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[硕士论文] 张琴
生理学 中南林业科技大学 2017(学位年度)
摘要:近年,糖尿病已经成为严重危害人类生存和生活质量的重要疾病,其发病率逐年攀升,成为重大的公众健康问题。已知糖尿病有两个关键发病因素,一个是胰岛β细胞的数目减少和功能衰竭,另一个则是胰岛素抵抗。由于现有糖尿病研究模型都存在β细胞生成效率低、细胞不成熟等问题,无法完全满足研究需要;并且在已有的肥胖动物模型上只有局限性的物种选择,因此建立起一个新型研究糖尿病的替代动物模型极为迫切。翼手目(Chiroptera)种类众多,分布广泛,是仅次于啮齿目的第二大哺乳类动物,其生态、食性多种多样。狐蝠科(Pteropodidae)是翼手目中以取食高糖食物(如水果汁液或者花蜜)为主的特化类群之一。长期的高糖食性适应性进化使得旧大陆果蝠有着快速降血糖的表型特征,避免取食大量简单碳水化合物后持续高血糖,因此高糖食性的旧大陆果蝠是研究降血糖机制的理想动物模型。本研究选择食果的犬蝠(Cynopterus sphinx)和食虫的大蹄蝠(Hipposideros armiger)作为实验对象,从激素水平和生理解剖水平探索其大量摄食高糖食物餐后快速降血糖机制,为哺乳动物血糖稳态研究提供帮助和补充,以期为人类的糖尿病治疗提供借鉴。
  首先,在空腹状态下,进行葡萄糖耐量(GTT)和胰岛素耐量(ITT)实验。结果表明食性不同的蝙蝠的降血糖速率存在差异(P<0.05),但都是依赖胰岛素降血糖的。较之大蹄蝠,犬蝠具有更高效的降血糖能力。
  其次,酶联免疫分析(ELISA)测定蝙蝠血清胰岛素浓度。结果显示空腹状态下(禁食12h)犬蝠(Mean±SE,39.10±4.46 mIU/L,n=9)的血清胰岛素浓度显著高于大蹄蝠(26.30±0.74 mIU/L,n=11)(P<0.05)。我们认为,犬蝠经长期进化已适应高糖食物,血液中高的胰岛素浓度与其快速降低餐后血糖的表型一致,从而避免犬蝠机体受到高血糖的损伤。
  接着,对蝙蝠进行解剖发现犬蝠的胰腺组织结构是紧密的,而大蹄蝠的胰腺组织是弥散的。对胰腺组织进行石蜡切片制作、脱蜡至水后,进行HE染色、免疫组化染色和分析。研究发现,犬蝠(n=4)的胰岛α细胞、胰岛β细胞和胰岛δ细胞分别占胰岛的比例为29.72±2.08%、48.41±4.59%和14.73±2.04%,大蹄蝠(n=4)分别为22.19±3.24%、50.28±5.99%和21.74±2.85%;犬蝠的胰岛与胰腺的面积之比为22.77±0.90%,大蹄蝠的胰岛与胰腺的面积之比之比为5.28±0.33%,犬蝠胰岛组织占胰腺组织的比例显著高于大蹄蝠。其次,犬蝠胰岛面积比大蹄蝠显著大,β细胞分布在犬蝠中贯穿整个胰岛,而大蹄蝠主要分布在胰岛核心。结果表明,犬蝠无论是胰岛大小还是β细胞数量和大小上都要比大蹄蝠大或者多,这些生理结构变化增强了犬蝠β细胞产生和分泌胰岛素功能,这可能是犬蝠血清胰岛素显著高于大蹄蝠的原因。
  最后,利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记增殖细胞以及其胰腺组织做免疫荧光实验鉴定蝙蝠胰岛β细胞的增殖。结果显示,相同时间内,成年犬蝠(n=4)的胰岛β细胞增殖的数目多于成年大蹄蝠(n=5)(P<0.05)。这表明犬蝠胰岛β细胞更新速率要比大蹄蝠快,这与犬蝠应对餐后高血糖对β细胞损伤得到充分修复有关,保持其高效的生产和分泌胰岛素功能。
  综上所述,葡萄糖耐量实验定量的描述了犬蝠降血糖速率显著的大于大蹄蝠,证明食果的犬蝠糖代谢能力高于食虫的大蹄蝠,并且从胰岛素浓度、胰岛结构和β细胞特征以及β细胞增殖生理层面揭示犬蝠高效的降血糖能力。暗示因食性的分化,旧大陆果蝠发生了适应性进化,获得快速降血糖表型。
[硕士论文] 张赟
动物学 河南农业大学 2017(学位年度)
摘要:瘦素是来源于脂肪组织的调节动物能量代谢的重要因子,其在中枢的作用主要是抑制动物的食欲并促进动物的能量消耗。瘦素作用于下丘脑上的受体,激活OB-Rb信号通路,发挥其生理调节作用。在瘦素抵抗的情况下,瘦素信号通路受阻,动物表现为肥胖等代谢障碍。有研究显示,动物下丘脑中FoxO1(Forkhead box O1)的增多是导致瘦素抵抗的原因之一。实验室对不同的FoxO1突变体的功能进行了前期研究。其中,敲除了DNA结合结构域(DNA Binding Domain,DBD)的FoxO1,在细胞水平的实验中有促进瘦素信号通路的效应。为了验证其在动物体内的作用,实验室构建成质粒pEF1α-Myc-FoxO1△DBD,利用显微注射法,以C57BL/6为背景,构建了突变型FoxO1转基因小鼠,总共获得了10个转基因首建鼠(Founder)。本论文的目的主要是检测转基因小鼠中目的基因表达的组织分布及其对动物生理的影响。首先,对转基因小鼠进行了基因型鉴定工作,将10个转基因首建鼠与野生型C57BL/6杂交各自扩增成系。作者为建立可靠的基因型鉴定方法,通过更换PCR体系等多方尝试克服了目的基因GC含量高不易扩增的问题,同时在采集鼠尾样本的过程中不断更换手套和清洗灼烧剪刀,并且使用含有滤芯的无菌枪头在超净台中进行加样克服了基因型鉴定易污染的问题,避免了假阳性结果的出现。根据此法,作者已将转基因小鼠鉴定到F5代,其中第8、9两只首建鼠无法繁殖后代,第1、2、3、4、5、6、10系的转基因小鼠根据后续的实验结果只做少量保种,第7系转基因小鼠作为实验对象目前保留500只左右;第二,利用荧光定量PCR的方法检测目的基因在转基因小鼠各组织中的表达水平。结果显示,肝脏中只有第7系小鼠目的基因有高水平表达;大脑中只有第3、7系小鼠目的基因有高水平的表达;白色脂肪组织中只有第7系小鼠目的基因有高水平表达,第3系小鼠目的基因有较低水平表达。下丘脑中第7系小鼠目的基因有高水平表达,第2、3系小鼠目的基因有中等水平表达,第1、10系小鼠目的基因有较低水平表达;棕色脂肪组织和腓肠肌中第7系小鼠目的基因同样有高水平表达;第三,利用Western Blotting检测目的蛋白在第7系转基因小鼠下丘脑中的表达。结果显示,目的蛋白有表达但是水平较低;第四,第7系小鼠的体重与采食量的检测。结果显示,阳性小鼠体重略低于阴性小鼠但差异并不显著,阳性小鼠与阴性小鼠采食量上没有显著差异,但是采食量比体重的比值,呈现显著差异且阳性鼠大于阴性鼠;第五,利用荧光定量定量PCR和Western Blotting检测第7系小鼠瘦素信号通路下游抑制食欲的POMC(Proopiomelanocortin)神经肽和促进食欲的AGRP(Agouti gene-related protein)神经肽的mRNA表达和瘦素敏感性。结果显示,常规条件下POMC和AGRP的表达差异不显著,饥饿小鼠一段时间对小鼠颈静脉注射瘦素并作用一段时间后,检测到阳性小鼠STAT3(Signal transducer and activator of transcription3)磷酸化水平高于阴性小鼠,而POMC的表达实验组相对于对照组没有显著升高;第六,利用荧光定量PCR检测第7系小鼠棕色脂肪中UCP1、2、3(Uncoupling protein1、2、3)的表达。结果显示,UCP1在阳性小鼠的表达明显升高(P<0.01),UCP2、UCP3则无显著变化。
[硕士论文] 刘春燕
神经生物学 沈阳师范大学 2017(学位年度)
摘要:为了探究 miRNA及高脂食物对贮脂类冬眠动物达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)从冬眠前育肥期至冬眠期这一过程中对能量选择发生的调节机制及其适应性变化的影响,采用第二代转录组测序(RNA-Seq)技术,对达乌尔黄鼠起始育肥期、快速育肥期、育肥完成期和冬眠期四个阶段的白色脂肪组织进行了测序,并分析了与代谢相关的miRNA差异表达情况。结果表明:在脂肪酸合成通路中,rno-miR-30a-3p、rno-miR-30e-3p在育肥完成期显著上调,rno-miR-106b-3p在育肥完成期显著上调。此时达乌尔黄鼠的体重呈下降趋势,提示在此期间这些miRNA可能抑制脂肪酸合成;在糖酵解/糖异生通路中, rno-miR-139-5p、rno-miR-185-5p、rno-miR-206-3p、rno-miR-23b-5p、rno-miR-29b-2-5p在快速育肥期和育肥完成期下调,rno-miR-30e-3p和rno-miR-135a-3p、rno-194-5p在快速育肥期下调,rno-miR-32-5p在完成育肥期下调,rno-miR-130b-3p、rno-miR-144-5p、rno-miR-194-5p、rno-miR-196b-5p、rno-miR-449a-5p、rno-miR-451-5p在冬眠期上调;在 TCA循环通路中,rno-miR-181a-5p、rno-miR-350、rno-miR-7a-5p在冬眠期上调。从快速育肥期到完成育肥期,黄鼠体重快速增加到顶峰的过程,黄鼠的供能主要来自食物,以糖代谢为主。进入冬眠期,糖代谢降低,推测此时已转化为脂代谢供能为主。
  为了探究高脂食物对达乌尔黄鼠糖脂代谢和冬眠的影响,通过对快速育肥期的达乌尔黄鼠喂以高脂食物,在饲喂前后对呼吸商和血糖稳态进行测定,在饲喂期间对体重和能量收支进行测定,在饲喂之后的冬眠期进行冬眠阵的观察。结果表明:1.在饲喂高脂食物的第60天高脂组体重显著高于对照组,高脂组在第48天和第54天的消化率和可代谢能率高于对照组,推测高脂食物可能通过增加消化率和可代谢能效率增加体重,推迟完成育肥期的到来;2.高脂食物饲喂后的高脂组呼吸商显著低于饲喂前,提示饲喂后高脂组代谢底物转变为以脂脂肪为主;3.高脂组血糖耐受性显著低于对照组,胰岛素敏感性没有差异,推测高脂食物可能会导致;4.高脂食物饲喂一个月对冬眠情况可能并没有影响。
[硕士论文] 何刘军
动物遗传育种与繁殖 四川农业大学 2016(学位年度)
摘要:脂肪组织广泛的存在于动物体内,是动物体内最大的能量储存库以及脂肪代谢的主要场所,同时也是重要的内分泌器官。脂肪组织主要由脂肪细胞组成,脂肪细胞数目的增多或是体积的增大将引发肥胖、Ⅱ型糖尿病及心血管疾病。前体脂肪细胞可诱导分化形成脂肪细胞,因此,前体脂肪细胞增殖调控的相关研究对于肥胖等代谢性疾病的治疗具有重要意义。ATP除了作为重要的能量物质以外,还是一种信号分子,参与机体多种生理过程。之前的研究表明,细胞外的ATP能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,然而它对前体脂肪细胞及脂肪细胞增殖的影响还鲜有报道。为探讨胞外ATP对前体脂肪细胞增殖的影响及其可能的作用机制,本实验以3T3-L1前体脂肪细胞为细胞模型,通过MTT法以及LDH释放率的检测实验来探讨ATP对3T3-L1前体脂肪细胞增殖的作用。并采用RNA-seq技术分别对ATP处理组和对照组细胞在0h、6h、12h、24h、48h的转录本进行了转录组测序,从转录组层面揭示ATP影响3T3-L1前体脂肪细胞增殖的分子机制。研究结果如下:
  (1) ATP(1.0mM)可抑制3T3-L1前体脂肪细胞的增殖并导致胞内LDH的释放。
  (2)转录组测序结果显示ATP处理组与对照组在6h、12h、24h、48h的差异表达基因(DEGs)数目分别为2995、3969、5462、5628个,其中有1188个差异基因是所有时间点共表达的差异基因。
  (3)短时间序列基因表达数据(STEM)分析发现1188个共表达的差异基因具有四种差异显著表达模式(模式16、模式19、模式17以及模式15),这四种基因表达模式分别包括了391、367、202以及132个基因。
  (4) GO分析发现四种表达模式的基因主要与细胞增殖和凋亡有关,特别是模式16中的基因,它们主要富集在细胞凋亡通路中,并且它们的表达量呈现直线上升趋势。
  (5) KEGG分析发现这1188个差异共表达基因主要富集在癌症相关通路、细胞外基质受体相互作用、MAPK以及焦点粘连的相关通路中。
  以上研究结果表明ATP能够通过调控与细胞凋亡通路或死亡通路相关的基因的表达量抑制3T3-L1前体脂肪细胞的增殖。
[硕士论文] 付萍
海洋生物学 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus),隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(Portunus),是我国重要的海产经济蟹类。海洋水生甲壳动物主要依靠两种不同的渗透压调节机制,即非等渗细胞外调节(AER)和等渗细胞内调节(IIR)。IIR主要是通过Na+-K+-泵调节机体无机离子的含量,而IIR主要借助于游离氨基酸(free amino acids,FAAs)含量的变化从而调节机体的渗透压,相比AER调节方式,FAAs有利于维持机体内环境的稳定。
  本研究分为三个部分:第一部分:盐度胁迫对三疣梭子蟹鳃,肌肉,血淋巴中游离氨基酸(Free amino acids, FAAs)含量变化的影响。结果显示:肌肉中含量最高,其次为鳃,血淋巴含量最低。三个组织中总游离氨基酸(total free amino acid,TOFAA)的含量与外界盐度呈正相关(P<0.05),发挥渗透压调节作用的FAAs主要为Ala,Glu,Gly,Pro。Pro在高盐环境渗透压调节方面均表现出主导作用,因此,研究Pro的代谢通路对梭子蟹高盐适应有重要意义。第二部分:盐度胁迫对三疣梭子蟹谷氨酸脱氢酶(Glu dehydrogenase,GDH)的基因表达以及酶活性影响的分析。该部分主要验证GDH作为Pro代谢通路的上游关键酶,对Pro含量的调控作用。Real-Time PCR和酶活结果分析显示:高盐促进了GDH的表达,但活性受到显著地抑制。因此结果表明Pro的合成主要受到自身代谢通路的调控,而非简单的由GDH的控制。第三部分:盐度胁迫对三疣梭子蟹Pro三条代谢通路中三个关键基因的分子水平和蛋白水平变化的研究。首先,对 Ornithine途径中的鸟氨酸氨基转移酶(Ornithine aminotransferase,OAT)的分析。采用RACE方法获得OAT的cDNA全长为1754bp,其中开放阅读框1317bp,编码438个氨基酸。同源性分析表明与捕食螨(Metaseiulus occidentalis)的OAT氨基酸序列同源性最高,Real-Time PCR和酶活结果显示:高盐和低盐显著抑制了OAT的表达和酶的活性。因此本实验表明,OAT对盐度变化较敏感,Ornithine途径可能不是梭子蟹盐度胁迫下合成Pro的主要途径。其次,对另一条合成途径Glu途径中Δ1-吡咯林-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)分析。Real-Time PCR和酶活结果显示:盐度对P5CS的表达没有显著地影响,但是酶活性变化与外界盐度表现正相关性(P<0.01)。因此,结果表明盐度胁迫下P5CS在合成Pro起主要作用,Glu途径为合成 Pro的主要合成途径。最后,探究 Pro唯一一条分解途径中的关键基因-脯氨酸脱氢酶(Proline dehydrogenase,ProH)对盐度变化的适应情况。采用 RACE方法获得三疣梭子蟹ProH的cDNA全长为2162bp,其中开放阅读框1890bp,编码629个氨基酸。同源性分析表明与厩螫蝇(Stomoxys calcitrans)的ProH氨基酸序列同源性最高。Real-Time PCR和酶活结果显示:ProH的表达量和酶活变化与外界盐度呈负相关,其发挥的作用与Pro含量的变化相吻合,表明盐度胁迫下ProH对于梭子蟹Pro含量的积累作用显著。
[硕士论文] 刘青
药理学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:生物节律是指生物的生理和行为活动都存在与昼夜环境保持同步的周期性节律。这一生物节律几乎存在于世界上所有的生物体内。生物节律与人类的健康息息相关。生物节律的紊乱严重影响生物体的生理和行为,导致内分泌失调、内环境紊乱等症状。在哺乳动物小鼠体内已克隆鉴定了七种生物钟相关基因,分别为Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock和Bmal1。这些基因和它们的蛋白质产物构成的自主调节的转录和翻译负反馈环,是生物钟运转的分子机制。
  本文通过蛋白质相互作用网络平台筛选出与生物钟核心蛋白BMAL1相互作用的E3泛素连接酶,探究其调控生物节律的分子机制;通过非标记谱图计数定量蛋白质组学鉴定BMAL1的相互作用蛋白以及它们对BMAL1翻译后修饰和代谢的影响,进一步探究其对生物节律的调控。
[硕士论文] 丛华剑
计算机应用技术 烟台大学 2016(学位年度)
摘要:蛋白质作为构成生命的基础有机大分子物质,其特性一直是人们所关注和研究的重点。在蛋白质的众多特性之中,蛋白质的热稳定性就是蛋白质的一项非常重要的特性。热稳定性好的蛋白质比其他蛋白质对高温环境具有更好的耐受能力,并有非常好的应用前景,然而目前对影响这一特性的特征挖掘却并没有取得很好的效果。本文针对蛋白质的这一重要特性,采用生物信息学的方法挖掘对蛋白质热稳定性有影响的序列特征,并通过序列特征预测提高蛋白质热稳定性的突变位点。主要工作包括以下三点:
  (1)本文构建了不同最适温度细菌的同源蛋白数据库集,根据同源蛋白的序列比对,找到对同源蛋白最适温度有影响的序列位置。对这些位置的氨基酸进行氨基酸组成、进化特征、氨基酸指数、蛋白质二级结构特征分析。通过分析,找到了一些造成同源蛋白最适温度差异的特征。
  (2)本文构建了不同最适温度的酶数据集,并且提出了一种新的序列特征提取方法——短片段模糊匹配方法。该方法对一定长度的蛋白质序列片段按照一定规则匹配到完整的蛋白质序列中,通过不同的蛋白质匹配的频率不同,计算该序列片段与蛋白质最适温度的相关性,从而构建与最适温度有明显相关性的特征片段库。对一个未知的蛋白质序列进行特征片段库中的短片段模糊匹配,即可预测蛋白质序列中与其热稳定性相关的位点。根据对比传统预测方法和在热力学突变数据库中进行预测验证发现,该方法具有较好的预测效果,且更利于实验设计。
  (3)本文将短片段模糊匹配方法应用到具体的实验中,实验采用中温淀粉酶和高温淀粉酶作为材料。通过本文方法预测提高蛋白热稳定性的突变位点,在结合一定的空间结构信息之后,实验最后取得了较好的结果。
  本文中的预测方法是一种局部特征匹配方法,其最主要的贡献在于可以快速定位到序列中与蛋白质热稳定性相关的位置,便于生物实验人员进行蛋白质突变实验设计,这也是众多全局特征匹配方法所不具备的优势。
[硕士论文] 张高帆
生物化学与分子生物学 中国计量学院 2015(学位年度)
摘要:小球藻(Chlorella vulgaris)是一种球形或椭圆形单细胞淡水藻类,直径3~8微米,无性生殖,是地球上最早的生命之一,出现在20多亿年前,是一种高效的光合植物,以光合自养生长繁殖,分布极广,极其容易获得,其作为一种高蛋白的海洋生物资源,高效益的实用价值还未被开发。近年来关于小球藻多肽防治糖尿病的动物实验研究和临床研究较少,其防治糖尿病的作用机制研究还有待进一步深入。小球藻多肽具有抗氧化活性,抗氧化活性对糖尿病的治疗和预防有一定相关性。基于此,本文以小球藻为原料,制备其抗氧化活性多肽,并分析其降糖活性,通过秀丽隐杆线虫体内的氧化酶活性、氧化簇水平、高糖环境下线虫寿命等方面对小球藻多肽的抗氧化活性和降糖效果进行探究,希望通过线虫实验建立理论基础,为后续的小鼠实验做铺垫。
  为了避免工厂破壁造成的蛋白损失,本论文对小球藻破壁条件进行了探索,根据单因素实验和正交实验结果,得到了的4个最佳的小球藻破壁条件,氢氧化钠浓度、提取时间、提取温度和料液比,分别为3.9%、26.8 min、47.3℃和1:31,在此条件下,小球藻可溶性蛋白提取率为5.20%。该方法具有简单易行,不涉及大型仪器操作,提取时间适中,可溶性蛋白提取率较高的特点。
  根据单因素实验的结果,我们选用复合风味蛋白酶作为小球藻活性多肽制备的蛋白酶,于50℃pH=6的环境中酶解5h,在该条件下获得的活性多肽DPPH清除率、超氧自由基清除率、羟自由基清除率、还原性、铁离子螯合率较高,活性多肽对 DPPH、超氧自由基及羟自由基的半抑制浓度 IC50分别为0.325mg/mL、0.325mg/mL和0.139 mg/mL。活性多肽能使线虫平均寿命延长39.20%,同时对处于高氧化性溶液中的线虫寿命有显著的提升,对氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分别提升77.87%和1575.21%,降低活性氧簇13.66%。对α-葡萄糖苷酶活性、α-淀粉酶活性、蔗糖酶活性的半抑制浓度IC50分别为1157.81 mg/mL、1.70 mg/mL和3.38 mg/mL,延长处于高糖环境中的线虫平均寿命43.83%。多肽溶液经2种不同分子量的葡聚糖凝胶纯化,获得2种分子量相近的多肽,大小约为11.2 kDa。
  实验证明,小球藻活性多肽具有较为理想的体外抗氧化能力,具有激发细胞内氧化物水解酶活性的效果,对过氧化氢酶活性提升尤为明显,其作用机理有待进一步的研究,活性多肽在协助细胞消除过剩自由基的基础上延长细胞寿命,保护细胞免受过氧化而凋亡。活性多肽表现出较高的多糖(双糖)水解酶抑制活性,可以减少生物体内的多糖(双糖)水解酶,将食物中多糖及双糖水解为葡萄糖,达到控制生物对葡萄糖的吸收效果。活性多肽对高糖环境下的线虫平均寿命具有较为明显的提升,高糖环境中线虫有较高的氧化水平,类似于糖尿病患者的胰岛β-细胞。因此,该活性多肽在理论上具有保护糖尿病患者胰岛β-细胞的功能。
  本论文制备的活性多肽具有良好的体外和体内的抗氧化能力,同时表现出较高的降血糖效果,为新型抗氧化型降糖药物的研发提供了基础。
[博士论文] 戴梓茹
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2015(学位年度)
摘要:酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信号通路是通过激活各种生理过程的多个关键信号级联反应来调节胞外信号的核心传输系统之一。最新研究表明,细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族蛋白能通过形成负反馈回路抑制JAK/STAT信号通路。SOCS蛋白家族是一类负反馈调节蛋白,参与调控多种细胞因子介导的信号通路。稳定遗传小鼠模型的研究阐明了SOCS家族中的几个成员的不同生理功能。其中,SOCS1参与调控干扰素γ(interferonγ,IFNγ)和泌乳素信号通路,而SOCS3则主要调节白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)信号通路和胎盘的发育。研究发现小鼠SOCS2突变体出现体型显著增大的表型,表明了SOCS2参与调节GH信号通路。此外,越来越多的证据表明,SOCS蛋白对胰岛素通路有调节作用。
  本文对敲除SOCS1a引起斑马鱼肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗进行了研究。机体生长是一个依赖于GH信号通路并被严密控制的过程。关于GH对出生后促生长的影响包括对脂类、葡萄糖以及氨基酸的代谢的影响的研究还不清楚。在哺乳动物中,GH通过激活 JAK2/STAT5通路而大范围的转录活化下游靶基因,包括胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor-I,IGF-I)、抗细胞凋亡基因和SOCS2。胰岛素是由胰腺产生的一种多肽类激素,它能促进其他组织从血液中吸收葡萄糖和促进供能脂类的储存。一般而言,GH也通过抵抗胰岛素对糖的作用和脂肪代谢而影响胰岛素信号通路。在哺乳动物模型中,长期的GH超量表达可能会增加肝糖产量和存储的甘油三酯,从而导致胰岛素抵抗作用。斑马鱼(Danio rerio)SOCS家族至少有12个成员。斑马鱼SOCS1a基因在肝脏中表达量较高。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)或聚肌胞:多聚核苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid,poly I:C)可诱导斑马鱼中SOCS1a的表达,这表明SOCS1a可能是IFN通路的抑制因子。研究发现,在 GH或生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)过量表达的斑马鱼肝脏中SOCS1a产生明显的应激效应,这表明SOCS1a可能参与调节水生生物的GH信号通路。通过转基因小鼠模型,已经阐明了SOCS家族成员的生理功能。然而,但对非哺乳生物物种的SOCS家族的研究缺乏,包括 SOCS蛋白在硬骨鱼类体内的基因功能尚未阐明。我们利用转录激活因子样效应物核酸酶(Activation of transcription factor sample effector nucleic acid enzymes,TALENs)技术敲除斑马鱼SOCS1a基因,并研究其生理作用。早期,斑马鱼SOCS1a突变系JAK/STAT5通路被过度活化,红细胞生成增多,生长正常。24 hpf时,斑马鱼突变系胚胎gata1的表达显著升高。90 dpf时,成年斑马鱼血液中红细胞数量没有显著差异。与对照组相比,SOCS1a突变系中的典型炎症性细胞因子如IFN-γ,IL-1,IL-6和肿瘤坏死因子α(tumour-necrosis factorα,TNFα)等基因的表达没有显著性差异。从第20dpf开始,SOCS1a突变系出现生长缓慢并伴随死亡,成年斑马鱼体重显著低于野生型。敲除 SOCS1a的杂合系成年斑马鱼机体快速生长,体重显著高于对照组。成年斑马鱼 SOCS1a突变系出现全身脂肪减少、肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗等和哺乳动物脂肪代谢障碍症相似的表型。肝脏比较转录组学数据分析表明,斑马鱼SOCS1a突变系肝脏中糖异生、脂分解和低氧诱导效应增强,且肝细胞出现明显的线粒体功能障碍。研究结果表明SOCS1a对JAK/STAT5通路的负调节作用可能参与包括红细胞生成和生长激素活性的抑制作用,导致在杂合系中出现的机体快速生长的生长激素激活作用。此外,斑马鱼模型和哺乳动物模型的SOCS1a突变系在胰岛素敏感性、脂代谢和炎症效应等方面的不同表型,反映出了SOCS1a在水生生物和陆生生物中的不同功能机制。
[硕士论文] 梁爽
神经生物学 河南大学 2015(学位年度)
摘要:血管的发生和细胞极性化的产生对于理解个体的发育、疾病的产生具有重要的意义。目前,实验领域主要研究的是研究小脑表观上面的发育,对于小脑的皮质生长过程中,由于Reelin蛋白缺失对血管发育的影响以及细胞极性化的产生所做的研究并不十分清楚。Reelin蛋白是在迁移细胞的过程中充当了终止信号的作用,这种蛋白对细胞片层化和细胞极性化以及血管的形成起着决定性的关键作用。我们用正常小鼠(WT)与Reeler小鼠的小脑分别进行尼氏染色,血管灌注和免疫细胞化学的方法进行实验研究,探讨Reelin蛋白的缺失对小脑皮质和血管发育的影响。
  目的:观察Reelin基因缺失的Reeler小鼠小脑浦肯野细胞迁移与极性化的改变以及Reelin基因对小鼠血管生长的影响;探讨Reeler小鼠血管的发生和细胞之间的关系,同时分析这两种小鼠浦肯野细胞极性化的改变和血管发育方式的不同。
  方法:应用免疫细胞化学,尼氏染色技术和墨汁灌注技术标记两种不同小鼠从 E17到 P21小脑内神经细胞的发育情况,并进行形态学的观察,同时对Reeler与野生型小鼠小脑皮质内血管体密度和浦肯野细胞直径的大小和角度进行测量与比较。
  结果:①Reeler小鼠小脑的皮质在发育过程中片层化发生了紊乱,没有形成正常的三层分层结构:外颗粒层(分子层),浦肯野细胞层,内颗粒层。②浦肯野细胞在迁移过程中细胞极性发生了改变,通过对小脑浦肯野细胞直径的大小和细胞角度改变的测量,发现不同的小鼠细胞极性发生了明显的不同,差异具有统计学意义P<0.05③墨汁灌注的方法显示两种小鼠小脑内血管的体密度都呈现逐渐上升的趋势,根据发育过程中血管体密度变化的相关性分析可知:P3和P7时Reeler小鼠血管体密度与WT小鼠相比P<0.05;P14和P21时,Reeler小鼠血管体密度与WT小鼠相比P<0.01,显示出发育过程中血管的体密度与年龄有关,差异有显著统计学意义。另外观察不同小鼠血管的外观也有很大的差异。
  结论:在小脑发育过程中缺少Reelin蛋白的Reeler小鼠皮质片层化发生紊乱,神经细胞极性发生改变,血管排列紊乱,体密度与相同年龄点的野生小鼠相比增大,Reelin蛋白在小脑皮质片层化发育生长的过程中发挥了至关重要的作用,一方面控制了皮层神经细胞形态结构的改变,并推进了哺乳动物生长发育的规律模式,形成了小脑发育的不同结构;Reelin也是一种支架蛋白,它的作用是调节放射状胶质细胞的形态学排列,为提供了细胞的正确迁移方向以及可以使血管能正常发育。提示 Reelin蛋白的突变对细胞的发育造成了损伤,从而使皮质片层化发育和血管发生的紊乱以神经细胞极性的改变。
[硕士论文] 刁志清
生物化学与分子生物学 安徽大学 2015(学位年度)
摘要:生物体正常的生命活动依赖于正常的能量供应。骨骼肌是人体重要的运动器官,消耗了有机体大量的能量,因此骨骼肌又是重要的能量代谢器官。脂质是骨骼肌中储存能量的物质,随时水解出脂肪酸进行β氧化提供能量。骨骼肌中脂质代谢异常会引起胰岛素抵抗,进而发展成为糖尿病。因此,研究骨骼肌中的脂质代谢具有重要的意义。
  骨骼肌中的脂质储存于骨骼肌细胞的脂滴中。脂滴表面由一单层磷脂包围,中心充满了以甘油三酯和胆固醇酯为主的中性脂,单层磷脂膜外分布着许多蛋白质,这些蛋白质赋予了脂滴的多功能性。脂滴不仅与脂质代谢密切相关,还参与了细胞器之间的信息交流,发育,蛋白降解,细胞凋亡,免疫以及病毒的复制。脂滴蛋白质PAT家族中,除了perilipin,其它PAT蛋白质在骨骼肌脂滴上均有表达:ADRP丰度最高,其次是TIP47,S3-12和OXPAT表达量较低。
  TIP47又称M6PRBP1,是在对阳离子依赖的M6PR进行酵母双杂交实验时鉴定出来的,因其分子量大小是47 kDa,与M6PR的尾端结合,因此被命名为47 kDa尾连蛋白(tail-interacting protein of47 kDa)。TIP47与M6PR结合,将M6PR从后期胞内体转运回到反面高尔基体管网状结构上。后来发现,小分子GTPase Rab9可以和TIP47直接相互作用,促进TIP47与M6PR的结合和转运。TIP47是一个广泛表达的蛋白质,在胎盘、卵巢、肾上腺、脑、皮肤、脂肪、肌肉和心脏等组织或器官中均有表达,并且,TIP47在子宫颈癌组织中高表达。目前,TIP47被当作发生子宫颈癌的血液标志和当作子宫颈发育不良与侵润性癌症的生物标志。TIP47也在眼睛中表达,参与眼睛明亮与黑暗的适应反应。另外,TIP47参与肝脏脂肪变性,病毒感染和肿瘤发展过程。
  TIP47与ADRP在氨基酸序列比对上达到43%的同源性。ADRP敲除后,TIP47可以代偿ADRP的功能。TIP47可以从细胞质中募集到脂滴上,与ADRP共同参与新生脂滴的成熟。ADRP的研究较为深入,且已经建立了基因敲除鼠,而TIP47对脂质代谢的研究较少,作用机制远未阐明,既没有建立TIP47敲除细胞系,更没有TIP47基因敲除鼠的报道。因此本研究采用最新的CRISPR/Cas9基因敲除技术,敲除小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12中的TIP47,进一步解释TIP47在小鼠骨骼肌细胞脂质代谢的作用。
  CRISPR/Cas9是细菌抵御外源遗传物质入侵的获得性免疫系统,属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统。经过改良后,可以简便高效地用于真核细胞的基因敲除和基因组编辑,现已广泛应用于动物模型的建立、基因治疗和动植物育种等。其基本原理是Cas9核酸酶在单链指导RNA(sgRNA)的指引下,对特异的双链DNA靶序列进行切割产生双链断裂,随后细胞进行非同源末端连接修复或同源重组修复,导致产生碱基或片段的缺失或插入突变。
  本研究运用改良后的CRISPR/Cas9技术,成功敲除了小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12中的TIP47,并获得了几个TIP47敲除(TIP47 KO)C2C12细胞系。用激光共聚焦扫描显微镜观察LipidTOXTM Red脂滴染色,在正常情况下,与对照组相比,脂滴没有变化,推断TIP47并不影响正常情况下C2C12细胞内中性脂和脂滴的生成。但是用200μM OA处理细胞12小时后,与对照组相比,TIP47KO的C2C12细胞内脂滴变多,说明TIP47可能参与了C2C12细胞在OA刺激下脂质的合成。3H标记OA示踪甘油三酯代谢的实验结果显示,与对照组相比,TIP47 KO的C2C12细胞,其甘油三酯的总量增加了,说明TIP47参与了甘油三酯代谢。另外,免疫印迹杂交的结果,在TIP47 KO的C2C12细胞中,ADRP的蛋白质表达量增加了,这表明,在TIP47 KO的C2C12细胞内,ADRP可能代偿了TIP47的功能。总之,本研究表明,TIP47在C2C12细胞的脂质代谢中起着重要的作用。
[硕士论文] 贺娟
生理学 南华大学 2014(学位年度)
摘要:目的:
  (1)观察槟榔碱对成熟脂肪细胞中脂质含量的影响;
  (2)观察不同浓度槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂质合成代谢关键酶FASmRNA和蛋白表达的影响;
  (3)观察不同浓度槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂质分解代谢相关酶 ATGL和HSLmRNA和蛋白表达的影响,以探讨槟榔碱影响脂肪细胞脂质代谢的可能机制。
  方法:
  (1)采用含胰岛素、地塞米松和异丁基甲基黄嘌呤(isobutyl methyl xanthine, IBMX)诱导剂诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成熟,显微镜下观察3T3-L1前脂肪细胞及脂肪细胞形态,MTT法检测槟榔碱对成熟脂肪细胞的毒性作用。设置对照组(0μmol/L)和处理组(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L),处理72h后,油红 O染色观察胞浆内脂滴聚集。
  (2)不同浓度槟榔碱处理72h后,提取各组细胞RNA,采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction;RT-PCR)检测各组脂质代谢相关酶mRNA的表达;
  (3)不同浓度槟榔碱处理72h后,提取蛋白,Western blot检测脂质代谢相关酶蛋白的表达。
  结果:
  (1)3T3-L1前脂肪细胞呈胞浆中无脂滴;分化成熟后,细胞呈大圆形或椭圆形,胞浆内可见大量脂滴环绕细胞核,呈“指环”状。脂质含量测定结果显示槟榔碱能减少成熟脂肪细胞中脂滴数量。
  (2)槟榔碱对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞具有一定的细胞毒性。在200-1600μmol/L浓度范围内细胞相对存活率随浓度增大而明显降低,具有浓度依赖性。在0-100μmol/L范围内,细胞相对存活率没有明显规律性,但总体存活较好。不同浓度槟榔碱处理3T3-L1脂肪细胞24h、48h、72h和96h,细胞相对存活率在96h时明显低于24h、48h、72h。
  (3)不同浓度槟榔碱处理细胞后,结果显示:槟榔碱降低脂肪酸合成酶FAS mRNA和蛋白的表达,其中以50μmol/L组降低最为显著。与对照组相比,25μmol/L槟榔碱组FAS mRNA表达降低40%,蛋白的表达降低15.7%,50μmol/L组FASmRNA表达降低65%,蛋白的表达降低46.2%,100μmol/L组FAS mRNA没有明显变化,蛋白的表达则降低约27.6%。
  (4)槟榔碱显著增加脂肪细胞脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)mRNA的表达。与对照组相比,25μmol/L槟榔碱组ATGL mRNA水平增加47.3%,HSL mRNA水平增加65.4%;50μmol/L组ATGL mRNA水平增加223.2%, HSL mRNA水平增加207.8%;100μmol/L组ATGL mRNA表达水平约增加198.1%;HSL mRNA表达水平约增加112.5%。
  (5)不同浓度槟榔碱均显著增加脂肪细胞脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白的表达。与对照组相比,25μmol/L槟榔碱组ATGL蛋白表达增加31.5%,HSL总蛋白水平增加43.7%,81kDa条带增加53.4%,83kDa条带增加71.6%;50μmol/L组ATGL蛋白表达水平增加99.2%,HSL总蛋白表达水平增加81.8%,81kDa条带增加69.1%,83kDa条带增加104.4%;100μmol/L组ATGL蛋白表达水平约增加41.6%,HSL总蛋白表达水平增加31.5%,81kDa条带增加14.5%,83kDa条带增加22.3%。
  结论:
  槟榔碱显著降低分化成熟的3T3-L1脂肪细胞内脂质的含量,可能与降低脂质合成关键酶脂肪酸合酶的表达水平和增加脂质分解代谢关键酶ATGL和HSL的表达水平有关。
[硕士论文] 马浩
计算机软件与理论 中国科学技术大学 2014(学位年度)
摘要:生物体表型的变化和其代谢系统的变化息息相关,细胞在生长发育的不同阶段、受到外界环境刺激以及发生病变等生物过程中,相应的细胞代谢系统也发生着相应的变化,对这些变化过程的代谢系统的变化的分析有助于我们从代谢的角度理解生物体的生长发育过程、对外界扰动刺激的应激机制以及疾病的致病机理。在过去的十几年里,对生物体进行全基因组尺度的代谢系统建模以分析细胞代谢行为,取得了一定的成果,但在对多细胞生物的代谢系统分析上,因为多细胞生物的固有复杂性,一直进展缓慢,本文在前人研究的基础上针对多细胞生物代谢系统建模做出了一些新的特色工作,在从系统的角度分析代谢行为方面有着广泛的应用前景。
  本文的研究工作主要关注多细胞生物的代谢系统变化过程,结合现有的高通量基因表达数据,对细胞在不同条件下的代谢系统的变化进行建模分析。主要的特色工作包括:(1)提出一种融合基因表达差异信息的面向多细胞生物的代谢系统差异分析方法,建立新的代谢系统分析模型,新方法不需要对细胞代谢功能做特定的假设,大大扩展了其应用范围。在人体不同组织细胞和正常组织与肿瘤组织细胞两个不同的数据集上验证了新的代谢系统差异分析方法,结果证明了本文提出的方法有效的预测了这些不同条件下的代谢系统差异。(2)利用新提出的代谢系统变化进行分析的方法,设计并实现了基于web的代谢系统差异分析工具,它能提供更加准确的代谢系统差异分析结果。同时,我们还构建了代谢系统差异数据库,整合细胞在生长发育、外界刺激以及病变过程中的代谢系统变化数据,方便研究人员对相关生物过程的分析研究。(3)针对时序条件下的代谢系统差异分析,提出了两种新的代谢差异分析方法,一种是基于富集分析方法在时序变化过程中任意两点的差异分析结果,推断pathway或者代谢反应在整个时间序列下的状态变化;另一种结合时序基因表达数据的代谢系统建模方法,考虑相邻时间点的变化对代谢系统分析的影响,更加准确的描述时序变化过程中的代谢系统状态变化。在小鼠脂肪细胞的分化的基因表达数据集上验证了新的时序代谢系统差异分析方法的有效性。
[硕士论文] 邵芳
遗传学 苏州大学 2014(学位年度)
摘要:MicroRNA(miRNA)是一类在基因后转录过程中通过对靶mRNA的翻译抑制和降解,而对基因表达起负调控作用的小的非编码RNA分子。其参与调控生物的生长、发育、细胞增殖、凋亡等多种生物学过程并与多种疾病密切相关。与哺乳动物不同,鸡的脂类从头合成主要是在肝脏而不是脂肪组织完成的,因此,其脂肪组织生长依赖于肝脏中合成的甘油三酯以及从肝脏中运输的量。而脂类代谢除了受固醇调节元件结合蛋白(SREBP)与肝X受体α(LXRα)这两个典型的转录因子调控外,还受到多种miRNA的调控。本研究以鸡miR-33为研究对象,对其进行了一系列的表达和功能研究,主要研究结果如下:
  ⑴miR-33的表达分析。通过生物信息分析方法发现鸡miR-33只存在一种类型,定位于鸡的1号染色体SREBP-2基因的内含子16上,是一个内含子型的miRNA。实时荧光定量PCR显示,miR-33在不同组织中均有表达,且在肌胃和心脏中的表达量较高,在其他组织中等表达。miR-33在肌胃中的表达量与脾脏、肾脏、脑、腺胃中的表达量差异显著(P<0.05),与肝脏和腿肌中的表达量差异极显著(P<0.01)。宿主基因SREBP-2基因在胸肌中的表达量最高,其次是脑、腿肌、肝脏组织,在肌胃中的表达量最低。鸡SREBP-2基因在胸肌中的表达量与其他各组织的表达量呈极显著差异(P<0.01)。miR-33与宿主基因SREBP-2的表达不存在组织特异性,并且两者在多种组织中不存在共表达现象。
  ⑵miR-33靶基因预测与验证。运用miRanda软件预测miR-33的靶基因,在鸡3'-UTR数据库的11891个基因中共预测到378个靶基因,其中筛选出的与脂肪酸代谢相关的候选靶基因CROT、CHPT1、HADHB、FTO、PRKAA1、PTDSS1和LRP2。体外双荧光素酶报告系统证实CROT、CHPT1、HADHB和FTO为miR-33的靶基因;靶位点突变实验证实CROT、CHPT1、HADHB和FTO基因3'-UTR上与 miR-33种子区互补位点为靶位点,且靶基因 CROT和 CHPT1的两个位点与miR-33种子区结合的程度不同,miR-33与CROT3'-UTR靶位点218-225结合能力较强,与CHPT13'-UTR靶位点846-865结合能力较强。
  ⑶miR-33与靶基因在鸡肝脏原代细胞中表达情况。为了研究在体外条件下, miR-33对脂类代谢的影响,以4周龄雌性商品代AA肉鸡为实验材料,采用改良的半原位两步灌流法并结合消化法分离肝细胞,进行原代培养,胶原酶消化法所获得的肝细胞分离良好,形态完整,铺板4h即贴壁;实时荧光定量PCR鸡肝脏原代细胞经培养2 d后,miR-33的表达量升高;而CROT、HADHB和FTO mRNA表达水平明显下降,且HADHB和FTO基因在培养2 d鸡肝脏原代细胞与刚分离的原代细胞中的表达量差异显著(P<0.05)。
  ⑷miR-33表达抑制或上升后对靶基因表达的影响。设计并合成LNA-antimiR-33转染鸡原代肝细胞,miR-33的表达水平下降了44%,而 miR-33靶基因CROT、CHPT1、HADHB和FTO的表达量都有一定程度的上升,其中CROT的表达量升高了近1.2倍,达到了显著水平(P<0.05);设计并合成miR-33模拟体使鸡肝细胞系miR-33过表达后,miR-33靶基因的表达量均在一定程度受抑制,其中CROT、HADHB的表达量极显著下降(P<0.01),FTO表达量显著下降(P<0.05)。
  ⑸miR-33和靶基因在不同发育时期肝脏中的表达情况。鸡miR-33在不同时期肝脏中的表达量呈先升高后下降再升高的趋势,靶基因除CHPT1外整体表达趋势与miR-33相反。经统计分析CROT(R=-0.695)、HADHB(R=-0.711)和FTO(R=-0.669) mRNA表达量miR-33呈中度负相关。
  ⑹综合以上研究结果,证实miR-33能通过与靶位点结合负调控靶基因CROT、HADHB、CHPT1和FTO的表达,初步发现miR-33通过调控与脂类代谢相关基因的表达,进而参与调控鸡的脂类代谢与脂肪沉积。
[硕士论文] 岳云双
动物营养与饲料科学 山东农业大学 2013(学位年度)
摘要:本课题22研究了腹腔注射菌体脂多糖(LPS),激活核因子(NF-κB)信号通路对食欲调节机制的影响。通过对LPS诱导厌食机制的研究,筛选出调节采食的关键基因及蛋白,从而确定了采用中枢灌注药物的方法,干预LPS诱导的动物厌食,为改善LPS诱导的动物厌食提供理论依据。
   试验一:体重相近的8周龄健康小鼠24只,随机均分成4组,饲养在环境控制的鼠房内,室内温度控制在23±0.1自由采食和饮水。试验期,小鼠禁食24小时后,分别按照0,10,100,1000μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS。分别记录注射后1、2、4、6、12、24小时的采食量及体重。结果发现:与对照组相比,LPS处理的所有时间点的采食量均显著降低(p<0.01),处理组内小鼠24h的体重也显著降低,但24小时以后,10μg及100μg处理组的小鼠的体重均出现了恢复;在LPS处理组中,随着LPS浓度的增加,动物的采食量和体重显著降低。以上结果表明:LPS能够降低动物的采食和体重,并且呈现剂量依赖性。
   试验二:8周龄体重相近的健康小鼠36只,随机均分成4组,饲养在环境控制的鼠房内,温度控制在23±0.1由采食和饮水。试验前,所有小鼠禁食24h后,于18:00点分别按照0,100,500μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS。注射LPS2小时后,将小鼠颈部移位处死,并迅速剥离下丘脑,进行样品分析。试验结果表明:LPS处理显著的提高了下丘脑内抑制食欲的基因POMC的mRNA水平(p<0.05)。利用Western Bloting技术测定下丘脑内FoxO1的磷酸化水平,发现FoxO1在Ser256和Thr24/FoxO3a(Thr32)位点的磷酸化水平显著上调(p<0.05),并且显著增强了细胞浆内FoxO1的水平(p<0.05);在测定细胞因子的基因表达量时,发现LPS处理显著提高了IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平(p<0.05);NF-κB蛋白磷酸化测定过程中,发现LPS处理显著地提高了NF-κB在Ser536位点的磷酸化水平(p<0.05),同时细胞核内NF-κB在该位点的磷酸化水平也显著提高;除此之外,AMPK在Thr172位点的磷酸化水平显著下调,而mTOR在Ser2448位点及P70S6K在Thr389位点的磷酸化水平均显著上调。上述结果提示:LPS处理可能是通过增加细胞因子的释放,从而激活NF-κB信号通路,引起食欲基因的变化,而影响动物的采食量;另外,AMPK以及mTOR信号可能也参与了LPS引起的动物厌食。
   试验三:试验选用体重相近的8周龄雄性昆明小鼠24只,随机均分为A、B、C、D4个组。禁食24小时后,于18:00点A、C组小鼠脑室注射人工脑脊液(artificialcerebrospinal fluid,ACSF),B、D组小鼠脑室注射AICAR。脑室注射1小时后,A、B组小鼠再腹腔注射LPS(500μg/kg BW),C、D两组注射生理盐水,记录采食量。样品采集:在小鼠腹腔注射2h后,将小鼠颈部移位处死,随后迅速剥离下丘脑,进行样品分析。结果显示:脑室注射AICAR没有影响LPS组小鼠的采食量(p>0.05),提示AMPK信号通路可能不是LPS诱导动物厌食中的关键通路。
   试验四:体重相近的8周龄雄性昆明小鼠24只,单笼饲养,饲喂基础日粮,自由饮水。试验期将小鼠随机平均分成A、B、C、D四个组。所有小鼠提前禁食24h后,于18:00点,A、C组脑室注射人工脑脊液1μl,C、D组按照20μg/μl的剂量脑室注射mTOR阻断剂Rapamycin1μl。脑室注射1小时后,B、D组按照500μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS,另外两组注射同剂量的生理盐水。记录1,2,4,6,12,24小时的采食量。样品采集:在小鼠腹腔注射2h后,将小鼠颈部移位处死,随后迅速剥离下丘脑,进行样品分析。由结果可知:脑室注射Rapamycin显著提高了LPS诱导的厌食小鼠的采食量(p<0.05),显著的下调了抑食基因POMC的mRNA水平(p<0.05),显著的提高了NPY/AgRP的mRNA水平(p<0.05);测定细胞因子的mRNA水平发现,脑室注射Rapamycin,显著降低了细胞因子IL-1α、TNF-α的mRNA水平(p<0.05),IL-1β的mRNA水平呈现下调的趋势,而IL-6的mRNA水平没有显著的变化;另外,Rapamycin处理显著降低了LPS诱导的FoxO1、NF-κB、mTOR、P70S6K的高磷酸化水平(p<0.05)。以上所述结果提示:Rapamycin可能是通过降低细胞因子的释放水平,使得调节食欲基因表达的蛋白的功能的恢复,从而食欲基因的表达得到改善,继而使LPS诱导的小鼠的采食量增加。
[硕士论文] 吴苗苗
动物营养与饲料科学 山东农业大学 2013(学位年度)
摘要:动物体氨基酸营养缺乏时,乳腺组织表现出与肌肉等其他外周体组织不同的反应。乳腺组织对血液氨基酸的提取率升高,以获得更多的氨基酸来满足乳蛋白合成的需要;肌肉等组织则分解蛋白质,将沉积的氨基酸释放出来进入血液循环,因此在体内氨基酸营养分配上,泌乳是优先于维持的代谢过程。对其中的机制还不清楚。
   本试验以小白鼠为动物模型,用不同蛋白水平和能量水平的日粮组对生产后泌乳母鼠进行处理,采集血液、乳腺组织和肌肉组织,用放射性免疫法测定血液中激素含量,用全自动生化分析仪测定血液中血糖含量,用实时荧光定量法对乳腺及肌肉组织中特征蛋白及泛素-蛋白水解酶复合体通路相关基因表达量进行分析,用蛋白免疫印迹法测定乳腺及肌肉组织中蛋白代谢mTOR途径相关因子及氨基酸载体的蛋白表达量。
   本研究结果:(1)日粮中蛋白或能量胁迫对β-casein、MHC2α的表达产生显著影响(P<0.01,P<0.05)。处理组乳腺组织β-casein mRNA表达量均升高,尤以仅提供能量组升高最显著,其次是饥饿组(P<0.01),其他处理组表达量也升高但无统计学差异。试验处理对肌肉组织中肌动蛋白α-actin的mRNA表达虽无显著影响,但使其有明显下降趋势,饥饿组下降幅度最大。同时,处理组中MHC2αmRNA的表达量显著降低(P<0.05),但各处理组间无显著差异。(2)不同日粮处理对泛素系统中PolyUbc、E214k及C2的mRNA表达量均有显著影响(P<0.01),有显著差异的处理组中其表达量水平均为上调。与饥饿组相比,E214k和C2 mRNA在提供能量组表达水平最高。(3)处理组中血液IGF-1含量均显著降低(P<0.01),但各处理组间差异不显著;饥饿组PRL含量下降,其他处理组PRL含量均上升,但各处理组间差异不显著。(4)处理组对酪蛋白合成通路中p70S6K的磷酸化水平影响显著(P<0.05),各处理组均使其磷酸化水平升高,饥饿组和仅供能量组的升高幅度更大。处理组乳腺组织中Lys及Arg载体CAT1表达量均升高(P<0.05),与提供蛋白组相比,饥饿组和仅供能量组的升高幅度略小。Met载体ASCT2表达量有下降趋势。此外,虽未见显著性差异,但处理组使mTOR及4EBP1磷酸化水平均升高。(5)除提供不足量蛋白组外,处理组肌肉组织中mTOR通路下游信号因子p70S6K磷酸化水平均升高,但升高幅度远低于乳腺组织。此外,mTOR及4EBP1磷酸化水平也有升高趋势,但幅度也均低于乳腺组织。Met载体ASCT2表达量均下降(P<0.05),饥饿组下降幅度最大。
[硕士论文] 张凯
动物学 杭州师范大学 2013(学位年度)
摘要:实验方法:96只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重为(104.48±7.29g)。适应饲养一周,随机分为3组,对照组(CON),饲喂标准饲料;共轭亚油酸组(CLA),饲喂添加CLA的饲料;共轭亚油酸加低氧组(CH),饲喂添加CLA的饲料同时低氧处理。45天后CH组开始在低氧舱内模拟5000米海拔饲养,持续一个月,其他2组常氧。同时三组动物分别于1天、10天、20天、30天做不同时长处理。取大鼠血液和肌肉,测葡萄糖、甘油三酯、组织乳酸、肌糖原、游离脂肪酸、胰岛素、脂肪酸合酶(FAS)、脂蛋白酯酶(LPL)、激素敏感酯酶(HSL)。
   实验结果表明CLA对大鼠体重和摄食量没有显著影响(P>0.05),低氧降低大鼠体重和摄食量(P<0.01);在不同的时间段中,CON,CLA,CH三组大鼠血糖含量无明显差异(P=0.87; P=0.81;P=0.05; P=0.14);在1天中CLA组大鼠血清甘油三酯含量高于CON组(P<0.01);CH组高于CON组(P<0.01);10天,20天和30天中CON,CLA,CH三组大鼠之间血清甘油三酯含量无明显差异。随着时间的变化,各组大鼠血清甘油三酯含量无明显差异。在不同的时间段中,CLA组大鼠血清游离脂肪酸高于CON组(P<0.01),CH组大鼠血清游离脂肪酸低于CLA组(P<0.01)。随着时间的变化,各组大鼠血清游离脂肪酸显示出先升后降的趋势。在不同的时间段中,CLA组大鼠血清胰岛素含量高于CON组(P<0.01),CH组大鼠血清胰岛素含量低于CLA组(P<0.01)。随着时间的变化,各组大鼠血清胰岛素含量显示出先升后降的趋势。
   在不同的时间段中,1天中CLA组肌肉组织葡萄糖低于CH组(P<0.05),10天中CON组和CLA组肌肉组织葡萄糖高于CH(P<0.05),20天中CON、CLA、CH三组肌肉组织葡萄糖之间无差异;30天中CON组和CLA组肌肉组织葡萄糖高于CH组(P<0.01)。随着时间的变化,CH组中10天和30天肌肉组织葡萄糖降低。在不同的时间段中,1天中CON组肌肉组织乳酸低于CLA(P<0.05);10,20和30天中CON、CLA、CH三组肌肉组织乳酸无差异(P>0.05)。随着时间的变化,CLA组和CH组肌肉组织乳酸降低,CON组无明显差异。在不同的时间段中,CON、CLA、CH三组肌肉组织甘油三酯无差异(P>0.05)。随着时间的变化,CLA组20天和CH组10天、20天肌肉组织甘油三酯降低。在不同的时间段中,1、10和30天中CON、CLA、CH三组肌肉组织糖原无差异(P>0.05);20天中CON组肌肉组织糖原高于CH组(P<0.01)。随着时间的变化,各组大鼠肌肉组织糖原显示出先降后升的趋势,CON组和CH组10天和20天肌肉组织糖原降低。在不同的时间段中,在1天、10天、20天和30天中CON组肌肉组织游离脂肪酸低于CLA组(P<0.01),CLA组肌肉组织游离脂肪酸显著高于CH组(P<0.01); CON组肌肉组织游离脂肪酸高于CH组(P<0.01)。随着时间的变化,各组大鼠肌肉组织游离脂肪酸显示出先升后降的趋势。
   在不同的时间段中,CLA组HSL高于CON组HSL(P<0.01),CH组HSL低于CLA组HSL(P<0.01),随着时间的变化,CON组20天和CH组10天、20天HSL升高。在不同的时间段中,CLA组LPL低于CON组LPL(P<0.01),CH组LPL高于CLA组LPL(P<0.01)。随着时间的变化,CON组20天和CLA组10天、20天LPL升高。在不同的时间段中,CLA组FAS低于CON组FAS(P<0.01),CH组FAS低于CLA组(P<0.01),随着时间的变化,CLA组20天和CH组10天、20天FAS升高。
[博士论文] 王洁
营养与食品卫生学 第二军医大学 2013(学位年度)
摘要:研究背景:
   铁是人体含量最多的一种必需微量元素。长期以来,对铁代谢的研究主要集中在铁缺乏/缺铁性贫血的防治。随着人们对铁代谢认识的发展,如今已经从铁缺乏扩展到机内铁过负荷的原因以及铁代谢紊乱引发的一系列相关疾病的机制探讨,尤其是铁过量与代谢性疾病之间的关系。
   近年来,诸多流行病学调查已经明确糖尿病,非酒精性脂肪肝等代谢性疾病患者存在铁过负荷。前瞻性研究进一步发现体内铁蛋白、转铁蛋白的升高与代谢综合征的发病率成正相关。多项META分析得出结论:机体铁含量过高是引起糖脂代谢紊乱、心血管疾病等发病的诱因之一,但具体机制尚未明确。血脂代谢的紊乱是代谢综合征的主要症状之一,血脂参数的持续异常显著增加心血管疾病的发病风险。流行病学调查显示铁过负荷人群常常伴有高脂血症,LDL-C、HDL-C等脂蛋白水平改变;动物给予单纯的高铁膳食也可见到血脂参数的异常。由于肝脏是调节脂代谢的重要器官,铁沉积于肝脏引起的氧化应激损伤是导致脂代谢紊乱的一个原因。事实上,机体铁沉积不仅仅发生在肝脏,脂肪、脑、胰腺等均有铁沉积的存在。
   与肝脏同样,脂肪组织是维持脂代谢平衡的重要器官。近年来,有研究证实脂肪组织是一个敏感的铁感应器官,它可以表达所有与铁代谢相关的调控、储存及转运的因子如铁蛋白、铁调节蛋白、转铁蛋白受体、HEF、hepcidin、ferroportin等。目前,脂肪组织不再是一个单纯的储脂产能组织,其分泌的细胞因子如瘦素、脂联素等对于维持机体能量和糖脂代谢的平衡具有重要的调节作用。是否脂肪组织像肝脏一样,会因为铁过负荷影响其内分泌功能,成为铁过量引起脂代谢紊乱的机制之一,这方面研究一直没见报道是个值得探索的问题。因此,本实验通过给小鼠腹腔注射右旋糖酐铁,观察血脂代谢指标的变化,并且用高通量细胞因子芯片观察血液中与脂代谢相关细胞因子的变化特点;进一步细胞实验证明不同浓度的结合型和离子型的铁干预能否直接影响脂肪细胞因子的分泌;最后在铁过负荷动物造模的同时,补充与血脂代谢最为密切的细胞因子脂联素至正常水平,检测脂联素作用的酶类活性及血脂参数的恢复情况,明确脂联素异常是否为铁过载引起的血脂异常的机制之一。
   研究目的:
   观察铁过负荷小鼠血脂代谢变化以及与脂代谢密切相关的多个细胞因子的变化特点;观察铁过负荷对脂肪细胞细胞因子分泌的直接影响并证实其分泌的异常是否为铁过负荷引起血脂代谢异常的机制之一。为阐明铁过负荷引起的代谢紊乱的原因机制提供证据支持,同时也为铁过负荷引起的血脂代谢紊乱的预防和治疗方法提供一定新的思路。
   研究方法:
   1.铁过负荷对小鼠血脂代谢的影响
   1.1实验动物小鼠铁过负荷模型的建立
   雄性C57小鼠(购自上海斯莱克公司),体重(20±2)g。按体重随机分为空白对照组、铁过负荷实验组,每组10只。实验组右旋糖酐铁腹腔注射2mg/d,对照组注射生理盐水,右旋糖酐铁注射总量为12mg。于第7天检测血清铁、铁蛋白、转铁蛋白饱和度、总铁结合力等血清铁相关参数;原子吸收法检测肝脏、脂肪铁含量;脂肪组织普鲁士蓝染色。
   1.2铁过负荷小鼠血脂参数及其他生化指标测定
   检测血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST等血清生化指标。血糖仪检测小鼠血糖水平。放射免疫法检测小鼠血液胰岛素水平。
   1.3肝脏甘油三酯合成酶类活性测定
   实时定量荧光PCR法检测小鼠肝脏FAS、ACC等甘油三酯合成酶mRNA水平;Western blot检测ACC酶磷酸化水平。
   2.铁过负荷小鼠血清各类细胞因子含量及脂肪组织细胞因子mRNA的变化
   2.1高通量细胞因子芯片检测血清细胞因子的改变
   选取IL-1β,IL-2,IL-6,IL-10,IL-15,IL-12(p70),TNF-α,IFNγ,GLP-1,GIP、Leptin, Resistin, Ghrelin, PAI-1, MCP-1,RANTES, VEGF-basic、FGF-bb、PDGF等19个细胞因子定制细胞因子芯片,检测血清含量变化。
   2.2 Elisa重复验证芯片结果
   2.3检测脂肪组织中细胞因子的mRNA表达水平
   采用实时定量荧光PCR法测定小鼠血清中显著改变的细胞因子脂肪组织中的mRNA表达变化。
   3.不同浓度的结合型和游离型铁对脂肪细胞瘦素、脂联素分泌的影响
   3.13T3-L1细胞培养分化
   选用3T3-L1前脂肪细胞,DMEM培养液中加入10%小牛血清、双抗,培养箱生长。细胞接触抑制至融合后用DMEM+10%胎牛血清培养,培养液中加入胰岛素(10μg/ml)、地塞米松(1μM)、IBMX(0.5mM)分化液分化,3天后换液,完全培养液并加入胰岛素(10μg/ml)干预,每隔两天换液一次,直至8-12天分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定。
   3.2不同浓度的结合型铁和游离铁干预后细胞活性检测
   用MTT法检测不同浓度的结合型铁和游离铁干预后细胞活性情况。
   3.3不同饱和度的转铁蛋白结合型铁对脂肪细胞瘦素、脂联素分泌影响
   用不同比例的apo-transferrin/holo-transferrin配成转铁蛋白饱和度为0、25%、50%、75%、100%5个浓度梯度的混合液,干预成熟脂肪细胞24h,转铁蛋白总浓度为30μM,Elis法检测细胞培养液中瘦素、脂联素含量,实时定量荧光PCR法测定mRNA的表达水平。
   3.4不同浓度的细胞外游离FeS04对脂肪细胞瘦素、脂联素分泌的影响
   用0μM,10μM,100μM,1000μM游离FeS04干预脂肪细胞24h,检测瘦素、脂联素mRNA水平及细胞培养液中的含量。
   4.外源性脂联素补充对铁过负荷小鼠血脂代谢及相关酶活性的影响
   4.1血清脂联素含量恢复后观察血液脂代谢变化
   小鼠右旋糖酐铁注射同时,腹腔注射重组脂联素,浓度为3.μg/g,使其血液中含量恢复正常,检测小鼠血清中TG、LDL-C、HDL-C等血脂代谢指标变化。放射免疫法检测胰岛素水平变化。
   4.2甘油三酯分解酶活性的变化
   血清中脂联素水平恢复至正常后,比色法检测各组小鼠血清脂蛋白酯酶、肝酯酶活性变化。
   5.数据的统计与处理
   采用quantity one图像分析系统对western条带进行灰度分析,实验数据用((x)±S)表示。应用SPSS11.5统计软件进行实验数据分析,两组间差异采用成组设计资料的t检验,多组间差异采用单因素方差分析。各组方差齐时,对照组与各实验组间比较采用Dunnett法,各组间两两比较采用LSD-t检验和SNK-q检验;方差不齐时采用Dunnett'sC检验。p<0.05为差别有统计学意义,p<0.01为非常显著性水平。
   结果:
   1.铁过负荷对小鼠血脂的影响
   1.1铁过负荷小鼠机体铁状况
   与对照组相比,右旋糖酐铁注射小鼠血清铁、转铁蛋白饱和度(TS%)、总铁结合力(TIBC)均显著升高(p<0.01);模型组小鼠肝脏铁水平较对照组升高4倍,脂肪组织铁含量升高5倍(p<0.01),通过普鲁士蓝染色进一步确定脂肪组织存在明显的铁沉积。
   1.2铁过负荷小鼠血清生化指标变化
   与对照组相比,铁过负荷模型小鼠血清甘油三酯水平(TG)显著升高(p<0.05);低密度脂蛋白胆固醇酯(LDL-C)显著升高(p<0.01),高密度脂蛋白胆固醇酯(HDL-C)显著降低(p<0.01);血糖、胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)没有明显改变,实验组、对照血清胰岛素水平差别没有统计学意义(p>0.05)。
   1.3铁过负荷小鼠肝脏甘油三酯合成相关酶ACC、FAS变化
   实验组肝脏ACC、FAS mRNA水平与对照组没有统计学差异(p>0.05),ACC的磷酸化水平没有明显变化。
   2.铁过负荷小鼠血清各类细胞因子含量及脂肪组织细胞因子mRNA变化
   2.1细胞因子芯片结果
   从芯片结果来看,IL-1β,IL-2,IL-6,IL-10,IL-15,IL-12(p70),TNF-α,IFN-γ等炎性细胞因子含量与对照组没有统计学差异;GIP、GLP-1两个促胰岛素分泌细胞因子没有显著改变;生长因子和趋化因子中,实验组趋化因子RANTES显著升高(p<0.01),VEGF, FGF、PDGF、MCP-1等与对照组差别均没有统计学意义;由脂肪细胞分泌的细胞因子瘦素、抵抗素、脂联素出现显著的降低(p<0.01),PAI-1有降低趋势,但没有统计意义(p=0.27),胃底细胞分泌的Ghrelin与对照组相比显著升高(p<0.01)。
   2.2 Elisa重复验证结果
   实验组小鼠血清中,由脂肪细胞分泌的脂联素、瘦素出现了显著地降低(p<0.01),与芯片结果一致。
   2.3脂肪组织细胞因子的mRNA水平变化
   实验组小鼠脂肪组织中,脂联素、瘦素的mRNA水平降低显著(p<0.01)。
   3.不同浓度的结合型铁和离子型铁干预对脂肪细胞细胞因子分泌的影响
   3.13T3-L1前脂肪细胞分化结果
   用完全培养液加入分化液分化三天,再用完全培养液加胰岛素干预约十天后,细胞由梭形变圆,核周围脂滴聚集,呈“戒环样”,经油红O染色鉴定前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,成熟脂滴形成。
   3.2不同浓度的离子型和结合型铁干预后细胞活性情况
   用MTT法检测后发现,最高浓度30μM的holo-transferrin和1000μM的硫酸亚铁干预后,细胞活性与对照组没有明显差异(p<0.05)。
   3.3不同饱和度的转铁蛋白结合型铁对脂肪细胞因子分泌的影响
   转铁蛋白饱和度在大于等于50%,脂肪细胞TfR-1 mRNA水平出现降低(p<0.05),提示细胞内的铁含量升高;细胞中的瘦素、脂联素mRNA水平随转铁蛋白饱和度升高,逐渐降低(p<0.05);转铁蛋白饱和度达到75%时,细胞培养液中瘦素、脂联素含量显著降低(p<0.05)。
   3.4不同浓度的细胞外游离FeS04干预影响脂肪细胞因子分泌
   FeS04干预成熟脂肪细胞后,浓度在10μM时,细胞TfR-1 mRNA水平就出现了显著降低(p<0.05),细胞中瘦素、脂联素的mRNA水平随着游离铁浓度的升高,逐渐降低(p<0.05)。100μM浓度的FeSO4干预后,细胞培养液中瘦素、脂联素含量降低(p<0.05)。
   4.外源性补充重组脂联素对铁过负荷小鼠血脂代谢的影响
   4.1铁过负荷小鼠补充重组脂联素至正常后血脂代谢参数变化
   外源性补充重组脂联素至正常水平后,可见血清TG的升高得到有效缓解,差别有统计学意义(p<0.05),HDL-C有升高趋势,LDL-C也有一定程度的恢复,但与对照组相比仍有统计学差异。
   4.2铁过负荷小鼠补充重组脂联素后血清LPL、HL酶活性变化
   铁过负荷小鼠血清中分解甘油三酯的脂蛋白酯酶和肝酯酶活性降低(p<0.05);重组脂联素水平恢复正常后,脂蛋白酯酶活性较模型组显著升高(p<0.05),肝酯酶活性与实验组差别没有统计学意义。
   结论:
   1.铁过负荷可引起血清甘油三酯、低密度脂蛋白升高,高密度脂蛋白降低;但对肝脏中与甘油三酯合成相关酶类没有受到影响;
   2.铁过负荷小鼠血液中与脂代谢密切相关的脂肪细胞因子瘦素、脂联素的含量降低,而炎性因子、趋化因子、生长因子等其他细胞因子没有变化,提示细胞因子含量的异常有可能为血脂代谢紊乱原因之一;
   3.细胞内铁含量升高后影响脂肪细胞瘦素、脂联素的分泌,结合整体动物脂肪组织细胞因子mRNA的结果,认为铁过负荷在转录水平影响了脂联素、瘦素的表达;
   4.外源性补充重组脂联素使血液中含量恢复至正常后,铁过负荷小鼠血清TG水平得到一定程度缓解,说明脂联素异常为铁过负荷导致的机体血脂代谢紊乱的机制之一;与此同时,调控血清甘油三酯分解代谢的脂蛋白酯酶活性得到一定程度的恢复;推测脂联素可能通过影响脂蛋白酯酶的活性参与了铁过载引起的血液中甘油三酯的升高。细胞因子
[硕士论文] 李海龙
放射医学 苏州大学 2013(学位年度)
摘要:研究背景:转基因食品(Genetically Modified Foods,GMF)是利用现代分子生物技术将某些生物的基因转移到其他物种中去,改造生物的遗传物质,使其在外观形态、营养价值、消费品质等方面向人们所需要的目标转变,以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是―转基因食品‖。传统观点认为转基因食品不会比普通食品给人类健康带来更多的威胁。然而,近年来越来越多的负面现象发生在食用转基因食品的人和动物身上,比如转基因食品很可能引起易感人群的过敏现象;又如与使用非转基因土豆饲养的小鼠小肠相比,使用转基因土豆饲养的小鼠小肠上皮发生了明显的改变;再如使用转基因大豆饲养的仓鼠生殖能力的下降等等,所有这些现象都促使我们不得不仔细考虑和重新评估转基因食品的安全性问题。在所有转基因作物中,转Bt基因作物占了绝大部分,其表达产物之一转基因蛋白Cry1Ab是使用最多分布最广的转基因蛋白之一,并且相对稳定,本实验中选择它作为转基因蛋白的代表,观察和研究其在实验中的作用。
  目的:探明Cry1Ab的生物组织分布情况并计算出其在血浆中的相关代谢动力学参数,明确其是否可以通过胃肠道吸收,是否有特异性的器官分布,并初步探查其相应机理,为转基因食品的安全性评估提供实验依据。
  方法:(1)采用同位素125I标记Cry1Ab并对标记结果进行质量控制,标记方法采用 Iodogen法。(2)通过灌胃和尾静脉注射两种方式给予正常 BALB/c小鼠125I-Cry1Ab,并于随后既定的时间点进行采血、采集图像和各器官组织中125I-Cry1Ab的测量。(3)进行Cry1Ab与生物组织芯片和IEC-6细胞的结合实验,并用Western blot技术对组织或器官裂解液中的Cry1Ab进行鉴定,最后用Ligand Blot方法寻找小鼠组织或器官裂解液中可能存在的Cry1Ab受体。
  结果:(1)标记产物125I-Cry1Ab即刻放射性化学纯度达95.7%。在体外及模拟体内环境条件下均具有较好的稳定性,可以满足下一步示踪实验的要求。(2)无论灌胃还是尾静脉注射给药,125I-Cry1Ab在肝、肺、脾、胃、肠道、性腺和肾脏都有较高的分布。但在大脑中分布极低。灌胃给药时,125I-Cry1Ab在血浆中约5h达到峰浓度,随后开始下降,至27h时基本清除。尾静脉注射给药时,125I-Cry1Ab的代谢符合方程:C=2495e-1.99t+702e-0.10t,分为分布相和消除相两个时相,分布相半衰期和消除半衰期分别为0.35h(T1/2α)和6.79h(T1/2β)。灌胃给药的绝对生物利用度为28.68%。(3)生物芯片中的胃、小肠等组织以及IEC-6细胞与Cry1Ab均有较强的结合活性,用Western blot技术鉴定结果认为是Cry1Ab的特异性结合,这与上一部分中动物实验的结果相一致。最后用Ligand Blot的方法寻找到了小鼠组织和器官中存在的Cry1Ab受体。
  结论:本实验证实了转基因蛋白Cry1Ab可以通过胃肠道整体吸收到体内,并在肝、肺、脾、胃、小肠、性腺和肾脏等器官有较多分布,但不能通过血脑屏障,主要的排泄器官是肾脏。Cry1Ab通过两种给药方式吸收后,其在血液中的代谢动力学相似,符合二室模型。然而,具有特定的吸收、分布(尤其是在胃肠道和性腺中的大量分布)代谢特征的转基因蛋白进入机体后造成的后果目前仍不明了,尚需进一步的研究。
[硕士论文] 宁勤建
制药工程 中国海洋大学 2013(学位年度)
摘要:海洋特殊的生态环境使得海洋生物物种间竞争异常激烈。软柳珊瑚属于低等无脊椎动物,主要通过产生具有化学防御作用的次级代谢产物在激烈的海洋生态环境中生存和繁衍。近年来,在对该属珊瑚的研究中已经发现了大量结构新颖、类型多样的次级代谢产物,其中部分次级代谢产物可能为该属珊瑚的特征性化学成分,具有一定的化学分类学意义。
  本研究采用海洋天然产物研究方法,对采自中国南海的侧扁软柳珊瑚Subergorgia suberosa(两个样品:分别采自中国南海梅山海域和西沙海域)和小月柳珊瑚Menella kanisa的生物活性次级代谢产物进行了初步研究。综合运用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、HPLC等分离手段,以及NMR,MS,IR,UV等波谱学技术,从中分离获得55个单体化合物,鉴定了其中42个化合物的结构,并运用多种活性模型对化合物的生物活性进行了初步评价。
  从中国南海梅山海域的侧扁软柳珊瑚S.suberosa中分离鉴定了12个化合物,包括孕甾烷类甾体4个(1–4),其它甾体化合物4个(5–8),柳珊瑚酸类倍半萜1个(9),甘油醚类2个(10,11),脂肪酸类1个(12)。从南海西沙海域的侧扁软柳珊瑚S.suberosa中分离鉴定23个化合物,包括孕甾烷类甾8个(1–4,13–16),其它甾体化合物6个(17–22),柳珊瑚酸类倍半萜5个(9,23–26),咖啡碱类2个(27,28),神经酰胺类1个(29),长链醇1个(30)。其中,化合物1,14和15为新天然产物。从不同海域的同种侧扁软柳珊瑚中,分离得到相同化合物5个(孕甾烷类1–4和柳珊瑚酸类倍半萜9)。对采自不同时间不同海域的同种侧扁软柳珊瑚进行了对比研究,发现C-17位连有乙酰基的孕甾类化合物为侧扁软柳珊瑚的特征性成分。从化学成分的研究角度,分析讨论了侧扁软柳珊瑚的次级代谢产物对软柳珊瑚属的化学分类学意义。与同属中的其它种软柳珊瑚进行比较分析发现,C-17位连有乙酰基的孕甾类化合物只从侧扁软柳珊瑚中分离获得,表明该化合物可能是侧扁软柳珊瑚的特征性成分,可能对该种珊瑚的化学分类学研究具有借鉴意义。
  从中国南海广西涠洲岛的小月柳珊瑚Menella kanisa中分离鉴定了12个化合物,包括愈创木烷型倍半萜9个(31–39),珊瑚烷型倍半萜1个(40),甾体2个(41,42)。高度氧化的α,β-不饱和γ-内酯愈创木烷型倍半萜为小月柳珊瑚的特征性成分,可能也具有化学分类学意义。
  采用卤虫致死、抗菌、斑马鱼鱼毒和细胞毒活性模型对化合物进行了生物活性筛选评价。结果显示,化合物1–4,13–16,31–33和35–37在50μg/mL的浓度下表现出卤虫致死活性;化合物9,23,24和26对白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)显示出较强的抑菌活性,其MIC分别为5.0μg/mL,5.8μg/mL,5.3μg/mL和5.2μg/mL;化合物23对酵母菌Pichia guilliermondii的MIC为5.8μg/mL,化合物16对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)显示出较强的抑制活性,其MIC为6.3μg/mL;化合物34和38显示了较强的斑马鱼胚胎毒性,化合物34对斑马鱼72h尾部致畸EC50值达到2.12μg/mL,对斑马鱼72h致死LC50值为2.02μg/mL,化合物38在72h致死的LC50值达到1.56μg/mL;化合物3对HeLa肿瘤细胞表现出抑制活性,其IC50值为15.40μg/mL。综合分析,可以初步推测,孕甾类和柳珊瑚酸类倍半萜类化合物可能在侧扁软柳珊瑚的化学防御作用中发挥重要作用。
  本研究对从海洋生物资源中发现新的活性化合物具有一定的指导意义,特别是对从中国南海珊瑚次级代谢产物中发现化学防御化合物具有参考价值,并且两种柳珊瑚中特征次级代谢产物的发现,也可能具有一定的化学分类学意义。
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