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[硕士论文] 周琳
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:昆虫细胞培养对昆虫细胞-杆状病毒生物技术的应用以及对医学、农业、及生物学的各个领域的发展都起着重要作用。本文以鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)的棉铃虫(Helicoverpa armigera)卵为实验材料,建立了一个新的棉铃虫胚胎细胞系。本实验主要从棉铃虫胚胎细胞系的建立、培养、生物学特性以及昆虫细胞系利用等方面进行了研究。新棉铃虫胚胎细胞系的建立不但为离体条件下进行相关的分子生物学等实验研究提供了潜在材料,也为昆虫细胞系的培养等相关研究奠定了一定的基础。主要的研究结果如下:
  1.棉铃虫胚胎细胞系Ha168的建立
  使用含有10%的TNM-FH培养基对棉铃虫胚胎细胞体外培养,历时将近两年的培养,最终建立了一个生物学特性稳定且生长良好且可以稳定传代的细胞系,命名为Ha168。
  2.棉铃虫胚胎细胞系Ha168的鉴定
  (1)细胞形态特征:Ha168细胞系为贴壁生长型细胞,以圆形,梭形细胞为主,还有少量的巨型细胞,其中圆形细胞约占77%,大小为14.30±2.804μm,n=100;梭形细胞约占20%,大小为12.04±2.928×47.09±12.674μm,n=100。
  (2)细胞系来源的分子鉴定:对比Sf9细胞、棉铃虫卵与Ha168细胞系的细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)序列,结果表明:Ha168细胞与棉铃虫卵COI基因序列相似度为100%,与Sf9细胞的COI基因序列比对相似度仅为91%。
  DAF(DNA Amplification Fingerprinting)与RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)的扩增谱带中Ha168与棉铃虫卵较为相似,与Sf9明显不同。
  以上结果均表明Ha168细胞系来源于棉铃虫组织。
  (3)细胞增殖动力学特性:绘制了Ha168细胞系的增长曲线,算出Ha168细胞系25代时的群体倍增时间为56.8h。
  (4)核型分析:通过对比发现0.7%KCL低渗溶液对观察Ha168细胞系效果最好,在1000倍光学显微镜下观察发现,棉铃虫胚胎细胞的染色体呈点状聚集于核区其结果呈正态分布,染色体数目分布区间为20~210,平均为71条。
  (5)冻存与复苏特性:对在液氮中冻存了6个月的Ha168细胞系进行复苏,观察发现其可以正常贴壁生长,说明此细胞系可以在液氮中长期保存。
  (6)支原体检测:PCR检测Ha168细胞系,结果为无支原体污染。
  3.EGFP在Ha168细胞系中的表达水平研究
  (1)Ha168细胞系对AcMNPV-EGFP的敏感性:用重组病毒AcMNPV-EGFP感染Ha168细胞系,Sf9细胞系作为对照,使用有限稀释法,测定Ha168、Sf9细胞系对AcMNPV-EGFP的半数组织培养感染剂量(Median Tissue Culture Infectious Dose,TCID50),结果为:Ha168细胞系的病毒侵染速度比Sf9细胞系慢,Ha168细胞系的TCID50为10-2.78,Sf9细胞系的TCID50为10-6.1,说明重组病毒AcMNPV-EGFP对Ha168细胞系的敏感性小于Sf9细胞系。
  (2)EGFP在Ha168细胞系中的表达水平:Ha168细胞系的蛋白表达量约为Sf9的7/10。
  综上所述,我们用棉铃虫卵建立了棉铃虫细胞系,并对其进行基础生物学测定,病毒敏感性,以及对外源蛋白表达水平的测定,有进一步的研究价值。
[博士论文] 项文娟
发育生物学 上海交通大学 2015(学位年度)
摘要:集体细胞迁移(collective cell migration)是正常生理发育所必须的,其受控异常会诱导各种疾病发生,比如癌症。细胞间的协调作用是群体有效迁移的保证。果蝇卵子发育过程中(Drosophila oogenesis)的边界细胞迁移(border cell migration)是研究集体细胞迁移的经典体内模型。边界细胞迁移是由两种不同的细胞类型相互协调沟通介导的:2个卵室(egg chamber)前端极细胞(anterior polar cell)分泌细胞因子Unpaired(Upd);作为JAK/STAT信号通路的配体,Upd激活其接收细胞—极细胞周围滤泡细胞(follicle cell)中的JAK/STAT信号通路,并在卵子发育八期(Stage8)诱导STAT活化度最高的其中4-8个接收细胞分化成能移动的边界细胞(border cell);随后边界细胞包围并运载着无移动能力的极细胞,形成花环结构(rosette)的边界细胞团(border cell cluster),脱离卵室前端基底层(basal lamina)后一起穿梭过滋养细胞(nurse cell)间隙,集体向卵室后端的(posterior)卵子(oocyte)方向移动。抑制Upd,边界细胞无法分化和运动,导致雌性不育;单独异常过表达Upd能赋予其他滤泡细胞(other follicle cell)类似边界细胞的运动能力。因此,Upd是边界细胞迁移的充分和必要条件;关于其的精密调控亦是这个过程的关键。
  通过RNAi筛选,我们第一次发现极细胞中的Tousled样激酶(Tousled-like kinase,Tlk)能在不影响极细胞自身分化和存活的前提下,通过特异性地调节Upd而调控边界细胞的分化和迁移。抑制极细胞中的Tlk,正常分化的极细胞诱导边界细胞分化的能力降低,使得含有较少边界细胞的边界细胞团不能正常有效移动,出现移动缺陷的表型(migration defect)。除了这一系列在边界细胞发育过程中的表型,抑制Tlk也能在极细胞自身中诱导类似JAK/STAT信号通路受阻后的表型:卵子发育早期(early oogenesis)产生的过量极细胞(excess polar cell)不能在卵子发育五期(Stage5),通过受JAK/STAT信号通路调控的凋亡过程(apoptosis)精确地减至2个极细胞,而出现多余极细胞表型(extra polar cell)。通过免疫组化染色测试3个JAK/STAT信号通路活性的报告子(reporter),发现抑制极细胞中的Tlk能显著降低边界细胞中的STAT活性。反转录实时定量PCR(qRT-PCR)实验更直接证实极细胞中的Tlk能调控Upd及其在边界细胞中的下游靶蛋白Slbo的mRNA水平。遗传互作实验进一步从功能上表明tlk与upd及其下游stat在边界细胞迁移中的协同作用;过表达upd也能部分但显著地恢复tlk缺失导致的边界细胞移动缺陷。
  这是首次发现Tousled样激酶在细胞运动中的作用,也是首次报道Tlk非细胞自主性的生物学功能:极细胞中的Tlk能通过调节细胞因子Upd转录而控制边界细胞的发育。更是第一发现基因能在不影响极细胞自身分化的前提下,特异性地调控Upd而调节边界细胞的发育,不同于已报到的其他基因,如Eyes Absent(Eya)和Hippo信号通路。这些结果为了解Upd如何被精密调控,及在集体边界细胞迁移中,极细胞如何控制边界细胞发育提供了新的机制;也有助于我们理解疾病发生,如癌细胞在侵润迁移过程中与其他类型细胞间的协调沟通关系。
[硕士论文] 赵洁
微生物学 山西大学 2015(学位年度)
摘要:昆虫杆状病毒是囊膜包裹的双链环状 DNA病毒,大部分寄生于鳞翅目、膜翅目、双翅目昆虫,因其形态呈杆状而得名。自上世纪末以来,它作为一种新型杀虫剂逐渐应用于害虫防治。根据杆状病毒在细胞中的分布和包涵体的形态可分为颗粒体病毒属(GV)和核多角体病毒属(NPV)。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)是杆状病毒的模式种,它研究最多也最具代表性。AcMNPV基因组约为130 Kbp,有150多个开放阅读框。杆状病毒的组织蛋白酶存在于核衣壳和囊膜中,可以降解宿主的肌动蛋白,引起细胞骨架的崩溃。杆状病毒具有多个强启动子,常用的有 IE1、PH、P10、P6.9、ETL,重组外源基因常受上述启动子调控。BmK IT是东亚钳蝎昆虫毒素,可与昆虫细胞膜的钠离子通道相互作用,它可以导致动作电位的重复发放,使得钠电流增强,钠传导的关闭延缓,最终导致昆虫兴奋性麻痹。蝎昆虫特异性毒素可刺激昆虫可兴奋细胞而造成虫体各系统代谢紊乱,通过重组蝎昆虫特异性毒素提高 AcMNPV对农业害虫的防治效果是重要的防治策略。本实验在揭示 BmK IT的抗虫活性的基础上,研究基于BmK IT提高AcMNPV抗虫活性的作用机制。
  本研究主要分为三个部分:(1) AcMNPV介导BmK IT的表达对Sf9细胞增殖及病毒在细胞内复制的影响;(2) BmK IT在AcMNPV不同启动子调控下对Sf9细胞增殖的影响;(3) AcMNPV介导 BmK IT与组织蛋白酶协同表达对 Sf9细胞增殖的影响。
  第一部分采用MTT法、TUNEL试剂、Western blot、 Real-time PCR及病毒滴度测定来检测 AcMNPV-BmK IT(IE1)对草地夜蛾卵巢细胞 Sf9增殖及病毒在 Sf9细胞内的复制情况。用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)感染Sf9细胞(病毒终浓度为1.52×1010 vp/mL(0.6 MOI)、1.9×1010 vp/mL(0.8 MOI)、2.5×1010 vp/mL(1 MOI)和3.8×1010 vp/mL(1.5 MOI)),24 h后通过MTT法检测到重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)对Sf9细胞增殖的抑制率分别是野生病毒AcMNPV处理组的2.8倍、2.1倍、2.0倍和2.4倍;用野生病毒 AcMNPV和重组病毒 AcMNPV-BmK IT(IE1)感染 Sf9细胞(病毒终浓度为1.29×1010 vp/mL(0.5 MOI)),24 h后用TUNEL试剂盒对细胞凋亡状况进行检测,结果显示重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)处理的Sf9细胞被绿色荧光标记的数量远大于野生病毒AcMNPV处理组,进一步证实重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)促进Sf9细胞的凋亡;分别用野生病毒AcMNPV和重组病毒 AcMNPV-BmK IT(IE1)感染 Sf9细胞(病毒终浓度为0.56×1010 vp/mL(0.2 MOI)),24 h后进行Western blot检测,重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)处理的Sf9细胞中c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax蛋白表达量都有所增加,而Bcl-2蛋白表达量有所减少。用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)感染Sf9细胞(病毒终浓度为0.56×1010 vp/mL(0.2 MOI)),24 h后Real-time PCR检测四种病毒关键结构蛋白38K、C42、P78和F基因的转录水平,结果表明重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)处理组细胞中四种关键基因的转录水平分别是野生病毒 AcMNPV处理组的2.1倍、1.5倍、1.6倍和1.8倍。用野生病毒 AcMNPV和重组病毒 AcMNPV-BmK IT(IE1)感染 Sf9细胞(病毒终浓度为1.52×1010 vp/mL(0.6 MOI)、1.9×1010 vp/mL(0.8 MOI)、2.5×1010 vp/mL(1 MOI)和3.8×1010 vp/mL(1.5 MOI)),24 h后检测病毒粒子滴度,结果显示,与野生病毒AcMNPV相比,重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)在细胞中的复制子代病毒量分别提高了58.3%、66.7%、70.6%和42.9%。以上结果显示AcMNPV介导BmK IT的表达在感染细胞前期可加速Sf9细胞的凋亡,并可提高病毒自身的复制能力。
  第二部分实验利用野生病毒 AcMNPV和重组单价病毒 AcMNPV-BmK IT(IE1)、AcMNPV-BmK IT(P10)和AcMNPV-BmK IT(PH)四种病毒感染Sf9细胞(病毒终浓度为3.8×1010 vp/mL(1.5 MOI)), MTT实验结果表明,在感染细胞12 h和24h,病毒对 Sf9细胞的抑制率由高到低依次为:AcMNPV-BmK IT(IE1)、AcMNPV-BmK IT(P10)、AcMNPV-BmK IT(PH)和AcMNPV。感染36 h和48 h,病毒对Sf9细胞的抑制率由高到低依次为:AcMNPV-BmK IT(PH)、AcMNPV-BmK IT(P10)、AcMNPV-BmK IT(IE1)和 AcMNPV。分别用以上四种病毒感染 Sf9细胞12 h,48 h(病毒终浓度为0.56×1010vp/mL(0.2 MOI)),Western blot分析细胞 c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax和 Bcl-2的表达量变化,结果显示在感染12 h, AcMNPV-BmK IT(IE1)处理组 c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax表达量要高于AcMNPV-BmK IT(P10)和 AcMNPV-BmK IT(PH)处理组,而 Bcl-2表达量则与之相反。在48 h, AcMNPV-BmK IT(P10)和 AcMNPV-BmK IT(PH)处理组 c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax表达量要高于 AcMNPV-BmK IT(IE1)处理组,而 Bcl-2表达量则与之相反。
  第三部分实验利用野生病毒 AcMNPV和重组病毒 AcMNPV-BmK IT(P10)、AcMNPV-vcath(PH)和AcMNPV-BmK IT(P10)-vcath(PH)四种病毒感染Sf9细胞(病毒终浓度为1.52×1010 vp/mL(0.6 MOI)、1.9×1010 vp/mL(0.8 MOI)、2.5×1010 vp/mL(1 MOI)和3.8×1010 vp/mL(1.5 MOI)),48 h后通过MTT法检测病毒对Sf9细胞增殖的抑制率,结果显示,AcMNPV-BmK IT(P10)-vcath(PH)处理组对Sf9细胞抑制率平均是重组单价病毒AcMNPV-BmK IT(P10)处理组的1.4倍,是AcMNPV-vcath(PH)处理组的2.1倍。分别用上述四种病毒感染Sf9细胞(病毒终浓度为0.56×1010 vp/mL(0.2 MOI)),48 h后进行 Western blot检测,发现与 AcMNPV-BmK IT(P10)和AcMNPV-vcath(PH)处理组相比,AcMNPV-BmK IT(P10)-vcath(PH)处理组的 Sf9细胞中 c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax蛋白表达量都有所增加,而 Bcl-2蛋白表达量有所减少。
  本研究分析了由AcMNPV介导的BmK IT表达对Sf9细胞的影响及作用机制,研究结果可为重组病毒杀虫剂的研发及机制分析提供实验依据。
[硕士论文] 戴伟宏
生物化学与分子生物学 安徽农业大学 2014(学位年度)
摘要:墨蝶呤还原酶(SPR)是生物体内催化GTP分解代谢合成四氢生物蝶呤(BH4)最后一步反应的关键酶。对 SPR的研究主要集中在高等脊椎动物,在昆虫中的研究报道不多。我们的前期研究表明家蚕(Bombyx mori)的SPR基因(BmSpr)是决定黄体色突变体(lem)的遗传基因,家蚕具有与哺乳动物相似的BH4从头合成途径。墨蝶呤(SP)是形成昆虫体表色的内源性色素之一,也是GTP分解代谢途径的中间产物,大量沉积于lem蚕幼虫的体表。SP也可在SPR和二氢叶酸还原酶(DHFR)的催化作用下经补救途径合成 BH4。作为芳香族氨基酸羟化酶和一氧化氮合酶的重要辅助因子,BH4的缺乏不仅可以引发苯丙酮尿症等生理代谢疾病,而且能够致使多种神经性代谢综合症,同时也是导致高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等内皮功能异常的重要原因。本实验室近两年已经研究了BmSPR的原核表达及酶活特征,试图以从lem蚕幼虫提纯的SP为底物,通过共表达BmSPR和BmDHFR,建立体外合成BH4的实验体系。
  本研究首先利用在线分析软件对BmSPR的疏水性、信号肽、亚细胞定位、功能结构域以及蛋白高级结构进行了全面的生物信息学分析和预测。其次,利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,在两种昆虫培养细胞BmN和Sf9中进行了BmSPR的真核表达研究及重组蛋白的鉴定。
  在Bac-to-Bac表达实验中,首先将BmSpr克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHT B中,获得了重组质粒pFastBacHT B-BmSpr,再将该重组质粒分别转化到含有不同杆状病毒粒子(Bacmid)的AcMNPV和BmNPV的DH10Bac感受态细胞株。在含有能够表达转座酶的辅助质粒DH10Bac的细胞中完成同源重组,获得了重组杆状病毒,分别命名为pAc-BmSpr和pBm-BmSpr。经过验证所获得重组Bacmid准确无误后,参照Lipofectamine2000的说明书,以脂质体介导法用重组BacmidpAc-BmSpr和pBm-BmSpr分别转染相应的宿主细胞Sf9和BmN。通过多次感染,获得较高的病毒滴度后,大量感染宿主细胞,以收获重组目的蛋白BmSPR。SDS-PAGE和Western Blot的检测结果表明,重组蛋白BmSPR在两种昆虫细胞中都能够稳定地表达。
  Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统具有高效安全性,并能获得生物学活性完全的目的酶蛋白。本研究为今后利用该表达系统大量表达和纯化重组 BmSPR,进一步开展BH4体外制备的应用基础研究奠定了必要的实验基础。
[硕士论文] 赵婧妍
农业昆虫与害虫防治 华中师范大学 2014(学位年度)
摘要:细胞凋亡通路的研究受到科学工作者的广泛关注,并且取得了众多成果。目前研究的较为透彻的是在线虫、果蝇和人类中的细胞凋亡通路,由于细胞凋亡事件在进化过程中的保守性,它们存在着许多相似的地方,但也有许多进化上的分歧引发的不同。最具保守性的是内源性线粒体凋亡通路,以哺乳动物为例,当细胞发生凋亡时,细胞色素C从线粒体的内外膜间质释放到细胞质中,跟位于细胞质中的Apaf-1结合引起其聚合形成凋亡体复合物,继而募集起始Caspase9酶原并活化形成一个大型的蛋白水解机器,切割活化效应Caspase引起凋亡的级联反应。然而在对鳞翅目昆虫凋亡通路的研究中却发现了与进化上相近的果蝇凋亡通路中相左事件,即内源性通路起始因子细胞色素C在该通路中是否参与的问题。凋亡体复合物是内源性线粒体通路的中心,而其组装亚单位Apaf-1更是该通路的核心蛋白,对鳞翅目昆虫Apaf-1的研究将为进一步揭示昆虫细胞凋亡通路的分子机制提供条件。本研究首先制备了斜纹夜蛾细胞Apaf-1蛋白的多克隆抗体,并运用该抗体对Apaf-1蛋白的功能进行初步研究。
  根据本实验室获得的斜纹夜蛾Apaf-1SNP序列,选取其中一段编码147个氨基酸的保守序列作为目的片段,构建原核表达载体pET22b-Apaf1N147,表达并纯化融合蛋白His-Apaf1N147,免疫兔子制备多克隆抗血清,然后以亲和层析的方法纯化所获得的抗血清并通过Western blot检测。结果表明,制备并纯化后的抗体可以特异性结合原核表达的Apaf-1抗原蛋白和斜纹夜蛾内源的Apaf-1蛋白。斜纹夜蛾Apaf-1兔多克隆抗体的制备,为进一步研究鳞翅目昆虫Apaf-1蛋白的结构和功能提供了有力的条件;同时,我们也提出了一个快速高效纯化多克隆抗体的方案。
  通过免疫荧光,我们利用所制备的Apaf-1兔多克隆抗体以及带有FITC标签的荧光二抗,以BSA作为对照间接地鉴定了这个蛋白在斜纹夜蛾细胞中的定位,结果显示它定位在胞质中。为了更进一步研究Apaf-1蛋白在鳞翅目昆虫凋亡通路中的作用,需要将该蛋白的ORF正确地扩增出来并外源表达。我们通过改变扩增体系中Mg2+浓度和退火温度以高保真KOD酶最终经过双轮PCR获得了Apaf-1的ORF全长,将其连接到原核表达载体上进行原核表达尝试,结果未获得完整正确表达的Apaf-1蛋白。之后我们构建真核表达载体pIE1-Apaf-1-EGFP并将构建好的真核表达载体转染进处于对数生长期的斜纹夜蛾细胞中,并在荧光显微镜下观察,结果发现外源的融合蛋白Apaf-1-GFP在斜纹夜蛾细胞中得以表达并且表达了的融合蛋白定位在细胞质当中,这与免疫荧光实验的结果相一致。
  用免疫共沉淀技术通过抗原抗体之间相互作用以及Protein G与抗体IgG之间特异的相互作用将斜纹夜蛾胞质蛋白中能够与Cyto C相互作用的Apaf-1蛋白沉淀下来并通过western blot检测;用pull-down技术通过挂在Ni-NTA树脂上的原核表达的融合蛋白His-Cyto C将斜纹夜蛾胞质蛋白中能与细胞色素C相互作用的Apaf-1蛋白留滞在Ni-NTA树脂上,然后通过western blot检测,结果发现在斜纹夜蛾细胞凋亡的线粒体内源性通路中存在Apaf-1蛋白和Cyto C之间的相互作用。之后我们构建了真核表达载体pIE1-EGFP-Cyto C和pIE2-Apaf-1-Cherry,然后将它们同时转染进处于对数生长期的斜纹夜蛾细胞并在激光共聚焦显微镜下观察,结果显示转染后细胞发生凋亡并且红色代表的Apaf-1蛋白和绿色代表的Cyto C蛋白存在基本的共定位现象。这些实验结果进一步肯定了在鳞翅目昆虫斜纹夜蛾中存在类似哺乳动物的内源性线粒体通路。
  Apaf-1多克隆抗体的制备,ORF的克隆以及与细胞色素C之间相互作用的研究都为鳞翅目昆虫细胞凋亡通路分子机制的阐明奠定了基础。
[硕士论文] 孙瑶瑶
农业昆虫与害虫防治 华中师范大学 2014(学位年度)
摘要:细胞凋亡是由胞内基因控制的程序死亡过程,即多细胞生物在生理或病理条件下,经过多途径的信号传导作用而启动内部机制,结束其自身生命的过程。目前人们对于细胞凋亡途径的研究已经进行了一个漫长的过程,由于细胞中的信号转导通路在细胞周期、增殖分化与凋亡以及多种生命活动中的重要调节作用亦愈来愈受人重视,因此关于细胞凋亡与细胞信号转导通路间的关系的研究也相继开展起来。JNK信号转导通路是MAPK通路的一重要分支,或称为应激活化蛋白激酶,它在细胞周期、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用;PI3K信号通路通过参与多种细胞生命活动尤其是调节肿瘤细胞的增殖和存活而受到人们的重视,其中AKT也称为蛋白激酶B(PKB),是PI3K下游主要的效应物,活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶或转录因子来调节细胞的功能。
  关于以上所述的细胞凋亡与细胞信号转导通路关系的研究基本是在哺乳动物细胞中展开,本实验室长期从事昆虫细胞凋亡的研究,前期的实验已经证实了AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程中涉及到线粒体凋亡途径,细胞色素C从胞间质释放到胞质中后引起下游的一系列复杂的凋亡级联反应。本实验拟在此基础之上,探究JNK和PI3K-AKT信号通路与AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程间是否也存在某种联系。
  SP600125和Wortmannin分别是JNK和PI3K-AKT信号通路的特异性抑制剂,实验之前我们对实验细胞SL-1进行了两种抑制剂的耐受性实验,发现SP600125和Wortmannin在浓度低于50μM时,对SL-1的生长基本无毒害用。首先为了更好地了解SL-1细胞在各种条件下的细胞动力学过程,实验中采用血细胞板法计数细胞,绘制它的生长曲线,发现正常培养条件下的SL-1细胞成简单的“S型”生长,当分别加入这两种最适浓度的抑制剂SP600125(2.5μM)和Wortmannin(0.5μM)培养细胞后,SL-1的生长趋势不变,因此后续实验中的抑制剂也是采用这两种浓度。在荧光显微镜下从形态学上定性的观察DAPI染色的SL-1细胞,发现经SP600125和Wortmannin分别处理的AfMNPV诱导后的SL-1细胞,凋亡小体明显减少;流式细胞术定量的测量细胞凋亡率的结果与之一致,抑制剂组的细胞凋亡程度明显较病毒组低,因此初步可以判定JNK和PI3K信号通路参与了AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程。
  接下来研究采用caspase-3酶活的测定以及Western Blot方法检测凋亡相关蛋白的表达,试图探究JNK和PI3K-AKT信号通路如何影响AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡过程。实验结果表明,AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡后,caspase-3酶活增强且被活化切割成17KD片段,启动了下游的凋亡事件,但是当分别或同时加入抑制剂SP600125和Wortmannin后,caspase-3的切割大幅度减弱,凋亡程度明显被抑制,其中同时使用两种抑制剂的效果和单独使用抑制剂时区别不大。于是对凋亡上游事件细胞色素C的变化情况进行检测,和预测结果一致,在加入抑制剂SP600125和Wortmannin后胞质中细胞色素C含量显著下降,这就说明在AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的起始阶段,JNK和PI3K信号转导通路即被活化参与到整个凋亡进程中。
  在哺乳动物细胞中发现编码JNK的基因jnk1、jnk2、jnk3,其相应的编码产物JNK1和JNK2广泛存在于各组织中,当JNK通路被激活,相应的蛋白JNK1和JNK2会发生磷酸化进而发挥功能。当用免疫印迹杂交的方法检测JNK1/2和PI3K的关键效应物AKT蛋白的表达情况,发现AfMNPV是通过磷酸化JNK1/2和AKT来分别激活了JNK和PI3K-AKT信号通路并且影响了SL-1细胞周期,但是所有这些蛋白的磷酸化程度在分别加入SP600125和Wortmannin后相应的减弱。实验结果显示无论是被活化切割的caspase-3蛋白还是JNK和PI3K信号通路的效应物P-JNK1/2和P-AKT,蛋白含量都随病毒诱导凋亡时间的延长而增加。
  因此初步可以得出结论,JNK和PI3K-AKT信号通路通过活化JNK1/2和AKT蛋白而参与到AfMNPV诱导的SL-1细胞凋亡过程中,协同调节各种凋亡反应并且影响细胞周期的改变。
[硕士论文] 关洁
动物学 上海师范大学 2013(学位年度)
摘要:蜱是一类仅依靠宿主血液生存的动物体表外寄生虫,蜱也因为传播大量的病原体而被人们熟知,包括立克次氏体、病毒、细菌、原虫等,这些病原体会导致动物和人类疾病。目前用来控蜱的策略仍然是用化学杀虫剂,但是这会带来蜱对杀虫剂的抗性,同时也会因为化学残留造成环境污染。因此,需要新的绿色环保的替代手段来控制蜱。不像其他的吸血节肢动物那样饱血迅速,蜱在吸附宿主后相当长一段时期吸取宿主大量的血液,因此蜱拥有一套有效地消化血液和吸收营养的机制。这些与蜱的吸血和血液消化相关的分子可能成为一类新的有效的控制蜱的疫苗候选分子,但是有关蜱消化血液的生物化学途径的信息很少。丝氨酸蛋白酶广泛存在于多种生物体中,参与众多的生理过程,如生理消化、血液凝固、免疫反应及细胞凋亡等。蜱吸食大量的血液之后,需要蜱体内的一系列酶来参与血液的消化,所以这些酶分子的分离及鉴定,不仅有助于了解蜱的生理学特征,还可以挖掘出有抗蜱免疫作用的候选靶标。
   本实验是采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术,从镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA中克隆出两个丝氨酸蛋白酶新基因,分别命名为SP30基因和SP48基因,进而对两个基因的全长序列进行生物学分析并进行编码序列的原核表达。应用Real-time PCR技术对两个基因在镰形扇头蜱的不同发育阶段和不同组织器官的差异表达分析,还对SP30和SP48基因进行了RNA干扰分析以及重组蛋白的酶活分析。结果表明,SP30和SP48基因全长分别为1194 bp和1586bp,分别编码299aa和462aa,预测分子量大小分别为30 kDa和48 kDa,都具有信号肽。将两基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,进行原核表达,经IPTG诱导,得到大小分别为56 kDa和74 kDa的重组蛋白。用纯化得到的重组蛋白分别免疫小鼠制备抗血清,进行Western blot分析表明,两种抗血清均能够识别蜱肠道30 kDa和48 kDa的天然蛋白。Real-time PCR分析结果表明,SP30和SP48基因在蜱的不同发育阶段均有不同程度的表达,其中SP30基因在未吸血的若蜱阶段表达量最高,而SP48基因在半饱血的若蜱阶段表达量最高。SP30和SP48基因在蜱的不同组织器官也均有不同程度的表达,两者都是在蜱的肠道中表达量最高。酶活性分析表明,rSP48重组蛋白浓度为5μM时与底物反应,表现出一定的活性。Real-time PCR结果显示,SP30和SP48基因干扰前后沉默效果明显。从生物学特征来看,SP30和SP48基因在干扰后,饱血率发生了一定的变化。
   综上所述,本研究应用RACE技术克隆出SP30和SP48基因,并进行原核表达。应用Real-time PCR分析两基因在不同发育阶段及组织器官的差异表达,并对两基因进行了RNA干扰分析,这些研究将为蜱的生理学特性了解和研究抗蜱疫苗提供基础。
[博士论文] 张欣
生态学 中国林业科学研究院 2011(学位年度)
摘要:昆虫细胞培养技术作为细胞工程基础之一,是现代实验生物学上极有价值的手段之一,广泛应用于生物学、医学及农业的各个领域。本文主要从昆虫细胞培养、细胞系建立、昆虫细胞系建立过程的生物学特性及昆虫细胞系利用等方面进行研究,通过研究为昆虫细胞系的建立提供有价值的技术手段,了解昆虫细胞在建系过程中发生的生物学变化规律,为昆虫细胞的研究与利用提供重要的理论依据。主要研究结果如下:
  1.不同目昆虫细胞培养技术。通过对来源于直翅目的短翅鸣螽(Gampsocleis gratiosa Brunnervon Wattenwyl)、东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis Meyen);鳞翅目的柑橘凤蝶(Papilio xuthus Linnaeus)、枯叶蛱蝶(Kallima inachus Doubleday)、金斑蝶(Danaus chrysippusLinnaeus);鞘翅目的喙尾琵琶甲(Blaps rhynchoptera Fairmaire)、黄粉虫(Tenebrio molitor Linnaeus)的多种组织原代培养条件研究,得出各种组织原代培养时的适宜培养条件,研究结果显示不同目昆虫细胞培养所适宜的条件不同。
  (1)直翅目昆虫细胞培养的消毒时间为3min,来源于5d胚胎组织的细胞较易取得传代,适宜于改良Grace及Schneider培养基及10%Hyclone+10%民海血清的搭配中培养,培养基的更换时间在30d左右。
  (2)鳞翅目昆虫细胞培养宜的消毒时间为3min左右,来源于3-4d胚胎、新孵幼虫、蛹血淋巴、蛹脂肪体组织的细胞较易取得传代,适宜于在改良 Grace及 Grace培养基及10%Hyclone+10%民海血清的搭配中培养,培养基的更换时间在15-20d之间。
  (3)鞘翅目昆虫培养的消毒时间为5-8min,来源于新孵幼虫、精巢、脂肪体组织的细胞较易取得传代,适宜于改良Grace及Schneider培养基及10%Hyclone+10%民海血清的搭配中培养,培养基的更换时间在25-30d之间。
  2.昆虫细胞系的建立。在上述培养技术和条件研究基础上对多种昆虫组织进行培养,8种昆虫细胞发生增殖而进行传代培养,但大部分细胞在传至一定代数后停止增殖,使传代不能正常的进行下去。其中1个柑橘凤蝶新孵幼虫细胞及3个短翅鸣螽胚胎细胞度过了传代的危机,并能稳定增殖,传代超过50代,成为无限细胞系,分别命名为RIRI-PX1、RIRI-GG1、RIRI-GG2、RIRI-GG3。
  3.建系过程中的生物学特性研究。RIRI-GG1细胞培养初期细胞形态多样,随着细胞生长的逐渐稳定,细胞形态主要为多边形及梭形细胞,并以多边形细胞为主。增殖动力学特征表现出稳定性,50代及60代细胞的生长曲线的走向变化不大,其群体倍增时间分别为105.3h及104.6h。不同代数的RIRI-GG1细胞染色体制片的条件无明显差异,都只有在0.005M秋水仙素处理4.5h,KCl处理浓度0.50%,处理时间为15min时的效果最好。RIRI-GG1的染色体特征随着传代次数的增加而逐渐变化,在传代的前短翅鸣螽原核型特征为2n=31♂,32♀,细胞染色体平均数在传代过程中有增加的趋势,1-50代细胞染色体平均数分布与31-42之间,各代次的细胞仍是二倍体细胞占多数,各代数细胞染色体形态差异不大,两条染色单体明显,为近端部或端部着丝粒染色体。通过ITS序列及COI基因序列比对,证实RIRI-GG1确实来源于短翅鸣螽胚胎细胞。
  RIRI-PX1细胞形态随传代次数增加而逐渐变化,培养初期细胞形态多样,随着细胞生长的逐渐稳定,细胞形态以梭形细胞为主;增殖动力学特征表现较高的稳定性,在50代及60代时的生长曲线的走向变化不大,其群体倍增时间分别为42.5h及42.1h。不同代数的RIRI-PX1细胞染色体制片的条件无差异,最优的条件均为0.005M秋水仙素处理5h,0.65%的KCl低渗溶液处理15min。柑橘凤蝶的原染色体难以计数,随后代数细胞染色体变异度较大,主要表现为为染色体数目众多,且数目分布广泛,染色体异倍化及多倍化严重,且染色体数目的变化不具备规律性,7-50代 RIRI-PX1细胞染色体数目平均数在103-199之间,染色体形态多为弥散型着丝粒的短杆状、颗粒状、点状或圆球状。通过COI基因比对,证实RIRI-PX1确实来源于柑橘凤蝶新孵幼虫。
  4.昆虫细胞系的利用。采用来源于3个目的14种昆虫细胞系对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus)和家蚕核型多角体病毒BmNPV(Bombyx morinuclear polyhedrosis virus)进行敏感性测定。试验结果表明,各昆虫细胞系对AcNPV及BmNPV的敏感性不同,来源于双翅目及直翅目的细胞系均不能被这两种病毒感染,AcNPV可侵染来源于鳞翅目的Sf21、Sf9、HighFive、RIRI-PX1及HZ,而BmNPV仅能侵染BmN细胞。其中AcNPV对Sf9细胞的感染率最高,接种病毒10 d后感染率平均达84.0%,而 RIRI-PX1的AcNPV病毒产量最高,形成的多角体数目为43.9PIBs/感染细胞。接种BmNPV10 d后BmN的感染率为72.2%,形成的多角体数目为23.1.PIBs/感染细胞。
  测定了氯氟氰菊酯等4种常用农药及二甲苯在不同浓度水平及时间上对7种昆虫细胞系的毒力。结果表明:4种农药对离体培养的7种昆虫细胞的生长均产生了影响,其中印楝素的毒力效果最为显著,其次是高氯?灭乳油、马拉硫磷及氯氟氰菊酯,二甲苯在设置的浓度下对7种细胞的影响不明显。在同一药剂同一浓度处理下,不同细胞系的反应不同,其中Sf9细胞系最为敏感,其次是NIAS-MaBr-85、SL2、NIH-SaPe-4、C6-36、RIRI-GG1及RIRI-PX1。研究结果表明昆虫细胞对农药的敏感性与农药的作用机理一致,昆虫细胞系用于农药的毒力测定及研究是可行的。
[硕士论文] 李亮
农业昆虫与害虫防治 河南农业大学 2010(学位年度)
摘要:昆虫识别挥发性气味分子的灵敏性和特异性对其生存和繁殖起着重要作用,这个过程包括对气味分子的结合、接受、把化学信号转化为电信号的信号转导、信号终止等步骤,有多种蛋白相互作用共同完成。性信息素结合蛋白(PBPs)能选择性识别结构非常相似的性信息素成分,而谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)具有使醛类物质特别是性信息素信号终止的作用,因此,PBPs和GSTs在昆虫雌雄间信息交流中都具有重要的作用,并承担着不同的功能。本文对烟夜蛾PBPs和GSTs基因进行了克隆、表达模式及原核表达研究,期望为进一步分析和探明烟夜蛾雌雄间的信息交流机制提供依据。主要研究结果如下:
   (1)利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾雄虫触角中克隆了PBP2基因的开放阅读框及3′末端序列,该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为Eu316186)。克隆和测序结果表明,HassPBP2开放阅读框全长450bp,编码149个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为16.9kD,等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明,该基因由3个外显子和2个内含子组成,内含子的长度分别为90bp和261bp。氨基酸序列联配分析表明,此序列具有气味结合蛋白的典型特征,与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%-91%之间,其中与棉铃虫PBP2和烟芽夜蛾PBP2的序列一致性高达91%。
   (2)利用跨内含子引物和半定量RT-PCR方法,研究了HassPBP2在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达,在蛹中期开始表达,并一直持续到成虫中后期,且只在雌雄成虫触角中表达。
   (3)成功构建了HassPBP2的原核表达载体pGEX-HassPBP2,导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经过IPTG诱导以及SDS-PAGE分析,结果表明融合蛋白得到了成功表达。
   (4)利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾雄虫触角中克隆了获得了1个谷胱甘肽S-转移酶基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为EU289223)。克隆和测序结果表明,该基因开放阅读框全长654bp,编码217个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.8KD,等电点为7.76。基因结构分析表明,该基因由6个外显子和5个内含子组成,内含子的长度分别为41.5bp、513bp、296bp、333bp和269bp。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe1。
   (5)利用跨内含子引物和半定量RT-PCR方法,研究了HaGSTe1在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HaGSTe1在幼虫中期、晚期,蛹晚期和成虫期均表达,而在卵、幼虫早期和蛹早期、中期不表达;在雌、雄成虫的触角和喙中表达。并成功构建了HaGSTe1的原核表达载体pGEX-HassGSTe1。
   (6)利用R-T-PCR方法,从烟夜蛾成虫腹部克隆获得了另1个谷胱甘肽S-转移酶基因的完整开放阅读框的cDNA序列(GenBank登录号:GQ856239)。该基因的开放阅读框全长636bp,编码211个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.2kD,等电点为6.66。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe2。
   (7)利用半定量RT-PCR方法,研究了HaGSTe2在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HaGSTe2在雌、雄虫触角、喙、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅中均有表达,而且在卵、幼虫和蛹中也有表达。
  
[硕士论文] 张玮莹
农业昆虫与害虫防治 华中师范大学 2010(学位年度)
摘要:细胞凋亡(apoptosis),是一种自主的、有序的,并按照某种预定程序发生的生理性自然死亡过程,是当前生命科学研究中的热门领域之一。凋亡体(apoptosome),是在线粒体介导的凋亡途径中,由细胞色素C(Cytochrome c,Cyt c)、ATP/dATP、凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)以及procaspase-9(Caspase-9的前体)构成的约700 kDa、具有很强的Caspase酶激活活性的大分子蛋白复合物,它能使procaspase-9自剪切成两段而被活化为Caspase-9,进而切割和活化下游的效应Caspase-3,启动Caspase级联反应,导致不可逆的细胞凋亡。研究表明,哺乳动物细胞发生的线粒体凋亡途径中有凋亡体的存在,并在胚胎发育中起至关重要的作用。本文即对昆虫的凋亡细胞中凋亡体的存在与否进行了初步的研究。
   病毒感染是一种常见的引起细胞凋亡的因素,本实验以杆状病毒AfMNPV诱导昆虫细胞S1-1发生凋亡,分别采用DAPI染色法、琼脂糖凝胶电泳法、荧光分光光度法、Western Blotting等方法检测了凋亡细胞的形态学与生物化学特性、Caspase-9活性及凋亡体复合物的存在与否。
   用AfMNPV感染S1-1细胞不同时间,DAPI染色与琼脂糖凝胶电泳结果均显示,杆状病毒感染S1-1细胞8 h后,能诱导发生细胞凋亡。由于凋亡体形成后,首先激活Caspase-9,因此我们采用荧光分光光度法,使用Caspase-9的特异性荧光底物Ac-LEHD-AFC和Caspase-9特异性抑制剂Z-LEHD-FMK检测凋亡细胞的Caspase-9的活性,结果表明,在AfMNPV诱导S1-1细胞8 h后即可检测出Caspase-9的活性,并在AfMNPV诱导S1-1细胞24 h时Caspase-9的活性达到最高值。为了进一步检测凋亡细胞是否有凋亡体的产生,我们又用Western Blotting分析了凋亡体复合物的蛋白质组分,结果显示,以AfMNPV诱导S1-1细胞6 h后能检测到组成凋亡体的蛋白质,但12 h后相应的蛋白质组分消失。以上这些研究结果表明,AfMNPV能诱导S1-1细胞凋亡,并初步认定昆虫细胞凋亡与哺乳动物细胞一样也有凋亡体的存在。
[硕士论文] 李银花
有害生物防治 青岛农业大学 2009(学位年度)
摘要:本论文以Sf-9为对照,对目前国际上广泛应用的BTI-Tn5B1-4细胞及其克隆株H5CL-G和H5CL-F分别进行了无血清驯化和培养,比较了细胞系在无血清培养基Sf-900Ⅲ和有血清培养基TNM-FH中的细胞形态、生长速率、病毒产量和重组蛋白表达水平,主要结果如下:
   1、在Sf-900Ⅲ中,细胞形态都发生了改变,BTI-Tn5B1-4和H5CL-G的梭形细胞比例都有不同程度的下降,细胞变的短而粗,圆形细胞比例增加,细胞略变大。H5CL-F的梭形细胞完全变为圆形细胞,直径为16.65±1.36μm,而在TNM-FH中梭形细胞比例为94.6%,大小为57.49±1.85μm×14.15±2.40μm,圆形细胞比例为5.4%,直径为15.59±1.26μm。Sf-9细胞比在TNM-FH培养的略大。
   2、细胞在两种培养基的生长曲线测定显示,BTI-Tn-5B1-4、H5CL-G、H5CL-F和Sf-9在Sf-900Ⅲ中生长速度快,倍增时间短,群体倍增时间分别为18.5h、18.8h、19.0h和21.7h,而在TNM-FH中它们的群体倍增时间分别为21.9h、21.69h、21.87h和25.4h。
   3、用AcMNPV-1A病毒分别对两种培养基中的BTI-Tn-5B1-4、H5CL-G和H5CL-F细胞进行侵染。结果表明,细胞系在两种培养基的病毒感染率都在90%以上,多角体产量两种培养基间无明显差异。细胞系BTI-Tn-5B1-4、H5CL-G和H5CL-F在Sf-900Ⅲ中的多角体产量大约为Sf-9在TNM-FH的2~3倍。
   4、重组蛋白β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和碱性磷酸酶(secretedalkalinephosphatase,SEAP)的表达测定,结果表明,两种培养基间的β-半乳糖苷酶表达量在细胞系BTI-Tn-5B1-4和Sf-9均无明显差异;细胞系H5CL-G和H5CL-F在Sf-900Ⅲ中表达量高于在TNM-FH的表达量,其中H5CL-F在Sf-900Ⅲ中表达量最高(4.08×104IU/ml),大约为它在TNM-FH的表达量的2.55倍。四种细胞系的碱性磷酸酶在Sf-900Ⅲ中的表达量明显高于在TNM-FH中的表达量,其中BTI-Tn-5B1-4在Sf-900Ⅲ的表达水平最高(3.90IU/ml),大约为H5CL-G、H5CL-F和Sf-9在TNM-FH表达量的3~5倍。
[硕士论文] 朴冬花
农业昆虫与害虫防治 东北农业大学 2008(学位年度)
摘要:目前已分离出一些昆虫几丁质酶,并且已将昆虫几丁质酶基因导入到植物中以增强植物的抗虫性,及将几丁质酶嵌入到昆虫病原体内,增强昆虫病原体对害虫的为害。本文从小地老虎体内分离和表达了几丁质代谢相关酶基因,详细了解其分子特性对研究和开发几丁质代谢相关酶为基础的杀虫剂是十分必要的。 ⑴从预蛹期小地老虎体内分离出两条几丁质酶基因cDNA序列,一条是全长基因序列,另一条是包含5’端的基因片段。全长的小地老虎几丁质酶基因cDNA序列长度为2823bp,包括1677个碱基的开放读码框,编码558个氨基酸,分子量为62.5kDa。5’端的几丁质酶基因cDNA序列片段长度为1082bp,编码360个氨基酸。由全长几丁质酶基因推导的氨基酸序列包含两个保守区域,一个是N-端的高度保守的几丁质催化区,另一个是C-端包括六个半胱氨酸的几丁质结合区。在催化区和几丁质结合区中间有一个被称为Linker的富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸的区域(PEST富集区)。预测其成熟期蛋白的N-端还含有一个疏水性的信号肽。 ⑵从已发现昆虫几丁质酶基因推导的氨基酸序列中的N-位和O-位糖基化的何点的确定,对于研究昆虫蛋白的分泌和维持其稳定性是必要的。利用PROSCAN和NetOGlyc2.0软件发现住小地老虎几丁质酶氨基酸序列中有2个N-位糖基化位点和20个O-位糖基化位点。 ⑶从预蛹期小地老虎体内分离出两条包含3’端的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。其中一条的长度为2267bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.6kDa。另一条的长度为2278bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.5kDa。两条β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推导的氦基酸序列都包含两个保守区,一个是N-端的水解催化区,另一个是C-端的水解结合区。 ⑷利用PROSCAN和NetOGlyc2.0软件发现在两条小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸序列中都有3个N-何糖基化位点和1个O-何糖基化位点。从取食期小地老虎体内分离出一条几丁质合成酶基因cDNA序列,长度为975bp,包括792个碱基的开放读码框,编码264个氨基酸,分子量为30.0kDa。利用BLAST搜寻出许多与小地老虎几丁质酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为80%,与棉铃虫同源性为85%,与美国白蛾同源性为83%,与斜纹夜蛾同源性为89%。序列比对表明小地老虎几丁质酶基因与其他鳞翅目昆虫的几丁质酶基因显示高同源性(75%以上)。利用BLAST搜寻出与小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草大蛾相应片段推导的氨基酸序列同源性为73%,与草地贪夜蛾同源性为37%,与玉米螟同源性为74.4%。用BLAST搜寻出与小地老虎几丁质合成酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草大蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为79%,与甘监夜蛾同源性为92%,与甜菜夜蛾同源性为89.4%。 ⑸克隆出的小地老虎几丁质代谢相关酶基因的cDNA序列已分别登录在GenBank上,登录号分别为:几丁质酶基因EU035316,EU622802:β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因EU622803,EU622804;几丁质合成酶基因EU601174。利用RT-PCR方法对小地老虎体内不同时期的几丁质代谢酶基因的时空表达进行了研究。结果表明,幼虫蜕皮和预蛹期有几丁质酶和β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶的mRNA表达,而在幼虫取食期只有几丁质合成酶的mRNA表达。
[博士论文] 余倩
微生物学 中山大学 2008(学位年度)
摘要:杆状病毒感染昆虫细胞可诱导细胞凋亡(apoptosis),细胞凋亡作为一种宿主范围决定因子限制了杆状病毒的杀虫范围,影响杆状病毒杀虫剂在生物防治中的应用:然而,在长期进化过程中,杆状病毒获得了抗凋亡基因以阻止细胞凋亡,使其能够正常复制。在已测序的杆状病毒中绝大部分都包含两个或两个以上的抗凋亡基因,但是部分体外实验结果表明,并不是所有抗凋亡基因都具有抗细胞凋亡活性。本研究首次利用RN Ai技术对斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)中两个抗凋亡基因Splt-iap4和Splt-p49在SpltNPV受纳宿主中的抗凋亡功能进行研究,通过瞬时表达检测探讨两个基因在SpltNPV非受纳宿主中的抗凋亡功能,同时对抗凋亡基因与其宿主的进化关系进行了初步探讨。主要结果如下: PCR扩增得到Splt-p49基因和Splt-iap4基因,分别将其连接到含有两个反向T7启动子的质粒载体上,体外转录得到大片段的双链RNA (double strain RNA,dsRNA),将dsRNA分别或同时转染至被SpltNPV病毒感染的SpLi-221细胞以沉默Splt-iap4或Splt-p49,或者同时沉默Splt-iap4和Splt-p49的转录。经光学显微镜观察、DNA ladder检测、细胞存活率计算以及病毒滴度测定,结果说明SpltNPV感染SpLi-221细胞时,Splt-P49具有抗凋亡功能,而Splt-IAP不具有这种功能。但实验中发现,SpltNPV感染SpLi-221细胞在48 h之前细胞会聚集成团,而勋Splt-iap4dsgNA处理细胞未出现此现象,大部分依然是独立的单个细胞,推断Splt-lap4基因在病毒感染期间起到了某种作用使得细胞的聚集受阻,但Splt-iap4的功能与病毒产生可感染性的子代病毒无关。 在vAcAnh感染Sf9系统中,分别瞬时表达Splt-iap4和Splt-p49两基因,经光学显微镜和细胞存活率计算方法检测,结果同样显示Splt-P49具有抗凋亡功能而Splt-IAP不具有抗凋亡功能,且Splt-IAP无辅助抗凋亡功能或延迟细胞凋亡功能。最后对杆状病毒中的抗凋亡基因与其来源宿主进行进化分析,结果显示亲缘关系相近的杆状病毒所含的抗凋亡类型也相近,说明抗凋亡基因与杆状病毒进化有着密切的关系,也可能发挥着重要作用。 斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(S. exigua)同属夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属的昆虫,亲缘关系很近.且SpltNPV和甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)基因组相似性很高,但这两种病毒并不能交叉感染各自宿主。本文从细胞水平和亚显微水平对SpltNPV感染非受纳宿主离体细胞Se301的过程进行了描述,并对感染失败的原因进行了初步的生化分析。 光学显微镜显示,被SpltNPV感染的Se301细胞在感染后24 h至120 h期间细胞出现了明显的病理现象,包括细胞空泡,细胞聚集等,且随着时间的延长病理症状越来越严重,但感染细胞中始终没有病毒多角体。DAPI染色荧光观察和电镜观察结果,都表明从24 h至120 h各样品中均显示细胞出现了早期凋亡的特征,但未形成晚期凋亡特征的凋亡小体。TCID50检测表明病毒没有产生有感染性的芽生型子代病毒。Dot blotting显示,在被感染的Se301细胞中可完成病毒DNA的复制;RT-PCR分析也显示,感染细胞72 h时,SpltNPV的早、晚期基因都有转录;Western blotting没有检测到被感染细胞中有极晚期基因polyhedrin的表达。以上结果表明,SpltNPV的感染可导致Se301细胞出现明显的早期凋亡症状,但不能进行到凋亡的最后阶段:虽然病毒可完成DNA的复制且早、晚期基因均有转录,但病毒的感染不能发展至极晚期,说明早期细胞凋亡仍然是限制病毒完成复制周期的重要因素。
[硕士论文] 徐明旭
动物学 南京农业大学 2008(学位年度)
摘要:由基因编码的抗菌肽首先从昆虫中分离鉴定得到,它被认为是宿主内广泛存在的一个抵御病原菌的生物化学防御机制。抗菌肽一般含有100个或者更少氨基酸残基,在中性环境中带正电荷,并且在低浓度下就对多种微生物和某些病毒具有广谱的抑制作用。现已在所有的生物门类中分离出抗菌肽,并且在宿主防御中发现有它们的表达和释放。 昆虫几乎存在于所有的陆生生境中,是地球上最大的生物类群,约占整个生物界物种总和的75%。它们是一类具有生态、科研、经济以及文化价值的自然资源。更重要的是,昆虫的血淋巴也是具有很大开发潜力的生物资源宝库。昆虫的血淋巴中含有种类繁多,功能复杂的生物活性物质,这些活性物质在昆虫的宿主防御中起到至关重要的作用。存在于昆虫血淋巴中的生物活性成分引起了世界上研究人员极大的关注。迄今为止,已从昆虫中分离鉴定出许多具有多种生物活性的多肽以及蛋白质。现已经鉴定出来的昆虫大约有1百万种,我国拥有约占世界1/10的昆虫资源,在生物活性物质开发方面具有极大的潜力。 以药用昆虫白星花金龟(Protaetia brevitarsis)幼虫为研究对象,对其血淋巴进行抗菌生物活性物质筛选:结果发现,白星花金龟血淋巴对枯草芽孢杆菌(Bacillus subttilis)具有较强的抗菌活性。 通过葡聚糖凝胶层折和反相高效液相层析等生物化学手段和研究方法,在白星花金龟幼虫血淋巴中发现两种抗菌活性物质,并对其抗菌活性作了初步研究。 通过三步分离纯化过程:Sephadex G-50凝胶过滤和两步反相高压液相层析(RP-HPLC),从白星花金龟幼虫血淋巴中分离纯化出两种对枯草芽孢杆菌具有较强抗菌活性的物质。借助于质谱,得到这两种抗菌活性物质的相对分子质量分别为2254.0459、2262.4438道尔顿。 以来源于单个昆虫白星花金龟幼虫个体脂肪体中提取的mRNA为材料,建立了白星花金龟幼虫脂肪体cDNA文库,得到大约为1×106个独立的克隆。这是首次构建白星花金龟幼虫脂肪体cDNA文库,为白星花金龟抗菌肽基因的克隆和结构功能研究奠定了基础。 肽聚糖识别蛋白是一种模式识别受体,可以与肽聚糖发生特异性的结合,在先天性免疫反应中起重要作用。通过Genbank搜索昆虫肽聚糖识别蛋白编码序列,通过序列分析找出保守序列设计引物,然后对来源于单个白星花金龟幼虫脂肪体的ds cDNA进行特异性PCR扩增,我们得到白星花金龟幼虫脂肪体肽聚糖识别蛋白成熟蛋白cDNA序列。该cDNA序列由623个核苷酸组成,推导出来的肽聚糖识别蛋白成熟蛋白组成为174个氨基酸,通过Genbank进行Blast发现该PGRP-S和来源于东北大黑腮金龟(Holotrichia diomphalia)的PGRP-1有98%的同源性。这是首次从白星花金龟得到来源于脂肪体的PGRP成熟蛋白cDNA序列。
[硕士论文] 于洋
动物学 南开大学 2008(学位年度)
摘要:细胞分类学(Cytotaxonomy)是生物系统学的一个重要组成部分,将细胞学知识应用到分类学中,推动了经典分类学的发展,并为更深层次地研究分类提供了新的手段。本文依据细胞分类学的理论,选取了摇蚊科昆虫中3亚科19属29种作为实验材料,首次对中国范围内摇蚊科习见种类染色体进行形态学研究。
   论文主要分为5部分,即总论、摇蚊及其染色体、材料与方法、实验结果、讨论及结果分析。
   总论部分介绍了细胞分类学的理论依据及研究内容,对细胞分类学的主要研究对象-染色体作了介绍,总结了具体的研究方法以及目前对昆虫染色体研究的现状,最后阐述了本项研究的目的、意义及其前景展望等方面内容。
   在摇蚊及其染色体部分,分别介绍了摇蚊科昆虫的特征及实践意义,详细地对染色体实验所用材料-摇蚊幼虫进行了描述,并对摇蚊染色体进行介绍,包括基本知识、染色体特征、国内外研究状况以及用于以系统学为目研究中的多线染色体主要性状。
   材料与方法部分,介绍了摇蚊幼虫的野外采集方法,室内实验所需要的实验器具以及实验药品,最后详细介绍了整个实验过程。
   实验结果部分,对选取的3亚科19属29种摇蚊科昆虫(其中摇蚊亚科Chironominae23种:长跗摇蚊族Tanytarsini3种、摇蚊族Chironomini20种,直突摇蚊亚科Orthocladiinae2种,长足摇蚊亚科Tanypodinae4种)进行了染色体形态学研究。其中23种摇蚊的染色体形态学特征为国际上首次报道。文中给出了每种染色体分带显微图片共计76幅。同时编制了基于染色体特征的分种检索表。
   讨论及结果分析部分,依据实验过程中的体会,对实验材料的选择、唾腺的获取、染色液的选择、染色前以及染色过程中所需要注意的事项、压片及制片等技术提出自己的心得和经验总结。文中对实验结果结合已有文献记录进行了比较分析,最后提出了该方面研究的工作展望。
[博士论文] 田颖
动物系统学 南开大学 2008(学位年度)
摘要:半翅目异翅亚目(六足总纲:昆虫纲:半翅目)是昆虫纲中种类较多,在世界范围广泛分布的一个类群。自从Linnaeus于1735年建立半翅目以来,为了建立自然的分类系统,其内部类群间系统发育关系的研究一直是人们关注的问题,附着生物分类学方法和分子系统学手段的发展,有关异翅亚目高级阶元间系统发育关系的研究成为近年来关注的热点。
   本研究以异翅亚目七个型,臭虫型内各总科和盲蝽科各亚科为研究对象,对半翅目异翅亚目高级阶元的系统发育关系进行了系统的研究,并首次应用DNA序列对臭虫型总科内部的系统发育关系进行探讨,论文分为6个部分:
   第一部分,对半翅目异翅亚目,以及内部类群中的臭虫型和盲蝽科的分类学和系统发育研究的历史及现状进行简要的回顾,并对其中比较重要的系统发育研究工作进行了评价,指出目前研究中存在争议的问题和本研究的意义。该部分还简要介绍了分子系统学研究现状,建树方法、核基因和线粒体基因的比较,总结了异翅亚目分子系统学研究的概况,并对本研究涉及的在完全合并分析中数据不相合性问题及检测方法进行了总结。
   第二部分,系统的阐述了取样原则和方法步骤。具体介绍了研究过程中标本采集,鉴定,实验条件,设备型号,分析软件,运算参数等。
   第三部分,以18S rDNA全序列,28S rDNA中D3区,线粒体16S rDNA和COI基因片段,共4121 bp序列为分子标记,选取代表异翅亚目七个型的49个类群,2个外群共51种昆虫,对半翅目异翅亚目高级阶元的系统发育关系进行了分析。分别得到了基于四个数据集独立分析和合并分析下的最大似然树和贝叶斯系统发育树。综合分析结果证实了Schuh(1979)和Wheeler等人(1993)基于形态或形态与分子数据得到的臭虫总科和蝽总科的姐妹群关系,以及异翅亚目的单系性。并提出了与以往结果不同的观点:蝎蝽型为异翅亚目的基部分支,鞭蝽型与黾蝽型互为姐妹群。细蝽型与奇蝽型的关系未得到明确解析。在分子标记的评价方面,证实了18S rDNA为研究这一阶元工作适合的分子标记,28S rDNA的D3区和COI基因片段可以提供部分信息,而16S rDNA则不适合异翅亚目高级阶元的研究。
   第四部分,针对目前在半翅目异翅亚目臭虫型系统发育研究中存在的争议,应用18S rDNA全序列,28S rDNA中D3区,线粒体16S rDNA片段共3277 bp序列,对代表臭虫型全部17个科中12个科的46个类群和3个外群(未包括粗股蝽科,非姬蝽科,毛唇花蝽科和丝蝽科和Schuh等2008年新增的一科Curaliidae),采用最大简约法,最大似然法,贝叶斯法构建系统发育树。研究结果证明了Schuh和Stys(1991)分类系统中臭虫总科的合理性,反映了臭虫总科和姬蝽科的近缘关系。通过使用ILD,PBS系数和PABA三种方法检测合并数据集中数据的不相合性,证明了在16S rDNA和核基因数据之间存在着显著的不相合性。16S rDNA被证明存在碱基替换饱和并在合并中引入冲突信号,不适合解决臭虫型高级阶元的系统发育关系。而18S rDNA和28S rDNA为完全合并系统发育树提供了主要的支持。
   第五部分,根据目前盲蝽科亚科间系统发育关系尚无基于大量分子序列研究的状况,选取NCBI中已有的盲蝽科四个基因(18S rDNA全序列,28S rDNA中D3区,线粒体16S rDNA,COI基因片段)共约3600 kb序列为分子标记,代表全部八个亚科中的七个亚科(25种),运用最大简约法,最大似然法,最小进化法和贝叶斯方法分析其系统发育关系。完全合并四个分子标记所得的数据集在各种算法中都得到了唯一确定的分子树,而且在这些分子树中,尤其是贝叶斯树中,代表亚科间关系的基部分支都得到了较高的节点支持率,证实了盲蝽亚Mirinae和齿爪盲蝽亚科Deriocorinae的姐妹群关系,也证明盲蝽单眼和拟蚁特征多次发生的可能。与Schuh(1974,1976)基于形态数据得到的结果主要区别在:盲蝽的基部分支不再是树盲蝽亚科Isometopinae,而是叶盲蝽亚科Phylinae:合垫盲蝽亚科Orthotylinae与叶盲蝽亚科近缘而非姐妹群。
   第六部分总结了全文的主要结果和得到的结论,并对论文不足之处的改进和进一步的工作提出了设想。
[硕士论文] 董鹏志
动物学 南开大学 2008(学位年度)
摘要:为理解异翅亚目昆虫的线粒体基因组结构和序列进化提供重要线索和数据,也为用线粒体基因组序列大规模地研究异翅亚目高级阶元之间的系统发育关系奠定基础,在本项工作中,测定、注释和分析了异翅亚目中三个次目四个代表种类的线粒体基因组全序列,四个种分别是黾蝽次目Gerromorpha中的黾蝽Gerris sp.,臭蝽次目Cimicomorpha中的杂毛合挚盲蝽Orthotylus flavosparsus,以及蝽次目Pentatomomorpha中的小光匙同蝽Elasmucha minor和紫蓝丽盾蝽Chrysocoris stolii。本项工作填补了黾蝽次目线粒体基因组全序列测序及分析的空白。
   通过测定,得到黾蝽线粒体基因组全序列15380bp、杂毛合挚盲蝽91%的序列13989bp、小光匙同蝽90%的序列13245bp、紫蓝丽盾蝽89%的序列13766 bp。
   黾蝽线粒体基因组中37个基因排序与异翅亚目锥猎蝽Triatoma dimidiate相同。基因排列紧密,共重叠33个碱基。黾蝽线粒体基因组全序列A+T含量为75.7%,而控制区的A+T含量为66.2%,低于全基因组水平;蛋白编码基因碱基含量呈AT偏向;注释共得到13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因及非编码区,非编区中最长的是控制区,781bp,较大的两个非编码区是tRNA-Tyr/CO1间37bp,tRNA-Ser/ND1间15bp。非编码区共计844bp。
   杂毛合挚盲蝽注释得到33个基因,小光匙同蝽得到30个基因,紫蓝丽盾蝽得到29个基因。这些基因的排序也和锥猎蝽相应部分具有相同的排列顺序。
   在对这四种昆虫线粒体基因组两条编码链碱基组成的统计显示:J链第三位密码子A、C含量高于N链A、C含量;N链T、G含量高于J链T、G含量,提示:这可能是由于复制、转录过程的不对称性导致两条编码链积累了不同的突变。
   以黾蝽、杂毛合垫盲蝽、锥猎蝽、草盲蝽Lygus lineolaris、稻绿蝽Nezaraviridula线粒体基因组的全部13个蛋白编码基因及部分tRNA序列为对象,检测了核苷酸替代速率,表明不同的蛋白编码基因由于不同的选择压而造成了核苷酸替代的差异;由于在线粒体基因组翻译过程中的重要作用,使tRNA核苷酸替代速率处在较低的水平。
   黾蝽为捕食性水生类群,锥猎蝽属陆生捕食性类群,杂毛合垫盲蝽、草盲蝽、稻绿蝽、小光匙同蝽、紫蓝丽盾蝽均属陆生植食性类群,这六种昆虫在相对核苷酸替代速率上并没有明显的差别。
[硕士论文] 李佳
农业昆虫与害虫防治 华中师范大学 2008(学位年度)
摘要:细胞凋亡是当前生命科学研究中最热门的领域之一,哺乳动物细胞凋亡的机制已经有比较深入的研究,可是昆虫细胞凋亡仍有很多问题有待研究。本文对昆虫细胞凋亡有关方面进行了探讨和研究。 1 两种昆虫血淋巴抑制S1-1细胞凋亡本实验采用DAPI染色、流式细胞仪、荧光定量分光光度法、Western blotting等方法检测了凋亡细胞形态学变化、细胞凋亡率、Caspase-3活性及细胞色素c(Cyt c)的释放,研究了甜菜夜蛾和棉铃虫血淋巴分别对放线菌素D诱导和病毒诱导的S1-1细胞凋亡的抑制作用。 采用分别含有不同浓度的甜菜夜蛾和棉铃虫血淋巴(1%、3%、5%)的Grace's培养基(5%胎牛血清)处理S1-1细胞1小时,然后用终浓度为200ng/ml的放线菌素D处理细胞,置28℃恒温培养箱中培养24小时,DAPI染色结果表明两种昆虫血淋巴均能抑制凋亡小体的形成,随着昆虫血淋巴浓度的增加,抑制效果越明显。流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果表明昆虫血淋巴明显抑制了细胞的凋亡,昆虫血淋巴浓度与细胞凋亡率呈负相关。为了进一步证明昆虫血淋巴对细胞凋亡的抑制作用,我们检测了ActD诱导的S1-1细胞凋亡中Caspase-3活性的变化及细胞质中Cyt c的变化。将细胞置于含5%甜菜夜蛾血淋巴和5%棉铃虫血淋巴的培养基分别培养1小时,再用放线菌素D(200ng/ml)处理S1-1细胞24小时后,制备细胞裂解液成份,然后用人工合成的Caspase-3特异性荧光底物AC-DEVD-AFC进行酶切反应,荧光分光光度法检测结果表明两种昆虫血淋巴均能明显抑制Caspase-3的活性,并且甜菜夜蛾血淋巴的抑制作用比棉铃虫血淋巴的抑制作用明显。Western blotting检测细胞质中Cyt c的变化,结果表明在ActD诱导的S1-1细胞凋亡中存在着Cyt c的释放,两种昆虫血淋巴对Cyt c的释放有明显的抑制作用,并且甜菜夜蛾血淋巴比棉铃虫血淋巴的抑制作用更明显。同时,用病毒处理细胞后检测Caspase-3活性,结果显示两种昆虫血淋巴同样抑制了Caspase-3的活性。这些结果表明,两种昆虫血淋巴不仅能够抑制放线菌素D诱导的S1-1细胞凋亡,而且能够抑制病毒诱导的细胞凋亡。因此,昆虫血淋巴抑制细胞凋亡可能具有广泛性。 2 AfMNPV诱导的S1-1细胞凋亡中几种Caspases活性及其关系本实验以杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡,检测了Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性及其关系,结果表明Caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK不能抑制细胞凋亡以及Caspase-3的活性,而Caspase-9特异性抑制剂Z-LEHD-FMK能够抑制细胞凋亡以及Caspase-3的活性。但是用荧光定量法,没有检测出Caspase-8及Caspaae-9的活性。在凋亡的Hela细胞阳性对照组中,检测到了Caspase-3和Caspase-8的活性,可是并没有检测出Caspase-9的活性。在不同时间间隔下,用兔抗多克隆抗体进行western blotting检测,没有检测到凋亡细胞的Caspase-9样蛋白.上述现象尚需深入进行研究。
[硕士论文] 周玥
微生物学 南京师范大学 2007(学位年度)
摘要:棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)是一类双链环状DNA病毒,其分子生物学和基因功能研究己取得很大进展。开放阅读框44(open reading frame 44,orf44)是HaSNPV的一个功能未知的结构基因,本文首次对HaSNPV G4株基因组中的orf44基因进行研究报道。 orf44基因和Ha44蛋白序列通过生物信息学分析表明:orf44基因长1137bp,预计编码378个氨基酸,预测蛋白质分子大小为42KDa;orf44基因起始密码子上游.80和-88位分别存在晚期启动子信号TAAG和早期启动子信号TATA;基因没有明确的功能结构域;通过PSI-BLAST比对发现,Ha44有多种杆状病毒同源蛋白,这些蛋白存在于group Ⅱ NPV或颗粒体病毒属((7rranulovirus,GV)中,其相应的功能还未知。 本试验中,我们用表达载体pGEX-KG及表达宿主大肠杆菌BL21对orf44基因进行谷胱甘肽(GST)融合表达,表达产物约为68KDa,与预期的大小相符。表达蛋白经初步纯化(包涵体纯化和凝胶电泳分离相结合),免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经ELISA和western-blot检测,获得了特异性较强的抗体,为进一步D垆4基因的表达时相分析作准备。 我们利用荧光蛋白基因egfp作为报告基因,将orf44和orf44连接在真核表达载体pIZ/V5-His上,形成融合表达产物,转染美洲棉铃虫细胞HzMA1,观察GFP在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下绿色荧光的分布位置,将orf44基因表达产物Ha44定位于细胞核,这表明该蛋白可能是病毒的重要结构基因,参与病毒基因复制与增殖。 为研究orf44基因的功能,我们通过同源重组在原核水平将该基因敲除,构建orf44基因缺失型重组病毒。即设计一对70bp,含有orf44基因同源臂的引物,以PCR的方法合成可供同源交换的线性片段P<,hsp>70<'->egfp-SV<,40>-Cm<'r>,借助含有九噬菌体Red重组系统的质粒pKD46及棉铃虫杆状病毒细菌人工染色体HaBacmid,在大肠杆菌BW25113中进行同源重组。通过PCR及酶切鉴定,我们得到了HaSNPV orf44基因缺失型重组病毒,为进一步在昆虫细胞水平研究此基因的功能奠定了基础。
[硕士论文] 汤蕾
动物学 华东师范大学 2007(学位年度)
摘要:本文对贻贝棘尾虫皮层微管骨架的超微结构及微管蛋白的免疫电镜定位进行了研究。文章应用扫描电镜术显示的纤毛器水平上皮层细胞骨架的形态发生过程、应用透射电镜术从毛基体水平、毛基体下水平显示的贻贝棘尾虫无性生殖周期中皮层细胞骨架的超微结构,与应用免疫电镜技术揭示的贻贝棘尾虫皮层细胞骨架结果基本一致。所有这三部分结果为贻贝棘尾虫形态发生学及分子水平上微管蛋白成分研究提供了基础的资料。
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