。为了确定该雄性不育是由ATPsyn-b基因在精巢中的表达下调引起的,我们通过qRT-PCR检测了实验组和对照组雄蝇精巢中ATPsyn-b基因的表达量。结果显示,ATPsyn-b基因在突变体雄蝇精巢中的表达量发生了极显著性下调(p<0.01),从而说明了突变体雄性不育是由ATPsyn-b基因表达下调引起的。为进一步找到突变体雄性不育的原因,我们对实验组和对照组雄蝇精巢进行DAPI染色,结果发现,突变体在精子延伸过程中,精子核不能够聚集形成精子束,而是完全处于分散状态,并呈现出短小的形态。另外在精巢末端的储精囊中没有个体化的成熟精子。该结果证明,ATPsyn-b基因在精巢中敲降造成了精子发生过程出现异常现象,不能产生成熟精子,并最终导致雄性不育。
  我们又将ATPsyn-b RNAi转基因雄蝇与ActGal4/Cyo-PscGFP处女蝇进行交配,使得ATPsyn-b在全身广泛敲降,结果发现羽化后的成蝇全部是卷翅果蝇,说明ATPsyn-b全身广泛敲降的果蝇(Act-Gal4; ATPsyn-b-hp)不能发育至成蝇阶段,而其姐妹型果蝇(Cyo-PscGFP; ATPsyn-b)却能够正常发育至成虫期。为确定ATPsyn-b全身广泛敲降的果蝇在什么时期死亡,我们在一龄幼虫期根据幼虫是否带有GFP将基因未敲降和敲降幼虫区分开,不带GFP的幼虫(Act-Gal4; ATPsyn-b)为ATPsyn-b基因广泛敲降的幼虫。同时以W1118与ActGal4/Cyo-PscGFP交配后的子代(Act-Gal4;W(-))作为对照。结果发现,当对照组的幼虫已经进入了三龄幼虫末期时,实验组幼虫仍然处于二龄幼虫大小;当对照组幼虫化蛹、羽化出成蝇后,实验组幼虫仍未达到三龄幼虫大小,且不能化蛹,其幼虫期长达15d以上,但最终逐渐死亡。为了证明ATPsyn-b基因广泛敲降的幼虫生长受阻与ATPsyn-b基因表达下调有关,我们通过qRT-PCR对ATPsyn-b基因在实验组和两个对照组幼虫中的表达量进行了检测。结果显示,ATPsyn-b基因在实验组幼虫全身的表达量发生了极显著性下调(p<0.01)。从而证明了突变体生长发育受阻是由ATPsyn-b基因表达下调引起的。为进一步研究ATPsyn-b基因广泛敲降的幼虫生长发育受阻的原因,我们通过喂养的方法,对实验组和对照组幼虫进行Brdu标记。Brdu掺入实验结果显示,实验组幼虫的前肠细胞核显著小于两个对照组,细胞体积也显著小于对照组。由于肠的细胞核是随着细胞DNA复制而增大的,所以很可能是因为DNA复制受到了阻碍,核体积不能增大,细胞体积亦不能增加。因此我们得出结论,ATPsyn-b全身广泛敲降个体生长发育受阻的主要原因可能是细胞体积不能够增加,而且很可能是由于DNA复制受阻造成的。
  我们的研究结果表明,ATPsyn-b基因在精巢中敲降能够产生成活的成蝇,但其雄蝇的精子发生过程存在严重的缺陷,且不能产生成熟精子,最终造成雄性不育。ATPsyn-b基因在全身广泛敲降导致果蝇生长发育受阻,原因可能为DNA复制缺陷使细胞核和细胞体积不能增大。这些结果表明,ATPsyn-b在果蝇精子发生和生长发育的过程中起着重要的作用。由于ATPsyn-b不仅被鉴定为果蝇的精子蛋白,同时也被鉴定为小鼠和人类的精子蛋白,因此对ATPsyn-b在果蝇精子发生过程中的作用的研究可为进一步了解ATPsyn-b在人类男性生殖过程中的作用提供有力的模型和新的线索。
[硕士论文] 黄莹
生物化学与分子生物学 广西师范大学 2014(学位年度)
摘要:蝴蝶是一类比较古老的昆虫,隶属于昆虫纲Insecra鳞翅目Lepidoptera锤角亚目Ropalocera,以其多彩的双翅和轻盈的舞姿为世人青睐,是古今中外许多诗词、传说的重要题材。蝴蝶与人类的生产生活关系密切,可作为观赏、药用和食用昆虫,在人文艺术创作、传粉、环境监测等方面也发挥出重要作用。金斑喙凤蝶Teinopalpus aureus是一种珍稀大型凤蝶,素有“梦幻中的蝴蝶”、“蝶中仙子”之称,隶属于凤蝶科Papilionidae喙凤蝶属Teinopalpus。目前已记录的亚种有5个:指名亚种Teinopalpus aureusaureus Mell、武夷亚种T.aureus wuyiensis Lee、海南亚种T.aureushainanensisLee、广西亚种T.aureus guangxiensis Chouet Zhou和斯金卡亚种T.aureus skinkaii Mori。分布在东南亚地区,北至浙江敕木山,南至越南DongNai,在我国浙江、江西、福建、湖南、广东、广西、海南均有发现。由于其生活习性和生境特殊,极少出现在人类视野中,对其相关研究也比较少,在世界自然保育联盟(IUCN)2004年濒危物种红色名录中被列为DD(Data deficient)物种,1989年被列为我国Ⅰ级重点保护物种。
  本文参考已获得的序列结果,通过常规PCR测得金斑喙凤蝶T.aureus线粒体基因组全序列,对原有的序列结果进行修订,并初步分析基因组的组成和结构特点。利用线粒体rDNA和蛋白质编码基因(PCG),以茶小叶卷蛾Adoxophyes honmai和柞蚕Antheraea pernyi为外群,通过MEGA4、PAUP*4.0b10等软件,分别分析47种蝶类昆虫的基因组成、替换饱和性等序列特征,并以最大简约法构建了分子系统树,探讨蝶类不同科、属间和金斑喙凤蝶T.aureus不同地理种群间的相互关系。结果表明:
  1.金斑喙凤蝶T.aureus线粒体基因组总长为15234±0.5bp,共编码37个基因:蛋白质编码基因13个(ATP6、8,Cytb,COⅠ-Ⅲ,ND1-6,ND4L),2个rRNA基因(16SrRNA和12SrRNA),22个tRNA基因,1个非编码控制区(A+T-rich region)。线粒体基因组各基因的排列顺序和已报道的大部分蝶类相一致,没有发现基因重排和缺失现象。有13个间隔区和12个重叠区,其中tRNAGln和ND2基因间的间隔区最长,在其他鳞翅目昆虫中,也存在该间隔区。线粒体基因组A+T含量为79.8%±0.01,各段基因也均表现出明显的AT偏向性。除COⅠ基因以CGA作为起始密码子外,其他蛋白质编码基因均以ATN作为起始密码子;COⅡ、ND3和ND4基因以残基T结尾,其他蛋白质编码基因以TAN结尾。使用频率最高的5种密码子是TTA、ATT、TTT、ATA和AAT,占所有密码子使用频率的45.5%,与基因组的AT偏向性一致。除tRNASer(AGN)缺少DHU臂外,其他tRNA均可构成典型的三叶草结构。不同地理种群的12SrRNA基因长度均为781bp,16SrRNA基因长度为1334-1335bp。A+T丰富区长为396bp,A+T含量为93.6%±0.06。存在类似微卫星的重复序列:(AT)6、(AT)8G(TA)5、poly-A和poly-T,有一段重复序列“AAATTAATAAATTA”和一段类似拷贝序列“TTAATAAATCAAAA”。A+T丰富区的同源性很高,不同地理种群中仅9个位点发生变异。
  2.基于rDNA和蛋白质编码基因的蝶类系统发育分析结果表明,凤蝶总科不是单系发生的类群,凤蝶科与绢蝶科聚为一支,粉蝶科与灰蝶总科、蛱蝶总科、弄蝶总科聚为1支。基于不同基因构建的MP树中,蛱蝶总科内相互关系不确定,蛱蝶科不构成单系群。弄蝶科在蝶类分支内部,与蛱蝶总科、灰蝶总科和粉蝶科有较远的共同祖先。粉蝶科构成单系分支,但不与凤蝶科、绢蝶科聚为一支,不同于形态分类结果。金斑喙凤蝶T.aureus在凤蝶科的支序内部,构成单系分支。由于不同基因的进化速率不同,所以基于不同基因构建的系统发育树拓扑结构均存在差异,其中12SrRNA、16SrRNA、CO1、ND1、ND5和总蛋白质编码基因适用与科、属水平上的分类;COⅠ、Cytb、ND3和总蛋白质编码基因构建的系统树能较好反映出种下水平的相关关系;多基因联合构建的系统树支持度高,与形态分类结果接近。
  3.基于rDNA和蛋白质编码基因的金斑喙凤蝶T.aureus不同地理种群系统发育分析结果表明,广西大瑶山、浙江梅花山、江西九连山和屏山种群分为两支:大瑶山与九连山种群聚为一支,梅花山与屏山种群聚为另一支。在大瑶山种群内,也产生了分歧:一支是具有大瑶山种群的特有衍征,另一支与九连山种群有共享衍征。
[硕士论文] 陈媛
动物学 广西师范大学 2014(学位年度)
摘要:本文对采自中国不同地区的蚁属Formica16种蚂蚁进行了分子DNA条形码研究,探讨条形码在物种鉴定上的可行性。以COI、ITS1、ITS2为基础以及联合数据集COI+ITS1、COI+ITS2、COI+ITS1+ITS2,对所得150个样品的碱基序列进行了碱基成分、种间遗传距离、系统发育检验等分析,运用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)、贝叶斯法(BI)等方法对数据集进行了系统发育分析,得到以下结论:
  (1)编码基因COI比非编码的内转录间隔区ITS1/ITS2更容易得到序列。成功得到COI序列的样品数为149个,成功率达到99.33%;而ITS1、ITS2的成功率分别为93.33%、91.33%。COI序列具A+T偏向性,而ITS区序列碱基偏向性则偏向G+C。在碱基变异频率分析中,3个基因片段均有高的保守性,相比之下COI片段具有较多的变异位点,对近缘种类间区分具有明显的优势。
  (2)种间遗传距离分析中,单个片段的ITS1、ITS2基因分析表明,蚁属种间遗传距离的差异较小,种间的同源性较高。而单个COI基因与其他3种联合数据集,结果基本一致:未知种Formcia sp.与其他15种的亲缘关系最远;而种间关系较为密切的有北方蚁F.aquilonia与多栉蚁F.polyctena、亮腹黑褐蚁F.gagatoides与日本黑褐蚁F.japonica。
  (3)饱和性分析得到单个COI基因片段以及COI+ITS1,COI+ITS2,COI+ITS1+ITS2数据集的碱基的转换和颠换均未达到饱和,可以用于系统发育分析;而在树长分布偏斜性分析中,这4类分子数据集的系统发育信号对最优树有较高支持率。因此,确定了用以下4个分子数据进行系统发育分析:COI,COI+ITS1,COI+ITS2,COI+ITS1+ITS2。
  (4)基于3种方法构建的系统发育树,除了贝叶斯方法构建的系统发育树对于联合数据集COI+ITS2及COI+ITS1+ITS2的实验结果没有得到理想的结果,其他2种方法构建的系统发育树基本一致,共有9个物种能够单独聚成一支,分子数据与形态学分类高度吻合,这9个种分别为:中华红林蚁F.sinensis、满洲凹头蚁F.manchu、乌拉尔蚁F.uralensis、凹唇蚁F.sanguinea、亮腹黑褐蚁F.gagatoides、光亮黑蚁F.candida、丝光蚁F.fusca、格劳卡蚁F.glauca、未知种Formcia sp.。
  (5)DNA条形码能够作为蚁属物种识别的辅助工具。经过DNA条形码构建的系统发育树与传统形态学差异分析表明,北方蚁F.aquilonia Yarrow,1955为多栉蚁F.polyctena Foerste,1850的同物异名。对满洲蚁Formica manchu中同巢中立毛生长情况不一致的样品,DNA条形码技术能起到校正的作用。通过系统发育树的分析,本文猜测,在红林蚁群F.sinae中存在隐存种,这需要其他工作进行证实。
  (6)由于种内与种间的基因差异存在着广泛的重叠区,无明显的种间阈值存在,表明单依靠DNA条形码鉴定物种结果并不准确。因此应该多种方法的综合分类以达到准确鉴定物种的目的。
[硕士论文] 韦滔
动物学 广西师范大学 2014(学位年度)
摘要:直翅目Orthoptera是不完全变态类昆虫类群中最大的一个类群,多数种类为典型的多食性,许多种类为农林业的重要害虫。本研究对广西弄岗自然保护区直翅目昆虫区系组成进行了初步研究,并运用线粒体COI基因和核糖体ITS序列对20种蝗虫210个样本进行了DNA条形编码研究,得出以下主要结论:
  1.广西弄岗自然保护区直翅目昆虫区系组成
  本文共记录弄岗保护区直翅目255种,隶属于7总科18科125属,11种为广西新记录,1属61种为弄岗保护区新记录,提出了2个新命名,即新郑蚱Tetrix neozhengi Huang Nom.nov.和郑氏悠背蚱Euparatettix zhengi Huang Nom.nov.分别作为龙州蚱Tetrix longzhouensis Zheng,2004和长翅悠背蚱Euparatettix longipennis(Zheng et Jiang,2000)的替换名。世界昆虫地理区划中,广西弄岗自然保护区直翅目昆虫以东洋界成分占有优势,并与古北区系有密切的联系;中国动物地理区系中,以华南区分布占优势,同时与华中区、西南区及华北区关系密切,而与东北区、青藏区和蒙新区关系较远。
  2.基于COI、ITS1、ITS2基因序列的部分蝗虫种类的分子系统学研究
  本研究在碱基序列特征分析、g1检验、种间遗传距离分析的基础上运用最大简约法(MP)、贝叶斯法(BI)、邻接法(NJ)进行系统发育分析,并运用BCM方法模拟检验了COI条形码序列在蝗虫物种分子鉴定中的准确率。研究表明有足够抽样且形态特征差异明显的的物种在种级水平上形成支持度很高的分支;部分形态特征相似的种类其系统发育分析结果与形态学研究结果不一致:
  (1)红角陇根蝗Longgenacris rufiantennus Zheng et Wei,2003的系统发育地位。
  陇根蝗属Longgenacris You&Li,1983包括斑边陇根蝗Longgenacris maculacarina You&Li,1983和红角陇根蝗Longgenacris rufiantennus Zheng&Wei,2003。通过形态学的比较研究发现,红角陇根蝗与斑边陇根蝗差异较大而与腹露蝗属的越北腹露蝗更接近。分子证据显示红角陇根蝗与越北腹露蝗在系统树上相互混合没有形成相互单系分支,红角陇根蝗与斑边陇根蝗的种间遗传距离为4.65%,而与越北腹露蝗的种间遗传距离为0.16%。形态学及分子证据均显示,红角陇根蝗与斑边陇根蝗的关系更远而与越北腹露蝗之间的关系更近,应该隶属于腹露蝗属Fruhstorferiola Willemse,1921而且是越北腹露蝗Fruhstorferiola tonkinensis(Willemse,1921)的同物异名。
  (2)越北蝗属Tonkinacris Carl,1916的系统发育关系。
  形态学比较研究发现,大明山越北蝗Tonkinacris damingshanus Li et al,1991与方尾越北蝗Tonkinacris dcoratus Carl,1916没有显著差异,桂南越北蝗Tonkinacris meridionalis Li,1986兼具中华越北蝗Tonkinacris sinensis Chang,1937与方尾越北蝗的某些特征。在系统树上的关系为((方尾越北蝗+大明山越北蝗)+桂南越北蝗)。遗传距离矩阵显示,大明山越北蝗和方尾越北蝗两物种种间遗传距离是0.57%;大明山越北蝗和桂南越北蝗两物种种间遗传距离为1.38%;桂南越北蝗和方尾越北蝗两物种种间遗传距离是1.14%。因此从形态学及分子证据均显示大明山越北蝗Tonkinacris damingshanus Li et al,1991是方尾越北蝗Tonkinacris dcoratus Carl,1916的同物异名。
  (3)绿腿腹露蝗Fruhstorferiola viridifemorata(Caudell,1921)与峨眉腹露蝗Fruhsforferiola omei(Rehn et Rehn,1939)的系统发育关系。
  绿腿腹露蝗Fruhstorferiola viridifemorata(Caudell,1921)、黄山腹露蝗Fruhstorferiola huangshanensis Biet Xia,1980与峨眉腹露蝗Fruhsforferiola omei(Rehn et Rehn,1939)在系统树上不能形成相互单系分支,基于遗传距离矩阵分析显示,绿腿腹露蝗与黄山腹露蝗Fruhstorferiola huangshanensis Bi et Xia,1980种间遗传距离为1.34%;绿腿腹露蝗与峨眉腹露蝗种种间遗传距离为0.67%;黄山腹露蝗与峨眉腹露蝗种种间遗传距离为1.21%。对比研究发现绿腿腹露蝗与峨眉腹露种间遗传距离较小,由于抽样不足,因而它们之间的关系仍需要进一步检验。
  (4)条形码分子鉴定的成功率检测。
  对20种蝗虫的COI基因序列进行BCM和ASB分析,BCM模拟结果显示,正确鉴定序列为190条,占总数的90.47%;模糊鉴定序列为15条,占总数的8.57%;错误鉴定序列2条,占总数的0.95%。ASB模拟结果显示,正确鉴定序列为165条,占总数的79.32%;模糊鉴定序列为43条,占总数的20.68%,错误鉴定序列0条。两种分析结果中模糊鉴定序列和错误鉴定序列主要出现在越北腹露蝗和红角陇根蝗中。
[硕士论文] 林敏平
动物学 广西师范大学 2014(学位年度)
摘要:蚱总科(Tetrigoidea)是直翅目蝗亚目的一个较小类群。1996年,据印象初统计,全世界已知的蚱类约有211属1600多种,我国约600多种。
  本文作者于2012年7月至2013年8月对十万大山蚱类昆虫进行了全面而又系统的采集与调查,进行系统分类和研究。
  一、本文共记述蚱总科昆虫7科28属85种,其中新种6种,待定种1种。编制了十万大山蚱总科昆虫名录。新种分别是:十万山羊角蚱Criotettix Shiwanshanensis sp.nov.十万山蚂蚱Mazarredia Shanwanshanensis sp.nov.拟隆背蚂蚱Mazarredia convexaoides sp.nov.十万山波蚱Bolivaritettix shiwanshanensis sp.nov.狭顶狭蚱xistra,Strictivertex sp.nov.拟断隆羊角蚱Criotettix interruptaoides sp.nov.(本文新种及所采集到的标本保存在河池学院化学与生物工程学院昆虫标本室。)
  二、本研究还基于线粒体COI基因对蚱总科部分种类的系统发育关系进行了重建,最后得出了如下结论:
  1、对蚱总科16种昆虫的COI基因部分片段序列组成进行统计分析,这个片段总长度为657bp,其中保守位点355个,变异位点302个,碱基替换位点258个,自裔位点44个。变异位点占总位点数的46.0%,碱基替换位点占总位点数的39.3%。平均的碱基组成为31%A,32.5%T,16.4%G,20.1%C,A+T平均含量为47.4%,G+C平均含量为52.6%,A+T含量与G+C含量基本相当。
  2、对COI基因部分片段序列进行了遗传距离分析,16种蚱COI基因的遗传距离在0.005~0.266之间,平均值为0.201。其中个体之间最小和最大遗传距离分别为:0.005和0.266。宽顶瘤蚱和钝叶瘤蚱之间的遗传距离为0.005,钝叶瘤蚱和侧刺瘤蚱之间的遗传距离为0.023、宽顶瘤蚱和侧刺瘤蚱之间的遗传距离为0.023,桂南蚱和拟喀蚱之间的遗传距离为0.043,细庭蚱和拟喀蚱之间的距离为0.075,细庭蚱和桂南蚱之间的遗传距离为0.061,均小于0.1,同源性较大,其它各种之间的遗传距离均界于0.142~0.266之间。
  3、对COI基因序列数据集采用四种方法(NJ、ME、MP以及BI)建树,比较它们之间的差异性。结果显示所构建的分子系统发育关系树在拓扑结构上差异较大。最小进化法(ME)、邻接法(NJ)的拓扑结构基本一致,属间、种间的进化关系明确,推断我国蚱总科四个科的系统发育关系为:股沟蚱科代表原始类群,刺翼蚱科和短翼蚱科代表中间类群,蚱科的一部分较原始,另一部分较进化。最大简约法(MP)的拓扑结构与前两种方法的拓扑结构相似,只是有些种类所处的树的位置不一样,而贝叶斯推论法(BI)的拓扑结构与前三种方法的拓扑结构不相一致。而且此种分析方法与蚱总科昆虫传统分类方法相去甚远。
[硕士论文] 张雅昆
生物化学与分子生物学 河北农业大学 2013(学位年度)
摘要:华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita Faldermann)属鞘翅目(Coleoptera)金龟总科(Scarabaeoidea)昆虫,幼虫称为蛴螬,是世界公认的危害严重且难于防治的地下害虫类群之一。其主要分布于中国北方的河北、山东、山西、河南、辽宁西部等省,主要为害花生等农作物、草坪苗圃及林木叶片果实等。
   昆虫中肠蛋白酶在昆虫食物蛋白质消化方面具有非常重要的功能,是昆虫生长发育的必须酶类。丝氨酸羧肽酶(Serine carboxypeptidases,SCPs)是一类真核生物蛋白水解酶,可参与多种生理及细胞多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等代谢过程。目前,对其结构和功能的研究主要集中于酵母和高等植物中,而在昆虫中的研究甚少,只有少数几个丝氨酸羧肽酶的序列及生物学功能得到鉴定。
   本研究以本实验室前期从华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库中筛选得到的丝氨酸羧肽酶HoSCP为研究对象,设计引物扩增hoscp基因的开放阅读框序列,构建重组表达载体pPICK9K-hoscp,并将其转化到缺陷型毕赤酵母菌株GS115中进行诱导表达。结果显示,重组丝氨酸羧肽酶HoSCP在重组酵母菌株甲醇诱导培养24 h后开始分泌表达,72 h时表达量达到最大,表达50 kDa蛋白,与预测分子量相符。以重组酵母菌株甲醇诱导72 h后所得上清液作为粗酶液,测定重组丝氨酸羧肽酶HoSCP的活力为0.033U,比活力为0.165 U/mL。
   通过提取不同龄期华北大黑鳃金龟幼虫的中肠及其内容物,测定相应丝氨酸羧肽酶的活力及比活力。结果表明,华北大黑鳃金龟3龄中期幼虫中肠丝氨酸羧肽酶最适pH值为8.0,对应活力为0.004 U,比活力为0.020 U/mg。2龄、3龄初期幼虫中肠丝氨酸羧肽酶的比活力均显著高于相同龄期末期幼虫蜕皮前的丝氨酸羧肽酶活性,分别是2倍左右。其中,3龄初期幼虫中肠丝氨酸羧肽酶活性最高,为0.0068 U/mg。
   本实验实现了华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶HoSCP在毕赤酵母菌株中的外源表达,并对其在幼虫体内及体外的活性进行了测定,为进一步研究其生物学功能提供了依据。
[硕士论文] 宋茜
生物化学与分子生物学 山东大学 2013(学位年度)
摘要:研究背景、存在的科学问题及研究意义
   昆虫是地球上种类最多、数量最大的类群,因而对人类的生存活动有着巨大的影响。现在对昆虫的研究,并不只局限于对害虫的防治,而更多的是以昆虫为模型来研究多种生理现象背后的机理。昆虫的表皮是昆虫进化过程中产生的与生存息息相关的天然物理屏障,由几丁质、蛋白和脂质组成(Andersen,Hojrupetal.1995)。它覆盖了昆虫所有组织,能防止昆虫组织脱水,抵御天敌,同时使昆虫运动成为可能。由于表皮不具有延展性,随着昆虫个体的生长变大,昆虫的生长发育过程必须要经过多次蜕皮,包括卵孵化、幼虫之间的蜕皮、幼虫到蛹的蜕皮和蛹到成虫的蜕皮。
   昆虫的蜕皮是一个复杂的生理过程,在蛋白酶作用下,昆虫在蜕皮过程中发生皮层融离,旧表皮消化吸收,为进一步形成新表皮做准备。在这个过程中,羧肽酶和氨肽酶起着关键作用(SamuelsandPaterson1995)。羧肽酶从羰基端水解肽链,而氨基酶从氨基端水解肽链(Willis2010)。蜕皮过程主要是由蜕皮激素20E和保幼激素JH调控的,20E起始蜕皮发生,JH则决定了蜕皮的性质(Burdette,1962;Riddiford,1993)。20E与核受体EcR结合后与USP异二聚化,形成20E-EcR/USP受体复合物,受体复合物与20E响应元件结合后招募共作用因子,指导下游效应基因的表达。JH通过与20E信号通路的拮抗作用协调控制昆虫生长发育。
   除了20E和JH外,有实验揭示了insulin与20E的调作用共同调控昆虫生长发育。其中,胰岛素调节生长速度,而20E决定了生长持续时间,这是决定昆虫体重的两种关键因素,从而决定了昆虫变态的临界体重。果蝇胰岛素样肽(ILP)缺失突变体的生长延迟并且体重降低,暗示了胰岛素对昆虫发育的重要性(Broughton,Piperetal.2005)。FoxO(ForkheadboxO)是一种胰岛素的重要靶标蛋白。营养充分时,胰岛素通过其受体使FoxO磷酸化并留在细胞之内,而营养缺失时FoxO被激活并转移至细胞核与响应元件结合并调控相关基因的转录(Tower2011)。20E能有效解除胰岛素对FoxO的抑制。FoxO可以与至少700种启动子区结合,参与调控了多种生理过程如生长,细胞分化,细胞周期,抗压,肿瘤抑制,代谢和凋亡等(Alic,Andrewsetal.2011)。高等动物中FoxO蛋白是肿瘤抑制子,主要通过促进一系列基因的转录来实现,FoxO的降解会导致癌细胞的增殖和存活(HuangandTindall2011)。过表达FoxO能上调脂肪体中dilp6(insulin-likepeptide6,一类可被饥饿激活的肽)的mRNA水平,从而延长果蝇的寿命(Bai,Kangetal.2012)。FoxO在果蝇的先天免疫中起关键作用,它能诱导上调果蝇dPrxV(PeroxiredoxinV,过氧化物氧还酶)的表达水平从而抵御肠道感染(Ahn,Leeetal.2012)。干扰了FoxO的棉铃虫的不能正常蜕皮。FoxO能调控多种基因的表达,那么,FoxO通过调控哪些基因的表达来影响昆虫蜕皮的呢?
   实验结果显示,FoxO在昆虫蜕皮变态期表达水平较高。20E能够上调FoxO的表达,干扰FoxO导致棉铃虫蜕皮异常现象的发生。通过对FoxO缺失导致的昆虫异常蜕皮的机理研究,发现FoxO可以调控CPA的表达,从而促进皮层融离。因此,FoxO在昆虫蜕皮期的皮层融离起关键作用。实验结果丰富了昆虫蜕皮的分子机理,完善对昆虫蜕皮机制的掌握,同时丰富了FoxO的功能研究。另外,昆虫表皮结构具有比较高的保守性,对其他昆虫蜕皮有借鉴意义。
   研究方法与成果和结论
   本文以棉铃虫为实验动物,运用实验室建立的表皮细胞系平台和虫体实验平台,运用分子生物学和细胞生物学等技术,研究了FoxO在昆虫生长发育中所发挥的重要作用,取得如下结果和结论:
   FoxO通过影响CPA的表达参与昆虫蜕皮。FoxO在各组织的蜕皮期和变态期高表达。虫体激素刺激显示20E能够显著上调FoxO的表达,细胞系激素刺激显示20E在6h时使FoxO发生向核的转移。干扰FoxO会导致昆虫蜕皮异常(异常率达62%),说明FoxO对昆虫蜕皮是必须的。进一步检测干扰后的基因变化,发现虫体干扰FoxO会导致Br-Z2、CPA表达受阻。这些结果表明,FoxO参与了昆虫的蜕皮行为,是通过影响皮层融离来实现的。
   创新点及意义
   证明了棉铃虫FoxO在蜕皮期和变态决定期高表达,阐明了FoxO在蜕皮期具有促进皮层融离的功能,20E能够诱导FoxO去磷酸化入核,从而对抗insulin诱导的FoxO的磷酸化和细胞质定位,为20E和insulin的相互作用提供了实验证据,对了解昆虫蜕皮机理具有参考价值。
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