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[硕士论文] 李玉娟
免疫学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:将黑腹果蝇肠道中的醋酸杆菌分离出,并研究醋酸杆菌对果蝇宿主的促生长发育的作用。
  方法:利用醋酸杆菌选择性培养基分离果蝇肠道醋酸杆菌;通过革兰氏染色和16S rRNA基因比对鉴定菌种;观察东方醋酸杆菌12小时内利用4种碳源情况,检测该菌株体外发酵特性;涂板计数不同生长周期果蝇肠道的菌落数,检测该菌的定植情况;将果蝇随机分为混合菌、无菌、单株菌果蝇三个组别,通过计数蛹和成虫出现的平均时间,检测该菌对果蝇发育作用;通过观察果蝇产卵后0天至蛹形成时的体表面积变化,检测果蝇的生长速率;解剖以上三种组别的果蝇成虫解剖肠道后,用PH3染色方法计数肠细胞分裂增殖数。提取以上三种组别的果蝇RNA,做RT- PCR,检测该菌对果蝇体内激素的影响。
  结果:⑴该菌株经鉴定为东方醋酸杆菌,属于醋酸杆菌属,革兰氏阴性杆菌。⑵东方醋酸杆菌12 h生长OD值高达1.25,pH降低至3.8。⑶东方醋酸杆菌在果蝇不同的生长阶段的肠道定植数量达104、105。世代传递结果发现东方醋酸杆菌可在子代果蝇肠道定植数量达103。⑷东方醋酸杆菌组在2%酵母丰富培养基条件下,蛹和成虫羽化时间分别为6.2 d和10.1 d和CR组比较无统计学意义(P>0.05);与GF(7.8 d和12.1 d)相比差别有统计学意义(P<0.05),在营养条件匮乏情况下,东方醋酸杆菌组果蝇蛹和成虫羽化时间分别为9 d和13.3 d,和CR果蝇相比无统计学意义(P>0.05);与GF组(7.8 d和22 d)相比差别有统计学意义(P<0.001),东方醋酸杆菌组显著地缩短果蝇发育历期,甚至可以代替CR组的作用。东方醋酸杆菌组较无菌组比明显增加果蝇的生长速率,并且与CR组结果类似。⑸PH3染色实验发现东方醋酸杆菌组较无菌组促进果蝇肠道细胞分裂增殖,尤其在最长的中肠间差异有统计学意义(P<0.001),并增加肠道细胞分裂增殖数量,数量甚至高于CR组,与CR组比较有统计学意义(P<0.05)。⑹东方醋酸杆菌组较GF组使果蝇促前胸腺激素分泌的时间较早,分泌的量较高,两组分泌量的高峰值比较有统计学意义(P<0.01),与CR组比较其表达时间类似。⑺东方醋酸杆菌组较GF组的胰岛素水平表达时间早、表达量高差异有统计学意义(P<0.001),并且与CR组结果类似(P>0.05)。
  结论:从果蝇肠道分离出一株东方醋酸杆菌,东方醋酸杆菌是果蝇一种益生菌、共生菌。东方醋酸杆菌在组织学水平增加果蝇的生长速率和缩短发育历期并在细胞学水平促进肠细胞分裂增殖,同时在体内激素水平也可激活胰岛素信号通路,维持机体稳定的血糖水平及促进果蝇关键生理期(幼虫期至蛹期)蜕变,从而促进果蝇生长发育。
[硕士论文] 高亚曼
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:限制或适当减少食物摄入对健康和寿命延长有好处的认识自古就有。在这一百年的研究历史中,到底是减少食物总量,还是减少食物中的蛋白质含量,还是减少食物中的总热量更有利于人或动物的健康和寿命延长在学术届一直存在争论。上世纪中期McCay等人用只限制动物摄入的食物总量而不减少其摄入的蛋白质质量的方法得出了同样能够延长动物寿命的结果,进而推论出是由于动物摄入的热量减少而不是蛋白质量减少而延长了动物的寿命。此后,热量限制(CR)一词几乎完全代表了所有的限制饮食(DR)。然而,在上世纪的中后期就有人用实验证明不用限制动物的取食量,而只减少动物食物中某种必需氨基酸(如色氨酸或甲硫氨酸)的摄入就可以延长动物的寿命同时,人们还发现,不限制动物的饮食,只把食物中的蛋白质含量从20%左右降低到4%,同样可以明显地延长动物的寿命。我们发现在这一百年的研究中,有几个课题组的人曾报道降低食物中的蛋白质与碳水化合物的比例,即使不限制动物摄取食物,也可以延长动物的寿命。
  本研究选用直接以植物成分为食的黄粉虫为实验对象,设计了不同碳水化合物与蛋白质比例的食物饲养黄粉虫,证明了不同碳水化合物与蛋白质比例的食物确实影响黄粉虫的生长和一些生理生化指标的改变。以不含蛋白质的地瓜淀粉、含蛋白质比例较低的地瓜粉及蛋白质含量适中的普通食物玉米粉分别作为基础食物成分,对食物中分别添加2%及20%的动物蛋白或植物蛋白,对黄粉虫的生长情况、体重增加情况、消化道淀粉酶活性和纤维素酶活性等进行了比较研究,得出结论:高蛋白含量的食物促进黄粉虫快速生长、快速衰老,低蛋白则使黄粉虫生长较慢、衰老较慢;动物蛋白较植物蛋白能更快促进生长和衰老;用组织学技术对黄粉虫消化道组织结构进行了研究。我们的实验也填补了本领域内在无脊椎动物类似实验研究中某些生物学表观指标和生理生化指标的空白,也避免了之前本领域所报道的类似实验采用酵母、线虫或果蝇这些非理想实验动物的困扰。另外,在实验中我们还对黄粉虫消化道的显微结构进行了观察研究。
[硕士论文] 谭慧军
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:白蚁是一种社会性昆虫。因为它们对于木质纤维素强大的降解能力,所以在生态圈的碳循环中发挥重要的作用。根据肠道共生物中是否包含原生动物,可将白蚁分成低等白蚁和高等白蚁。高等白蚁中与真菌共生的白蚁为培菌白蚁。培菌白蚁的食物中包含真菌孢子,而孢子的细胞壁主要成分是几丁质,故培菌白蚁肠道中可能存在几丁质酶来起着降解真菌孢子细胞壁的作用。
  黄翅大白蚁是培菌白蚁的一种,目前对培菌白蚁来源昆虫几丁质酶的研究是非常有限的。分析黄翅大白蚁肠道转录组测序结果后,我们从中筛选出功能注释为几丁质酶的基因,对它们进行生物信息学分析。本研究主要对其中可能参与代谢的几丁质酶基因进行了基因克隆和功能性表达,具体内容如下:
  1.本文先对黄翅大白蚁转录组测序结果进行分析,通过关键词“chitinase”搜索,发现有40个功能注释为几丁质酶的unigenes。将这40个几丁质酶基因进行一系列生物信息学分析,并对其中三个基因进行进一步功能的探索。
  2.Unigene基因comp133624_c0的在前肠中相对表达量最高,为277.21。该片段进行生物信息学分析之后,设计引物,通过PCR得到cDNA全长,在大肠杆菌JM109中表达;unigene基因comp174658_c0的中肠相对表达量最高,523.34。对该片段进行生物信息学分析之后,设计引物,通过PCR得到cDNA全长,然后将该基因在大肠杆菌JM109中和BL21(DE3)以及毕赤酵母中异源表达;unigene基因comp182537_c0在中肠和后肠的相对表达量都相对较高,分别为750.43和1638.2。该片段编码一个含有CBM-14(结合域)的几丁质酶,并且设计引物,通过PCR得到cDNA全长并克隆到在大肠杆菌JM109中和BL21(DE3)表达。
  3.为了进步一确认上述三个基因的优势表达部位,我们还对上述基因进行了qPCR和RT-PCR验证,证实是否与转录组测序结果的优势表达位点相吻合。
  总之,本研究成功克隆得到三个几丁质酶基因,而且在大肠杆菌异源表达。它们的重组蛋白均能检测到几丁质酶活性,但是几丁质酶活性不高。这种现象可能是因为昆虫来源蛋白在大肠杆菌中表达时,重组蛋白没得到很好的修饰和折叠,导致大多数重组蛋白都形成了包涵体。另外,unigene基因comp174658_c0在毕赤酵母中异源表达且表达产物具有降解几丁质的能力。最后,qPCR和RT-PCR的结果显示:除了基因comp174658_c0外,另外两个基因在各个部位的表达水平趋势与转录组测序结果相符合。
  关键词:黄翅大白蚁;几丁质酶基因;克隆;功能性表达
[硕士论文] 于洋
生物工程 济南大学 2016(学位年度)
摘要:酚氧化酶,作为一种广泛存在于各种生物体的重要蛋白,在昆虫体液免疫和细胞免疫中均起到了极其重要的免疫作用,在生物体其一般以酚氧化酶酶原的形式存在。虽然对昆虫酚氧化酶及酶原的研究已经一个多世纪了,但在家蝇方面却没有其功能的相关报道,为探究家蝇体内酚氧化酶的功能,并制备家蝇酚氧化酶原免疫制剂,本文利用家蝇这一常见的生物,将家蝇酚氧化酶原基因与已发表并探明功能的部分昆虫酚氧化酶原基因进行比对与分析,预测家蝇酚氧化酶具有酚氧化酶的一般功能,本文将家蝇酚氧化酶原基因1的ORF克隆出来、装入pET-30a中进行了原核表达,建立了原核表达的家蝇酚氧化酶原包涵体变性复性为可溶性蛋白的有效方法,并对获得的可溶性蛋白的酶活性进行了检测。另外,利用原核表达的家蝇酚氧化酶原制备了多克隆抗体,并通过抗体封闭、RNAi实验,研究了家蝇三龄幼虫中的酚氧化酶原的免疫功能,结果显示,家蝇体内的酚氧化酶原蛋白及基因分别在抗体封闭和dsRNA干扰后,家蝇酚氧化酶的活性显著降低,家蝇死亡率显著升高,说明家蝇酚氧化酶原在家蝇的免疫反应中有重要作用。实验中,初步制备了家蝇酚氧化酶原的免疫制剂,并初步探究了其功能,为之后进行免疫制剂的更深入研究提供了理论基础。
[硕士论文] 喻广强
微生物学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:嗅觉系统能够感知外界环境中瞬息万变的气味信号,对于生命体的觅食、求偶、避险、繁殖和警戒等各种生命活动都有重要意义。在气味的识别和结合过程中,气味结合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)首先探测、结合、区分并转运气味小分子,然后呈递至气味受体(Olfactory receptors,ORs)等下游蛋白并最终产生嗅觉。因此研究气味结合蛋白和常见气味物质间的相互作用机理对于理解气味的本质具有重要意义。
  本研究首先对花绒寄甲气味结合蛋白DhelOBP21进行了同源模建,获得了其三维结构。发现它符合Minus-C类OBPs的特征:具有4个保守的半胱氨酸并形成2个二硫键用于稳定蛋白的三维结构;结合腔相对疏水,利于结合疏水性气味小分子。其后的分子对接则初步获得了蛋白DhelOBP21与18个小分子的结合构象,用于后续的动力学模拟。
  随后的常规动力学和恒定pH动力学模拟则首次观测到了气味结合蛋白的N端在无规卷曲和Alpha螺旋之间的转变,我们据此提出了新的理论假设:对于Minus-C类的OBP,它们的构象同时受环境pH和小分子的调节。当pH由酸性增高到中性时,蛋白的远离结合腔并且为无规卷曲的N端逐渐向结合腔靠近,并转变成规则的Alpha螺旋,利于小分子的结合和转运;而当pH由中性降低为酸性时,蛋白的N端由Alpha螺旋逐渐解旋为无规卷曲并逐渐远离结合腔,利于小分子的释放。
  此外,蛋白结合腔内部的部分氨基酸残基对18个小分子(17个常见挥发物和荧光探针1NPN)的结合活性都很高,它们为“基础性氨基酸”,可能决定蛋白结合小分子的杂泛性;而另外一些氨基酸残基对于18个小分子的结合活性各不相同,它们为“选择性氨基酸”,可能决定了蛋白结合小分子的选择性。
  本研究对Minus-C类的气味结合蛋白和小分子的相互作用机制提出了新的理论假设,并从蛋白的角度解释了气味结合蛋白结合小分子的杂泛性和选择性的原因,为昆虫的气味识别和宿主定位等难题提供了新的洞察和理解。
[硕士论文] 高倩
植物保护 山西大学 2016(学位年度)
摘要:草履蚧Drosicha corpulenta(Kuwana)(半翅目:蚧总科:绵蚧科),是一种聚集在枝芽处刺吸汁液取食的植食性昆虫,当虫口密度过大时往往会造成枝芽枯死。由于草履蚧体表分泌蜡质形成保护层,人工清除和化学防治难以对其进行有效控制,而大量化学杀虫剂的使用不仅会灭杀天敌,还会对果实和环境造成污染。因此本文从昆虫化学通讯对害虫防治的角度出发,对草履蚧触角中参与嗅觉形成过程的相关蛋白进行研究,发现嗅觉基因在蚧虫中的作用,为今后的生物防治提供新的视角及理论依据。本文的研究内容包括:(1)对草履蚧雌成虫触角转录组进行测序,并进行组装、注释和同源性分析;从Unigenes中预测草履蚧嗅觉基因并归纳基因信息;对草履蚧的气味结合蛋白(OBPs)及化学感受蛋白(CSPs)序列进行比对,并构建系统发育树;(2)在转录组测序和分析的基础上,得到气味结合蛋白 OBP(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2的编码序列;利用生物信息学方法分析其序列信息,并构建三维结构。
  本研究主要内容包括:⑴对草履蚧雌成虫触角转录组进行高通量测序。在转录组中,共获得33,741,845条序列标签 reads,其中16,334条非重复序列 unigenes被组装。这些unigenes通过 GO分析和 eggNOG分析进行基因功能的分类统计。草履蚧触角中unigenes与其他物种相似性比较发现,与豌豆蚜相似的数量最多,达到18.31%。⑵从unigenes中预测到16条编码气味结合蛋白OBPs的基因、2条编码化学感受蛋白CSPs的基因、1条编码感觉神经元膜蛋白SNMP的基因、21条气味受体基因ORs和7条编码味觉受体GRs的基因,并总结归纳了47条嗅觉基因信息。此外,对草履蚧触角中预测的气味结合蛋白OBPs和化学感受蛋白CSPs序列与蚜虫、盲蝽和扶桑绵粉蚧相关序列构建系统发育树。结果显示,8条气味结合蛋白与蚜虫聚在一起,3条草履蚧气味结合蛋白OBPs聚在一起。2条化学感受蛋白与扶桑绵粉蚧的2条化学感受蛋白分别聚类在一起。根据聚在一起且已知其功能的蚜虫和盲蝽的物种,可以对草履蚧的OBPs功能进行预测。草履蚧嗅觉基因的发现对认识其在蚧虫行为反应中的作用提供新的视角,同时提高蚧虫的生物防治策略。⑶在草履蚧雌成虫触角转录组测序和分析的基础上,通过RT-PCR技术得到的气味结合蛋白OBPs(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2的编码序列,利用生物信息学的方法对草履蚧这些蛋白的理化性质、信号肽、亲疏水性等进行预测分析。分析表明,这些蛋白均有完整的开放阅读框ORF,N端带有19~29个氨基酸的信号肽,等电点在4.12~9.30之间,相对分子质量为15.6~17.0KDa,这些蛋白均为亲水性蛋白。OBPs(DcorOBP4,5,6,7,8,14)含有六个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白家族的特征。化学感受蛋白DcorCSP2包含有四个保守的半胱氨酸位点,符合化学感受蛋白家族的特征。草履蚧典型的气味结合蛋白(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2通过同源建模后发现,三维结构都是由六个α螺旋组成。DcorOBP4,6,7,8这四个气味结合蛋白的六个保守半胱氨酸形成了三对二硫键,与典型的气味结合蛋白特征相符。化学感受蛋白DcorCSP2也构建出两对二硫键,这些二硫键均起到稳定蛋白质结构的作用。以上6条OBPs均由α1,α2,α4,α5,α6这5个α螺旋形成疏水口袋,α3在口袋的一端不参与疏水口袋的形成。此外,这些蛋白的 C-末端均折合进入蛋白质的口袋内部,使得口袋结构变得更加稳固。
[硕士论文] 马全兵
生物学 江苏大学 2016(学位年度)
摘要:家蚕(Bombyx mori)是一种重要的鳞翅目模式昆虫,是研究变态发育的理想材料。脂肪体是体内的一种重要组织器官,它既是代谢中心,又是激素作用的靶组织,在家蚕生长发育和变态过程中发挥着极其重要的作用。我们进行了家蚕脂肪体在变态发育过程中的蛋白质组学研究,以期找到与变态发育密切相关的蛋白。另外昆虫翅的发育是一个典型的变态过程,我们对在翅原基中表达的Hemolin蛋白和Yippee蛋白进行了相互作用研究,为今后研究两者在发育过程的作用提供依据。本研究得到如下一些结果:
  1.从家蚕五龄幼虫期和蛹期不同发育阶段提取脂肪体总蛋白,利用双向电泳技术进行分离和鉴定,找出不同时期的27个差异蛋白点;对这些蛋白进行质谱分析及数据库检索,检索到相匹配的候选蛋白质,这些蛋白与物质和能量代谢、细胞骨架、蛋白质代谢与合成、生长发育、信号转导等生理活动紧密相关,在家蚕生长发育与变态发育的过程中可能发挥着重要的功能和作用。
  2.从27个差异蛋白点中选取了9个蛋白相对应的基因进行荧光定量分析,其中有70K热休克蛋白、脯氨酰羟化酶、延伸因子、谷胱甘肽硫解转移酶、琥珀酰辅酶 A、胰凝乳蛋白酶抑制剂、胞质甲酰四氢叶酸脱氢酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶等等,并对它们在变态发育中的可能作用进行了分析。
  3.通过制备抗体来研究Hemolin蛋白与Yippee蛋白之间的相互作用。我们用新西兰大白兔制备了家蚕Yippee蛋白的多克隆抗血清,Western Blotting结果显示出我们制备的家蚕Yippee蛋白兔多克隆抗血清具有较好的特异性。
  4.利用本实验室之前制备的家蚕Hemolin鼠多克隆抗血清和Yippee蛋白兔多克隆抗血清对Hemolin和Yippee蛋白进行了免疫共沉淀和杂交实验,结果证明了Hemolin和Yippee蛋白在家蚕翅原基中有相互作用。
  通过上述研究我们找到了一些与变态发育有关的重要蛋白,对变态发育的研究有着一定的参考价值。我们提出了一个关于Hemolin与Yippee蛋白的相互作用的一个假设,对揭示翅原基的发育提供了一个新的线索。
[硕士论文] 朱明
生物化学与分子生物学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:细胞色素 P450(P450)是多功能氧化酶的核心酶系,参与昆虫杀虫剂的代谢以及蜕皮激素、保幼激素等激素的合成,与昆虫的生长、发育和防御密切相关。另外,这些酶与过氧化物酶有类似的活性,因此可能在保护生物体免受活性氧损伤的过程中发挥作用。本研究以我国特色种质资源中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为实验材料,根据意大利蜜蜂(Apis mellifera)的同源序列,利用RT-PCR和RACE-PCR的方法从中华蜜蜂中首次克隆得到了P450家族CYP3分支和CYP2分支的CYP336A1和CYP18A1两个基因,并且分别命名为AccCYP336A1和AccCYP18A1。然后进一步对它们进行了序列比对、表达特性分析以及功能预测。具体的结果如下:
  (1)AccCYP336A1开放阅读框全长1491bp,编码一个含有496个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为57kDa,等电点为8.8。AccCYP18A1开放阅读框全长1620bp,编码一个含有539个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为60.7kDa,等电点为8.42。氨基酸序列比对发现,AccCYP336A1、AccCYP18A1与其他物种中P450家族基因的同源性较高,且具有该家族保守的功能区域。进化树分析发现,AccCYP336A1和AccCYP18A1分别属于CYP3分支和CYP2分支。
  (2)采用qRT-PCR的方法分别对两个基因在中华蜜蜂不同发育时期和不同组织部位中的表达特性进行了分析。qRT-PCR结果表明,AccCYP336A1和AccCYP18A1在整个中华蜜蜂的变态发育过程中均有表达,AccCYP336A1在卵期的表达量最高,而AccCYP18A1在变态发育的两个重要发育节点:5日龄幼虫(L5)及1日龄成蜂(A1)时期表达量最高。以上结果表明,AccCYP336A1及 AccCYP18A1可能与中华蜜蜂的变态发育有关。另外,中华蜜蜂不同组织部位中的表达特性显示,AccCYP336A1在表皮中表达量最高,而AccCYP18A1在中肠中表达量最高。这些结果初步表明了两个基因的组织特异性。
  (3)采用qRT-PCR的方法分别对两个基因在不同非生物应激中的表达模式进行了研究。结果表明,AccCYP336A1、AccCYP18A1两个基因的表达受高温、低温、紫外线和杀虫剂等非生物应激的诱导。这些结果表明,这两个基因在中华蜜蜂抗逆、抗氧化过程中起到重要作用。
  (4)采用Western-blot的方法分别对两个基因所编码蛋白在不同非生物应激中的表达特性进行了研究。结果显示,AccCYP336A1、AccCYP18A1两个蛋白的表达受高温、低温、紫外线和杀虫剂等非生物氧化胁迫的诱导,此结果与两个基因转录水平表达特性相一致,进一步暗示了AccCYP336A1和AccCYP18A1在中华蜜蜂抗逆、抗氧化过程中起到重要作用。
  (5)在大肠杆菌菌株中利用纸片扩散实验检测体外AccCYP336A1蛋白的功能。研究发现表达AccCYP336A1蛋白的大肠杆菌对百草枯的抗性显著增强。
[硕士论文] 杨婷
生物化学与分子生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:昆虫要经历蜕皮(molting)和变态(metamorphosis)两个阶段才可以完成从幼虫向成虫的转变。在幼虫变态时期,昆虫的内部结构发生巨大变化,变化最为明显的就是中肠,表现为幼虫中肠的消失与成虫中肠的形成。幼虫中肠的消亡是由程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)介导的,PCD主要包括凋亡与自噬。蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)对变态和PCD都有一定的促进作用。自噬是一个将自身废旧的细胞器如内质网、高尔基体以及一些细胞蛋白吞噬,并送往溶酶体,将其消化掉的过程,为自身代谢的需要以及某些细胞器的更新提供能量。细胞凋亡是指细胞在一定的情境下,受内部遗传机制的调控来自动结束生命的过程。细胞凋亡是机体为适应环境而做出的主动的行为,其过程涉及到一系列相关基因的激活、表达以及调控等的作用;它并不是病理条件下,对机体产生损伤的一种现象,是为更好地适应生存条件而自发进行的一种死亡过程。在棉铃虫中肠的组织重建过程中,自噬和凋亡均会发生。自噬的发生以及自噬体形成都依赖于一系列ATG蛋白及两个类泛素样蛋白偶联结合系统的相互协作才能顺利进行。ATG5与ATG12作为自噬膜延伸过程中的“核心”蛋白,为自噬体形成所必须。在昆虫的生长发育过程中,PCD对消化多余的细胞、增加受限细胞的数量及维持体内的动态平衡都是必不可少的。有研究表明在果蝇的生长发育过程中,已经有两种PCD被发现,一个是自噬,;另外一个是凋亡。有报道称在果蝇中肠PCD过程中是自噬在起决定作用,而在家蚕中的报道发现自噬早于凋亡的发生。本文主要研究自噬相关基因ATG12在棉铃虫中肠PCD过程中的功能,并在棉铃虫表皮细胞系上做进一步的验证,为害虫的防治提供靶标基因。
  我们以棉铃幼虫与表皮细胞系为实验对象,研究自噬相关蛋白ATG12在棉铃虫中肠变态发育过程中的作用及激素调控功能。得到以下实验结果:ATG12在棉铃虫表皮、中肠和脂肪体中均有表达,在6-72 h表达量上调持续至6-120 h,到蛹期表达量明显下降;20E上调ATG12的表达,并且促进与ATG5的结合;变态时期,ATG12在中肠中发挥着重要的作用,虫体上干扰掉ATG12,导致棉铃虫的化蛹时间延迟及中肠PCD的延缓;棉铃虫表皮细胞系上干扰掉ATG12,减弱了经20E诱导后的LC3-Ⅱ的形成及caspase3、caspase5的片段化。
  基于上述研究,我们得出ATG12在自噬与凋亡中的作用及与20E之间的关系。20E能够上调ATG12的表达及ATG12与ATG5的结合,ATG12对棉铃虫中肠PCD是必须的,在棉铃虫中肠PCD过程中自噬与凋亡均有发生。
  发现20E可以上调ATG12与ATG5的结合,ATG12在中肠的组织重建过程中发挥着至关重要的作用;在中肠PCD过程中自噬受阻,凋亡也会受到影响。这些结果对研究棉铃虫中肠的组织重建过程有一定的参考及借鉴作用。
[硕士论文] 陈晓
遗传学 安徽师范大学 2016(学位年度)
摘要:青凤蝶属(Graphium)隶属于鳞翅目(Lepidoptera),凤蝶科(Papilionoidea),凤蝶亚科(Papilioninae),青凤蝶族(Leptocircini)。可分为五个亚属:青凤蝶亚属(Graphium)、纹凤蝶亚属(Paranticopsis)、绿凤蝶亚属(Pathysa)、剑凤蝶亚属(Pazala)及奥利斯比亚属(Arisbe)。世界范围内,该属蝶类共约100种,其中,青凤蝶亚属蝴蝶约30多种,其中我国有7种,绿凤蝶亚属共15种,纹凤蝶亚属共11种,剑凤蝶亚属共7种,奥利斯比亚属约30种。迄今为止,有关青凤蝶属的系统分类以及起源和进化方面的研究还比较匮乏,还有待于进一步的深入研究,特别是分子生物学数据资料和其他相关证据的介入。
  本研究以及推测青凤蝶属起源和分化的路径图和时间表,利用PCR和long-PCR相结合的方法测定了国内7种青凤蝶(青凤蝶、统帅青凤蝶、碎斑青凤蝶、黎氏青凤蝶、木兰青凤蝶、银钩青凤蝶和宽带青凤蝶)的线粒体基因组全序列或近全序列;同时,结合GenBank中已有的凤蝶科线粒体基因组全序列数据,基于13个蛋白编码基因(PCGs)序列数据重建凤蝶科主要类群的系统发生树,并重点探讨7种青凤蝶的系统发生关系;基于已有的凤蝶科及其寄主植物的相关化石记录资料,运用宽松分子钟手段,推测青凤蝶属相关类群的分歧时间和进化路线图,以期为青凤蝶属及各亚属的分子进化和谱系发生方面的研究提供一些基础资料。实验结果显示:青凤蝶、统帅青凤蝶、碎斑青凤蝶、黎氏青凤蝶、木兰青凤蝶、银钩青凤蝶线粒体基因组全长分别为15299 bp,15377 bp,15235 bp,15213 bp,15169 bp,15212 bp,已测宽带青凤蝶近线粒体基因组序列长度为14540 bp,七种青凤蝶的线粒体基因组中均包含13个PCGs、2个rRNA基因、22个tRNA基因以及非编码的AT富集区。其中宽带青凤蝶的12S rRNA和tRNAMet基因序列不完整,而AT富集区未测出。这七种青凤蝶的PCGs的起始密码子除COI为CGA外,其它均为ATN;终止密码子除COI和COII基因是单个碱基T外,其余的均为TAA或TAG,编码的氨基酸数目分别为3727,3724,3728,3728,3726,3727,3728个。七种青凤蝶线粒体基因组中相邻基因或多或少存在重叠区或间隔区,重叠区长度范围为1~12 bp,间隔区长度范围为1~40 bp。除宽带青凤蝶外其余六种青凤蝶的控制区中 AT含量都是整个线粒体基因组中最高的,均达到94%以上。基于线粒体基因组全序列数据的凤蝶科主要类群间的最大似然树和贝叶斯树均显示,凤蝶科内各族之间的系统发生关系为(凤蝶族+裳凤蝶族+喙凤蝶族+青凤蝶族+(锯凤蝶族+绢蝶族);青凤蝶族内部,燕风蝶先分离出来,其次是铁木剑凤蝶;七种青凤蝶形成二个互为姊妹群的进化支,其系统发生关系为(((青凤蝶+宽带青凤蝶)+统帅青凤蝶)+(碎斑青凤蝶+木兰青凤蝶+银钩青凤蝶+黎氏青凤蝶)。基于已知的COI和ND5基因序列重建的青凤蝶属系统发生树显示,本研究所涉及七种青凤蝶的系统发生关系与上述结果一致;并推测绿凤蝶亚属、纹凤蝶亚属及青凤蝶亚属都是多系起源,而剑凤蝶亚属和奥利斯比亚属为单系起源。谱系发育年代学分析结果显示:凤蝶科的分歧时间是在86.8百万年前(Ma)的晚白垩纪时期(95%置信区间:70.6~106.1 Ma;下同);凤蝶亚科和绢蝶亚科的分化时间也都是在白垩纪晚期,分别为77.6 Ma(63.4~94.3 Ma)和72.0 Ma(48.8~95.4 Ma);青凤蝶族的分歧时间在第三纪古新世(61.9 Ma;47.1~79.9Ma);青凤蝶属的分化时间在第三纪始新世(43.66 Ma;29.61~51.0 Ma)。
[硕士论文] 龚永昌
遗传学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:研究发现真核生物基因组中有大量的DNA生成了非典型性的转录本,它们的的功能引起了广泛的争议。这些转录本中包含很多小的开放读码框(small open reading frames,sORFs),这些sORFs起初被认为是不能翻译成蛋白的RNAs,然而,越来越多的证据表明其中的一些sORFs可以翻译成为小肽,而且它们的作用被严重低估了。sORFs翻译成的小肽可能代表一类被忽视的生物活性分子,近年来的研究表明这些小肽在发育、分化等生物过程中具有重要的功能。其中对tal-like基因相关小肽的研究较为深入,该基因最早在果蝇中被发现。在果蝇中,Tal控制基因的表达和组织的形成,作为一个结构和形态发生的链接,对果蝇的生长发育起到非常重要的作用。家蚕作为一种典型的模式经济昆虫,在生长发育的诸多方面与果蝇有很多相似的地方。本研究在成功克隆了家蚕tal-like基因(Bombyx mori tal-like gene,Bmtal)的基础上,检测了Bmtal基因在家蚕五龄三天不同组织的表达水平,研究了过表达Bmtal和抑制Bmtal对家蚕ovo基因(Bmovo)及部分信号通路基因表达的影响,利用RNA-Seq技术开展了过表达Bmtal的BmN细胞与对照组BmN细胞的比较转录组学研究,为理解Bmtal基因对家蚕生长发育的影响提供了新的线索。
  本研究主要内容包括:⑴为了研究家蚕tal-like基因的功能,根据序列设计引物进行RT-PCR,成功克隆到1661bp的Bmtal全长cDNA序列。结构分析显示,Bmtal基因中存在多个sORFs,其中前四个sORFs(A1-A4)分别编码11-12个氨基酸、且序列相似的小肽,紧跟着一个编码32个氨基酸的sORFs(B)。其结构模式与果蝇的非常相似,提示Bmtal基因的功能有可能与果蝇的相似。通过荧光定量PCR(Real-time PCR)分析了Bmtal基因在家蚕五龄三天各种组织的表达水平,结果显示,Bmtal基因在五龄三天的气管丛、马氏管、丝腺中表达量较高,在性腺中也有表达。⑵在果蝇中,越来越多的证据表明tal-like基因对个体的生长发育起到至关重要的作用,为了探讨Bmtal的表达规律以及细胞定位特征,将Bmtal的功能区域编码序列与DsRed基因融合,克隆进pET-32a(+),在E.coil中成功表达了重组蛋白。并利用免疫小鼠制备了多克隆抗体。细胞定位结果显示,BmTal定位在BmN细胞的细胞核中。⑶为了进一步探讨Bmtal基因的功能,本研究通过过表达和RNAi的方法调查了上调和下调Bmtal基因对Bmovo基因及其他信号通路基因表达水平的影响。结果显示,过表达的Bmtal基因可以调控ovo基因的表达水平,对其他信号通路的部分基因的表达水平也起到明显的影响。⑷为了研究Tal-小肽在家蚕BmN细胞中的相互作用蛋白,采用免疫共沉淀技术从过表达BmTal的家蚕BmN细胞中筛选互作蛋白,然后对与BmTal互作的候选蛋白进行质谱鉴定,共鉴定到6种候选蛋白(14-3-3蛋白zeta、纤毛和鞭毛关联蛋白、鞭毛轴丝关联蛋白mst101、多聚泛素、U3小核仁RNA互作蛋白、细胞生长调节核仁蛋白)。信息分析结果显示,这些蛋白涉及到信号传导、细胞增殖分化、蛋白降解、细胞表面突起形成、核苷酸代谢等各个方面。表明BmTal可能通过多种方式调节生物学过程。⑸将Bmtal基因克隆进昆虫表达载体pIZT-V5/His构建重组质粒pIZT/V5-His-tal,将pIZT/V5-His-tal和pIZT/V5His质粒转染家蚕BmN细胞,通过Zeocin连续筛选两个月后,获得转化2组转化细胞,利用高通量转录组测序技术(RNA-Seq)进行了比较转录组学研究。结果显示,差异表达基因主要集中在与细胞的生长分化及增值过程中。表明Bmtal基因在细胞的生长分化及增值过程中起重要作用。
[硕士论文] 孙文英
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是专性吸血的体外寄生虫,在自然界中存在两性生殖种群与孤雌生殖种群,可携带多种病原体而导致疾病,给人类健康和畜牧业生产带来极大危害。防御素(defensin)是一种抗微生物肽,在动植物中广泛存在,尤其在节肢动物中,由于缺乏适应性免疫反应,防御素在其先天免疫防御过程中发挥重要作用,可以有效对抗入侵的病原体。蜱作为专性吸血的特殊类群,同样具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原体的侵袭。
  本研究以长角血蜱孤雌生殖种群为研究对象,利用Clontech建库试剂盒和3'RACE的方法构建cDNA文库,分子克隆得到三条防御素基因,分别命名为Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。开放阅读框大小分别为225bp、210bp和237bp,编码氨基酸个数为74、69和78,成熟肽长度分别为38、37和46,等电点分别为9.69、8.33和9.50。通过对Hp-defensin-1进行原核表达及功能分析,结果表明,长角血蜱Hp-defensin-1与边缘革蜱(ACJ04433.1)同源性最高,为75.68%。系统发育树表明,Hp-defensin-1基因序列与革蜱属(森林革蜱KJ885301.1)亲缘关系最近。荧光定量结果表明,Hp-defensin-1表达量在不同时期和不同组织存在显著性差异(P<0.05),大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌胁迫效果依次减弱。将Hp-defensin-1连入载体pET-32(a+),并转入BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE电泳显示目的蛋白大小约23kDa,与预测大小一致。该多肽对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌性,对部分革兰氏阴性菌和真菌也具有一定的抗菌活性。表达产物的抗氧化实验表明,该多肽对ABTS·+和DPPH·自由基具有很强的清除能力,具有很强的抗氧化活性,但不存在溶血活性,因此对健康的人血细胞无伤害,为新型抗菌药物的研发提供了基础。
[硕士论文] 高小贺
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:长角血蜱Haemaphysalis longicornis是一种专性吸血的体外寄生虫,世界范围内广泛分布,宿主种类多样、可携带多种病原体而导致疾病,对其防治研究具有重要的经济学和流行病学意义。伊维菌素(ivermectin)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的半合成大环内酯类多组分抗生素,是一种新型的广谱、高效和低毒抗生素类抗寄生虫药,对寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好的驱杀作用。
  本研究对家兔注射不同浓度的伊维菌素,分别于兔耳饲喂长角血蜱成蜱、若蜱和幼蜱,记录蜱的叮咬率、吸血期、饱血体重、产卵前期、产卵量和死亡率等生物学参数,分析伊维菌素对长角血蜱生殖和发育的影响。结果表明,伊维菌素对蜱的叮咬率、吸血期和产卵前期无显著影响(p>0,05),对长角血蜱的饱血体重、产卵量、卵的孵化率、若蜱和幼蜱的死亡率有显著影响(p<0.05)。用超景深显微镜观察对照组和处理组雌蜱卵巢在饱血当天至产卵当天的形态学变化,发现处理组雌蜱卵泡发育不良,产生皱缩。测定伊维菌素长效性实验中,对家兔注射伊维菌素后7天、14天和21天,分别于兔耳饲喂长角血蜱成蜱,记录饱血体重、产卵量和孵化率生物学参数。结果表明,处理组和对照组无显著差异,说明伊维菌素对长角血蜱没有长效的防治效果。综合实验数据得出,伊维菌素对长角血蜱叮咬率无显著影响,对若蜱和幼蜱的死亡率有显著影响,对成蜱的死亡率无显著影响,但通过显著降低吸血量和产卵量抑制长角血蜱的发育和生殖,降低长角血蜱的数量。
[硕士论文] 谭量量
食品科学 浙江大学 2015(学位年度)
摘要:类二十烷酸是一种主要由二十碳四烯酸(arachidonic acid,AA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)通过环氧合酶(COX1/2)、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450(CYP)三种酶路径代谢而成的脂类衍生物,主要衍生物包括前列腺素(PGs)、白细胞三烯(LTs)、凝血嗯烷(TXs)、过氧化羟基四烯二十烷酸(HPETEs)、羟基四烯二十烷酸(HETEs)、羟基五烯二十烷酸(HEPEs)和表氧化三烯二十烷酸(EETs)等脂氧素类。以往研究报道表明,果蝇既不需要也不合成二十碳多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs),但也有研究证明C20 PUFAs的衍生物类二十烷酸对果蝇具有重要生理作用。为探究这一矛盾,本文以Canton-S野生型果蝇为研究对象,开展了果蝇的脂肪酸组成及果蝇是否具有产生相关类二十烷酸能力的系统性研究。
  本研究分为三个部分:
  (一)用添加了1 g/kg AA或EPA的饲料以及基础饲料作为对照分别培养果蝇,并检测各组果蝇整体、头部和胸腹部的脂肪酸组成。结果显示,对照组果蝇脂肪酸组成为12∶0,14∶0,14∶1n-5,16∶0,16∶1n-7,18∶0,18∶1n-9,18∶2n-6,18∶3n-3;相对于对照组,AA和EPA组果蝇的脂肪酸组成分别多出了AA或EPA;其中AA组果蝇整体、头部和胸腹部AA的相对含量分别为2.35±0.45%、2.92±0.39%和1.39±0.23%; EPA组果蝇整体、头部和胸腹部的AA的相对含量分别为1.98±0.57%、2.92±0.39%和1.39±0.23%。该结果证实,果蝇本身不能产生20C以上的PUFAs,但可以通过食物吸收,并且主要富集于头部。
  (二)选取了AA和EPA在COX、LOX和CYP路径代谢产生的15种类二十烷酸作为对象,以果蝇为研究体系,根据所选类二十烷酸的性质,通过优化样品前处理、液相色谱条件以及质谱检测条件,建立了最佳的代谢产物定性、定量分析HPLC-MS/MS方法。结果表明:在2.5 ng/ml~100 ng/ml范围内,15种代谢产物均具有良好的线性关系,相关系数(R2)都在0.9900以上,检出限为0.1-2.6 ng/g。在空白果蝇样品中添加三个浓度水平的代谢产物混合标准溶液,回收率为89.3%-111.5%,相对标准偏差为1.0%-15.0%,均满足分析方法要求。
  (三)检测了AA和EPA饲料组果蝇组织及AA和EPA添加组匀浆体系中AA和EPA的代谢情况。结果表明:对照果蝇组织中未检测到AA或EPA的代谢产物;AA和EPA饲料组果蝇组织及AA和EPA添加组果蝇匀浆体系中都检测到了15(S)-HETE和15(S)-HEPE。15(S)-HETE和15(S)-HEPE分别是AA和EPA在人体15-LOX路径对应的代谢产物,AA和EPA产物路径的一致性表明,果蝇可能具有与人体15-LOX酶功能相同的代谢酶。此外,实验表明果蝇不能产生15(S)-HETE和15(S)-HEPE的前体15(S)-HpETE和15(S)-HpEPE,故果蝇对AA和EPA的代谢路径与人体15-LOX路径又存在差异。而AA在COX路径的代谢产物PGH2、PGF2α和PGE2、AA在人体5-LOX路径的代谢产物5(S)-HpETE和LTB4、AA在人体CYP路径的代谢产物20-HETE和11(12)-EET以及EPA在人体COX路径的代谢产物PGF3α和PGE3、EPA在人体CYP路径的代谢产物17(18)-EpETE和17,18-DiHETE都未检测到,说明果蝇可能不具备与人体COX、5-LOX和CYP路径酶功能相同的代谢酶。
[硕士论文] 王红
植物保护;农业昆虫与害虫防治 东北农业大学 2015(学位年度)
摘要:大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)1年仅发生1代,越冬时间较长,且飞翔能力不强,经过长时间的地理隔离有可能会发生种群遗传结构的变异,从而加大了对其防治的难度。于是研究大豆食心虫种群遗传变异水平和种群遗传多样性水平,解析大豆食心虫各地理种群间的亲缘关系,揭露大豆食心虫地理历史发生发展规律的意义十分重大。本文选择三个经常使用的线粒体基因COⅠ,COⅡ和Cytb为对象,对我国东北三省虫害发生较重的10个大豆食心虫地理种群进行了深入的研究与分析。
  本研究主要内容包括:⑴扩增出了我国东北三省10个大豆食心虫地理种群的490个个体的3个线粒体DNA片段(COⅠ,COⅡ和Cytb),三个基因片段的长度分别为:657bp、683bp、415bp。且基于这三个基因片段,共获得了17个COⅠ基因的单倍型、16个COⅡ基因单倍型和14个Cytb基因单倍型。⑵COⅠ、COⅡ和Cytb三个基因变异位点所占的比例依次为5.48%、4.83%和7.71%;平均单倍型多样度(Hd)依次为0.456、0.463和0.443;平均核苷酸多样度(p)为0.00676、0.00170和0.01143。中性检验结果结果均认为东北三省大豆食心虫种群近历史时期没有经历种群突然扩张,遗传分化程度较小,遗传多样性为中低等水平。⑶各基因单倍型交织混杂的分布在系统发育树和中介网络图中,没有按照地理区域结构聚集在一起,未形成明显的系统地理结构。⑷种群的遗传变异主要来自种群内部;基于三个mtDNA的总种群和各种群的基因流均大于1,基因交流未受到地理距离的影响。⑸种群间的遗传距离大小和各种群地理距离之间没有明显的线性相关性,说明地理距离不能解释种群间的遗传分化。
[硕士论文] 张欢
植物保护;农业昆虫与害虫防治 东北农业大学 2015(学位年度)
摘要:β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是降解昆虫体内几丁质的关键酶之一,具有调控昆虫发育、变态和生殖等功能,是一种重要的糖苷酶。几丁质被分解时,首先几丁质酶降解几丁质成小分子的寡聚物,之后被β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶降解为单分子的N-乙酰氨基葡萄糖。
  本研究克隆甘蓝夜蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶全长cDNA序列,对基因推导的氨基酸序列进行分析,构建了进化树,并进一步在大肠杆菌中成功表达了该序列的蛋白,进行纯化和复性,获得了有活性的目的蛋白,为β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶蛋白今后的研究奠定了基础。针对基因的时空表达进行研究,同时,体外注射蜕皮激素和dsRNA对β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因进行功能的研究。本试验扩增得到甘蓝夜蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的全长cDNA序列,命名为MbNAG(GenBank登录号:KP730442)。该基因含有2445 bp,包括一个开放读码框大小为1782bp,编码一个多肽含有594个氨基酸,其相对分子量大小约为67.8 kDa,等电点为5.11。该序列含有G20家族保守活性位点HMGGDEVSERCW,判定该基因属于GH20家族中的一员。推导得到的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因含有三个N-位糖基化位点。与甘蓝夜蛾与八字地老虎和小地老虎的一致性达到85%和84%,综上所述,本试验克隆的基因是甘蓝夜蛾的一条新的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因。原核表达成功表达外源蛋白,分子量与预测融合蛋白分子量相符,表达的蛋白为包涵体蛋白,蛋白经过充分洗涤、纯化、复性获得纯的目的蛋白,蛋白经SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明该蛋白为目的蛋白。复性及活性检测结果表明,随着pH的升高,重组蛋白活性先升高后降低,pH=7时活性最高为39.33 U/mL;随着温度的升高,蛋白的活性先升高后降低,在温度为34℃时活性最高为31.33 U/mL。利用荧光定量PCR技术检测基因表达量的变化,结果表明,该基因在甘蓝夜蛾的不同发育阶段和不同组织中都有mRNA水平的特异性表达,1-6龄虫体基因的表达量逐渐升高,预蛹期表达量最大,蛹期又降低。在围食膜中该基因的表达最高,是前肠的54倍。Real-time PCR分析激素处理后MbNAG基因表达量的变化。结果表明,浓度为2μg/μl,基因的表达变化不明显,与对照趋势相同;浓度为6μg/μl和18μg/μl时基因表达量在48h达到最大,分别是对照的3.92和6.56倍;表明该基因的表达受蜕皮激素影响,且浓度为18μg/μl时变化明显。RNAi结果表明,注射48 h后,处理组虫体中Mb NAG基因表达量下降60%;注射72 h后,处理组下降到67%。同时,试验组虫体出现不能正常蜕皮、羽化和死亡现象,到完全羽化为成虫死亡率达到52%。
[硕士论文] 季莉丽
动物学 河北大学 2015(学位年度)
摘要:广炮步甲Pheropsophus occipitalis通过防御腺体喷射化学液体并瞬时产生高温对付猎敌,其防卫方式在昆虫纲极为特别。揭示该虫防御体系形态结构、揭秘其分泌物化学成分,以及伴随其喷射防御物质而产生的一系列行为反应,对于阐述其生命奥秘具有重要科学价值。本文分别从广炮步甲的形态、生活习性、喷射行为,防御腺的总体及各部分形态结构,防御反应的反应物、生成物以及催化剂、和研究展望等几个方面对广炮步甲及其防御机制进行了全面的研究分析。
  本研究主要内容包括:⑴防御体系构成经三维数码显微镜(VHX-100,日本 KEYENCE公司产)、扫描电镜(TM3000,日本HITACHI公司产)与显微CT(SKYSCAN1172)拍摄得知广炮步甲的防御体系由贮液囊、分泌组织和反应室三部分组成。贮液囊是薄而透明且坚韧的囊袋,中间着生1束由12根细管组成的丛根状导管以从体内吸收或生产反应物。反应室为1对骨化的马蹄形结构,表面可见稠密、大小不一和分布不甚均匀的粗瘤;其纵截面内部为复杂的蜂窝状结构并长满形态各异的枝刺,用以加固内壁和控制和液体流向;入口处可见人字形瓣膜,是控制喷射和产生脉冲的关键部分,对于降低反应室温度和虫体控制喷射时间有重要意义。⑵腺体内存化学物质测定经GC/MS质谱仪测定,共测得炮步甲的防御腺化学物质6种,主要成分为甲基对苯二酚(Methyl on phenol)、对苯二酚(hydroquinone)、甲基对苯醌(Methyl-p-benzoqu inone)与对苯醌(p-benzoqu inone);腺体外化学物质测定:相对于贮液囊囊体的化学成分,喷射出的化学物质多达13种,是反应之后苯环断裂的结果,其中除对苯醌以外还有甲酸、乙酸等多数物质都具有刺激性和毒性,可进行有效的防御;将反应室的上清液于不同温度下进行酶活性测定,其颜色反应吸光度在40℃左右最高,超过40℃之后逐渐失去活性,说明于反应室中确实是过氧化物酶起的催化反应,而不是金属离子。⑶广炮步甲喷射“炮弹”的防御行为是主要研究内容,实验得知炮步甲对感到有危险的方向有独特的瞄准方式,它主要通过甲虫通摆动腹部姿势,协调足与足之间角度对喷射方向做出初步判断。此后,再由腹部末端的上唇结构进一步对方向做出调整。其喷射持续0.01~0.03s,0.002s左右即有1脉冲波,一次喷射有5~15次脉冲。
[硕士论文] 易杰群
动物学 南昌大学 2015(学位年度)
摘要:蒲氏钩蝠蛾和湖南棒蝠蛾属鳞翅目蝙蝠蛾科,分别为冬虫夏草及亚香棒虫草寄主,是一类有经济价值的昆虫资源。目前有关于两种蝠蛾研究主要集中于形态学、生物学、生态学等方面。本研究通过常规PCR技术测得蒲氏钩蝠蛾及湖南棒蝠蛾线粒体基因组全长,并分析其特征;基于蒲氏钩蝠蛾和湖南棒蝠蛾在内的39种已知鳞翅目线粒体基因组所有编码基因、氨基序列及rRNA基因,构建了系统发育树。主要结论如下:
  1.蒲氏钩蝠蛾及湖南棒蝠蛾线粒体基因组全长分别为15,064bp及15,301bp,AT含量分别为80.73%和81.85%,均包含37个基因(13个蛋白质编码基因、22个tRNA和2个rRNA)以及一个AT富含区。两种蝠蛾线粒体中,tRNAMet从tRNAIle与AT富含区之间跳跃至tRNAGln与ND2之间。
  2.蒲氏钩蝠蛾及湖南棒蝠蛾线粒体蛋白质编码基因以多样的密码子起始编码蛋白,除两者COX1基因均以CGA起始编码,湖南棒蝠蛾ND1基因以特殊的TTG作为起始密码子外,均为鳞翅目线粒体常见的ATN类型。在两种蝠蛾中,线粒体编码基因多以TAA及单个T作为终止密码子,但蒲氏钩蝠蛾线粒体ND3基因的终止密码子为TAG。密码子使用分析发现,两种蝠蛾线粒体中,UUU(F)、UUA(L)、AUU(I)及AUA(M)这四种密码子使用率最高。就氨基酸而言,Cys氨基编码数量最少,在两种蝠蛾中均仅占0.75%。
  3.两种蝠蛾22个tRNA长度为59-74bp,AT含量约为84%,高于整体水平。在这些tRNA基因中,除tRNASer(AGN)外,均可折叠成三叶草结构。这些tRNA二级结构中碱基错配普遍存在于二氢尿嘧啶臂、氨基酸接受臂、反义密码子臂及TΨC臂上,蒲氏钩蝠蛾及湖南棒蝠蛾分别存在16处和12处错配。
  4.蒲氏钩蝠蛾及湖南棒蝠蛾线粒体AT富含区长度分别为287bp及368bp,AT含量高达92.33%、93.21%。在蒲氏钩蝠蛾线粒体AT富含区中存在2个串联的长为119bp的重复序列和3处8bp长的Poly-A结构;而湖南棒蝠蛾AT富含区中存在4处Poly-T、1处Poly-A以及(TA)9、(AT)6和(AT)8三处微卫星结构。这些结构都被认为普遍存在于鳞翅目昆虫AT富含区。
  5.蝙蝠蛾科已知的四种蝠蛾(蒲氏钩蝠蛾、湖南棒蝠蛾、人支钩蝠蛾、云南无钩蝠蛾)线粒体全长同源性极高,均达89%以上,在COX1、ATP6、ND5等众多蛋白质编码基因处可发现存在用于区分冬虫夏草寄主蝠蛾与亚香棒虫草寄主蝠蛾的标签序列,可用于虫草鉴定研究。
  6.基于线粒体所有编码基因核苷酸序列、氨基序列及2个rRNA序列所建四种系统树显示蝙蝠蛾总科四种蝠蛾单独聚为一支,且其分支节点靠近进化树根部,证实该总科属于更为原始的一个类群。巢蛾总科、卷蛾总科与鳞翅目其它昆虫亲缘关系较远,其在系统树所处位置在蝙蝠蛾总科内侧,而在螟蛾类昆虫外侧。四种系统发育树中,除MP树显示弄蝶总科弄蝶科先与粉蝶科汇成一支外,余下三种系统发育均表明凤蝶总科系统发育关系为(凤蝶科+(弄蝶科+(粉蝶科+(蛱蝶科+(蚬蝶科+灰蝶科))))),这与传统蝶类分类系统矛盾。而螟蛾总科与(夜蛾总科+(尺蛾总科+蚕蛾总科))形成姊妹群,该结构在多数报道中均被验证。
[硕士论文] 王乐
动物学 河南大学 2015(学位年度)
摘要:棉铃虫(Helicoverpa armigera)是世界性重大农业杂食害虫,不仅对棉花生产造成严重危害,而且也对我国的粮食安全造成影响。棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigeranuclear polyhedrosis virus,HaNPV)是棉铃虫专一性的病原菌,也是我国第一个注册并在农田里大范围使用的生物农药,其对生态环境污染小,病毒进入棉铃虫体内复制传播后可以有效的杀死棉铃虫,但该病毒在棉铃虫体内传播机制目前仍不清楚。棉铃虫属于无脊椎动物,仅有先天免疫系统,其可以识别非己成分,抵御外来微生物入侵,保证自身的正常生存。在棉铃虫先天免疫中,C型凝集素作为其中的一种模式识别受体在此过程中发挥重要的功能。在棉铃虫中,已经报道的有8个C型凝集素,它们的主要功能是对细菌和真菌的吞噬作用、黑化作用等,但在病毒感染中的作用研究的很少。HaNPVF囊膜融合蛋白作为出芽病毒囊膜表面重要糖蛋白,在病毒侵染宿主细胞过程中发挥重要作用。实验室前期研究结果证实HaNPV感染棉铃虫后,能够诱导Ha-Lectin基因表达上调,并已经成功构建重组表达载体 Pet-30a-Ha-Lectin。
  本文利用分子克隆技术构建了原核重组表达载体Pet-30a-HaNPV F。经IPTG诱导,包涵体蛋白复性,Ni2+亲和柱纯化后获得重组表达蛋白Ha-Lectin和HaNPV F,并利用重组蛋白Ha-Lectin和HaNPV F作为抗原分别免疫家兔和小鼠,制备多克隆抗体。然后通过免疫细胞化学和免疫共沉淀技术检测两种蛋白的体内互作情况。为进一步研究Ha-Lectin在HaNPV感染中的作用,将Ha-Lectin重组蛋白和抗体分别与出芽病毒BV混合孵育后注射到棉铃虫体内,qPCR检测棉铃虫体内病毒的滴度变化。PCR扩增获得717bp的HaNPVF基因目的片段,并经测序证实载体构建成功;SDS-PAGE电泳检测构建的原核重组表达载体,结果显示 Ha-Lectin重组蛋白的分子量约为41KDa,重组蛋白HaNPV F分子量约为34KDa,二者均存在于诱导后的沉淀中;Western-blotting检测结果显示制备的Ha-Lectin和HaNPV F多克隆抗体能够分别特异识别棉铃虫体内Ha-Lectin和HaNPV F;免疫细胞化学实验证实HaNPV F蛋白与Ha-Lectin蛋白存在体内共表达;免疫共沉淀结果证实HaNPV F囊膜融合蛋白能够靶向结合血淋巴中的Ha-Lectin蛋白;qPCR检测结果显示随着Ha-Lectin蛋白浓度的提高,棉铃虫体内病毒的滴度降低。由以上结果可以看出,C型凝集素Ha-Lectin通过与HaNPV F囊膜融合蛋白互作,抑制病毒在棉铃虫体内的增殖。本文从病毒和宿主蛋白互作的角度揭示NPV的感染机制,阐述 C型凝集素在病毒感染中的作用,为寻找新的害虫分子防治靶标提高生物农药的杀虫效果奠定理论基础,同时也具有较大应用价值。
[硕士论文] 王琰
基础医学;病原生物学 第二军医大学 2015(学位年度)
摘要:中华按蚊Anopheles sinensis Wiedemann,1828隶属按蚊属(Genus Anopheles)、按蚊亚属(Subgenus Anopheles)的赫坎按蚊种团(An.hyrcanus group),在我国分布广泛,是疟疾和丝虫病的重要传播媒介。本研究对中华按蚊宏基因组进行测序和初步的生物信息学分析,拼接注释中华按蚊的完整线粒体基因组,构建了系统发育关系;并在基因组水平统计分析了与抗性相关的代谢解毒酶基因多态性,检测我国现场中华按蚊群体击倒抗性基因(knockdown resistance gene,kdr)突变型,分析击倒抗性的产生和发展的时空变化。取得如下结果:
  1.采自山东北湖与曹县2个现场中华按蚊样本的宏基因组测序数据,经组装和初步注释后,预测基因组大小分别为243Mb/276Mb,蛋白编码基因数为22164个/19587个。
  2.中华按蚊线粒体基因组全长为15076 bp,包含37个编码基因(13个蛋白编码基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因)和控制区。基于全部蛋白编码基因,构建的18蚊种系统发育树,分支合理、稳定,且置信值高;而单个编码基因的信息量不足。进化分析结果显示所有按蚊最近的共同祖先出现于约9861万年前,Nyssorhynchus亚属的分化时间为约5114万年前,塞蚊亚属的分化时间为约7419万年前,按蚊亚属的2种分化时间为约5998万年前。
  3.细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶和非特异性酯酶等8个与代谢抗性相关的代谢解毒酶基因编码区,在中华按蚊的基因组水平均存在一定程度的多态性,每1000 bp的SNP位点数从8.73到29.94,其中21.2%的SNP为非同义替换。
  4.对1996至2014年采集自我国17个省31个地点的773个中华按蚊样本的进行kdr基因型检测,结果显示L1014位点存在点突变,共检测到4种等位基因,编码亮氨酸(L)的野生型TTG(62.01%),以及3种kdr突变等位基因:编码苯丙氨酸(F)的TTT(27.15%)和TTC(1.30%)、编码半胱氨酸(C)的TGT(9.55%)。存在10种基因型,包括野生型纯合子TTG/TTG(55.25%),突变型纯合子TTT/TTT(17.60%)、TTC/TTC(0.27%)、TGT/TGT(1.91%),突变型杂合子TTT/TTC(0.68%)、TTT/TGT(10.23%)、TTC/TGT(0.55%),以及野生/突变型杂合子TTG/TTT(8.19%)、TTG/TTC(0.82%)和TTG/TGT(4.50%)。依地理分布分析,发现在我国中部地区,kdr突变型在中华按蚊群体中频率较高,且随时间不断增加;而在其他地区,kdr突变频率较低,部分地区并未检测到kdr等位基因,提示不同群体对菊酯抗性介导的机制可能不同。
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