绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 35
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 692 条结果
[博士论文] 程玉强
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界范围内死亡率占第三位的恶性肿瘤,预后极差,主要原因之一是其容易侵犯临近的门静脉系统而形成门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus,PVTT)。肝癌门静脉癌栓已成为制约肝癌预后的最大瓶颈问题。血小板(platelet,PLT)作为近年来肿瘤相关研究的热点,其在肝癌发生中的作用被逐渐认识,几乎参与了诸如肝脏炎症的损伤与修复、肝纤维化直至肝癌等慢性肝脏疾病的各个过程。但是,血小板与门静脉癌栓形成这一特殊的肝癌转移方式之间的关系尚未见报道。分析血小板在肝癌门静脉癌栓形成过程中的作用,不仅能为癌栓的形成机制做以新的阐释,更能为其治疗开辟新的思路。
  目的:
  通过回顾性分析术前伴有不同血小板计数的肝癌门静脉癌栓患者的预后,建立血小板与门静脉癌检之间的初步联系。进一步通过分析门静脉癌栓患者血小板活化情况及癌栓组织特异表达的基因谱,探讨血小板在肝癌门静脉癌栓形成中的重要作用,从而为肝癌门静脉癌栓的治疗寻找新的治疗靶点和方法。
  方法:
  一、术前血小板计数与肝癌门静脉癌栓患者预后关系的分析
  以肝癌伴门静脉癌栓患者为研究对象,结合术前临床资料数据及预后生存状况,以术前血小板计数的高低将病人分为三组:血小板减少组(PLT<100×109/L)、正常组(100×109/L≤PLT≤300×109/L)和升高组(PLT>300×109/L)。回顾性分析患者的预后,以确定术前血小板计数对肝癌门静脉癌栓患者预后的影响。
  二、肝癌伴门静脉癌栓患者血小板活性检测
  分离提取肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,通过分析血小板的聚集能力差异,探讨肝癌门静脉癌栓患者的血小板活化状态改变情况。并进一步用血小板活化相关分子通过流式细胞技术加以验证。
  三、癌栓组织特异性mRNA表达谱分析
  取三例肝癌伴门静脉癌栓患者的配对新鲜组织样本,包括癌旁组织(pritumoral tumor,PT)、肝癌原发灶组织(parenchyma tumor,T)和门静脉癌栓组织(portal vein tumor thrombosis,PVTT/P),行基因芯片检测。分别分析不同病人间的个体化差异和各组织间的特异性表达差异。通过Metascape(http://metascape.org)分析差异基因参与的生物学功能及相关信号通路,并最终确定目的基因。
  四、目的基因诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的作用机制研究
  通过扩大样本量,确定目的基因在不同组织中的表达。进一步用不同肝癌细胞系与血小板共培养,建立体外“癌栓”形成模型,并结合细胞系的成栓能力及目的基因的表达水平确定体外研究的工具细胞系。再通过该模型对目的基因在门静脉癌栓形成中的机制做探讨。
  结果:
  第一部分:门静脉癌栓患者血小板降低的的伴发比例较高(20.9%)。不同血小板计数患者之间的临床病理特征不同,肝硬化伴发率(p<0.001)、肿瘤大小(p<0.001)以及肿瘤是否存在包膜(p=0.032)差异明显。门静脉癌栓患者伴有血小板计数减少者的无瘤生存期RFS(recurrence free survival)和总体生存期OS(overall survival)均优于血小板计数正常组(p均小于0.001)和升高组(p=0.008和0.046),但血小板计数正常组和升高组之间无明显的统计学差异(p=0.578和0.877)。进一步通过倾向性匹配评分(PSM)排除各组间的病历资料差异的影响并作亚组分层,结果表明:Ⅱ型门静脉癌栓患者中血小板减少组的患者的无瘤生存期明显优于血小板正常组(p=0.011),但Ⅰ型癌栓和Ⅲ型癌栓病人的不同血小板计数组之间无明显差别(p=0.154和0.142)。Ⅰ型和Ⅱ型癌栓中血小板减少组的患者的总体生存期的分析均优于血小板正常组(p=0.021和0.029),但Ⅲ型癌栓患者的两组间仍无差异(p=0.451)。多因素风险回归分析结果表明血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后相关的独立危险因素,包括无瘤生存期(hazard ratio[HR]0.602,95%CI0.444-0.836,p=0.001)和总体生存期(HR0.582,95%CI0.415-0.816,p=0.002)。
  第二部分:通过分析肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,结果表明肝癌伴门静脉癌栓患者的血小板聚集能力增强,血小板活化的比例增加。通过对肝癌伴门静脉癌栓患者配对的不同组织(癌栓组织、原发灶组织和癌旁组织)行基因芯片检测发现,病人之间存在交大的个体化差异;进一步汇总分析三例病人均有差异的基因显示:三种组织各自具有其独特的基因表达谱。将差异基因在基因功能网站进行分析发现,癌栓组织中特异表达的基因在细胞溶解、一元羧酸酸代谢、胰岛素样生长因子调节、小分子代谢以及有机羟基化合物运输等生物学功能上富集明显,且部分差异基因还与整合素信号通路和HNF3B信号通路等肿瘤相关的信号通路密切相关。进一步根据差异基因的表达水平及其生物学功能,最终将干细胞因子(SCF/KITLG)作为目的基因重点进行后续的机制研究。
  第三部分:通过扩大样本检测结果发现,目的基因KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中表达明显高于肝癌原发灶组织和癌旁组织,此外,KITLG的受体基因c-KIT表达水平与其相一致,在门静脉癌栓组织中表达升高。进一步检测肝癌相关的干细胞标志物发现,EpCAM、CD44、CD90和CD133在门静脉癌栓组织和肝癌原发灶组织中的表达均比癌旁组织高,除CD133在门静脉癌栓组织中与肝癌原发灶中表达水平相似外,EpCAM、CD44和CD90的表达水平在癌栓组织中最高。不同肝癌细胞系中KITLG的表达水平不一样,来源与肝癌门静脉癌栓的细胞系CSQT-2中KITLG的表达水平最高。通过将CSQT-2与血小板共培养建立体外“癌栓”模型的实验结果表明,细胞系中KITLG的表达水平与成栓能力有关,KITLG是肝癌门静脉癌栓形成中的重要分子。
  结论:
  1、血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后的独立危险因素。伴血小板计数减少的肝癌门静脉癌栓患者预后相对较好;
  2、肝癌门静脉癌栓患者血小板活化增强;
  3、门静脉癌栓组织、肝癌原发灶组织和癌旁组织的基因表达存在差异,各有自身特异的基因表达谱;
  4、KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中高表达,促进癌栓肿瘤细胞干性的维持,并可在体外诱导栓块形成而促进癌栓的发生。
  本课题创新点及潜在应用价值:
  确定了血小板计数与肝癌门静脉癌栓的预后关系,为肝癌门静脉癌栓的临床治疗提供指导。通过基因芯片分析明确了癌栓组织特异性基因表达谱,并分析其分子功能及相关信号通路,为癌栓形成机制的相关研究提供数据支持和参考;进一步分析明确KITLG通过诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的机制,为抗血小板治疗在肝癌门静脉癌栓的应用提供有力证据。
[博士论文] 沈頔
外科学(整形外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:婴幼儿血管瘤是一种婴幼儿期较为常见的内皮细胞良性肿瘤。该肿瘤通常具有增殖期、消退期和消退完成期的临床病理特征。患者在出生后3-6个月发病并迅速进入增殖期。该病一般在患者3-7岁可自发出现消退。在增殖期,由于血管瘤内血流量迅速增加,瘤体快速增殖,可使肿瘤体积明显增大,从而对周围组织器官造成压迫症状。多发者可伴随其它相关病理表现。在消退期,肿瘤瘤体停止生长,并自发消退。多数患儿可不残留明显皮肤改变。但部分婴幼儿血管瘤因其深在,或者并发其他疾病,可导致严重的并发症。某些病例中最终残留的病变可影响患儿正常生活。目前对于婴幼儿血管瘤的治疗方法已逐渐统一,但是还没有一种治疗方法是完全有效和没有副作用的。这主要是因为对于其发病机制还没有完全研究清楚。目前普遍认为,相对于增殖期,消退期的婴幼儿血管瘤中内皮细胞的凋亡是一个重要的促进因素。
  miRNA又称为微小RNA,是一类自然界中普遍存在的小分子RNA。该类RNA对于维持机体内环境稳定,调控细胞和组织分化有重要意义。该类RNA并不通过编码蛋白质发挥作用,而是通过识别特定靶目标的mRNA,降解mRNA或部分抑制mRNA的表达,从而抑制靶目标蛋白的形成和发挥作用。目前有诸多文献均认为,在肿瘤中miRNA与细胞凋亡有着重要的关系。在前列腺癌中[1],miRNA-34可以下调Bcl-2蛋白表达,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。在恶性胶质瘤中[2],miRNA-153可以通过下调Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡。在直肠癌中[3]存在着低表达的miRNA-195。通过在直肠癌细胞内高表达miRNA-195,可以促进直肠癌细胞的凋亡。我们之前对增殖期及消退期的婴幼儿血管瘤组织进行差异microRNA芯片检测和筛选,发现miR-29a-3p在不同期的组织中差异明显,且在消退期的婴幼儿血管瘤组织中明显高表达。同时,在诸多文献中,均发现miR-29家族成员可以通过作用于凋亡相关因素而抑制肿瘤的发展。通过实验[4]发现,在恶性肝细胞癌细胞株中,miR-29a可调控抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2,从而导致肝癌细胞的凋亡。在慢性淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌中,miR-29a均表达下调。上调miR-29a表达可以激活P53的表达,并抑制CDC42、Tcl-1等多种增殖相关基因的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。
  通过本研究,我们试图探讨miR-29a对婴幼儿血管瘤生物活性的影响,以及在婴幼儿血管瘤消退中的作用及其机制。以期对进一步了解婴幼儿血管瘤自发消退的机制有所裨益。
  第一部分:婴幼儿血管瘤内皮细胞的培养及鉴定
  实验目的:
  通过原代细胞培养的方法,获得可用于实验的增殖期婴幼儿血管瘤内皮细胞。
  实验方法:
  1、无菌条件下收集手术中新鲜的增殖期婴幼儿血管瘤标本,于6小时内转入实验室超净台中。以组织块贴壁培养法处理并培养血管瘤组织。培养数周后,获取其周围爬出的细胞,通过酶消化法收集。经过传代再培养。传至3-4代,细胞量足够时,收集并以CD31免疫磁珠分选,获得CD31阳性细胞。将细胞进行CD31-FITC的流式细胞学检验,以保证阳性细胞率达90%以上。
  2、将获得的高纯度的CD31阳性细胞进行培养,在倒置相差显微镜下观察其生长形态,并绘制生长曲线,行Matrigel基质胶成管实验,以确定该细胞的生长特性。
  3、通过CD31、vWF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,以明确该细胞为可用于下一步实验的婴幼儿血管瘤内皮细胞。
  实验结果:
  1、通过对增殖期婴幼儿血管瘤新鲜标本组织块的培养,细胞的收集、扩增、传代、并经CD31免疫磁珠分选,获得了足够量的细胞。通过CD31-FITC的流式细胞学检验,所获得CD31阳性细胞率为96%左右。
  2、获得的细胞通过培养,在倒置相差显微镜下观察,可见其形态为梭形,生长较为杂乱。生长曲线显示其具有较为旺盛的增殖活性。Matrigel基质胶成管实验显示其具有早期成管能力。
  3、通过CD31、vWF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,可见该细胞上述表面标志物表达均为较强阳性。
  实验结论:
  我们通过收集增殖期婴幼儿血管瘤标本,并经体外扩增培养并获得细胞。经形态学及免疫荧光抗体检测,其特征均符合文献的一般描述,证实为所需婴幼儿血管瘤内皮细胞。经流式细胞仪检测,该细胞纯度较高,活力较强,可用于下一步实验。
  第二部分:上调miR-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响
  实验方法:
  1、体外构建能够转染并可在细胞内稳定表达miR-29a的慢病毒颗粒Lv-hsa-miR-29a及阴性对照病毒Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin。
  2、以自身细胞作为阴性对照组,以Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin转染的细胞作为阴性病毒转染组,以Lv-hsa-miR-29a转染的细胞作为慢病毒转染组。通过荧光显微镜观察其荧光表达情况。通过qRT-PCR检测细胞在转染前后miR-29a表达的变化,从而确定其转染效率。
  3、在婴幼儿血管瘤细胞内过表达miR-29a后,采用MTT法检测其增殖能力的改变。流式细胞仪检测其周期及凋亡水平的改变,Transwell侵袭法检测其侵袭能力的改变,以研究过表达miR-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响。
  实验结果:
  荧光显微镜下观察,FITC荧光表达显示miR-29a转染效果良好,转染效率约为95%左右。qRT-PCR结果显示miR-29a在婴幼儿血管瘤内皮细胞中的表达丰度为中等,转染慢病毒颗粒后,miR-29a基因的表达丰度是阴性对照组的2.643倍。转染病毒后72h,过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,其早期凋亡率约为10.82%,较阴性对照组及阴性病毒转染组有显著性差异。其晚期凋亡率约为1.72%,较阴性对照组有显著性差异。而细胞周期、侵袭及增殖实验结果均无显著性差异。
  实验结论:
  通过转染慢病毒颗粒Lv-hsa-miR-29a,可以构建稳定高表达miR-29a的细胞模型。过表达miR-29a后,婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡率有显著性变化。而对于细胞周期、增殖及侵袭均无显著性影响。
  第三部分:miR-29a在婴幼儿血管瘤中作用机制的研究
  实验方法:
  1、以miR-29a过表达后的婴幼儿血管瘤细胞作为目标样本,以自身细胞作为阴性对照,采用miRNA基因表达谱芯片筛选的方法,获得两者之间有较大表达差异的mRNA表达谱。通过与TargetScan数据库进行比对,结合之前细胞功能学研究结果,参考相关文献,选取可能为miR-29a下游的靶基因作验证。
  2、通过双荧光素酶检测显示,miR-29a的下游作用分子可能为Mcl-1分子。
  3、通过Western-blot检测的方法,进一步验证在过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平是否有显著性变化。
  4、通过查阅文献及相关数据库,我们选取Stat3及Akt3这两个可能同时是Mcl-1上游及miR-29a下游靶蛋白的分子加以验证,进一步研究miR-29a是否通过调控Mcl-1上游分子表达以调控Mcl-1表达的可能。
  实验结果:
  参考miRNA芯片筛选、数据库分析结果及相关文献,我们获取相关分子作为miR-29a可能的下游靶蛋白并进行验证。通过双荧光素酶检测确定Mcl-1具有与miR-29a结合的相关位点,其为miR-29a可能的下游分子。通过Western-blot检测,证实了Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平均有显著性变化。同时,通过Western-blot检测,证实了Stat3及Akt3蛋白水平无显著性变化。
  实验结论:
  双荧光素酶检测发现,miR-29a与Mcl-1是直接相互作用并且可以找出相互作用的结合位点。通过Western-blot检测,在过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白表达明显下调。而miR-29a与Mcl-1的上游分子Stat3和Ark3没有表达相关性,miR-29a并不能抑制或者激活Stat3和Ark3的表达。
[博士论文] 陈远征
外科学(整形) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几章展开论述:
  第一章 口服普萘洛尔不同给药方案治疗婴幼儿血管瘤疗效对比
  第一部分 口服不同剂量普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤疗效对比
  背景:
  婴幼儿血管瘤(infantile hemangioma,IH)是最常见的儿童体表软组织良性肿瘤,婴幼儿的发病率一般在5%-10%。极低出生体重早产儿发病率可以高达20%-30%。目前治疗手段有很多,如手术、冷冻、激光、药物治疗等。常用的药物有糖皮质激素、干扰素α、环磷酰胺、长春新碱等。上述治疗药物均有不同程度的副作用,使其临床应用受到限制。自2008年法国专家Léauté-Labrèze报道普萘洛尔对婴幼儿血管瘤有很好的疗效后,国内外广泛应用普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤,均取得了良好的疗效和较少的不良反应,已经成为治疗婴幼儿血管瘤的一线药物。
  目的:
  对比研究1.0 mg/kg/d和2.0mg/kg/d剂量普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的疗效,以期为临床治疗提供理想的用药剂量及理论依据。
  方法:
  2015年9月到2016年10月期间,诊断为婴幼儿血管瘤,且符合纳入标准的婴幼儿血管瘤患儿,采用随机对照的原则,根据口服普萘洛尔的剂量不同分为两组,治疗A组(N=45):口服普萘洛尔剂量为1mg/kg/d;治疗B组(N=44):口服普萘洛尔剂量为2 mg/kg/d。1mg/kg/d和2 mg/kg/d的剂量,均分两次给药,时间间隔8小时。纳入A组和B组患儿按相应方案口服药物治疗,根据Achauer等提出的分级标准进行疗效评价,记录有效病例;记录治疗过程中发生的不良反应;符合治愈停药标准时,停药,并记录治愈病例及治疗持续时间。六个月时进行有效率、治愈率、不良反应发生率的比较;12个月时进行治愈率及治愈病例所需治疗时间的比较;治愈停药后随访3个月,统计复发病例,并进行复发率的比较。
  结果:
  治疗A组:开始治疗的平均年龄为3.7月(1-9月),终止治疗的平均年龄为11.1月(3-18月)。6个月时45例患儿疗效评价为:Ⅰ级(差)1例,Ⅱ级(中)3例,Ⅲ级(好)14例,Ⅳ级(优)27例;有效率91.1%;治愈率为60%;不良反应发生率为13.3%,复发率为9.5%。12个月时治愈率为86.7%,治疗持续时间为7.6±2.7个月。治疗B组:开始治疗的平均年龄为3.8月(1-9月),终止治疗的平均年龄为10.3月(3-18月)。6个月时44例患儿疗效评价为:Ⅰ级(差)2例,Ⅱ级(中)2例,Ⅲ级(好)8例,Ⅳ级(优)32例;有效率为90.9%;治愈率为72.7%;不良反应发生率为15.9%,复发率为11.9%。12个月治愈率为88.6%,治疗持续时间为6.2±1.9个月。6个月时两组有效率比较差异无统计学意义(P>0.05);治愈率比较差异有统计学意义(P<0.05)。不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。12个月时两组治愈率差异无统计学意义(P>0.05);治疗持续时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。停药3个月后两组复发率差异无统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1.普萘洛尔1 mg/kg/d或2 mg/kg/d的剂量治疗婴幼儿血管瘤疗效好,不良反应少,有效率、不良反应发生率及复发率差异均无统计学意义,均可以作为治疗剂量。
  2.普萘洛尔1 mg/kg/d和2 mg/kg/d的剂量治愈婴幼儿血管瘤时间上相比,1 mg/kg/d的剂量需要更长的治疗时间。
  3.普萘洛尔说明书中推荐儿童用药剂量为0.5-1.0 mg/kg/d。考虑到不明确的远期不良反应及超剂量、超说明书用药方面的问题,建议治疗剂量为1mg/kg/d,在效果欠佳的情况下可逐渐增加剂量至2mg/kg/d。
  4.展望:进一步观察不同剂量对身高、体重、神经系统发育等远期的影响;前瞻性多中心大样本随机对照研究,为普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的药物临床实验提供理论依据,为获得中国食品药品监督管理局(CFDA)的批准做出贡献。
  第二部分 口服普萘洛尔不同给药次数治疗婴幼儿血管瘤疗效对比
  目的:
  对比普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤不同给药次数对临床治疗效果的影响,为临床治疗提供安全方便有效的给药方法。
  方法:
  2016年10月到2017年2月间,诊断为婴幼儿血管瘤的患儿,并符合纳入标准。共收治患儿37例,采用随机对照的原则,根据口服普萘洛尔的给药次数分为两组,治疗1组(N=19):口服普萘洛尔剂量为2 mg/kg/d,2次/日;治疗2组(N=18):口服普萘洛尔剂量为2mg/kg/d,3次/日。治疗过程中记录不良反应发生情况;根据Achauer等提出的分级标准进行疗效评价,记录有效病例;根据治愈停药标准停药,并记录治愈病例。六个月时对两组有效率、治愈率及不良反应发生率进行比较。
  结果:
  37例婴幼儿血管瘤患儿在口服普萘洛尔后1周内,观察到瘤体张力下降,颜色变淡。治疗6个月时评价疗效。治疗1组19例患儿疗效评价:Ⅰ级(差)1例,Ⅱ级(中)0例,Ⅲ级(好)4例,Ⅳ级(优)14例,有效率94.7%,治愈率73.7%;发生无症状性心动过缓1例,腹泻1例,无低血压、低血糖、呕吐,四肢发凉,睡眠障碍等发生,不良反应发生率10.5%。治疗2组18例患儿疗效评价为:Ⅰ级(差)0例,Ⅱ级(中)0例,Ⅲ级(好)4例,Ⅳ级(优)13例,因不良反应改变治疗剂量1例,有效率94.4%,治愈率72.2%;发生口唇苍白及呕吐1例,腹泻1例,无其他不良反应发生,不良反应发生率11.1%。治疗有效率及治愈率差异无统计学意义(P>0.05)。两组间不良反应发生率均较低,其差异无统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1.口服2mg/kg/d普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤,一日三次给药与一日两次给药有效率、治愈率及不良反应发生率无明显差异,均安全、有效。
  2.目前普萘洛尔无针对婴幼儿剂型,且患者为婴幼儿,年龄小,服药困难,为减轻其服药痛苦,减轻患儿父母或者监护人护理负担,推荐用药次数为2次/日。
  3.展望:可进一步采取多中心大样本前瞻性研究,并增加药代动力学及药效学方面的指标,为用药次数的选择进一步提供理论依据。
  第二章 普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤作用机制的实验研究
  背景:
  血管瘤是婴幼儿最常见的血管良性肿瘤,约60%位于头颈部,大多位置表浅,严重地影响美观,给患儿及家属带来巨大的心理压力。根据Mulliken等提出的生物学分类法,通过病理学特点、生长方式及临床表现等将其分为血管瘤(hemangiomas)和血管畸形(vascular malformations)两大类。婴幼儿血管瘤的增殖和消退过程与血管内皮细胞的异常增殖、分化和成熟关系密切,所以对婴幼儿血管瘤发病机理及治疗的研究多数集中在血管发生和血管生成等因素中。
  缺氧诱导因子1α(Hypoxiainducible factor-1α)是细胞缺氧状态下分泌的重要细胞因子之一,是肿瘤生长过程中促进新生血管生成的始动因素,HIF-1α的高表达可以对包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号在内的多种下游靶基因进行调控,促进新生血管生成,缓解瘤体细胞供血不足,保证瘤体快速生长。
  目的:
  检测血管瘤组织及应用普萘洛尔后的瘤体组织和细胞中的HIF-1α的表达量,探讨HIF-1α过表达或敲除后对血管瘤内皮细胞的生物学行为影响,阐述普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的作用机制,为普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤提供理论依据。
  方法:
  该组实验纳入10例婴幼儿血管瘤患儿,收集其切除的新鲜组织,检测正常血管组织,婴幼儿血管瘤组织和普萘洛尔治疗后婴幼儿血管组织中HIF-1α表达量变化。同时以体外培养血管瘤内皮细胞HemECs为研究对象,采用CCK-8法、流式细胞仪、划痕实验和成管能力分别测定HIF-1α过表达、敲除HIF-1α及普萘洛尔对血管瘤内皮细胞增殖、凋亡、迁移和成管能力的影响;采用荧光定量PCR和western blot法测定HIF-1α的变化。
  结果:
  与正常血管组织相比,HIF-1α在婴幼儿血管瘤组织中的表达量上调,经由普萘洛尔处理后的婴幼儿血管瘤组织中的HIF-1α的表达量下调。HIF-1α在普萘洛尔处理过的血管瘤内皮细胞中的表达量呈现浓度和时间依赖性;血管瘤内皮细胞经过普萘洛尔处理后能够抑制由HIF-1α过表达诱导的细胞增殖;HIF-1α过表达能够降低或者阻止由普萘洛尔诱导的细胞凋亡;转染HIF-1α过表达载体能够显著促进细胞的迁移及成管能力,而转染HIF-1αsiRNA干扰则会降低细胞的迁移及成管能力。
  结论:
  1.普萘洛尔和HIF-1α对血管瘤内皮细胞的生物学功能即增殖、凋亡、迁移、成管产生影响,并且二者相互影响,对血管瘤内皮细胞具有相反作用。
  2.通过对HIF-1α的调节发挥治疗作用可能是普萘洛尔治疗血管瘤作用机制之一。
  3.需要大样本的随机对照研究进一步明确普萘洛尔作用机制。可进一步对细胞内部的信号接收、传导等进行相关研究。
[博士论文] 饶薇
临床医学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:皮肤血管肉瘤是一种高度恶性的软组织肿瘤,其中头面部血管肉瘤最为常见。该病较为罕见,目前的研究多为病例报道或小样本量的病例分析,有关该病的治疗方案与预后风险因素尚无定论。由于缺乏有效的治疗方式,头面部血管肉瘤预后极差,寻找有效的治疗方式十分必要。而mTOR信号通路在调控细胞生长、增殖与存活,促进血管生成等方面具有重要的作用,其异常调节对于肿瘤的发生发展至关重要,且mTOR抑制剂已被尝试用于治疗部分肿瘤。同时,动物实验及体外实验表明,mTOR信号通路在血管肉瘤中也存在异常表达,但有关该通路在头面部血管肉瘤中的研究十分缺乏。
  目的:
  1.回顾分析北京协和医院2010年至2016年诊断的头面部血管肉瘤患者,总结其临床特征及治疗方案,初步分析可能影响预后的风险因素。
  2.探索mTOR信号通路相关分子在头面部血管肉瘤中的表达情况,为可能的靶向治疗提供新的证据。
  方法:
  1.检索北京协和医院2010年1月1日至2016年12月31日病理确诊为头面部血管肉瘤的患者,调阅患者的病案资料并进行电话随访,整理患者的临床特点和治疗情况,并进行生存分析,找出可能的预后影响因素。
  2.选择p-AKT at Ser473、p-AKT at Thr308、p-mTOR at Ser2448及p-p70S6K1atThr421/Ser424这4个靶分子进行免疫组化染色,同时分析这些分子对头面部血管肉瘤预后的影响。
  结果:
  1.我院2010年1月1日至2016年12月31日病理确诊为头面部血管肉瘤的患者共计23例,其中2例中途失访,8例死亡,6例无随访数据,中位随访时间为13个月。
  2.23例头面部血管肉瘤患者平均年龄为68.3岁,皮损多分布于额、项、颞以及眶周、颊部。
  3.我院头面部血管肉瘤患者的中位生存时间为26月,1年及3年累积生存率分别为73.5%(95%置信区间:51.0%-96.4%)和21.8%(95%置信区间:0%-57.7%)。
  4.通过单因素分析,我们发现年龄<70岁的患者中位生存时间为33.0月,而年龄≥70岁的患者则仅为8.0月(P=0.001)。此外,肿瘤>5cm的患者中位生存时间为13.0月,肿瘤≤5cm的患者则为33.0月(P=0.02)。
  5.头面部血管肉瘤中p-AKT at Ser473、p-AKT at Thr308、p-mTOR at Ser2448及p-p70S6K1at Thr421/Ser424的阳性率分别为13.0%、78.3%、47.8%及21.7%。
  6.AKT、mTOR及S6K1的磷酸化水平与头面部血管肉瘤的总生存期无显著相关性。
  结论:
  头面部血管肉瘤好发于老年人,皮损多分布于额、顶、颞以及眶周、颊部。该病预后极差,年龄≥70岁、肿瘤>5cm为可能的不良预后因素。此外,头面部血管肉瘤中存在AKT/mTORC1信号通路的异常调节,部分患者中尚存在mTORC2的异常激活,使用该通路的抑制剂治疗头面部血管肉瘤或许可以作为未来的研究方向。然而,p70S6K1在该病中的异常表达并不显著,S6K的其他亚型或mTOR下游的其他信号分子可能在头面部血管肉瘤中具有更重要的地位。
[博士论文] 刘筱雯
外科学(整形) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分:基于转录组芯片的婴幼儿血管瘤组织中长链非编码RNAs(lncRNAs)表达谱分析
  婴幼儿血管瘤是婴幼儿时期最常见的良性血管性肿瘤,婴幼儿血管瘤的发病率约为3%~10%。临床上婴幼儿血管瘤表现:增生期以出生后一年以内快速增生为特征,消退期以一年以后自发消退为特征,3~5年后可进入消退完成期。增生期婴幼儿血管瘤是以不成熟内皮细胞的异常增殖为特征,而消退期婴幼儿血管瘤的内皮细胞逐渐成熟,血管团块逐渐形成管腔结构,消退完成期婴幼儿血管瘤瘤体的血管结构逐渐由脂肪组织和纤维结缔组织所取代。在增生期婴幼儿血管瘤中,血管瘤内皮细胞成类圆形,细胞核较大,消退期血管瘤中,血管瘤内皮细胞变细长,逐渐成熟。
  婴幼儿血管瘤由血管瘤干细胞,血管瘤内皮细胞,周细胞,肥大细胞等构成。婴幼儿血管瘤各种细胞组分的成功分离,揭示了血管瘤干细胞的存在。移植血管瘤干细胞于裸鼠体内可以模拟婴幼儿血管瘤的典型三期临床表现,这为研究婴幼儿血管瘤的发病机制提供新的依据,暗示婴幼儿血管瘤可能来源于血管瘤干细胞,婴幼儿血管瘤的增生与消退有可能是与血管瘤干细胞的增殖与消退有关。婴幼儿血管瘤发病机制假说有,胎盘内皮细胞栓塞假说,血管生成或者血管形成能力增加学说,组织缺氧学说。婴幼儿血管瘤中重要的信号通路机制包括,VEGF/VEGFR通路,Notch通路,β肾上腺素受体通路,HIF-α信号通路,PI3K/Akt/mTOR信号通路,PDGFB/PDGFR-β信号通路。
  虽然关于婴幼儿血管瘤的发病机制存在多种假说,目前婴幼儿血管瘤发病机制不清,血管内皮细胞异常增殖为特征的病理性血管生成是婴幼儿血管瘤的重要病理机制。而血管生成不足通常出现在缺血性疾病如心梗、中风等相关性疾病,而过度血管生成常在肿瘤增殖、炎症反应和视网膜病变等生理过程中起负面作用。故探究婴幼儿血管瘤血管生成的相关机制,亦有利于揭示病理性血管生成相关性疾病的发病机制。
  长链非编码RNAs(lncRNAs)是一类长度>200碱基的几乎不编码蛋白的RNA。LncRNAs参与大量生命活动过程,如染色体印记,表观遗传学调控,细胞周期调控,细胞凋亡调控,多能干细胞的调控等。LncRNAs在肿瘤、心血管、神经发育等病理生理活动中起重要调控作用。在血管生成方面,lncRNAs在生理性血管生成及病理性血管生成中起重要调控作用,例如在血管内皮细胞中,抑制lncRNAMALAT1促进细胞迁移同时抑制细胞增殖能力;在糖尿病相关肾脏微循环障碍,敲减LncRNA RNCR3可减轻肾脏血管功能障碍;糖尿病视网膜病变中,敲减lncRNAMIAT明显减轻糖尿病诱发的微循环障碍症状。故lncRNAs有可能在病理性新生血管生成中起到重要调控作用。
  目前lncRNA在婴幼儿血管瘤方面的表达情况及作用机制尚不清楚,本研究拟在现有工作基础上,对目标长链非编码RNA在婴幼儿血管瘤发病机制之一的病理性血管生成作用方面,进行效应及机制的深入研究,可进一步完善lncRNA在婴幼儿血管瘤发生中的作用机理,也有可能为病理性血管生成相关性疾病的研究提供有力依据。
  研究目的:本章节拟利用lncRNA芯片技术进行婴幼儿血管瘤组织中lncRNA表达谱分析,通过生物信息学分析差异表达的LncRNA,筛选出与血管生成相关的lncRNA,采用QPCR验证其在婴幼儿血管瘤瘤体中的表达量,并初步探讨其功能,为婴幼儿血管瘤的病理机制的研究提供新的突破点。
  研究方法:收集2013年6月份到2016年6月份山东省立医院烧伤整形外科就诊的增生期婴幼儿血管瘤及瘤体旁组织的标本,存放于液氮中。采用Trizol一步法提取RNA,应用基因芯片技术进行婴幼儿血管瘤瘤体对比瘤体旁正常组织进行lncRNA及mRNA表达谱分析。芯片数据进行差异表达基因的生物信息学分析,并结合文献,选择目的分子。采用荧光定量PCR检测目标lncRNA表达量,验证目标lncRNA是否差异性表达,并判断差异表达倍率是否与芯片分析结果一致。
  结果:增生期婴幼血管瘤lncRNA+mRNA表达谱芯片分析数据经过标准化分析处理,选择变化倍率超过2倍,p<0.05,为差异表达lncRNA和mRNA。相对于增生期婴幼儿血管瘤体旁正常组织,婴幼儿血管瘤瘤体,有1259个lncRNA高表达,857个lncRNA低表达,另外有1469个mRNA高表达,1184个mRNA低表达。这些数据资料已上传GEO数据库(GSE78811)。
  采用KOBAS2.0系统分析差异表达mRNA,其中排名前30的GO条目包括大血管发育,血管调节,血管发生,细胞迁移,内皮细胞发育,心血管系统发育,血管生成和组织迁移。排名前30的通路信息条目包括“一氧化氮激活鸟苷酸环化酶”,“表皮生长因子受体(EGFR)与磷脂酶C-gamma的相互联系”,“血管内皮生长因子信号通路(VEGF)”,“血管平滑肌收缩”,“神经生长因子信号通路(NGF)”,“非整合膜蛋白-细胞外基质和Rho GTPase环路相互作用”。共表达网络关联分析图展示MEG3,MEG8,FENDRR和Linc00152与之相关mRNA的关系,提示一个lncRNA有可能与几个到数十个mRNAs相关联。
  根据文献及生物信息学分析,选择目标靶分子进行QPCR分析,其中文献推荐的分子有MALAT1,MEG3,MEG8,FENDRR,Linc00152,根据生物信息学分析选定的分子有p29066,p33867,p44557_v4和p8683,选定的mRNA分子为FOXF1,EGFL7。采用QPCR法在大样本中验证芯片结果;其中9个lncRNAs(MALAT1,MEG3,MEG8,p29066,p33867,FENDRR,linc00152,p44557_v4,and p8683)和2个mRNAs(FOXF1,EGFL7)经过QPCR验证,与芯片结果一致。
  结论及意义:
  1.首次进行增生期婴幼儿血管瘤瘤体对比瘤体旁正常组织的lncRNA的表达谱芯片分析,结果为有1259个lncRNA高表达,857个lncRNA低表达,另外有1469个mRNA高表达,1184个mRNA低表达,提示lncRNA和mRNA分子在婴幼儿血管瘤中存在显著差异性表达。
  2.生物信息学分析显示,排名前30的GO条目包括大血管发育,血管调节,血管发生,细胞迁移,内皮细胞发育,心血管系统发育,血管生成和组织迁移,共表达网络关联图展示MEG3,MEG8,FENDRR和Linc00152与之相关mRNA的关系,提示差异表达的lncRNA可能与婴幼儿血管瘤中血管生成机制存在相关性。
  3.差异表达的lncRNA中,我们选取文献推荐的分子MALAT1,MEG3,MEG8,FENDRR,linc00152,根据生物信息学分析选定的分子p29066,p33867,p44557_v4和p8683,选定的mRNA分子为FOXF1,EGFL7为目标分子,进行QPCR分析,结果与芯片结果相一致。提示差异表达的lncRNA可能与婴幼儿血管瘤的疾病发展存在相关性。
  第二部分:MALAT1在婴幼儿血管瘤组织的表达及功能研究
  研究目的:我们前期工作发现婴幼儿血管瘤瘤体lncRNA存在显著差异表达,其中明星分子MALAT1表达上调明显。在新生血管生成中,lncRNA MIAT及MALAT1在糖尿病视网膜病变中促进新生血管生成。而婴幼儿血管瘤以病理性血管生成为特征。本试验目的在于探究婴幼儿血管瘤中过表达的MALAT1是否对血管生成过程有调控作用。
  研究方法:首先扩大样本量,采用QPCR法探究MALAT1在婴幼儿血管瘤瘤体中的表达量。再次采用shRNA慢病毒感染脐静脉内皮细胞,采用MTT法探究MALAT1在细胞增殖方面的作用,采用流式细胞仪法检测MALAT1在细胞周期调控方面的作用,检测细胞凋亡情况,采用血管生成实验检测MALAT1对血管生成的调控作用。
  结果:扩大样本量后,MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中依然存在高表达;shRNA病毒感染法敲减MALAT1,敲减组MALAT1表达量约为对照组的41%,MTT实验提示敲减MALAT1显著抑制细胞增殖,流式细胞仪检测提示敲减MALATI显著引起S期延长,凋亡检测提示敲减MALAT1诱导凋亡,血管生成实验提示敲减MALAT1抑制体外血管生成。
  结论及意义:MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中存在高表达,敲减MALAT1显著抑制脐静脉内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制体外血管生成。故过表达的MALAT1有可能在婴幼儿血管瘤增生期的快速增殖和快速血管生成中起重要作用。
  第三部分:FENDRR及FOXF1在婴幼儿血管瘤组织中的表达及其机制研究
  研究目的:前期工作发现血管瘤瘤体lncRNA存在显著差异表达,其中FENDRR及其邻近转录因子FOXF1表达上调明显,FENDRR为表达上调倍率最高的lncRNA分子。FENDRR在胚胎时期的大血管心脏及体壁的发育中起重要调节作用,在血管内皮细胞的研究中发现FOXF1促进体外血管生成,同时FOXF1促进胚胎时期大血管发育。婴幼儿血管瘤以血管生成活动过度为特征,而FENDRR和FOXF1在婴幼儿血管瘤中虽表达增高,但其作用及机制尚不清楚。故该课题旨在探究FENDRR在婴幼儿血管瘤中的作用,及FOXF1与FENDRR之间的调控机制研究。
  研究方法:本课题拟扩大样本量采用QPCR法验证FENDRR与FOXF1表达量;采用shRNA构建慢病毒转染细胞后构建FENDRR敲减细胞株,采用MTT法、流式细胞仪检测法、血管生成实验探究FENDRR的细胞学功能;采用荧光素酶报告基因法探究FOXF1是否调控FENDRR的表达;于HUVEC中转染慢病毒敲减FENDRR,后采用QPCR法检测FOXF1表达量;于HUVEC中转染过表达FOXF1慢病毒,后采用QPCR法检测FENDRR表达量;采用表达谱芯片法探究FENDRR调控血管生成间接机制,选择目标蛋白,采用蛋白质印迹法验证芯片结果。
  结果:
  1.QPCR实验证实,lncRNA FENDRR及转录因子FOXF1在增生期婴幼儿血管瘤组织中的相对于瘤体旁正常组织存在显著高表达,且FENDRR的表达量与FOXF1的表达量之间存在正相关。
  2.体外功能学实验发现,于脐静脉内皮细胞中敲减FENDRR后,可显著抑制脐静脉内皮细胞增殖,诱导细胞凋亡,细胞周期检测发现敲减FENDRR可引起G2/M期阻滞,体外血管生成实验发现,敲减FENDRR可显著抑制血管生成现象。
  3.为探究转录因子FOXF1是否可以转录激活LncRNA FENDRR,采用荧光素酶报告基因实验,证实FOXF1可转录激活FENDRR;另外,在脐静脉内皮细胞中过表达FOXFI,FENDRR的表达量显著升高;在脐静脉内皮细胞中敲减FENDRR后,QPCR法检测FOXF1表达量显著下降。提示转录因子FOXF1与FENDRR之间可能存在负反馈调节机制。
  4.为探究lncRNA FENDRR的下游调节机制,采用基因表达谱芯片分析,结果为在脐静脉内皮细胞中敲减FENDRR后,相对于对照组,敲减FENDRR组上调基因364,下调基因207个(表达量变化大于1.5倍,且P值要小于0.05),IPA分析提示,EIF2信号通路被显著抑制,AMPK信号通路被显著激活,鉴于功能学实验提示敲减FENDRR抑制细胞增殖和血管生成,并可引起细胞周期的G2/M期阻滞,我们选取相关调节基因,如PLK1,KIAA0101和CCND2,采用Western Blot法验证其表达量,提示敲减FENDRR可抑制PLK1,KIAA0101和CCND2表达量。
  结论及意义:
  1.增生期婴幼儿血管瘤中,转录因子FOXF1及lncRNA FENDRR显著高表达,且FENDRR与FOXF1的表达量存在正相关。
  2.FOXF1激活的过表达FENDRR,有可能通过激活PLK1,KIAA0101和CCND2表达,起到促进细胞增殖,促进血管生成的效果。
  3.探究FENDRR与新生血管生成相关机制有可能揭开LncRNA在婴幼儿血管瘤发病中的作用,为新生血管生成性疾病的靶向治疗提供靶点。
  第四部分结论及创新点
  结论
  1.婴幼儿血管瘤lncRNA表达谱分析发现约1259个lncRNA分子上调,857个lncRNA分子下调,另外有1469个mRNA高表达,1184个mRNA低表达。其中经验证9个lncRNA和2个mRNA经过QPCR验证表达存在明显差异,且差异变化规律与芯片结果一致。
  2.LncRNA MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中显著高表达。功能学实验中,敲减MALAT1可显著抑制细胞增殖,抑制血管生成,诱导S期阻滞。
  3.LncRNA FENDRR在增生期婴幼儿血管瘤中高表达。功能学实验中,下调FENDRR可抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,诱导G2/M期阻滞,同时抑制血管生成。
  4.机制研究发现FOXF1可转录激活FENDRR,抑制FENDRR可通过下调PLK1,KIAA0101和CCND2的表达来产生抑制血管生成、抑制增殖、诱导凋亡、引起G2/M阻滞的效应。
  创新性:
  1.首次在婴幼儿血管瘤中采用表达谱芯片法研究长链非编码RNA的差异表达,并应用生物信息学分析结合文献选定目标分子,为深入研究lncRNA在婴幼儿血管瘤的功能及其机制提供依据。LncRNAs在病理性血管生成及生理性血管生成中均起到重要的调控作用,而婴幼儿血管瘤的病理特征为病理性血管生成,故从婴幼儿血管瘤组织中筛选出差异表达的lncRNA分子,并探究其在病理性血管生方面的作用及其机制,有可能为其他病理性血管生成性疾病的研究提供有力依据。
  2.首次发现MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中高表达,MALAT1促进内皮细胞增殖,促进血管生成。提示MALAT1具有促进细胞增殖和血管生成的作用,MALAT1在婴幼儿血管瘤中有可能起到促进血管瘤内皮细胞增殖和血管生成的作用,MALAT1有可能成为治疗血管过度生成性疾病的新靶点,这为血管生成性疾病的机制研究及治疗提供依据。
  3.首次发现转录因子FOXF1诱导的过表达FENDRR通过PLK1,KIAA0101,CCND2促进内皮细胞增殖,促进血管生成。提示FENDRR具有促进细胞增殖和促进血管生成的作用,FENDRR有可能参与婴幼儿血管瘤的发病机制,并且FENDRR有可能成为治疗血管生成相关性疾病的新靶点。本研究深入探讨并明确目标lncRNA FENDRR及通路中相关分子对血管瘤的调控作用,不但可以完善血管瘤的发病机制,填补相关领域的空白,而且可以从分子生物学角度为婴幼儿血管瘤的疾病干预提供理论依据。进而为其它相关疾病如肿瘤、糖尿病等领域的血管生成干预提供重要参考。
[硕士论文] 王逸飞
口腔医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  婴幼儿血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是婴幼儿最常见的先天性良性肿瘤,约60%发生于口腔颌面部。IH多在出生后数天内出现,一般在4周及4-5个月的时候快速生长;1岁以后进入自然消退期,可持续3-8年甚至更长时间,多数为不完全消退。IH的发病机制目前尚不完全清楚,其中血管瘤内皮细胞(Hemangioma Endothelial cells,HemECs)作为IH的最主要细胞成分,直接决定着其各种生物学特性,是现阶段相关研究的主要研究对象。HemECs可分泌血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factors,VEGF),作用于自身或周围同类细胞的相关受体,激活其下游通路,促进血管生成,进而导致IH的增殖。目前国际上主张对IH进行早期积极干预以减少并发症,但现阶段关于IH的多种治疗方法均存在或多或少的缺陷。因此,进一步揭示IH的发病机制,探索更加安全有效的治疗方法仍十分必要。
  体液免疫系统在机体对抗肿瘤发生发展中发挥重要作用,肿瘤抗原可刺激机体产生抗肿瘤抗体,即免疫球蛋白,可激活补体系统,形成以C5b-9为主要成分的补体膜攻击复合体,通过补体依赖的细胞毒作用,杀伤肿瘤细胞。儿童免疫学的研究表明,婴幼儿抗体补体系统的发育与成熟和IH的增殖消退存在时间相关性。另有研究表明,以IgG为主要成分,麦芽糖为主要辅料的临床常用药静脉注射用人免疫球蛋白(Intravenous Immunoglobulin,IVIg)可通过多种途径抑制血管内皮细胞VEGF表达及作用,对正常内皮细胞如人脐静脉内皮细胞的增殖有抑制作用。
  现阶段未见关于体液免疫系统与IH关系的基础实验研究,免疫球蛋白是否与IH的发病及病程进展有关需要一步探究。因此,本研究通过组织切片染色检体外细胞培养和药物干预实验等方法,从免疫学角度对IH的发病机制进行初步探究,为免疫球蛋白在IH的临床治疗中的应用提供初步的理论基础。
  目的:
  1.检测抗体和补体膜攻击复合体(Membrane Attack Complex,MAC)在不同时期IH中的表达分布情况;
  2.通过体外药物干预实验,检测IVIg对HemECs的增殖及分泌VEGF情况的影响;
  3.探讨抗体补体系统与IH发生发展的关系,为免疫球蛋白在IH的临床治疗中的应用提供初步的理论基础。
  方法:
  1.选取2010-2016年于山东大学齐鲁医院口腔科或小儿外科手术切除的不同时期IH标本,制备组织切片,以Glut-1免疫组织化学染色明确诊断;HE染色观察不同时期IH中免疫细胞的类型及分布;免疫荧光染色检测不同时期IH中IgG和C5b-9的共沉积情况。
  2.选取手术切除的新鲜增殖期IH标本,以组织块贴壁法分离培养HemECs;通过CD31+免疫磁珠进行细胞纯化,免疫细胞化学检测纯化前后细胞表达CD31和vWF的情况,流式细胞术进行细胞纯度鉴定。
  3.配置浓度为0、5、10、15、20、25mg/mL的IVIg和浓度为25mg/mL麦芽糖溶液(作为对照组),进行药物干预,通过CCK-8法检测24h、48h后HemECs的增殖情况;ELISA检测24h、48h后HemECs分泌的VEGF的变化。
  结果:
  1.增殖早期IgG和C5b-9表达均不明显;增殖晚期瘤体内血管内皮可见IgG沉积,C5b-9不明显;消退期瘤体内可见IgG和C5b-9强阳性共沉积,局部可见IgG-C5b-9共沉积带。
  2.组织块贴壁法培养HemECs,组织块种植第3天可见细胞爬出,原代细胞呈多角形或长梭形。CD31+免疫磁珠法成功分离纯化HemECs,CD31和vWF阳性表达,细胞纯度达99%以上。
  3.CCK-8实验发现IVIg浓度大于等于10mg/mL时,实验组OD值显著降低;ELISA发现IVIg浓度为5mg/mL时,HemECs分泌VEGF的量增多,当药物浓度大于等于10mg/mL时,随药物浓度增加,VEGF的量降低。
  结论:
  1.IgG和C5b-9的沉积与IH的消退存在相关性。
  2.一定浓度的IVIg在体外可显著抑制HemECs的增殖,这可能与IVIg抑制HemECs分泌VEGF有关。
  3.抗体补体系统在IH的病变发展中存在一定作用,IVIg在IH的治疗中具有一定的临床应用价值。
[博士论文] 和晓坡
口腔医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景
  血管瘤(hemangiomas)是发生在婴幼儿的血管源性良性肿瘤,发病率高达10~12%,绝大多数在出生时或出生后不久发现,大部分可自行消退,但仍有20%的血管瘤不能消退。根据病变发展过程可分为增殖期、消退期和消退完成期。血管瘤虽然属于良性肿瘤,但发生在口腔颌面及颈部的病变,不仅严重影响面容美观,还可能由于病变阻塞呼吸道、消化道而影响发音、进食,甚至导致局部出血、窒息并危及生命。因此目前主张对该病应积极进行早期治疗。血管瘤常用的治疗方法有药物治疗、激光、手术切除、冷冻以及硬化治疗等。冷冻、激光及硬化治疗易导致增生或萎缩性瘢痕、色素沉着或色素减退等,手术切除仅适用于局限性的血管瘤的治疗。药物治疗则是一种治疗早期血管瘤安全、有效的方法。治疗血管瘤的药物有多种,目前国内外常用药物包括以下几类:1.β-肾上腺素受体阻滞剂,以普萘洛尔(propranolol)为主;2.皮质类固醇激素,以泼尼松(prednisolone)为主;3.其它:α-干扰素(IFN-α)、咪喹莫特(Imiquimod)、抗肿瘤药环磷酰胺(CTX)及长春新碱(VCR)等。2008年,在《新英格兰医学杂志》上,Leaute-LabrezeC等首次报道口服普萘洛尔引起了鼻咽部血管瘤的消退。近年来,口服普萘洛尔逐渐成为治疗血管瘤的一线药物。
  2012年,Swetman等首次报道口服西地那非(sildenafil)治疗3名淋巴管畸形患儿后病变显著消退,发表于《新英格兰医学杂志》上,提示西地那非可作为治疗淋巴管畸形的一种新型药物。但该文章仅展示了患儿病变部位的照片和核磁共振平片(magnetic resonance imaging,MRI),病变均未经手术及病理证实为淋巴管畸形。根据MRI表现,我们认为此患儿更符合血管瘤伴发淋巴管畸形的诊断,且病变以血管瘤为主。西地那非是一种磷酸二酯酶-5(phosphodiesteraseisoform-5,PDE-5)抑制剂,因而我们推测可能西地那非是通过抑制PDE-5的作用使该病变缩小的。在此启发下,我们通过免疫组织化学的方法研究了PDE-5在静脉畸形、动静脉畸形、淋巴管畸形、血管瘤组织中的表达。结果表明PDE-5在血管瘤组织中呈阳性表达,在其它脉管畸形组织中无表达。因此,我们认为西地那非是对血管瘤而不是淋巴管畸形起作用。目前很多文献证实西地那非可增强某些类型的恶性肿瘤化疗效果并对血管平滑肌、肺动脉内皮细胞等有抗增殖及促进凋亡的作用。因此,我们通过体外实验进一步研究西地那非对血管瘤内皮细胞(HemECs)增殖及凋亡的影响,并对其相关机制进行探讨。
  目的
  1.检测PDE-5在血管瘤及各种脉管畸形组织中的表达。
  2.研究西地那非对人源性HemECs的增殖和凋亡的影响。
  3.研究西地那非对HemECs的增殖和凋亡作用与DNA分化抑制因子-1(Id-1)表达的关系,探讨该药的作用机制。
  方法
  1.收集山东大学齐鲁医院病理科2000-2013年血管瘤及脉管畸形组织块,通过免疫组织化学的方法分别检测石蜡包埋的10例淋巴管畸形、8例增殖期血管瘤、
  2例消退期血管瘤、10例静脉畸形以及10例动静脉畸形组织块中PDE-5的表达。血管瘤及脉管畸形的诊断是依据患者病史、体格检查、MRI表现以及最后的病理结果确定的。淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)、细胞膜表面分化抗原34(CD34)和葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)分别作为淋巴管内皮细胞、血管内皮细胞和血管瘤组织的特异性标记物。随后对PDE-5在血管瘤及各种脉管畸形组织的表达进行了检测。本研究通过了山东大学齐鲁医院医院伦理委员会授权,所有患者或监护人均知情同意。
  2.收集山东大学齐鲁医院手术切除并经病理证实为血管瘤组织标本,利用组织块贴壁培养法分离并培养HemECs。通过免疫细胞化学法检测第八因子相关抗原因子vWF、CD34和PDE-5在HemECs中的表达。体外以梯度浓度西地那非(0μM,1μM,3μM,5μM,10μM和15μM)处理HemECs24 h、48 h和72 h后,MTT法检测细胞的增殖能力。以梯度浓度的西地那非(0,1,5,10,15μM)处理HemECs,20分钟后分别加入50 ng/ml bFGF、50 ng/ml VEGF。继续孵箱培育24 h。MTT法检测西地那非对bFGF及VEGF诱导的HemECs增殖的影响。HemECs分别经对照组(0μM)、5μM西地那非处理24 h后,采用流式细胞Annexin-V/PI staining assay检测细胞凋亡率。
  3.组织块培养法获得的HemECs分别经OμM(对照组)、5μM(实验组)西地那非处理24 h后,用TRI法提取细胞总RNA并逆转录成Id-1 cDNA,再通过实时荧光定量RFQ-PCR扩增cDNA,利用比较Ct值法(2ˉ△△Ct)计算Id-1基因和内参照基因阈值循环数差异,检测两组HemECs中Id-1基因的相对mRNA表达量。HemECs分别经0μM(对照组)、5μM(实验组)西地那非处理24 h后,提取细胞总蛋白,通过免疫印迹法(western blot)检测两组HemECs中Id-1蛋白的表达水平,人舌鳞癌TCA8113细胞系作为Id-1蛋白表达的阳性对照。
  结果
  1.免疫组织化学检测发现CD34、LYVE-I和GLUT-1分别作为血管内皮细胞、淋巴管畸形组织和血管瘤组织的特异性标记物表达均阳性。PDE-5表达在血管瘤组织HemECs胞浆内,但在淋巴管畸形、动静脉畸形、静脉畸形组织中均无表达。
  2.MTT法检测发现在西地那非浓度为5μM时,24 h后与对照组(0μM)相比开始出现显著差异(t=3.220,P<0.01),出现明显的细胞抑制现象,且随时间延长抑制作用逐渐加强。西地那非作用于HemECs72 h时细胞的增殖活性与48 h相比无明显差异(P>0.05)。在检测西地那非对bFGF及VEGF诱导的HemECs增殖的抑制作用时,西地那非浓度为5μM时,对bFGF及VEGF诱导的HemECs增殖也出现明显的细胞抑制现象(P<0.05),且随时间延长抑制作用逐渐加强。然而,当西地那非浓度为15μM时,与浓度为10μM相比对HemECs的增殖抑制作用无明显差别(P>0.05)。因此,浓度为5μM和作用时间为24 h分别是西地那非抑制HemECs的最适有效浓度和最适有效作用时间。用5μM西地那非处理HemECs24 h后,在光学显微镜下可见到HemECs随着细胞间连接的破坏和胞浆内不断增加的颗粒,细胞形态发生了改变。流式细胞学分析结果表明5μM西地那非处理HemECs24 h后凋亡率为10.5%,高于对照组(2.53%)。因此,体外实验中浓度5μM的西地那非处理24 h后显著抑制了HemECs的增殖并促进了其凋亡。
  3.通过实时荧光定量RFQ-PCR方法,根据2-△△ct公式,用5μM西地那非处理HemECs24 h后,细胞内Id-1的mRNA相对表达量减少了44.2%,(t=9.749,df=4,P=0.0006<0.01)。根据Western blot实验取得的免疫印迹条带的灰度值比较分析,用5μM西地那非处理HemECs24 h后,细胞内Id-1的蛋白表达也降低。
  结论
  1.血管瘤组织中存在磷酸二酯酶-5。
  2.西地那非在体外能抑制HemECs增殖和促进其凋亡。
  3.西地那非抑制HemECs增殖和促进其凋亡作用可能是通过下调Id-1基因来实现的。
[硕士论文] 罗薇
口腔医学 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:应用地塞米松联合低剂量普萘洛尔与单纯低剂量普萘洛尔治疗婴幼儿面颈部血管瘤进行对比研究,分析其疗效及安全性,同时检测其对血清中血管内皮生长因子(VEGF)的影响。
  方法:选择2015年2月-2016年11月就诊于遵义医学院附属口腔医院及遵义医学院附属医院小儿外科的32例婴幼儿面颈部血管瘤患儿,年龄在1月~1岁,其中男性15例,女性17例。用药前行血常规、电解质、肝肾功、血糖、凝血功、心脏彩超等检查,常规化验检查无异常者,根据纳入标准采用双色球法随机分为试验组及对照组。每组各16例。试验组采用静滴低剂量地塞米松联合口服普萘洛尔进行治疗,地塞米松用法为静脉滴注,剂量为0.3 mg/kg/d,每日1次,共3日;普萘洛尔用法为口服,剂量为2.0 mg/kg/d,1次/日顿服,疗程为6个月;对照组采用单纯口服普萘洛尔组,剂量为2.0 mg/kg/d,1次/日顿服,疗程6个月。对用药前、用药后6月患儿病变治疗有效率及肝功能、心率指标进行分析,同时检测血清中VEGF水平,分析对血清中VEGF的影响。
  结果:试验组总体有效率为93.75%,对照组总体有效率为81.25%,两组间具有显著差异(P<0.05);治疗后1周,试验组血清VEGF水平下降较对照组大(P<0.05);治疗后6月,两组血清中VEGF水平对比无差异(P>0.05);治疗前后监测患儿肝功能,两组对比无差异(P>0.05);第1日用药前后心率比较,对照组心率有所降低,差异有统计学意义(P<0.05),第2日用药2h时,患儿心率变化无差异(P>0.05)。试验组于用药前后心率对比无差异(P>0.05)。
  结论:低剂量糖皮质激素联合低剂量普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤,疗效优于单纯使用低剂量普萘洛尔的治疗。其安全性与单纯低剂量普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤无差别。
[硕士论文] 任彤
外科学(神经外科) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分动脉瘤性蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血影响因素META分析
  目的:
  目前关于动脉瘤性蛛网膜下腔出血后发生迟发性脑缺血(DCI)的影响因素的报道尚不统一,尤其是关于手术和介入治疗对DCI的不同的影响结果的报道仍有分歧。因此本课题通过Meta分析,探讨动脉瘤性蛛网膜下腔出血后发生迟发性脑缺血的影响因素及其相关危险度,为动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)患者预防DCI提供理论依据。
  方法:
  搜集PubMed上近10年关于动脉瘤性蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血影响因素相关的文献,利用Revman5.2软件对纳入文献相关指标畸形META分析,计算每个影响因素的优势比(OR值)及95%置信区间。
  结果
  此次研究共纳入13篇相关文献,共5084名患者,其中发生DCI的患者为1338人,DCI总发生率为26.3%。Meta分析结果还提示各因素合并OR值及95%置信区间分别:性别0.87(0.68-1.12)、高血压(Hypertension)病史1.26(0.76-2.09)、吸烟史1.28(0.92-1.77)、入院时临床分级(Clinical Grade)0.35(0.27-0.46)、Fisher分级0.38(0.22-0.65)、治疗方式0.70(0.60-0.81)、动脉瘤位置1.23(0.88-1.71)。
  结论:
  入院时临床分级、Fisher分级及动脉瘤的治疗方式是影响动脉瘤性蛛网膜下腔出血后发生迟发性脑缺血的影响因素,而性别、高血压病史、吸烟史、动脉瘤位置未显示出有明显相关性。
  第二部分破裂动脉瘤术后迟发性脑缺血的影响因素分析(单中心)
  目的:
  分析本院破裂动脉瘤术后出现迟发性脑缺血的发生率、影响因素和相关临床特点,更深入的研究迟发性脑缺血的影响因素,以期为改善蛛网膜下腔出血患者的预后提供进一步的理论依据。
  方法:
  回顾性分析我院自2013年1月至2016年6月入院的动脉瘤破裂后蛛网膜下腔出血2周内行手术治疗的患者临床资料,分析迟发性脑缺血的影响因素及发病特点。
  结果:
  破裂动脉术后迟发性脑缺血发生率为10.7%,经多元回归分析提示治疗方式(开颅夹闭或介入栓塞)(OR=6.645,P<0.05)和Fisher分级(OR=5.325,P<0.05)是影响破裂动脉瘤患者出现迟发性脑缺血的危险因素。在Fisher分级Ⅰ-Ⅱ级的病人中,栓塞组病人和夹闭组病人DCI的发生率均很低,分别为2.4%和4.8%。在Fisher分级Ⅲ-Ⅳ级时栓塞组病人和夹闭组病人DCI发病率分别为3.4%和27.7%,且两者有统计学差异(P<0.05)。迟发性脑缺血的部位可以在手术同侧,也可以在手术对侧。DSA造影显示,血管痉挛较严重的一侧,均发生在SAH较重的一侧。
  结论:
  治疗方式和Fisher分级均是破裂动脉瘤术后DCI的危险因素,即只有在Fisher分级≥3级的患者行夹闭手术时对DCI发生具有高度危险性,而且脑缺血的部位与蛛网膜下腔出血波及的范围相关,且出血较多的部位,发生血管痉挛更为严重。
[硕士论文] 张源方
外科学(血管瘤外科) 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨卡波西样血管内皮瘤(KHE)伴卡梅现象(KMP)患儿糖皮质激素受体(GRa、GRβ)的表达与激素敏感性的关系。
  方法:
  收集自2013年5月年-2016年5月来我院治疗的卡波西样血管内皮瘤伴卡梅现象的患儿25例,男性9例,女性16例,平均年龄为(2.4±1.5)月。所有通过入选标准的患儿均进行为期1周的激素治疗,根据疗效评判标准,分为敏感组和抵抗组。待患儿的血小板得到提升,凝血功能得到改善,对于手术和麻醉的耐受力得到提高,并完善其他的术前准备,行手术治疗,以外科手术切除的15例多余的健康组织作为对照组,对其手术切除组织进行免疫组化SP法检测,比较分析敏感组、抵抗组、对照组糖皮质激素受体(GRa、GRβ)阳性表达的数量、强度和分布特点。
  结果:
  1. GRa的表达强度在三组中的无统计学意义。GRa阳性细胞数量在敏感组中高于抵抗组(P<0.05)。
  2. GRβ的表达强度在抵抗组中显著高于敏感组、对照组(P<0.01);GRβ阳性细胞数量在敏感组、对照组、抵抗组中呈逐渐上升趋势,且有明显显著性意义(P<0.01)。
  3. GRa/GRβ表达强度的比值在抵抗组中显著低于敏感组、对照组(P<0.01);GRa/GRβ阳性细胞数量的比值在敏感组、对照组、抵抗组中呈逐渐下降趋势,且有明显显著性意义(P<0.01)。
  结论:
  1. KHE伴KMP患儿瘤体组织中GRa、GRβ的表达与GC敏感性密切相关。
  2. GC的敏感性可能与GRa有一定的关系,但相对GRβ来说不起主导作用。
  3. GRβ表达增高可能是GC抵抗的重要原因,并对GC敏感性的影响起主要作用。
  4. GRβ表达的增高可能对GRa起负性调节作用,GRa、GRβ表达比例的平衡失调,可能是GC抵抗的重要原因,还有待进一步研究证实。
[硕士论文] 李娟
小儿外科 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨mTOR信号通路在血管瘤消长中的作用,为临床以PI3K/AKT/mTOR信号通路及AMPK/mTOR信号通路为靶点治疗婴幼儿血管瘤提供实验参考。
  方法:
  1.收集我院2008-2015年间存档的术前均未做任何辅助性治疗且病理诊断为小儿毛细血管瘤的病理标本50例,结合Mulliken分类法与Ki-67表达情况将标本进行分类和分期,免疫组织化学法检测并比较AMPK及mTOR在血管瘤增生期和消退期中的表达情况。
  2.手术切取婴幼儿增生期血管瘤组织,采用组织块法分离培养血管瘤血管内皮细胞,待单层细胞铺满培养瓶底75%以上后,去掉组织块,将细胞消化后予以传代培养。取第四代细胞予以第Ⅷ凝血因子相关抗原鉴定。
  3.取对数生长期细胞,运用无血清培养液同步化孵育24h,对照组加入完全培养基4mL、二甲双胍组加入含20mmol/L二甲双胍的培养液4mL、NVP-BEZ235组加入含0.5μmol/LNVP-BEZ235的培养液4ml、联合组加入含二甲双胍与NVP-BEZ235的培养液(培养液中二甲双胍终浓度为20mmol/L,NVP-BEZ235终浓度为0.5μmol/L)4ml,孵育24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot法检测血管瘤血管内皮细胞中AMPK、mTOR及p70s6k表达情况,比较各组AMPK、mTOR及p70s6k表达差异,分析血管瘤血管内皮胞凋亡与mTOR信号通路的关系。
  结果:
  1.24例增生期血管瘤AMPK、mTOR的积分光密度分别为33.94±12.78,182.43±47.10;26例退化期血管瘤AMPK、mTOR的积分光密度分别为85.87±19.53,47.22±44.52。增生期血管瘤AMPK的积分光密度明显低于消退期,差异有显著性(t=11.02,P<0.01);增生期血管瘤mTOR的积分光密度明显高于消退期,差异有显著性(t=10.44,P<0.01);AMPK与mTOR的表达呈负相关关系(r=-0.78,P<0.01)。
  2.血管瘤血管内皮细胞体外培养过程中,第一周见少量梭形细胞从细胞岛边缘爬出,第二周见细胞数量逐渐增加,且围绕细胞岛向周围呈放射状生长,第三周细胞开始不均匀分布生长,第四周见细胞铺满培养瓶底部。倒置相差显微镜下见单个细胞呈梭形或不规则多边形,细胞聚集处呈铺路石样或管形排列。第Ⅷ凝血因子相关抗原呈阳性表达。
  3.细胞总凋亡率:对照组为1.45±0.27,二甲双胍组为11.98±1.00,NVP-BEZ235组为16.12±1.88,联合组为25.96±0.96;二甲双胍组、NVP-BEZ235组、联合组与对照组比较,差异均有显著性(t=17.30、13.13、42.49,P<0.01)。联合组与二甲双胍组、NVP-BEZ235组比较,差异均有显著性(t=3.90、8.17,P<0.01)。二甲双胍组与NVP-BEZ235组比较,差异均有显著性(t=-18.53,P<0.01)。
  4.AMPK表达情况:对照组为0.43±0.23,二甲双胍组为3.97±0.40,NVP-BEZ235组为0.55±0.23,联合组为3.99±1.10;二甲双胍组、联合组与照组比较,差异均有显著性(t=13.32、5.49,P<0.01);二甲双胍组与NVP-BEZ235组比较,差异均有显著性(t=12.91,P<0.01);联合组与NVP-BEZ235组比较,差异均有显著性(t=5.3,P<0.01);NVP-BEZ235组与对照组比较,联合组与二甲双胍组比较,差异均无统计学意义(t=0.66、0.03,P>0.05)。
  5.mTOR表达情况:对照组为6.35±1.81,二甲双胍组为2.47±0.69,NVP-BEZ235组为1.46±0.27,联合组为0.40±0.21;二甲双胍组、NVP-BEZ235组及联合组与对照组比较,差异均有统计学意义(t=-3.47、-4.63、-5.66,P<0.05);联合组与二甲双胍组、NVP-BEZ235组比较,差异均有统计学意义(t=-4.99、-5.35,P<0.05);二甲双胍组与NVP-BEZ235组比较,差异无统计学意义(t=2.37,P>0.05)。
  6.p70S6K表达情况:对照组为0.65±0.22,二甲双胍组为2.49±0.19, NVP-BEZ235组为3.98±0.55,联合组为13.95±1.16;二甲双胍组、NVP-BEZ235组、联合组与对照组比较,差异均有显著性(t=11、9.78、19.54,P<0.01);联合组与二甲双胍组、NVP-BEZ235组比较,差异均有显著性(t=16.9、13.46,P<0.01);二甲双胍组与NVP-BEZ235组比较,差异具有统计学意义(t=-4.45,P<0.05)。
  结论:
  1.AMPK在血管瘤消退期表达高于增生期,mTOR在消退期表达低于增生期。
  2.激活AMPK或抑制PI3K均可使mTOR信号通路受抑,诱导体外培养血管瘤血管内皮细胞凋亡,尤以同时激活AMPK和抑制PI3K时效果最为明显。
[硕士论文] 刘凤娇
内科学(心血管病) 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过对急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)合并室壁瘤(Ventricular aneurysm,VA)病史资料、并发症、冠状动脉病变情况、实验室指标、心脏彩超指标、预后进行回顾性分析,探讨AMI合并VA的临床特征和危险因素,寻找VA发生的可控危险因素,并提出干预措施,为降低临床VA发生率和相应心血管事件提供资料和证据。
  方法:
  回顾性收集分析遵义医学院心内科2010年1月-2016年9月住院期间确诊AMI合并VA的患者70例纳入研究组,并随机选取同期不合并VA的AMI患者70例作为对照。通过对2组患者病史资料、并发症、冠状动脉病变情况、实验室指标、心脏彩超指标、预后做统计分析,建立AMI合并VA的Logistic回归模型,寻找VA发生的可控危险因素。
  结果:
  (1)在单因素分析中,年龄(68.01±11.081 vs56.93±10.772,P=0.000)、吸烟史(45.71%vs68.57%,P=0.006)、既往心肌梗死病史(42.85%vs8.57%,P=0.000)、既往脑卒中病史(32.28%vs0.00%,P=0.000)、全心衰(14.28%vs0.00%,P=0.001)、单纯左心衰(30.00%vs8.57%,P=0.001)、左心室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF)值降低(90.00% vs45.55%,P=0.000)、合并脑卒中(30.00 vs4.28%,P=0.000)、院外1年内全因死亡率(10.00%vs14.28%,P=0.000)、前降支血管病变(95.74%%vs80.00%,P=0.016)、APOB(0.8380±0.30044 vs1.0127±.23991,P=0.000)、白细胞升高(28.57 vs45.71%,P=0.000)在VA和无VA两组之间均有显著不同。
  (2)经多因素分析,年龄(OR=1.072β=0.069 P=0.00595%CI=1.021-1.125)、既往有心肌梗死病史(OR=8.228β=2.108 P=0.00295%CI=2.120-31.931)、LVEF值降低(OR=6.905β=1.932 P=0.00695%CI=1.747-27.294)、合并脑卒中(OR=5.483β=1.702 P=0.03095%CI=1.180-25.474)为VA形成的独立危险因素。
  结论:
  年龄、既往心肌梗死病史、LVEF值降低和合并脑卒中为VA形成的独立危险因素。临床上积极干预上述危险因素,降低临床AMI后VA发生率,改善预后。
[博士论文] 张永鑫
外科学(神经外科学) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分椎动脉梭形动脉瘤几何形态与流场特征的多因素分析
  目的:本研究测量并分析椎动脉V4段梭形动脉瘤的几何形态参数和流场类型,筛选出与螺旋型流场相关的主要几何形态参数。
  方法:筛选本中心2011年11月至2015年10月间接受脑血管造影的V4段梭形动脉瘤,根据入选标准和排除标准纳入病例,测量动脉瘤和载瘤动脉的几何形态参数,流动力学软件分析动脉瘤的流场。几何形态参数分三类共9项,包括形状大小参数、形态分布参数和空间位置关系参数。根据流场图,将动脉瘤分为螺旋型流场动脉瘤和非螺旋型流场动脉瘤,流场特征判读结果通过Kappa检验其一致性。Logistic分析螺旋型流场相关的几何形态参数。
  结果:共157例动脉瘤纳入研究,89例为螺旋型流场,68例为非螺旋型流场,流场特征结果判读一致性较好(Kappa=0.896,P<0.001)。将9项几何形态参数先纳入单因素Logistic回归分析筛选后,再纳入多因素Logistic回归分析,结果显示近端载瘤动脉入口角度(OR=7.964,P=0.003)、远端载瘤动脉出口角度(OR=4.892,P=0.014)、入口平面和出口平面所在中轴线的空间距离(OR=0.015,P<0.001)为影响瘤内螺旋型流场的危险因素。
  结论:入口角度、出口角度、入口平面和出口平面所在中轴线的空间距离影响梭形动脉瘤流场特征。螺旋型流场动脉瘤有更小的入口角度、更小的出口角度、更大的入口平面和出口平面所在中轴线的空间距离,提示梭形动脉瘤累及的血管越迂曲,越可能具有螺旋流场。
  第二部分具有螺旋型流场兔颈总动脉梭形动脉瘤模型的构建
  目的:采用弹性蛋白酶、CaCl2溶液和物理扩张的不同因素组合,联合作用于兔颈总动脉内膜或(和)外膜,并且改变载瘤动脉形态,探索与人类颅内梭形动脉瘤病理特征更相似且具有螺旋型流场的梭形动脉瘤建模方法。
  方法:40只新西兰大白兔分成四组(每组10只):A组为对照组,在颈总动脉封闭一段血管腔,留置针穿刺入封闭血管腔,注入生理盐水,以2 atm持续加压扩张15分钟;B组为单纯CaCl2内腔组,方法同A组,但注入封闭血管腔的为0.5 M CaCl2溶液;C组为酶内腔+ CaCl2外膜组,方法与A组相似,不同的是注入封闭血管腔的为0.15 U/μl的弹性蛋白酶消化3分钟,且不加压,同时外膜予0.5 M CaCl2溶液浸润15分钟;D组为CaCl2内腔+酶外膜组,方法同C组,同时外膜予3 U/μl的弹性蛋白酶消化3分钟。四组均通过肌肉错层缝合拉伸血管形成血管扭曲,造成引起螺旋型流场的形态微环境。4周后予MRA检查和流场分析,测量对比各组动脉瘤扩张率(动脉瘤最大横径-远、近端血管平均直径/远、近端血管平均直径)、成瘤率(扩张率≥50%为成瘤标准)、狭窄及闭塞率、螺旋型流场率等形态学指标。动物处死后,对比瘤体标本内膜和中膜厚度、弹性纤维面积分数、胶原纤维面积分数、弹力层破坏程度等病理学指标。
  结果:四组动物建模后无死亡,MRA显示A、B、C、D组平均扩张率分别为13.51%、36.2%、69.1%、77.7%,成瘤率分别为0%、30%、60%、90%。与A组相比,B、C、D组均出现扩张(P<0.05),C、D组平均扩张率高于B组(P<0.01),C组与D组间无差异(P=0.460)。C、D组成瘤率均显著高于A、B组(P<0.001),C组与D组相似(P=0.303)。四组分别有0例、1例、3例、1例血管闭塞,另外C组有3例、D组有1例存在狭窄,C组的狭窄闭塞率高于其他三组(P<0.05)。流场分析显示,四组螺旋型流场形成率分别为10%、44.4%、28.6%、88.9%,B、C、D三组均高于A组(P<0.0125),三组间无差异。组织病理显示,B、C、D组均出现不同程度的弹力层破坏,弹性纤维均较A组显著减少(P<0.001),C、D组比B组显著减少(P<0.001)。B、C组的胶原纤维较A、D组显著升高(P<0.01)。B组瘤壁厚度较A、C、D组显著增厚(P<0.05),A、C、D三组间无差异。B、D组大部分(55.56%、66.67%)模型可见内膜下新生血管。
  结论:CaCl2内腔加压灌注联合弹性蛋白酶外膜消化法建立的梭形动脉瘤模型,成瘤率高,狭窄闭塞率较低,具有螺旋型流场,病理学特征与人梭形动脉瘤相似,是进行血流动力学与病理学改变相关性研究的合适模型。
  第三部分不同流场对梭形动脉瘤形态和病理学改变的影响
  目的:CaCl2内腔加压灌注联合弹性蛋白酶外膜消化法处理兔颈总动脉后,通过改变载瘤动脉形态分别使梭形动脉瘤形成螺旋型流场和非螺旋型流场,对比两种流场特征对梭形动脉瘤形态和病理学改变的不同影响。
  方法:36只新西兰大白兔,4只作为对照,32只分成两组,W组为扭曲实验组:在兔颈总动脉封闭一段血管腔,留置针穿刺入封闭血管腔,注入0.5 M CaCl2溶液,以2 atm持续加压扩张15分钟,同时外膜予3 U/μl的弹性蛋白酶消化3分钟,拉伸血管形成血管扭曲,以形成螺旋型流场动脉瘤,Z组为直线对照组:化学处理与W组相似,不同是处理后血管保持平直,以形成非螺旋型流场。在6周时,行MRA、USPIO增强MRI、流场特征分析,分为螺旋型流场组和非螺旋型流场组,对比动脉瘤扩张率、狭窄及闭塞率、MRI平均SNR下降比率等形态学指标,处死一半动物,对比瘤体内膜和中膜厚度、弹性纤维面积分数、胶原纤维面积分数、MMP-2、MMP-9和α-SMA等病理学指标。在9周时,行相同检测后两组间对比,同时行两个时间点前后自身对比。
  结果:6周时:两组均有2例闭塞,1.流场特征:Z组14例均为非螺旋型;W组13例为螺旋型,1例非螺旋型纳入Z组分析。2.形态学:W组(螺旋型流场)的平均扩张率显著大于Z组(非螺旋型流场)(P=0.001)。3.组织病理学: W组弹力纤维面积分数和α-SMA面积分数更低(P<0.05)。4.分子病理学:W组的MMP-9、MMP-2、NF-κB表达均显著高于Z组(P<0.01)。
  9周时:1.流场特征:Z组7例均为非螺旋型;W组7例均为螺旋型。2.形态学:与Z组相比,W组平均扩张率更高(P<0.001)。3.组织病理学:W组内膜和中膜厚度更厚(P=0.047),胶原纤维面积分数和α-SMA面积分数更低(P<0.05)。4.分子病理学:W组的MMP-9、MMP-2、NF-κB表达均显著升高(P<0.01)。
  9周与6周时比较:1.形态学:Z组动脉瘤已明显缩小(P=0.001),而W组的平均扩张率仍达75.8%,无明显变化。2.病理学:Z组在9周时MMP-2、MMP-9、NF-κB的表达均明显下降(P<0.05),而W组仅MMP-2的表达有所下降(P=0.032),MMP-9、NF-κB无下降。
  USPIO增强MRI:注射USPIO后,正常血管SNR无明显变化,W组和Z组的瘤壁SNR均显著下降(P<0.001)。
  结论:与非螺旋型流场相比,螺旋型流场使瘤壁NF-κB、MMP-9、MMP-2表达增加,弹性纤维、胶原纤维和合成型平滑肌细胞减少,导致瘤体体积更大。模型动物可对已形成的梭形动脉瘤进行自身修复,而螺旋型流场的持续存在阻碍了其自身修复的过程。USPIO能使梭形动脉瘤瘤壁MRI信号改变,提示其可用于MRI瘤壁成像诊断。
[博士论文] 岳劼
外科学(心胸外科) 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  腹主动脉瘤(AAA)是指腹主动脉发生局限性或弥漫性瘤样膨大,瘤体直径≥主动脉或腹主动脉的管径扩张超过1/3的一类疾病,起始于膈肌,或向下延伸至髂血管分叉处,好发于肾下腹主动脉。患者多为65-85岁的老年男性,男女之比为4~6∶1。腹主动脉发病率逐年上升,一旦发生瘤体破裂,病死率高达78-94%。随着我国逐渐向老年化发展,腹主动脉瘤逐渐成为威胁老年人健康的常见疾病。目前,AAA(Abdominal Aortic Aneurysm)的治疗手段主要为药物治疗、开腹手术以及血管腔内介入治疗。治疗腹主动脉瘤的药物主要有他汀类药物,抗生素、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂,β受体阻滞剂,维生素E,环氧酶-2抑制剂,抗炎抗血小板药物,激素等,这些药物主要起间接抑制瘤体进展,防止破裂的作用,且无明显药效。因此,开发针对腹主动脉瘤发病机制的药物对疾病的预防和治疗具有重大意义。
  目的:
  腹主动脉瘤的病变主要为血管中膜及外膜。从已有的研究报道来看,AAA发病机制主要包括氧化应激、炎症反应、基质弹力纤维损伤以及中膜平滑肌凋亡等。若能针对这些发病机制开发新药,将大大提高AAA药物治疗进展,同时能很好的预防AAA的发生发展。葛根素,是传统中药葛根的主要成分,临床上广泛用来防止血栓栓塞性疾病。目前报道葛根素具有抗氧自由基损伤、细胞保护、抑制血管内皮细胞组织因子的表达,抗氧化等多种作用。但其是否能影响腹主动脉瘤形成尚无文献报道。
  方法:
  我们将实验动物分为阴性对照组、AngⅡ模型组(阳性对照组),100mg/kg葛根素治疗组,200mg/kg葛根素治疗组。AngⅡ刺激4周后,检测四组的腹主动脉瘤发生率,用Western blot和免疫组织化学分析法对小鼠腹主动脉组织中NADPH氧化酶活性,MMP2激活情况,ROS生成情况,AP-1和p-Jun蛋白的表达情况。同时研究葛根素对EOMA细胞的增殖和凋亡作用,检测EOMA细胞中caspase-9/3酶活性。
  结果:
  结果显示,AngⅡ模型组腹主动脉瘤的发生率为80%,而200mg/kg和100mg/kg葛根素治疗组分别降至50%,30%;葛根素治疗组中NADPH氧化酶活性,MMPs表达,ROS产物,AP-1和P-Jun蛋白的表达相比于AngⅡ模型组显著降低。同时,葛根素显著抑制EOMA细胞的增殖并诱导其凋亡,并显著增加EOMA细胞内caspase-9/3酶活性。
  结论:
  我们首次发现葛根素可以显著抑制血管紧张素诱导的腹主动脉瘤形成。其主要机制包括抑制ROS产物、降低基质金属蛋白酶的表达水平和活性,降低主动脉瘤内AP-1蛋白的表达,同时增强p-Jun蛋白表达,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制细胞内caspase-9/3酶活性。提示葛根素可能成为临床上预防和治疗腹主动脉瘤形成新的潜在药物。
[博士论文] 郭晓博
外科学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:胸主动脉瘤是一种由于多种原因导致主动脉壁结构破坏、强度减弱,发生瘤样扩张或者膨出的高危性疾病。大多数胸主动脉瘤患者无明显症状,但是可进行性扩大并发生致命性的并发症,如瘤体破裂或主动脉夹层,预后凶险。影像技术的普及提高了胸主动脉瘤的早期诊断率,为避免并发症的发生并延缓手术提供了药物治疗的时间。但是目前临床并没有有效药物抑制胸主动脉瘤的扩大。而对于胸主动脉瘤发病机制的研究与理解是能否找到特异性治疗方法的关键。虽然综合征型和家族型胸主动脉瘤已经发现相关致病基因位点,但是占大多数的散发型胸主动脉瘤(STAA)的遗传背景和发病机制仍不明确。新近发现的长链非编码RNA(lncRNA)可以在多个水平调节基因表达,也被报道与多种心血管系统疾病相关。但是lncRNA在胸主动脉瘤领域的作用仍不清楚。本课题旨在通过研究胸主动脉瘤中lncRNA的表达谱差异,以及差异表达lncRNA(HOTAIR)对主动脉平滑肌细胞功能和细胞外基质重塑的影响,来探索lncRNA在胸主动脉瘤发病机制中的作用。
  研究内容包括以下两部分:
  第一部分 散发型胸主动脉瘤中lncRNA表达谱研究
  目的:研究散发型胸主动脉瘤lncRNA表达谱差异,并找到可能与致病相关的目标lncRNA。
  方法:选取2013年7月到2015年6月在阜外医院行手术的胸主动脉瘤患者升主动脉瘤体组织样本(STAA组)和行冠状动脉搭桥术患者主动脉打孔组织样本(对照组),经年龄、性别等指标配对后,共4对样本进行lncRNA+mRNA联合芯片分析。差异基因中挑选四条lncRNA(uc031qjh.1、ENST0000045164、HOTAIR、LIT3501)和2条mRNA(CTSB和TNFSF10),进行实时定量反转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)验证芯片结果。对差异表达基因行Gene Ontology Enrichment分析、lncRNA-mRNA共表达分析和lncRNA靶基因预测。
  结果:与对照组相比,STAA组中1105条(5%)lncRNA出现明显差异表达,其中151条(1%)表达上调,954条(4%)表达下调。差异表达的mRNA有1568条(5%),其中1175条(4%)上调,393条(1%)下调。qRT-PCR结果与芯片结果基本一致,STAA组uc031qjh.1、ENST0000045164、LIT3501、CTSB和TNFSF10的相对表达量均明显高于对照组,HOTIAR的相对表达量明显低于对照组。富集最多差异表达基因的生物过程是血管新生、细胞外结构调节、细胞外基质调节、白细胞迁移和细胞粘附。通过结合Gene Ontology分析和lncRNA-mRNA共表达分析,得到细胞外基质相关lncRNA-mRNA共表达网络,由277个lncRNA和50个mRNA组成,其中包括HOTAIR。
  结论:散发型胸主动脉瘤中lncRNA表达谱与正常对照相比存在明显差异。生物信息学分析显示lncRNA HOTAIR可能与胸主动脉瘤相关。
  第二部分 lncRNA HOTAIR对主动脉平滑肌细胞和细胞外基质的影响
  目的:扩大样本量验证HOTAIR在胸主动脉瘤中的差异表达,并通过细胞实验探索其对平滑肌细胞和细胞外基质的影响。
  方法:病例组选取2013年7月到2015年6月在阜外医院行手术的胸主动脉瘤患者升主动脉瘤体组织样本24例,对照组选取冠状动脉搭桥术患者主动脉打孔组织样本22例,心脏移植供体升主动脉样本2例。通过qRT-PCR验证HOTAIR在两组间表达差异。体外培养主动脉平滑肌细胞(HASMC),通过siRNA技术沉默HOTAIR,观察HASMC凋亡、增殖、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的改变,并通过RNA测序技术观察mRNA表达谱差异及发生改变的信号通路。
  结果:胸主动脉瘤中HOTAIR表达量降低,且与瘤体直径呈负相关。沉默HOTAIR可以促进HASMC凋亡,抑制增殖。HASMC中沉默HOTAIR可以上调MMP-2的表达,下调Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达。RNA测序结果显示沉默HOTAIR后差异表达基因共620条,其中上调53条,下调567条。差异基因功能富集分析显示改变最显著的是平滑肌细胞收缩功能,共相关基因13条,均表达下调,包括ACTA2、CALD1、MYLK等。信号通路富集分析显示MAPK、Wnt、TGF-beta等信号通路发生改变。
  结论:散发型胸主动脉瘤中lncRNA HOTAIR表达量明显降低。沉默HOTAIR可以通过损伤平滑肌细胞收缩功能和促进细胞外基质重塑,进而可能引起胸主动脉瘤的发生。
  散发型胸主动脉瘤中lncRNA表达谱与正常对照相比存在明显差异,且lncRNA HOTAIR表达量明显降低。沉默HOTAIR可以通过损伤平滑肌细胞收缩功能和促进细胞外基质重塑,进而可能引起胸主动脉瘤的发生。
[博士论文] 李婉
免疫学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)是由卡波氏肉瘤病毒(Kaposi'ssarcoma-associated herpesvirus,KSHV)感染引起的一种以血管异常增生和高度侵袭转移为特征的恶性肿瘤。KSHV体外感染内皮细胞能够显著增强细胞的侵袭与血管生成能力。KSHV编码12个前体微小RNA(precursor microRNA,pre-miRNA),最终生成25种成熟miRNAs,这些miRNAs在KS肿瘤转移和血管生成中的作用目前尚不清楚。
  目的:研究KSHV编码的miR-K6-3p对人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVECs)迁移和血管生成能力的影响,并探讨其中涉及的分子机制。
  方法:首先构建表达miR-K6-3p的重组质粒mpCDH-miR-K6-3p。通过三质粒表达系统包装重组慢病毒Lentivirus-K6-3p及其对照Lentivirus-mpCDH并分别感染HUVECs,进行Transwell小室迁移、微管形成和基质胶栓塞(PLUG)实验,观察miR-K6-3p对内皮细胞迁移和血管生成的影响。为了鉴定miR-K6-3p的靶基因,运用质谱分析技术获得miR-K6-3p和mpCDH两组细胞的差异蛋白表达谱。通过多种生物信息学软件,包括TargetScan、RNAhybrid、Findtar和PicTar等分析,筛选出miR-K6-3p的候选靶基因,结合虫荧光素酶(Luciferase)报告实验、点突变实验和免疫印迹(Western blot)进行鉴定。通过检测候选基因对细胞迁移和血管生成能力的影响证实该基因参与调控miR-K6-3p诱导内皮细胞迁移与血管生成。进一步,通过Western blot、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)以及GST pull-down实验鉴定与miR-K6-3p靶基因密切相关的信号蛋白及其通路在miR-K6-3p诱导内皮细胞迁移和血管生成中的作用。最后,运用反向遗传学技术在KSHV基因组中剔除miR-K6基因,进一步证实miR-K6-3p及其下游信号通路在内皮细胞迁移与血管生成中的作用。
  结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒mpCDH-miR-K6-3p构建成功。表型实验结果显示,异位表达miR-K6-3p能够促进内皮细胞迁移和血管生成。质谱分析结果显示,与对照组相比,miR-K6-3p细胞中下调2倍以上的蛋白有47个。经生物信息学分析,筛选出可能包含miR-K6-3p结合位点的3个候选蛋白。荧光素酶报告实验以及Western blot结果表明,miR-K6-3p能够通过直接靶向SH3域结合谷氨酸富含蛋白(SH3 domain binding glutamate richprotein,SH3BGR)的3'非翻译区(untranslated region,UTR)抑制其蛋白表达。过表达SH3BGR能够逆转miR-K6-3p诱导的内皮细胞迁移和血管生成。Co-IP和GST pull-down实验结果显示,miR-K6-3p下调SH3BGR蛋白表达,将其绑定的STAT3释放,使得STAT3被磷酸化活化,活化的STAT3参与调控miR-K6-3p诱导内皮细胞的迁移和血管生成。最后,从KSHV全基因组中剔除miR-K6废除了其对SH3BGR/STAT3通路的调控能力,并且显著抑制了KSHV诱导的细胞迁移和血管生成。
  结论:miR-K6-3p通过直接靶向抑制SH3BGR蛋白进而激活STAT3信号通路促进内皮细胞迁移与血管生成,从而有助于KSHV诱导的恶性肿瘤的转移与血管生成。
[博士论文] 尹亚娟
生物化学与分子生物学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  SM22α是成熟血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表达的一种细胞骨架相关蛋白,在多种情况下作为衔接蛋白聚合信号复合物并调节信号转导。SM22α缺失可诱发血管炎症,促进NF-κB活化。腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种危害生命的慢性炎症性血管疾病,其形成与多种因素有关。研究显示,在动脉夹层组织和人AAA组织中SM22α丰度明显减少。然而,SM22α与动脉瘤发生之间的因果关系缺乏明确证据。本研究探讨缺失SM22α对腹主动脉瘤发生的影响及病理机制。
  方法:
  利用SM22α基因敲除和同窝野生型小鼠经背部皮下植入AngII微渗透泵复制AAA模型,在整体水平评价SM22α与Ang II诱导的AAA关系;用定量RT-PCR、Western blot技术和免疫荧光染色检测蛋白mRNA及蛋白质表达;用免疫荧光染色确定炎症部位促炎因子表达和炎性细胞的浸润;用间接共培养体系,确定VSMCs缺失SM22α活化巨噬细胞;用跨膜迁移分析和粘附分析确定VSMCs缺失SM22α对巨噬细胞迁移和粘附的影响;用细胞外分泌组学分析进一步阐明SM22α缺失在巨噬细胞与VSMCs粘附中的作用机制;利用抗体阻断实验,确定SM22α缺失增加巨噬细胞活化、迁移和粘附是通过上调VCAM-1实现的;用免疫共沉淀分析和免疫双荧光染色,确定F-actin和VCAM-1具有相互作用,并明确其相互作用发生在皮层区。
  结果:
  1.SM22α缺陷促进腹主动脉瘤形成
  1.1.SM22α缺失有助于Ang II诱导腹主动脉瘤形成
  对腹部主动脉瘤模型分析结果显示,输注 Ang II的Sm22α-/-小鼠和Sm22α+/+小鼠在腹主动脉部位均有动脉瘤形成,发病率分别为66.7%(10/15)和26.7%(4/15),Sm22α-/-小鼠AAA发病率明显高于Sm22α+/+小鼠(P<0.05)。小动物超声活体测量腹主动脉直径显示,Sm22α-/-小鼠的腹主动脉最大直径显著高于Sm22α+/+小鼠(P<0.01)。结果表明,SM22α缺失促进Ang II诱导AAA形成。
  1.2.SM22α缺失促进MMP-2、MMP-9释放,弹力纤维和胶原蛋白降解
  植泵28天剥取腹主动脉进行组织包埋,取Sm22α-/-小鼠腹部动脉瘤部位和Sm22α+/+小鼠相等部位切片,对组织切片进行HE、EVG和免疫荧光染色,结果显示,Sm22α-/-小鼠腹主动脉瘤部位管腔膨胀,管壁增厚,弹力纤维断裂和胶原蛋白降解,病变程度比Sm22α+/+小鼠更为明显。定量RT-PCR、Western blot和组织免疫荧光染色检测MMP-2和MMP-9表达,结果显示,与生理盐水对照组相比,Ang II促进小鼠腹主动脉组织 MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达;而Sm22α-/-小鼠腹主动脉MMP-2和MMP-9表达明显高于Sm22α+/+小鼠。结果表明,SM22α缺失促进AngII诱导的MMP-2和MMP-9表达,导致血管细胞外基质降解,管壁结构重塑。
  1.3.SM22α缺失导致的腹主动脉瘤是血压非依赖的
  为了验证 Sm22α-/-小鼠 AAA的形成是否与高血压有关,通过智能无创血压计监测小鼠血压变化,结果显示,与对照组相比,两种基因型小鼠注入Ang II第1周血升压开始明显升高,直至第4周血压持续升高,但第3周和第4周 Sm22α-/-小鼠的血压升高明显低于Sm22α+/+小鼠(P<0.001),表明Sm22α-/-小鼠增加的AAA发生率不依赖于Ang II诱发的高血压。
  2.敲除SM22α促进血管中膜巨噬细胞浸润和活化
  2.1.SM22α缺失增加血管炎症
  对组织切片进行免疫荧光染色,结果显示,在 Ang II作用下,大量巨噬细胞聚集在Sm22α-/-小鼠中膜。主动脉组织定量RT-PCR检测结果显示,在Ang II作用下,两种基因型小鼠腹主动脉组织中促炎因子IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达上调,而Sm22α-/-小鼠促炎因子的表达明显高于Sm22α+/+小鼠(P<0.001)。以上结果表明, SM22α缺失是通过增加巨噬细胞浸润和促炎因子释放增强炎症反应促进AAA发生。
  2.2.SM22α缺失促进巨噬细胞募集
  为了进一步探讨 SM22α缺失是否直接影响巨噬细胞的聚集,通过VSMCs-RAW264.7细胞共培养系统,检测敲除SM22α对巨噬细胞跨膜迁移和粘附的影响。跨膜迁移和粘附分析结果显示,在Ang II作用下,RAW264.7细胞的跨膜迁移增强,同时与VSMCs粘附的数量增多,而与野生型VSMCs相比,SM22α缺失明显增加RAW264.7细胞的跨膜迁移和(P<0.001)与VSMCs粘附能力(P<0.01);然而,当Sm22α-/-小鼠VSMCs恢复SM22α表达后明显降低对RAW264.7细胞跨膜迁移(P<0.001)和与VSMCs粘附的促进作用(P<0.01)。以上结果表明,SM22α缺失通过直接影响巨噬细胞的迁移和粘附,促使巨噬细胞募集。
  2.3.SM22α缺失促进巨噬细胞活化
  用Ang II刺激Sm22α-/-和Sm22α+/+小鼠VSMCs后,收集细胞培养基。定量RT-PCR检测结果显示,与野生型相比,Sm22α-/-小鼠VSMCs条件培养基明显促进RAW264.7细胞表达促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1(P<0.001),诱导巨噬细胞活化。然而,当Sm22α-/-小鼠VSMCs恢复SM22α表达后,则对巨噬细胞的活化能力降低。结果表明,缺失SM22α的VSMCs可激活巨噬细胞表达促炎因子。
  3.SM22α缺失促进血管平滑肌细胞VCAM-1表达
  3.1.血管平滑肌细胞外分泌组学分析
  对VSMCs培养基进行外分泌蛋白质组学分析,结果显示,在外分泌差异蛋白中,Sm22α-/-来源的可溶性VCAM-1(sVCAM-1)的表达是野生型的25.6倍,是差异最显著的一种粘附分子。
  3.2.敲除SM22α促进VCAM-1表达
  VCAM-1在单核细胞浸润过程中发挥重要作用。对两种基因型小鼠的主动脉组织分别进行Western blot和免疫荧光染色,结果显示,在Ang II植泵的Sm22α-/-小鼠主动脉中VCAM-1表达明显高于野生型小鼠。对体外培养的VSMCs培养基和膜蛋白进行分析,结果显示,与野生型VSMCs相比,缺失SM22α促进AngII诱导的VCAM-1表达,细胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1表达同时升高(P<0.001)。然而,补救表达SM22α的细胞其VCAM-1表达明显受到抑制,细胞膜表面VCAM-1和sVCAM-1明显减少(P<0.05)。结果表明,SM22α对VCAM-1表达具有负调节作用。
  3.3.SM22α缺失通过上调VCAM-1介导巨噬细胞募集
  为了进一步明确VCAM-1在巨噬细胞浸润中的功能,收集AngII刺激的Sm22α-/-小鼠细胞培养基,用抗VCAM-1抗体中和培养基中的sVCAM-1,观察其对 RAW264.7细胞的影响。结果显示,中和培养基sVCAM-1后,其诱导的RAW264.7细胞跨膜迁移明显减少(P<0.001),RAW264.7细胞中TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6 mRNA表达明显下降。为了验证上述发现,用重组VCAM-1处理RAW264.7细胞,结果显示,VCAM-1可明显增加RAW264.7细胞迁移和活化。此外,用抗VCAM-1抗体阻断VSMCs膜表面的VCAM-1后,观察其与RAW264.7细胞的相互作用。粘附分析显示,两种细胞的粘附明显减少(P<0.01)。结果表明,SM22α缺失的VSMCs通过上调VCAM-1实现对巨噬细胞的募集和活化。
  3.4.敲除SM22α促进皮层F-actin与VCAM-1的结合和VCAM-1膜定位
  已知SM22α参与actin细胞骨架重构,下调SM22α可促进胞浆F-actin解聚和皮层区F-actin聚合。为了探讨actin细胞骨架动力学是否参与VCAM-1细胞膜转位,通过免疫共沉淀检测二者的相互作用。结果显示,SM22α缺失促进细胞VCAM-1与F-actin的相互作用。双荧光染色细胞骨架和VCAM-1,结果显示,VCAM-1与皮层区F-actin共定位。用细胞骨架稳定剂JPK预处理VSMCs后,F-actin与VCAM-1相互作用减弱,皮层区共定位明显减少。表明SM22α缺失通过调节actin细胞骨架动力学而促进VCAM-1膜定位。
  结论:
  1.SM22α缺陷促进腹主动脉瘤形成。
  2.敲除SM22α促进血管中膜巨噬细胞浸润和活化。
  3.SM22α缺失促进血管平滑肌细胞VCAM-1表达。
[硕士论文] 谢松旺
外科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:为了调查清楚动脉瘤性蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血危险因素。迟发性脑缺血是动脉瘤性蛛网膜下腔出血的最重的并发症之一。了解其危险因素对于它的预防和治疗有着非常重要的意义。使用标准搜索引擎,包括PubMed,关于动脉瘤性蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血的医学文献进行了回顾。CT扫描显示重度蛛网膜下腔出血是唯一一致的动脉瘤性蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血的危险因素.迟发性脑缺血相关危险因素包括:年龄、临床分级、再出血、脑室内或脑内出血、急性脑积水、动脉瘤大小、部位、白细胞增多、白细胞介素-6水平和心脏畸形,这些似乎与蛛网膜下腔出血的严重程度相关而不是每一个因素都有直接影响。吸烟、高血压、心电图示左室肥厚与迟发性脑缺血有关,但是和蛛网膜下腔出血的严重程度无关。重度的蛛网膜下腔出血是一个最为明确的动脉瘤性蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血的危险因素,其次是吸烟,高血压,左室肥厚。但是迟发性脑缺血的发病机制,目前尚不明确,为了进一步了解迟发性脑缺血的发病机制,进一步研究,尤其是与动脉瘤性蛛网膜下腔出血严重程度无关的危险因素的研究是必要的。
[硕士论文] 张泽
麻醉学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:本研究拟通过观察右美托咪定预防颅内动脉瘤栓塞术患者全麻插管交感神经反应的效果及对血清肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a, TNF-a)和白细胞介素-6(interleukin, IL-6)水平的影响,探讨右美托咪定对颅内动脉瘤栓塞术患者脑保护的作用机制。
  方法:选取在本院进行全身麻醉行颅内动脉瘤栓塞手术的患者80例作为研究对象,男女不限,年龄18~66岁,ASA分级为Ⅰ或Ⅱ级。入选患者体质量指数在16kg/m2~28kg/m2,术前无严重肺、心、肝等疾病患者。使用随机数字表法,将患者随机分为2组(n=40):对照组(C组)和右美托咪定组(D组)。麻醉诱导前10min,右美托咪定组经静脉输注右美托咪定1μg/kg(10min内输注完毕),随后以0.4μg·kg-1·h-1的速率持续输注至手术结束前30min,对照组采用同样的方法静脉输注等容量的生理盐水。麻醉诱导:静脉注射咪达唑仑0.05mg/kg、舒芬太尼0.5μg/kg、依托咪酯0.3 mg/kg和罗库溴铵0.6 mg/kg诱导,经口明视下行气管插管,固定气管导管,连接麻醉机行机械通气,行桡动脉穿刺置管测压。机械通气潮气量6~10ml/kg,通气频率11~14次/分,维持呼末二氧化碳(PETCO2)在35~40mmHg之间,血氧饱和度>95%,气道压<40mmHg。麻醉维持:微量泵静脉输注瑞芬太尼0.05~0.2μg·kg-1·min-1,丙泊酚4~8mg·kg-1·h-1,术中根据手术刺激强弱调整剂量。术中维持平均动脉压波动幅度不超过基础值的20%,BIS值在40~60之间。术毕患者清醒后拔除气管导管送返病房。记录患者入手术室平静休息3 min(T1)、气管内插管前即刻(T2)、插管后即刻(T3)、插管后3 min(T4)的舒张压(DBP)、收缩压(SBP)、心率(HR),将患者麻醉诱导期间的舒张压、收缩压和心率最大值和最小值的差定义为波动值。于患者入手术室平静休息3 min(T1)、动脉瘤栓塞前即刻(T5)、手术结束时(T6)、术后6h(T7)、术后24h(T8)取桡动脉血,静置30min,以3000 r/min离心10min,取上清液,酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清TNF-a和IL-6的水平。
  结果:插管时血流动力学变化与T1时比较,对照组T2时收缩压明显降低(P<0.05), T3、T4时收缩压和心率及T3时舒张压明显升高(P<0.05),右美托咪定组T2时的收缩压和心率及T4时收缩压和舒张压明显降低(P<0.05)。与对照组比较,右美托咪定组患者T3、T4时的收缩压、舒张压及心率均降低(P<0.05),收缩压、舒张压和心率的波动值均显著降低(P<0.05)。
  血清TNF-a和IL-6的水平与T1时比较,两组T6-8时的血清TNF-a和IL-6水平均升高(P<0.05),与对照组比较,右美托咪定组T6-8时的血清TNF-a和IL-6水平均降低(P<0.05)。
  结论:给予1μg/kg的右美托咪定负荷量,随后以0.4μg·kg-1·h-1的速率持续输注,可以预防颅内动脉瘤患者全麻插管时的交感神经反应,同时可以降低颅内动脉瘤栓塞术患者术后血清炎性因子的水平。
[硕士论文] 张丹
影像医学与核医学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分颈内动脉眼动脉和后交通动脉段动脉瘤的发病与年龄、血管角度和直径的关系
  目的:
  颅内动脉分支处动脉瘤很常见,以颈内动脉段眼动脉和后交通动脉分支处为著,然而后交通动脉及眼动脉分支处动脉血管形态学参数与动脉瘤形成之间的关系至今仍不明确。在本研究中,我们的目的是确定颅内动脉分支处动脉瘤的形成与年龄、分叉顶角、颈内动脉直径和分支血管直径之间的关系。
  方法:
  95例做过三维旋转血管造影的病人纳入了本研究,包括动脉瘤组52例(后交通动脉动脉瘤30例,眼动脉瘤22例),对照组43例(后交通动脉对照组21,眼动脉对照组22)。测定了动脉分叉顶角、颈内动脉直径、分支血管直径和颅内颈内动脉分支处动脉瘤的大小等几何特征。
  结果:
  45-60岁(23例动脉瘤)和65-70岁(8例动脉瘤)的患者易患动脉瘤,女性(43例动脉瘤)比男性(9例动脉瘤)易患动脉瘤。分支处顶角与年龄无显著相关性(P>0.05)。进一步研究发现动脉瘤组(135.2°±12.8°;范围108.3°-171.1°)与对照组(118.7°±12.4°;范围89.3°-144.6°)相比顶角显著增大(P<0.0001)。动脉瘤组(4.5±1.9mm)与对照组(4.4±1.8mm)颈内动脉直径无显著性差异(P>0.05),动脉瘤组(1.7±1.2mm)与对照组(1.7±1.1mm)分支血管直径无显著性差异。颈内动脉直径(4.5±1.9mm)、分支血管直径(1.7±1.2mm)与动脉瘤大小(高径×宽径)呈显著正相关(R=0.22 R=0.23 P<0.001)。动脉瘤大小与动脉瘤颈宽成显著正相关(R=0.52 P<0.0001)。
  结论:
  在颈内动脉段眼动脉和后交通动脉动脉瘤的发病上,中老年人好发动脉瘤,女性比男性好发。动脉瘤好发于分叉顶角大的分叉处,动脉瘤的大小与颈内动脉直径、眼动脉和后交通动脉的直径以及动脉瘤的颈部大小呈显著正相关。
  第二部分颈内动脉眼动脉和后交通动脉段分支角度诱发的血流动力学因素对动脉瘤的形成
  目的:
  近年来越来越多的研究表明颈内动脉分支处形态学参数对动脉瘤的形成发挥着重要的作用。在这些参数中颈内动脉眼动脉及后交通动脉分支处角度对动脉瘤的形成显得尤为重要。本研究的目的是确定颅内动脉分叉顶端角度与动脉瘤形成的关系。
  方法:
  84例做过三维旋转血管造影的病人纳入了本研究。44例颈内动脉分支处动脉瘤:眼动脉分支处动脉瘤22例,后交通动脉分支处动脉瘤22例。对照组40例:眼动脉对照组22例,后交通对照组18例。测定颈内动脉眼动脉及后交通动脉分叉顶角的大小、血流动力学参数动态压力、壁面剪切力两个峰值之间的宽度及血流直接冲击区域的大小。
  结果:
  眼动脉动脉瘤组分叉顶角(平均值131.0°±10.3°;范围115.7°-146.8°)比对照组分叉顶角(平均值116.9°±12.3°;范围89.3°-141.2°)大,具有显著性差异P=0.0005。后交通动脉瘤组分叉顶角(平均值139.3°±13.2°;范围118.1°-171.1°)比对照组分叉顶角(平均值119.0°±12.0°;范围92.6°-144.3°)大,具有显著性差异P=0.0001。血流动力学参数动态压力、壁面剪切力两个峰值之间的宽度顶角大的比顶角小的大。同时,动脉瘤组和对照组(眼动脉及后交通动脉)的顶角与血流动力学参数动态压力、壁面剪切力两个峰值之间的宽度成显著正相关(病例组:眼动脉瘤组P=0.0040 R=0.35,后交通动脉瘤组P=0.0001 R=0.55;对照组:眼动脉对照组P=0.0089 R=0.30,后交通对照组P=0.0047 R=0.40)。进一步研究发现,顶角较大的血流直接冲击的区域(FIZ)比顶角小的宽。总压力与顶角之间无显著相关性。
  结论:
  颅内动脉分支处角度越大,反应了血流从主干血管到分支血管之间的角度越小,该处血流冲击变化和较大的压力,导致血管内皮较大的损伤,说明顶角越大越容易形成动脉瘤。
  第三部分颈内动脉眼动脉和后交通动脉段动脉瘤发病机制的血流动力学研究
  目的:
  近年来普遍认为血流动力学对颈内动脉眼动脉和后交通动脉分支处动脉瘤的起始、形成和发展发挥着重要的作用。然而血流作用对动脉瘤发生发展的确切机制依然没有完全阐明。本研究的目的是通过用三维血管血流动力学模型确定重要的血流动力学参数与眼动脉及后交通动脉分支处动脉瘤的联系。
  方法:
  该研究纳入了52例做过三维旋转血管造影的颈内动脉分支处动脉瘤(包括眼动脉分支处动脉瘤22例、后交通分支处动脉瘤30例)以及对照组43例(其中眼动脉对照组22例、后交通对照组21例)。用血流动力学软件模拟血流流动,观察研究血流动力学参数,包括壁面剪切力(WSS)、总压力(total pressure)、动态压力(dynamic pressure)、涡流(vorticity)、角速度(velocity angle)和应变率(strain rate)。
  结果:
  颈内动脉分支处局部压力、剪切力具有极大的差异。在分支处血流直接冲击处的压力最高、剪切力最低,分别向两端分支血管延伸,压力显著降低,而管壁剪切力则显著升高。在分支处血流直接冲击处的动态压力、涡流、和应变率最低,向两端逐渐升高,于分支血管处达到峰值。动脉瘤的始发位点不是位于血流直接冲击处,而是位于其邻近区域,该区域的顶角(A2/分支血管)较大,血流动力学压力比对照组高。动脉瘤形成后瘤壁的血流动力学参数与动脉瘤虚拟切除后起始点的区域相比显著的下降。
  结论:
  动脉瘤不是起始于血流直接冲击的位点,而是位于血流直接冲击处的邻近血流加速区。动脉瘤的形成是高压力和高剪切力同时作用的结果,离开一方孤立地谈论另一方是没有意义的。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部