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[博士论文] 岳秋林
生物化学与分子生物学 安徽农业大学 2015(学位年度)
摘要:植物甾醇是一类存在于植物中,结构上类似于胆固醇的物质,在植物中以游离态、酯化态或糖苷的形式存在,目前已知大约有100多种不同形式的植物甾醇存在于植物王国中,常见的植物甾醇包括β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等。由于植物甾醇具有降低胆固醇吸收和抗癌等功效,近年来被添加到人类日常饮食中,以降低心血管疾病的发生并预防癌症的发展。然而,关于植物甾醇对心脏病和癌症的防护机制研究尚未清晰。由于缺乏市售的绝大多数植物甾醇单体(除豆甾醇和β-谷甾醇外),到目前为止,多数研究都是针对植物甾醇混合物展开的,因此,很有必要开展关于其他具有代表性的植物甾醇单体的研究,包括菜油甾醇和相关衍生物单体,这将为全面理解植物甾醇的作用及功效奠定坚实的理论基础。
  甾醇,包括胆固醇和植物甾醇,都是不饱和脂类,它们很容易被氧化,产生与之相对应的胆固醇氧化物和植物甾醇氧化物。已有的研究表明,胆固醇氧化物具有细胞毒性、促进凋亡和引发炎症等作用,此外,胆固醇氧化物还和许多重要的慢性疾病的引发和发展有着密切的关系,例如动脉粥样硬化、神经性退行疾病、糖尿病和肾功能衰竭等。与研究相对透彻的胆固醇氧化物相比,同样是由于尚无市售的植物甾醇氧化物单体的原因,限制了对于植物甾醇氧化物的生物活性研究,而且许多针对相关氧化混合物的研究结果尚存在争议。因此需要对植物甾醇氧化物的潜在毒性进行深入全面的研究,以阐明其中存在的分子机制。
  酿酒酵母是一种具有特殊优势的真核生物,由于具有简易的基因操作性,可以很容易地对酵母进行过表达或基因敲除,筛选到所需要的突变株。此外,研究表明,酵母基因组编码了和哺乳动物细胞同源的控制细胞凋亡的重要调控因子,包括酵母中唯一存在的天冬氨酸蛋白酶(Yca1p)、核酸内切酶G(Nuc1p)、凋亡诱导因子(Aif1p)和BH3蛋白(Ybh3p)等。因此酿酒酵母作为一种模式生物,已被广泛应用于体内研究,用来研究与人类疾病相关的细胞凋亡通路及机理。
  本研究首先以一种植物甾醇混合物(Generol95R)作为起始物,首先通过半制备高效液相色谱法分离制备了高纯度的植物甾醇单体(菜油甾醇和β-谷甾醇),然后通过化学合成法结合柱层析和半制备高效液相色谱法,分离制备了高纯度的植物甾醇氧化物单体(7-酮基菜油甾醇和7-酮基谷甾醇),并对这些化合物进行了结构表征。本研究提供了一种新型制备植物甾醇氧化物单体的方法。
  由于氧化应激在人类疾病的发病机制中扮演着重要角色,本研究以酿酒酵母作为研究模型,对菜油甾醇在氧化应激条件下对酵母可能的保护机制进行了研究。结果表明,将酵母细胞进行菜油甾醇预处理可以降低活性氧的产生,促使抗氧化酶的活性增加,并能有效降低脂质过氧化程度。同时,我们对野生型酵母细胞和突变型Δyno1酵母细胞进行菜油甾醇预处理,比较了在氧化应激条件下所引起的酵母细胞的变化。实验结果表明,菜油甾醇的这种保护作用是依赖于NADPH氧化酶的,因为在NADPH氧化酶缺失的酵母突变株Δyno1中,菜油甾醇并不能发挥它的保护作用。
  本研究在酿酒酵母上对7-酮基胆固醇和7-酮基植物甾醇引发的细胞毒性进行了评估,平板计数法和细胞凋亡标记物检测指标被用于衡量酵母的死亡程度。实验结果表明,7-酮基胆固醇和7-酮基植物甾醇都可以诱导酵母细胞凋亡,在经过它们处理之后都可以引起染色质固缩,释放活性氧自由基,以及磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧翻转到外侧。我们的研究结果证明了半胱氨酸蛋白酶在7-酮基甾醇氧化物诱导酵母凋亡中发挥着重要的作用,当YCA1缺失或其功能被抑制时,7-酮基甾醇氧化物的细胞毒性显著降低。此外,研究表明7-酮基胆固醇的细胞毒性比7-酮基植物甾醇的细胞毒性大。除了这些传统检测细胞凋亡的方法,本研究还发明了一种基于方波阳极溶出法分析(SWASV)的电化学方法,来检测酵母细胞的凋亡。此方法检测的细胞凋亡的结果与传统的流式细胞仪检测结果呈现良好的吻合性,提供了一种优于传统方法的新型检测细胞凋亡的电化学方法。
[硕士论文] 刘丽
环境科学 西南大学 2015(学位年度)
摘要:漆酶是一种含铜或含铁的多酚氧化酶,其底物具有广泛性,是少数几种非特异性生物酶,能降解酚型和非酚型化合物,以及持久性的环境污染物。因此,漆酶被大量应用在纸浆造纸、纺织印染、酿造行业等工业废水的脱毒脱色降解,以及生物质能源开发的生物质前处理脱除木质素。漆酶在植物、真菌、细菌及昆虫体中广泛存在。迄今研究最多的是以白腐菌为代表的真菌漆酶,可以通过种间相互作用或外源化合物等多种诱导条件促进漆酶的大量合成,但是其诱导表达的机制尚不清楚。研究种间相互作用过程中漆酶的诱导表达机制,可以为种间作用途径生产漆酶提供理论依据,同时也可以为研究真菌间相互作用的代谢表达调控机制提供借鉴。本研究主要内容包括:
  ⑴通过平板对峙培养,在5株模式真菌中筛选出Trametes versicolor(TV)、Pleurotus ostreatus(PO)和Dichomitus squalens(DS)作为试验的漆酶生产菌。将这3株白腐菌两两组合共培养,测定其漆酶活性。结果显示,TV和DS的种间诱导酶活分别是单菌TV和DS的150倍和520倍;TV和PO的种间诱导酶活分别是单菌TV和PO的100倍和50倍;PO和DS的种间诱导酶活分别是单菌PO和DS的20倍和200倍。验证了外源化合物对3株白腐菌产漆酶的诱导效果:Cu2+具有很强的漆酶诱导能力,不同的芳香化合物和木质素衍生物对白腐菌产漆酶也具有一定的诱导效果。同时,初步探讨了营养物质对白腐菌产漆酶的影响,果糖和L-天冬酰胺为白腐菌共培养产漆酶最佳的碳氮源,草本植物的成分相对于木本更有利于白腐菌产漆酶。
  ⑵白腐菌在共培养条件下的胞外分泌物能诱导漆酶产生。通过在平板共培养体系中的半透膜装置验证了菌丝的物理接触对于漆酶种间诱导是非必须的。然后用有机试剂萃取菌丝交汇处的胞外分泌物,添加到单菌培养体系中验证其漆酶诱导能力。结果显示,共培养体系中菌丝交汇处的胞外分泌物对白腐菌产漆酶的确有显著的诱导效果。但是单菌的发酵上清液对白腐菌产漆酶没有显著的诱导效果。
  ⑶通过比较代谢组学和数字差异基因表达谱分析发现,菌丝交汇处相对于两侧的单菌发生了一系列的调控变化。种间共培养时,细胞处于防御与攻击状态,参与细胞攻击的水解酶、抗菌化合物等在基因水平和代谢水平上出现大量的上调表达;参与细胞防御的疏水蛋白、氧化还原酶及一些细胞色素等也出现大量的上调表达。同时细胞处于活跃状态,糖、脂类、氨基酸代谢等代谢途径的相关基因都发生上调表达,为细胞提供能量和物质基础。
  ⑷综合组学结果分析,白腐菌漆酶种间诱导机制:在种间作用下,细胞受体识别到对方细胞后,启动自身的攻击机制,产生活性氧中间体、氮反应中间体、抗菌性挥发性有机物及一些刺激性的代谢物等对对方细胞产生胁迫和伤害。对方细胞的漆酶基因启动子区域存在的响应元件会对这些物质产生相应的应答反应,启动自身的防御机制,导致漆酶的大量表达缓解这些胁迫和伤害。此外,分泌大量的水解酶破坏细胞完整性和种间营养物质的竞争也是诱导漆酶大量表达的原因。本研究为探索漆酶诱导的表达机制提供了分子水平的证据,为下一步鉴定白腐菌种间漆酶诱导的关键因子及代谢调控网络分析奠定了基础。同时,本研究为研究微生物间的相互作用提供了借鉴。
[硕士论文] 张小婷
微生物学 西南大学 2015(学位年度)
摘要:近年来,微生物电化学系统(microbial electrochemical system,MES)已成为能源与环境领域的研究热点,而产电菌是生物电化学系统的关键组成部分之一,充当生物催化剂,氧化有机底物,并通过电子传递系统,将获得的电子传递到阳极。现有的研究表明,由阳极产电菌与阳极间的界面电子传递(胞外电子传递)是MES的关键步骤。产电菌与电极间的异相电子传递步骤是由界面附近的产电菌细胞色素完成的,可通过电化学分析来表征。相关研究发现,产电菌的电化学信号会随工作电位的不同而发生变化,推测与电极接触的产电菌可根据电极电位的不同来改变自身的电子传递系统,从而获得最多的能量。但产电菌的胞外电子传递系统是否确切发生改变还不清楚;此外,低电位下工作的产电菌可提高MES的性能,相关文献普遍将阳极底物的标准氧化电位作为阳极的热力学极限,并认为已知的模式产电细菌在进行胞外电子传递时,已经接近这一极限。但本课题组前期的发现与该认知有差异。鉴于此,本文探究了-0.25V、-0.20V、0.00V及+0.20V四组不同工作电位下模式产电菌Geobacter sulfurreducens的电化学信号,并对信号差异明显的G.sulfurreducens的基因转录水平进行了对比分析,从分子水平为产电菌电化学信号的改变与电子传递系统改变的关联性提供证据,为解释自然环境下发生的一些重要过程机理提供依据,并为MES的阳极热力学极限的准确定义提供思路。本研究主要内容包括:
  ⑴在设定的电位水平下,G.sulfurreducens均可以产电,最低工作电位降至-0.25 V。计时电流实验结果表明,+0.20V,0.00V的电位水平下,产电菌可在约3.0h后产生催化电流,对应阳极并分别在70±5h和72±5h首次达到最大活性,产电菌产生电流密度分别为90±6 uA/cm2和85±2 uA/cm2;而-0.20 V的工作电位下,反应器启动时间延长到约7.5h,阳极在111±4h首次达到最大活性,电流密度为14±5 uA/cm2;对于接近热力学极限的电位水平-0.25 V的水平下,在约165 h后初次可产生催化电流,且阳极在368±5h首次达到最大活性,电流密度为3±1uA/cm2,且在该电位水平下,产电菌产生的最大电流密度为14±4 uA/cm2。
  ⑵在所设的四个电位水平下,阳极上均附着G.sulfurreducens,-0.25V工作电位下,附着量较少。扫描电子显微镜的结果表明,充当阳极的碳布,在+0.20V水平下,碳纤维上非常密实而均匀地附着了生物膜,平均厚度为1.0um;0.00 V水平下,碳纤维上较均匀地附着了生物膜,碳纤维最粗处的生物膜厚度为1.0 urn;-0.20 V水平下,碳纤维上稀疏且均匀地附着了单层生物膜,平均厚度0.4 urn;-0.25V水平下,碳纤维上稀疏地附着了G.sulfurreducens。一定范围内,电极电位越高,产电菌获得的能量越大,越利于生物膜的形成。
  ⑶对比不同电位G.sulfurreducens电子传递系统末端的CV和DPV信号,在催化期,信号存在显著差异,-0.25V电位下的主要氧化还原峰的中值电位为-0.238±0.004V,进行双电子传递。催化期的DPV结果表明,-0.25 V水平下,G.sulfurreducens的电化学信号表现为主峰中值电位在-0.25~-0.20V的范围内,进行双电子传递,而-0.20 V电位水平下,G.sulfurreducens的电化学信号为混合双峰,主峰中值电位为-0.187±0.006V,也进行双电子传递,0.00 V及+0.20 V水平下,G.sulfurreducens的电化学信号的双峰融合,形成单峰,峰电位接近-0.158±0.006 V,为单电子传递;催化期的CV结果显示,-0.25 V水平下,G.sulfurreducens的电活性中心中值电位为-0.237±0.003V,-0.20 V水平下为-0.182±0.003 V,0.00 V及+0.20 V水平下,为-0.158±0.002V,与DPV结果基本一致。非催化期的DPV结果表明,不同电位水平下的G.sulfurreducens的电化学信号基本相同,均主要包括中值电位为-0.180±0.005 V和-0.090±0.004V两对氧化还原峰,峰高度比例基本一致,而非催化期CV的结果也符合此现象,所含的两个电活性中心的中值电位与该电位基本相同。因此,不同电位水平下,G.sulfurreducens在催化期和非催化期的电化学信号不同,电位对催化期的电化学信号有显著影响。
  ⑷差异转录基因分析。对电化学信号差异最明显的+0.20 V与-0.25 V两组催化期的阳极上附着的G.sulfurreducens的基因转录水平进行分析,得出该两组样本之间有373个差异显著基因,其中,两样本均含有的基因共366个,+0.20 V组样本特有基因3个,-0.25V组样本特有基因4个。较+0.20 V样本,-0.25 V样本共有282个差异显著基因上调,其中24个基因涉及细胞色素C;有91个差异显著基因下调。并且,差异倍数4倍以上的上调基因114个。GO富集分析结果表明,282个上调基因,共涉及19条GO,分别包括BP(Biological Process)、CC(Cell Components)、MF(Molecular Function)类8、2、9条,其中显著富集的GO分别为1、1、5条,分别与“电子传递”,“膜组成”,“电子载体活性”、“NADH脱氢酶活性”、“与NADH或NADPH相关的氧化还原酶活性”、“钼离子绑定”功能及NADH脱氢酶(醌类)活性等相关;而91个下调基因共涉及23条GO,包括12条BP类,11条MF类,MF类中共有5条与“物质跨膜运输”有关的GO显著富集。KEGG通路富集分析结果显示,基于全部的差异显著基因,共有52条KEGG通路参与。上调基因共参与45条KEGG通路,包括1条极显著富集通路----“氧化磷酸化涉及的能量代谢”(p_fdr<0.001);下调基因共参与21条KEGG通路,并有3条通路显著富集,为分别与硫相关的“物质代谢”和“遗传信息处理”。综合差异基因表达分析结果,不同电极电位可引起催化期产电菌的电子传递系统发生了变化。
[博士论文] 崔红晶
临床检验诊断学 重庆医科大学 2015(学位年度)
摘要:酿酒酵母蛋白质-氧-甘露糖转移酶(Protein-O-mannosyltransferase, PMT)家族共有七个成员(Pmt1p-Pmt7p),这些成员从酵母到哺乳动物都存在一定的保守性。PMT家族蛋白都定位于内质网,主要通过调控内质网未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR),参与调控内质网蛋白质的动态平衡。内质网应激感应因子 Ire1和转录因子Hac1参与调控 UPR通路下游靶基因的表达,这些靶基因增强内质网对未折叠或错误折叠蛋白质的折叠处理能力,减轻内质网应激。在这一过程中,HAC1mRNA被剪接是UPR通路激活的关键步骤。研究显示UPR和内质网应激在多种物种的衰老和衰老相关疾病的发生和发展中具有重要作用。
  研究内容与实验方法如下:
  1.依据基因同源重组的原理构建 PMT家族单基因缺失( pmt1△~pmt6△)酵母菌株、PMT1与 HAC1或 IRE1双基因缺失(pmt1△hac1△和pmt1△ire1△)酵母菌株模型。在Scope AⅠ光学显微镜下,用玻璃纤维针对酵母母细胞和子细胞进行分离,并计数子细胞数量,统计分析酵母细胞复制寿命,研究PMT家族成员是否参与调控酵母细胞的复制寿命。采用RT-PCR检测pmt1?菌株中HAC1 mRNA的剪接情况,实时荧光定量PCR检测UPR通路中部分靶基因的转录水平, Western Blot检测内质网伴侣分子Kar2蛋白的表达水平,以探讨PMT1调控酵母细胞复制寿命与UPR信号通路的关系;
  2.依据基因同源重组的原理成功构建TED1基因缺失(ted1△)酵母菌株,PMT1与TED1双基因缺失(pmt1△ted1△)酵母菌株(Pmt1p和Ted1p形成复合物),以及 PMT1与 TED1和 HAC1三基因缺失(pmt1△ted1△hac1△)酵母菌株模型。采用酵母细胞复制寿命检测方法和实时荧光定量PCR方法,分析酵母菌株的寿命变化和UPR通路活性变化,研究PMT1与TED1在寿命调控方面是否存在关联,探讨UPR信号通路调控寿命的可能机制。
  3.分别用衣霉素和刚果红/荧光增白剂作为内质网应激和细胞壁应激的诱导剂,通过单克隆形成实验方法观察 PMT1与 TED1对细胞应激的敏感性。研究酵母细胞应激能力与UPR信号通路和细胞壁完整性通路的关系,进而探讨酵母细胞复制寿命与应激能力之间的调控关系。
  实验结果及结论如下:
  1.在PMT家族基因缺失酵母菌株中,仅pmt1?菌株平均复制寿命延长约20%(p<0.0001),缺失HAC1或IRE1基因能缩短pmt1?菌株的复制寿命。缺失PMT1基因能诱导HAC1 mRNA剪接,进而上调UPR通路中部分下游靶基因的表达水平,这些靶基因包括内质网伴侣分子(KAR2和LHS1),参与蛋白质输出的基因(FKB2)和氧化折叠的基因(EUG1和 ERO1)。同时,内质网伴侣分子Kar2蛋白表达水平也明显上调。这些结果提示 PMT1基因缺失延长酵母细胞的复制寿命,寿命延长与UPR活性上调相关;
  2.与野生型酵母菌株比较,ted1?菌株平均复制寿命明显缩短约14%(p<0.001),缺失PMT1基因能明显延长ted1?菌株的复制寿命,寿命延长依赖 HAC1的存在。并且,缺失 PMT1基因能诱导 ted1?菌株HAC1 mRNA的剪接,上调UPR靶基因的表达水平。该结果提示缺失PMT1基因可能通过上调UPR活性来恢复ted1?菌株较短的复制寿命。
  3.野生型酵母菌株中缺失 PMT1基因对内质网应激敏感,但是在hac1?菌株中缺失PMT1基因可以增强细胞对内质网应激的抗性。缺失PMT1基因可以导致ted1?菌株对内质网应激和细胞壁应激的敏感性。这表明长寿命的酵母菌株不一定具有较强的应激能力。
  综上所述,缺失PMT1基因可以延长野生型酵母细胞及ted1菌株的复制寿命,寿命延长与UPR通路活性相关;尽管PMT1基因缺失可以诱导保护性UPR靶基因和参与细胞壁应激反应转录因子的表达上调,但是没有增强酵母细胞的应激能力。这提示酵母细胞复制寿命与应激能力之间复杂的调控关系还有待进一步深入研究。
[硕士论文] 杨敏
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2015(学位年度)
摘要:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)属于芽胞杆菌属的蜡样芽胞杆菌群(B.cereus group),是一种特殊革兰氏阳性细菌,在产生芽胞的同时产生由杀虫蛋白组成的具有规则形状的伴胞晶体(主要由cry和cyt基因编码)。因其对靶标生物高效、对环境安全友好等特点而成为目前应用最广泛的微生物杀虫剂。在芽胞形成过程中,不同的Sigma(σ)因子在时空上级联起始基因转录,σK由sigK基因编码,是Bt芽胞晚期重要的Sigma因子,芽胞晚期主要涉及芽胞外壁形成、芽胞的成熟和释放、母细胞裂解、晶体的形成等重要细胞发育过程,目前对这些细胞过程所知仍然很少。因此本研究主要明确Bt中σK因子的调节子,为解析母细胞生长过程的晚期调控网络进而为阐明芽胞形成晚期细胞过程的分子机制奠定基础。
  以芽胞形成晚期全局调控因子gerE突变体作为对照,分别提取sigK和gerE突变体在T7、T10时期的总RNA进行DNA芯片分析,明确受σK控制的基因或操纵子。结果表明T7时期有158个受σK下调的基因和138个上调的基因。T10时期有878个受σK下调的基因和1317个上调的基因。利用σK因子结合位点的一致序列,分析T7和T10下调基因的启动子区域,发现264个基因的启动子具有σK因子结合位点,包括10个操纵子和242个基因。其功能包括氨基酸运输和代谢、碳水化合物运输和代谢、无机盐离子运输和代谢、信号转导、蛋白转译后修饰等其他功能和未知功能。
  表达并纯化了具有His标签的SigmaK蛋白,并对上述σK因子的调节子进行验证。前人研究已明确SigmaK控制crylAc基因的启动子转录,凝胶阻滞实验EMSA结果表明纯化的SigmaK蛋白可以与crylAc基因启动子结合,说明纯化的SigmaK具有体外与受其控制的启动子结合的功能。因此迸一步通过EMSA实验验证了6个基因(芽胞萌发相关的基因HD73_3496,HD73-335水解酶基因HD733410和芽胞外壁相关的基因bxpB,exsB,bclB)和一个操纵子(HD73_2493,HD73_2494)的启动子能与SigmaK因子结合,证明了这6个基因和1个操纵子受SigmaK因子控制。此外构建了水解酶基因HD733156的启动子和lacZ基因的融合载体,将载体转入HD73菌株及sigK突变体中,测定β-半乳糖苷酶活性发现HD733156的启动子活性在突变体中完全丧失,进一步证明了HD73_3156的转录受σK控制。
[博士论文] 张俊波
动物遗传育种与繁殖 石河子大学 2014(学位年度)
摘要:布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引发的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌能够抑制细胞的凋亡和促进细胞的自噬,导致布鲁氏菌在吞噬细胞中生存繁殖,它能引起人、畜多器官损伤和慢性感染,给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重威胁。已有研究表明PI3K/Akt信号通路不仅参与细胞凋亡、自噬等多种细胞活动和生物学效应还与病原体在细胞内的生存繁殖密切相关,然而,该信号通路否参与了布鲁氏菌在宿主细胞内的生存繁殖尚鲜有报道,本研究通过探讨PI3K/Akt信号通路对胞内布鲁氏菌生存繁殖的影响及与布鲁氏菌介导的细胞凋亡、自噬的影响,揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制,为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。
  目的:⑴检测布鲁氏菌及脂多糖是否激活小鼠巨噬细胞的PI3K/Akt信号通路。⑵阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M生存繁殖在宿主体内外的影响。⑶阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞凋亡的影响。⑷阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞自噬的影响。(5)检测PI3K催化亚基p110α在羊种布鲁氏菌16M侵染巨噬细胞过程中的功能。从而揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制,为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。
  方法:①应用Western blot技术检测:布鲁氏菌16M(16M)、其它菌株和脂多糖LPS对巨噬细胞内p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的影响;以及16M对巨噬细胞内p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的影响是否与侵染时间和侵染比例有关;PI3K抑制剂2-(4-吗琳基)-8-苯基-4氢-1-苯并毗喃-4酮(LY)对16M介导p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的抑制效果。②抑制剂LY(LY)与巨噬细胞孵育1h,然后,用16M侵染巨噬细胞,未经抑制剂LY处理的细胞作为对照组,分别在30min、45min、4h、12h和24h检测布鲁氏菌的CFU;用ELISA检测细胞上清液中IFN-γ、IL-12p70和TNF-α的分泌。选取6-8周龄雌性BALB/c小白鼠(每组10只),腹腔注射抑制剂LY(20mg/kg/day)并持续到实验结束,给药5天后感染16M,剂量为LD100(4.6×108CFU/0.2mL)和LD50(6.3×107CFU/0.2mL),统计小鼠的死亡率;感染1×106CFU/0.2mL剂量的16M,取小鼠脾脏和肝脏,计算16M的含量;利用病理切片技术,观察病理变化。③抑制剂LY与巨噬细胞作用1h,然后,用16M侵染巨噬细胞,未经抑制剂LY处理的细胞作为对照组,利用caspase-3、8、9活性检测试剂盒检测其活性变化;利用实时定量PCR和Western blot检测凋亡相关基因的表达;利用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。④用慢病毒包装Plex-MSC-EGFP-LC3质粒,转染巨噬细胞,抑制剂LY与转染的巨噬细胞作用1h,然后用16M感染细胞,在12h和24h,用共聚焦显微镜检查EGFP-LC3绿色聚点,及溶酶体与EGFP-LC3绿色聚点的共定位;利用投射电镜观察细胞中包含16M的自噬泡的数量。⑤对p110α基因设计四条特异性阳性siRNA分子和一条阴性siRNA分子,构建shRNA慢病毒表达载体pLentiLox-siRNA,将其转染巨噬细胞,通过荧光实时定量PCR技术筛选出干扰效果最好的pLentiLox-siRNA质粒;将最优pLentiLox-siRNA质粒转染RAW264.7巨噬细胞。
  结果:⑴布鲁氏菌16M感染细胞后,p-Akt(S473)和p-Akt(T308)在第1h表达量最高,且显著高于对照组和其他组(P<0.05),在第8h、12h和24h其水平恢复正常,与对照组相比其表达量无显著差异( P>0.05)。粗糙型的RB51、M5Δpgm感染的细胞中p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达显著低于光滑型的M5、16M和S2308(P<0.01)。抑制剂LY对16M介导的p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的阻断具有浓度依赖性。⑵在30min、45min、4h、12h和24h,LY处理组细胞中的细菌数量显著低于对照组细胞(P<0.05)。在第10天,攻LD100和LD50剂量后16M+LY组的小鼠成活率分别为30%和60%,对照16M组小鼠成活率分别为0和30%;16M+LY组的小鼠血清中的IFN-γ、IL-12p70和TNF-α显著高于16M组(P<0.01);16M+LY组小鼠中CD8+T细胞百分比显著高于16M组(P<0.05);16M+LY组小鼠的脾脏和肝脏的病理变化都比对照16M组小鼠较轻。⑶在4h、12h和24h,16M+LY组细胞caspase-3的OD405都显著高于对照组细胞(P<0.05);caspase-9的OD405值与caspase-3趋势一致;16M+LY组细胞中Bax的mRNA相对表达量显著高于16M组细胞(P<0.01),Bcl-2 mRNA相对表达量显著低于16M组细胞(P<0.01),16M+LY组细胞中的cleaved PARP、Bax和Cytosolic Cyt-c的蛋白表达量显著高于16M组(P<0.01);16M+LY组细胞凋亡率显著高于16M组细胞(P<0.01)。⑷在12h和24h,16M+LY组的绿色荧光颗粒显著低于16M组细胞(P<0.01);16M+LY组细胞中Beclin1和ULK1 mRNA相对表达量显著低于16M组细胞(P<0.01);16M+LY组细胞中的LC3-II/LC3-I转换率、Beclin1和ULK1的蛋白水平显著低于16M组细胞(P<0.01);16M+LY组细胞中包含16M的自噬泡与16M组细胞相比明显减少(P<0.01)。⑸在30min、45min和4h,p110α基因沉默组与正常细胞组内16M的CFU无显著差异(P>0.05),但在12h和24h时差异显著(P<0.05);在12h和24h,沉默p110α基因后,与对照组相比,感染细胞的caspase-3活性显著提高(P<0.01);促凋亡相关蛋白cleavedPARP、Bax和Cytosolic Cyt-c细胞凋亡率也显著提高(P<0.01);16M介导的IL-12p70和TNF-α的水平显著提高(P<0.01)。
  结论:①布鲁氏菌及其LPS可激活PI3K/Akt信号通路。②抑制剂LY可显著降低16M在宿主体内和体外的存活,可提高宿主的细胞免疫抵抗16M感染。③抑制剂LY可显著提高16M介导的RAW264.7巨噬细胞凋亡,并且这种细胞凋亡依赖caspase-3和caspase-9的活性。④抑制剂LY可显著抑制16M介导的RAW264.7巨噬细胞自噬。⑤沉默p110α基因,可降低16M在胞内的存活,诱导16M介导的细胞凋亡,提高细胞免疫,对16M介导的细胞自噬无影响。
[博士论文] 李道波
环境工程 中国科学技术大学 2014(学位年度)
摘要:跨膜电子传递机构是电化学活性细菌参与环境氧化还原化学的分子基础,也是细胞-受体界面电子传递过程的核心组分。目前根据分子遗传学和光谱电化学技术手段获取的对跨膜电子传递蛋白/分子的认识,无法完全解释电化学活性细菌在环境中的活性或澄清电子传递通道的组成。因此,研究电子传递机构在环境界面的生理活性,揭示细菌胞外电子传递策略的生理调控,对于深入认识电化学活性细菌的跨膜电子传递机制及其环境功能十分重要。本论文针对电化学活性细菌在细胞-环境受体界面电子传递的关键问题,研究了细菌跨膜电子传递过程的环境表现和电化学调控,探索了电化学活性细菌的电子传递策略和介导化学过程,为电化学活性细菌的应用研究提供了依据。论文的主要研究内容和结果如下:
  1.以Shewanella oneidensis MR-1对溶解态SeO32-的还原为例,揭示了电化学活性细菌的各种厌氧呼吸还原酶/分子通过异化还原对环境污染性受体进行生物解毒的能力和分子机制。通过对多种基因缺陷株还原能力的测试,证明和解析了S.oneidensis MR-1利用厌氧呼吸系统还原清除胞内SeO32-的分子机理。研究发现S.oneidensis MR-1对SeO32-的还原是快速的胞内异化过程,其主要还原产物为Se(0),Se(0)依次在胞内和外膜上以颗粒形式沉积。与一般细菌通过还原性硫醇驱动清除胞内SeO32-的还原模式不同,S.oneidensis MR-1利用多样化的厌氧呼吸系统执行对SeO32-的还原。周质空间的延胡索酸还原酶FccA作为直接还原SeO32-的黄素蛋白。还原过程对CymA的依赖性以及受延胡索酸抑制的发现同样支持这一结论并证实了SeO32-还原的电子通道。S.oneidensis MR-1周质空间中的硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶和外膜Mtr蛋白几乎不参与细胞对SeO32-的还原反应。
  2.以Geobacter sulfurreducens细胞和α-Fe2O3构建了直接的电化学界面,探索了电化学活性细菌在激发态、半导体电子受体表面的电荷缺陷中心处进行胞外放电并驱动细胞呼吸的可能性。发现在高于-0.25 V的极化电势下,光激发α-Fe2O3可以加速G.sulfurreducens细胞向α-Fe2O3的电子传递。光激发显著提高了α-Fe2O3内部电荷传导性能,使非平衡电荷得以快速转移,从而避免α-Fe2O3的还原溶解。证明了在光激发条件下细胞呼吸和放电与α-Fe2O3内部电荷分离之间的耦合关系。通过电化学和生理抑制实验,证明光电流完全来源于α-Fe2O3表面细胞的呼吸放电。从细胞粘附到α-Fe2O3表面并产生阳极呼吸电流开始,细胞异化呼吸和消耗底物的速率与界面光电流大小成正比。此外,研究发现快速的界面电子传递和相对温和的氧化能力,避免了细菌-电极界面处大量自由基的生成,使细胞在激发态α-Fe2O3表面维持良好的生化活性。
  3.在-0.1V~+0.6V的电势范围内观测G.sulfurreducens细胞在电极表面自发粘附、呼吸、放电并驯化成膜的过程,同时根据传导层的生物化学测试和电化学表征研究了成熟生物膜内部的传导特性,从而澄清了极化电势对拥有多样化氧化还原复合物的电化学活性细菌的胞外电子传递过程的影响,。发现+0.0V~+0.2V的极化电势最有利于G.sulfurreducens细胞在电极表面粘附、放电、生长,最终形成高活性、厚而致密的生物膜,单细胞在电极表面的放电效率最高;而在更高电位下,细胞初始粘附、放电明显滞后,最终形成更薄的生物膜,单细胞放电能力也较差。尽管所有生物膜内部基本的传导方式均为氧化还原活性中心之间的电子隧穿,但是在低电势下培育的生物膜合成更多的胞外含血红素蛋白以及更少的胞外多糖,同时表现出更低的电子转移电阻。研究还发现,各生物膜在电极表面的主要氧化还原物种种类一致,但在+0.2V~+0.4V下的数量比其他电势下的更丰富。
  4.利用四种具有电子摄入生理特征的细菌在惰性固体电极表面的固着,表征了阴极条件下细胞-电极的直接电化学相互作用,以研究阴极生物催化的基本模式和实现条件。发现在电子受体存在时电极表面的T.denitrificans和G.sulfurreducens细胞可以立即表现出阴极电催化活性,产生最大阴极电流分别为-7.1μA/cm2和-4.2μA/cm2。而A.thiooxidans和G.metallireducens则需要相当的延迟才产生显著的阴极电流,可能发生了一定的生理代谢改变。极化电位的驯化对细胞的阴极电化学活性非常重要,在-0.3 V阴极电势下驯化的细胞比在阳极电势下驯化的具有更强的阴极电化学活性。利用G.sulfurreducens生物膜进行的实验表明,电子受体对阴极电流的产生是必需的。此外,细胞在电极表面的两种固着方式产生相近的阴极电化学活性,并在电极表面都存在氧化还原活性物种。
[硕士论文] 胡荣柳
食品科学 河南科技大学 2013(学位年度)
摘要:本实验拟以大肠杆菌及其多个H2O2相关基因的突变体资源为材料,利用可见、紫外分光光度法,透射电子显微镜等技术,研究 H2O2对细菌间体功能的介导及其分子机制,探讨细胞分裂中 H2O2参与的间体的功能;阐明 H2O2额外大量产生及时空定位转换的问题,分析这些额外产生的 H2O2的胞内来源。该项目的完成将进一步阐明和完善 H2O2的作用机理和生物学功能。对细菌特有细胞器-间体功能完成机制的阐释,将有助于细菌功能学研究的进一步深入。
  实验结果表明:在常规组织化学方法基础上调整和改进了电镜组织化学染色法,确定了 H2O2的染色与样品固定同时进行是定位细菌细胞中内源性 H2O2的一种可取方法。观察了大肠杆菌 H2O2在细胞分裂周期中的时空定位变化。基因突变和外源加入 CAT处理都会影响胞内 H2O2的水平,H2O2含量与大肠杆菌的生长繁殖呈负相关。离体后间体中仍有大量 H2O2产生和积累,确定间体是额外 H2O2的胞外产生来源。加入盐酸羟胺后立即在4℃条件下冰浴处理10min,之后在40℃条件下温浴40min,为间体重新释放 H2O2的最佳条件。间体对原生质体再生起到积极作用。结论:在大肠杆菌菌株中发现胞内额外的大量 H2O2积累和定位与细胞分裂的进程密切相关,这种 H2O2的时空变化很可能是细菌分裂时的普遍现象。且H2O2对细菌增殖中具有重要的作用。
[博士论文] 仲国维
生物学;微生物学 南京师范大学 2013(学位年度)
摘要:细胞分裂(cell division)过程是真菌(fungi)进行无性繁殖的重要方式,对于真菌的形态建成是必需的。细胞分裂一旦失调将会导致真菌的生长受损甚至死亡。研究这个过程的发生机制,对于控制医学和农业上有害真菌的增殖或促进工业上有益真菌的生长都具有非常重要的意义。
  真菌的胞质分裂(cytokinesis)的发生是由母细胞通过收缩肌动蛋白环从而分裂其细胞质,最终产生两个子细胞的过程。胞质分裂是有丝分裂细胞核分裂之后的最后也是最关键的一步。无数的研究表明,该过程需要一个非常保守的信号网络的激活,这个信号网络在芽殖酵母中称为有丝分裂退出网络(Mitotic ExitNetwork,MEN),在裂殖酵母中称为隔膜形成网络(Septum Initiation Network,SIN)。虽然不同的真菌会有不同的机制来完成胞质分裂的过程,但在哺乳动物及构巢曲霉(Aspergillus nidulans)等真菌中的研究已有越来越多证据表明这个网具有一定的保守性。
  与单细胞的酵母不同,丝状真菌构巢曲霉的菌丝是由隔膜所间隔的多核细胞。在构巢曲霉的孢子萌发过程中,分生孢子首先经过多轮的核分裂生成8到16个核,但是直到细胞达到一定的体积后才会产生隔膜,第一个隔膜通常在孢子头和芽管的分隔处生成。因此,菌丝中的胞质分裂和有丝分裂不是同步进行的。
  在构巢曲霉中SIN途径的SEPH蛋白是由温度敏感型菌株筛选实验发现的,是裂殖酵母SIN信号途径中的丝-苏氨酸激酶Cdc7p的同源蛋白,它是胞质分裂早期所必须的组分。但是目前关于SEPH的调节元件是否存在,以及它们是正向调控还是反向调控SEPH知道的很少。为了对这一机制进行研究,前期实验中我们通过紫外诱变获得了116株能够恢复sepH缺陷的突变菌。通过杂交分离、回交验证、互补实验(complementation test)并测序得到了反向调节基因(suppressor)磷酸核糖焦磷酸合成酶Anprs1(AN6711.4,Phosphoribosyl pyrophosphate,PRPPsynthetase)。
  本课题首先对该基因单独设计引物扩增并连接入质粒Prg3-AMA1-NotⅠ,再次进行互补实验转入菌株Sin110仍旧得到了和前期相同的结果。这说明Sin110的病态表型确实是由Anprs1基因造成的。进一步通过反向遗传学验证Anprs1基因是sepH的反向调节子,我们构建了乙醇启动子控制的GFP标记的Anprs1同源整合菌株、透射电镜观察、Anprs1完全敲除和C端部分敲除等验证了Anprs珀勺功能,又通过PRS酶活测定、qRT-PCR技术、酵母双杂交技术验证了Anprs1,2,3家族蛋白的功能。结果显示AnPRS1蛋白弥散定位在胞质中,在正在形成的隔膜上有微弱的聚集信号,推测其在胞质近隔膜的位置参与隔膜形成。抑制表达情况下和Sin110菌株表型一致,电镜结果显示Anprs1基因受到抑制时隔膜呈弯曲状。Anprs1完全敲除菌表型和野生型一致,但是C端敲除菌表型和Sin110菌株一致。AnPRS酶活测定显示Sin110菌株中酶活最低,显示了正常的胞质分裂和PRS酶活相关。但Anprs1,2,3基因测序都没有突变,我们推测酶活的降低可能和这三个基因的转录有关,Sin110菌株的qRT-PCR的结果显示Anprs1,Anprs2和Anprs3都明显表达下调,把这三个基因全部克隆入载体Prg3-AMA1-NotⅠ,共转入Sin110菌株,结果其病态表型被完全弥补。进一步的酵母双杂交实验表明构巢曲霉中存在AnPRS家族形成三聚体发挥功能。
  另外根据酵母中对蛋白磷酸酶2A(protein phosphatases2A,PP2A)调节亚基能够反向调节SIN的发现及其和AnPRS家族都能转移磷酸基团的功能。我们找到并研究了构巢曲霉中PP2A的两个调节亚基parA和pabA,虽然不能反向调节sepH,但对于构巢曲霉的形态建成起重要作用。
  本课题对于构巢曲霉胞质分裂的研究,将为我们在实际应用中抑制或促进真菌的无性繁殖提供重要的理论基础,对医学上控制肿瘤治疗提供强有力的理论依据。
[硕士论文] 钱娉婷
化学工程与技术;生物化工 东北农业大学 2012(学位年度)
摘要:为了发现新的活性化合物,对本实验分离得到的一株具有较强抗菌活性的新种微生物Actinoalloteichus nanshanensis sp.nov.NEAU119的代谢产物进行分离纯化,结构鉴定和活性测定。
   本实验运用对人体肺癌细胞株A549的体外抗肿瘤及对表皮葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌筛选模型,结合TLC检测,首先对NEAU119菌株的最佳发酵培养基进行筛选,最终选定XG培养基(葡萄糖2.0%,Malt Extract1.0%,玉米可溶性淀粉1.0%,Yeast Extract0.4%,CaCO30.2%,pH7.2-7.4)为最佳培养基。之后利用发酵罐(50 L)进行放大发酵,利用硅胶、凝胶、HPLC等分离方法对菌株的发酵产物进行分离,最终得到12个化合物,利用核磁共振和质谱等分析方法进行结构鉴定,确定3个为含有5,5,6-三环骨架和四胺酸结构单元的大环内酰胺类化合物,其中化合物2为新化合物,1和3为已知化合物;另外9个化合物(4-12)为结构较新颖的环戊酮类新化合物,最后,对其中11个化合物进行抗肿瘤和抗菌活性评价,化合物1,2,3,8对人体肺癌细胞株A549的IC50分别为:1.71,2.37,1.36和14.67μg mL-1。化合物8和12对人体白血癌细胞株K562的IC50分别为11.87,92.03μg mL-1,对肾癌细胞株ACHN的IC50分别为23.36,97.60μm mL-1。另外化合物1,2,3表现出较好的抗菌活性。10个新化合物分别命名为:4-dehydroxy dihydromaltophilin(2);4-(3-hydroxypropy1)-6,7-dihydro-2H-cyclopenta[c]pyridine-1,5-dione(4);2-(hydroxymethy1)-6-(3-hydroxypropy1)-2-me-thoxy-3,3a-dihydro-2H-cyclopenta[b]furan-4(6aH)-one(5);(z)-2-(1,5-dihydroxypent-2-en-2-y1)-3-(hydroxymethy1)cyclopent-2-enone(6);(E)-2-(1,5-dihydroxypent-2-en-2-yl)-3-(hydr-oxylmethy-1)cyclopent-2-enone(7);2H-2-(2-hydroxyethy1)-4-(3-hydroxypropy1)-6,7-dihydro-cyclopenta[c]pyridine-1,5-dione(8);4R*,7R*,11R*,2H-3,4,4a,5a,7,8-hexhydro-4-hydroxy-pyra-no[2,3-b]cycl-openta[d]pyran-9(6H)-one(9);4R*,7S*,11S*,2H-3,4,4a,5a,7,8-hexhydro-4-hydroxy-pyrano[2,3-b]cyclopenta[d]pyran-9(6H)-one(10);7R*,11R*,2H-3,4,4a,5a,7,8-hexhydro-pyrano[2,3-b]cyclopen-ta[d]pyran-9(6H)-one(11);2H-3,5a,7,8-hexhydro-pyrano[2,3-b]cyclopenta[d]pyran-9(6H)-one(12)。
[博士论文] 刘玉涛
微生物学 南京农业大学 2012(学位年度)
摘要:囊泡运输与细胞自噬是真核生物维持正常生命活动所必需的基本生理过程。囊泡运输是实现胞内物质转移的重要途径,而细胞自噬则是维持细胞稳态和应对环境因子的胁迫所必需的一类亚细胞降解途径。
   酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)体内的囊泡运输受到Ypt/Rab类小G蛋白(GTPase)的调控,而小G蛋白的活性又受到鸟苷酸交换因子(GEFs)和GTPase激活蛋白(GAPs)的调节。酿酒酵母中的转运蛋白颗粒(Transport Protein Particle,TRAPP)复合体是一类拴系因子,同时也是小G蛋白Ypt1和Ypt31/32的GEFs,可激活相应的小G蛋白。目前酵母中已报道的TRAPP复合体有三类:TRAPPⅠ、TRAPPⅡ和TRAPPⅢ,分别在内质网至高尔基体的囊泡运输、高尔基体内部及离开高尔基体的运输和细胞自噬过程中起作用。这些TRAPP复合体由六个共同的亚基(Bet3、Bet5、Trs20、Trs23、Trs31、Trs33)构成TRAPPⅠ核心复合体,在此基础上,TRAPPⅡ还含有Trs120、Trs130、Trs65和Tca17四个特异性亚基,TRAPPⅢ含有Trs85特异性亚基。这些亚基中,Bet3作为共有必需亚基,在囊泡运输中有着非常重要的作用;Trs65是一种只存在于真菌,而尚未在哺乳动物等高等真核生物中发现的蛋白,其主要起到组装和稳定TRAPPⅡ复合体的作用;而Trs85则主要作用于细胞自噬的启动过程。已有越来越多的证据显示小G蛋白及其GEFs除了在调控囊泡运输中发挥作用之外,也参与对细胞自噬过程的调节。但是,至今没有研究系统地比较TRAPP复合体的同一亚基在囊泡运输与细胞自噬过程中的不同功能及分析囊泡运输与细胞自噬过程之间的关联性。本论文将就三种具有代表性的TRAPP复合体亚基Bet3、Trs65和Trs85在囊泡运输和细胞自噬过程中的作用开展研究并进行比较,得到如下主要结果:
   1.Trs65、Trs85及Bet3参与了胞内的囊泡运输利用四分体分离技术和直接敲除法得到了trs65Δ菌株、trs85Δts菌株和trs65Δtrs85Δts菌株,并对上述菌株的胞内Snc1蛋白所代表的囊泡运输情况进行了研究。结果发现,在营养丰富的条件下,TRS65敲除未引起Snc1运输的异常,TRS85敲除则引起了Snc1极性运输功能的丧失,在胞内呈弥散状;TRS65和TRS85双敲除所引起的囊泡运输缺陷较单敲除更为严重;通过利用荧光蛋白标记的胞内不同位点的标志蛋白和细胞活体染色技术,初步确认了TRS85敲除或TRS65和TRS85双敲除所引起的GFP-Snc1蛋白运输受阻于内质网(ER),而从质膜向内体运输的内吞途径未受影响。在氮素营养缺乏条件下,TRS65敲除菌株细胞中Snc1向液泡的运输也出现了受阻现象。有关TRAPP复合体公用必需亚基Bet3参与囊泡运输的功能已有一些报道,本论文中进一步将CPY-GFP整合入bet3ts菌株,发现Bet3突变导致CPY在营养丰富条件和氮素营养缺乏条件下向液泡的运输均受阻,情况类似于Ypt1突变所引起的运输缺陷,说明Bet3亚基参与了CPY所代表的囊泡运输。
   2.TRAPP复合体亚基突变所引起的生长、囊泡运输及液泡形态的异常可以通过其对应小G蛋白的过量表达来进行抑制在trs85Δts及trs65Δtrs85Δts等温敏感型菌株中过量表达调控物质进出高尔基体的小G蛋白Ypt1和Ypt31,发现突变体的高温敏感性、GFP-Snc1运输缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通过过量表达Ypt1而不是Ypt31进行抑制。这些结果与trs130ts菌株的高温敏感性、GFP-Snc1运输缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通过过量表达Ypt31而不是Ypt1进行抑制构成对应关系,表明TRAPP复合体亚基可通过其对应的小G蛋白调控相关的生理过程。
   3.Trs65和Trs85参与了饥饿处理条件下非自噬蛋白向液泡的运输跟踪了非自噬蛋白GFP-Snc1和GFP-Snc1-PEM在饥饿条件下向液泡中运输的规律,发现TRS85敲除或TRS65和TRS85双敲除菌株对饥饿处理的响应速度较野生型和TRS65单敲除菌株慢,响应程度也明显低。当用FM4-64染料对饥饿处理20小时的GFP-Snc1-PEM整合菌株进行染色,发现TRS85敲除或TRS65和TRS85双敲除细胞的液泡内大部分为空的,而野生型和TRS65敲除细胞的液泡内充满了内容物。Trs65虽然不显著影响细胞自噬过程,但饥饿处理导致大量GFP-Snc1在trs65Δ细胞中的累积。这些结果说明Trs65和Trs85均参与响应饥饿处理后物质向液泡的定向运输过程。
   4.Trs85或Trs65和Trs85共同参与了饥饿处理后单个圆形液泡的形成细胞饥饿处理后,随时间的进程,发现trs65Δ菌株、trs85Δts菌株、trs65Δtrs85Δts菌株及其野生型菌株细胞的液泡都有变成单个圆形液泡的趋势,但是在变化速度和程度上存在较大的差异。TRS85敲除和TRS65与TRS85双敲除菌株中最终单个圆形液泡率低于野生型菌株,经方差分析表明存在显著性差异,说明Trs85或Trs65和Trs85共同参与了饥饿处理后液泡的融合过程。
   5.Bet3参与细胞自噬并部分通过小G蛋白Ypt1起作用通过在bet3ts菌株中整合GFP-Atg8、Atg9-3×GFP以及RFP-Ape1等自噬相关蛋白,研究了这些蛋白在营养丰富和营养缺乏条件下的运输情况,并结合Western blot技术,发现Bet3亚基参与了细胞的Cvt途径(Cytoplasm to Vacuole Targeting pathway)和巨自噬,其突变会导致RFP-Ape1在胞内形成一个亮的圆点,而GFP-Atg8无法向液泡运送等严重的自噬缺陷表型。进一步统计分析表明野生型和突变体间GFP-Atg8与RFP-Ape1的共定位率、Atg9-3×GFP与RFP-Ape1的共定位率以及Atg9-3×GFP点的亮度和直径,都有显著性差异。此外通过TAKA试验,表明Bet3突变影响了Atg9向PAS(Pre-autophagosomal structure/Phagophore assembly site)的顺向运输。这些结果说明,Bet3突变影响了Atg8的募集和Atg9的运输,从而导致细胞自噬无法进行。基于Bet3可能通过TRAPP复合体作用于Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31/32调控细胞自噬的可能性,本研究探讨了细胞自噬过程中Bet3与Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31之间的关系,结果表明,在营养丰富条件下,Ypt1和Ypt31单独过量表达或同时过量表达均无法抑制Bet3突变所导致的自噬功能缺陷;而在营养缺乏的条件下,Ypt1可部分抑制突变体中的自噬缺陷,且Ypt31可以促进Ypt1的抑制效果。
   以上对TRAPP复合体不同类型的亚基参与囊泡运输和细胞自噬的研究结果,将为进一步分析这些亚基在囊泡运输与细胞自噬中的作用,解析这两大生理过程之间的联系提供理论依据。
  
[硕士论文] 李霞
微生物学 山东大学 2012(学位年度)
摘要:粘细菌是一类具有复杂多细胞社会学行为的革兰氏阴性单细胞滑动细菌,能够合成多种抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、免疫调节等生物活性的天然产物。
   黄色粘球菌(Myxococcus xanthus, M.xanthus) DK1622是研究粘细菌多细胞群体行为及遗传与进化的陆生模式菌株,属于孢囊杆菌亚目的粘球菌属,不含内源性质粒,染色体为一条环状双链DNA,基因组序列全长为9.14Mb左右,其多细胞群体行为主要表现为双运动系统支配的滑行运动、子实体发育及粘孢子形成、自然环境中的群体捕食行为等。
   纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)属于堆囊菌亚目的堆囊菌属,具有迄今为止发表的最大的原核生物基因组,是粘细菌中次级代谢产物数量最多、种类最为丰富的一个菌种,合成的次级代谢产物几乎占所有已发现粘细菌种类的一半,并且几乎100%的菌株都具有合成生物学活性物质的能力。
   埃博霉素(epothilone)即是纤维堆囊菌产生的一类大环内酯类聚酮化合物,具有促微管聚合活性,是继紫杉醇之后发现的作用于微管的抗肿瘤化合物中最令人兴奋的研究热点之一,是极具潜力的抗癌药物。但是由于代时长(16h)、遗传操作体系不成熟及遗传背景不清晰等限制因素,纤维堆囊菌的研究远远落后于其它药源微生物,埃博霉素的生物发酵也难以工业化生产,因此异源表达可能成为一种提高埃博霉素发酵产量的有效途径。而作为异源表达的合适的“底盘”细胞,应具有精简、健壮的基因组结构,即“最小”基因组,从而最大程度的降低噪声干扰,提高对所设计系统的可控性和可操作性。
   本课题研究目的是为了寻找黄色粘球菌DK1622基因组水平转移获得的非必需基因簇,首先对DK1622基因组岛进行生物信息学预测和必需性分析,并进行大规模失活实验以确定基因组岛片段的必需性,以期为粘细菌“最小”基因组研究奠定基础。
   本论文首先采用IslandPath预测了DK1622基因组19个片段可能为水平转移的基因组岛(GIs),总长度接近400kb,约占基因组全长的4.5%左右;接着从基因注释、蛋白比对、代谢途径预测以及基因表达分析等方面对预测的19个GIs进行了基因必需性分析。分析结果显示,GIs一半多基因编码未知功能的假定蛋白,不参与DK1622的基本初级代谢途径,发挥的生物学功能尚不清晰,因此,我们初步推测GIs是DK1622的非必需基因,但是表达分析显示部分基因在粘细菌生长阶段和发育阶段能够表达;为了进一步确定GIs在DK1622维持正常生命活动中的必需性,我们借助自杀性质粒的同源重组进行GI失活实验,实验获得了12株GI敲除突变株,生长能力分析结果显示12个GI不能影响DK1622正常生命活动,是DK1622的非必需基因,因此可以进行大规模基因组片段剔除来精简基因组。本部分实验结果为我们下一步的“最小”基因组研究和“底盘”细胞的构建提供了依据和基础。
   同时,为了研究GIs在粘细菌社会学行为中发挥的作用,我们对12株GI缺失突变株的多细胞群体行为表征进行了分析。结果显示,GIs的敲除对粘细菌DK1622的双运动系统、捕食能力影响不大,GI01和GI03在粘细菌的子实体发育及孢子产生方面发挥着一定作用,这将有助于我们更好地理解粘细菌的进化适应问题。
[硕士论文] 周相如
微生物学 山东大学 2012(学位年度)
摘要:能源、资源以及环境问题是21世纪人类生存发展所面临的最严峻挑战,也是制约我国社会经济发展的主要因素。从长远看,石油资源将在本世纪上半叶迅速走向枯竭的边缘,开发可持续利用的替代资源的任务已非常紧迫。生物质能(biomass energy),就是太阳能以化学能形式贮存在生物质中的能量形式,即以生物质为载体的能量,它直接或间接地来源于绿色植物的光合作用,可转化为常规的固态、液态和气态燃料,取之不尽、用之不竭,是一种可再生能源,同时也是唯一一种可再生的碳源。纤维素类物质是生物质资源的主体部分(占其总量的80%以上),价格低廉,供应充足,且尚未得到充分开发利用。
   哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii ATCC33406)是自然界中广泛存在的一类可降解结晶纤维素的好氧细菌,它降解结晶纤维素速度较快并且彻底。哈氏噬纤维菌降解结晶纤维素的策略不同于已知的好氧真菌或厌氧细菌,其菌体不分泌明显的胞外纤维素酶,菌体表面也未检测到纤维小体结构,参与结晶纤维素降解的相关酶和蛋白尚缺乏研究。因此,哈氏噬纤维菌作为一种独特的结晶纤维素降解细菌,对其纤维素降解机制的阐明,将对开发新的纤维素降解策略以更好利用纤维素资源有重要意义。本论文以C.hutchinsonii为研究对象,围绕其胞外分泌的主要蛋白和可能存在体眠状态的生理特征,初步探究了CHU_0344蛋白和CHU_0099蛋白的生物学功能,为进一步揭示C.hutchinsonii独特的胞外蛋白分泌机制与休眠状态的复苏因子提供重要依据。
   CHU_0344蛋白是C.hutchinsonii胞外的主要分泌蛋白,而且具有结合微晶纤维素的能力。生物信息学分析显示CHU_0344没有信号肽,但具有类似CTD的碳端结构域,可能是通过一种新型的蛋白运输系统porSS运输到胞外的蛋白。本论文通过分子克隆转化技术在E.coli中成功表达了可溶性的CHU_0344融合蛋白,并同时从菌体培养物中分离纯化了天然CHU_0344蛋白,通过比较融合蛋白和天然蛋白的性质和结构特点发现,天然蛋白和融合蛋白均具有结合微晶纤维素的能力,但是两种蛋白的结构有所不同。CHU_0344天然蛋白是一种核酸结合蛋白,蛋白质中的巯基以自由巯基的状态存在,没有明显的二硫键结构,Westernblot结果显示该蛋白主要定位在细胞表面或分泌到胞外。而异源表达的融合蛋白则没有结合核酸,并形成二硫键结构。结果表明该蛋白在C.hutchinsonii和E.coli中的成熟过程明显不同,为进一步深入研究C.hutchinsonii新型的胞外蛋白分泌机制提供依据。通过基因敲除技术获得CHU_0344基因敲除突变株,发现突变株在固体介质上的运动能力明显下降,说明CHU_0344可能与C.hutchinsonii的运动相关。
   C.hutchinsonii在培养后期细胞形态发生明显变化,活性也显著下降,推测可能存在休眠状态。生物信息学分析显示,CHU_0099同沙门氏菌的复苏促进因子(resuscitation promoting factor,Rpf)的序列有一定相似性,同源模建显示CHU0099蛋白质的三级结构也与沙门氏菌的Rpf蛋白具有高度的相似性,因此推测CHU_0099蛋白可能是一种复苏促进因子。通过基因敲除技术获得CHU_0099基因敲除突变株,发现突变株在固体介质上的运动能力明显下降,在液体培养条件下的生长能力和在固体平板上的菌落形成能力均有所下降。通过分子克隆转化技术在E.coli中成功表达了可溶性的CHU_0099融合蛋白,证明CHU_0099融合蛋白能够促进C.hutchinsonii野生株的衰老细胞的复苏生长,说明该蛋白可能是C.hutchinsonii的复苏促进因子,这是在拟杆菌门中首次发现的类Rpf蛋白。
[硕士论文] 熊娟
微生物学 山东大学 2012(学位年度)
摘要:粘球菌Myxococcus xanthus(M.xanthus)是一类具有复杂社会学行为的革兰氏阴性细菌。在营养丰富条件下,细胞通过分别称作Social(S)运动和Adventurous(A)运动的双运动系统在固体介质表面实现上滑动运动;在饥饿条件下,细胞通过群体运动形成子实体结构并分化成抗逆性的粘孢子以度过不良环境。粘细菌复杂的社会学行为与其复杂的调控系统紧密相关。
   粘球菌的子实体形成包括单个细胞感知饥饿信号,群体细胞感知饥饿信号和细胞聚集形成子实体并分化成抗逆性孢子三个主要流程。双组份系统(twocomponent system,简称TCS)是原核细胞中主要的信号感应与传导系统,可以识别胞外信号并调控下游相应基因的转录从而使细胞对外界环境变化产生应答。粘球菌基因组编码有大量的TCS,它们组成了一个复杂的网络,在枯球菌子实体发育等行为中发挥着重要作用。
   我们前期研究中发现了一个新的含有典型的信号接受结构域(REC)的蛋白,预测为双组份系统中的应答调控蛋白或信号传递蛋白。它的缺失导致菌株表现出特殊的发育性状,饥饿条件下菌体早期能够聚集成不典型的子实体,但无法生成抗逆性孢子,我们命名为DidR(defective in developmental regulator)。那么,DidR在已知的粘球菌发育调控网络中处于怎样的位置,又是如何发挥作用的呢?
   包括运动、胞外多糖(EPS)产生及发育生孢等能力在内的突变体性状分析显示,与野生型菌株DK1622相比,敲除菌株△MXAN1093的EPS产量升高,但运动能力无明显变化,饥饿条件下菌体早期能够聚集成不典型的子实体,但无法生成抗逆性孢子;对其磷酸化位点定点突变菌株D128N的分析显示,其A及S运动能力均降低,饥饿条件下菌体早期聚集缓慢,后期无法生成抗逆性孢子。通过对比DK1622、△XAN1093和D128N的性状,我们得到以下结论:(1)DidR蛋白的磷酸化位点的突变可能通过抑制EPS产生而抑制菌体运动;(2)DidR蛋白的非磷酸化形式抑制发育早期的聚集过程;(3) DidR的缺失影响孢子的生成。
   反转录PCR分析显示didR与其上游基因MXAN1096-1094共转录,提示它们可能组成一个操纵子而发挥相同或相关功能。生物信息学预测显示MXAN1096-1094均与脂多糖(LPS)核心多糖组分脱氧辛酸KDO的合成与激活有关,这意味着DidR也可能与LPS的合成相关。提取DK1622、△MXAN1093和D128N的LPS并进行SDS-PAGE分析发现△MXAN1093展现出与野生菌株DK1622不同的带型,D128N与DK1662带型基本相同。我们推测△MXAN1093的LPS可能部分受损,D128N的LPS不受影响,△MXAN1093的LPS具体发生了怎样的变化仍需要进一步的研究。另外,我们构建了didR共转录基因kdsC(MXAN1094)敲除菌株△MXAN1094,该菌株与DK1622相比S运动降低但EPS产量升高,对该菌株的LPS进一步分析发现该菌株的LPS受损。研究者们发现影响S运动主要与四型pili、胞外多糖和脂多糖三类基因有关,其中LPS核心多糖组分KDO对S运动的影响尚为空白。kdsC与KDO的激活相关,△MXAN1094敲除菌株的性状说明了LPS核心糖KDO与S运动的相关性。
   突变菌株性状分析和基因组织分析为研究DidR的功能提供了一定的线索,为进一步对DidR在发育通路中的位置进行定位,有必要了解DidR是作为应答调控蛋白还是磷酸化信号传递蛋白起作用。我们利用凝胶阻滞实验对DidR的DNA结合能力进行分析,首先异源表达了DidR蛋白,通过Bandshift实验对其DNA结合能力进行分析发现该蛋白可能具有DNA结合能力。为了进一步了解该蛋白结合的DNA片段,实验中采用了体外蛋白钓取DNA的方法和体内染色质免疫共沉淀的方法,但尚未得到可能结合的DNA片段。
[硕士论文] 申靖
微生物学 山东大学 2012(学位年度)
摘要:生物表面活性剂主要是微生物在一定条件下培养时,在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物。生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似,但相比之下,生物表面活性剂可生物降解,具有较好的环境相容性,无毒或低毒,结构多样,可适用于多种环境。因此对生物表面活性剂已进行广泛的研究,并极有可能替代化学合成的表面活性剂。
   槐糖脂是一种重要的糖脂类生物表面活性剂,目前己获得广泛的研究。槐糖脂分子由亲水性部分和疏水性部分组成,疏水性部分是饱和或不饱和的十六或十八个碳原子的ω-(或ω-1)羟基脂肪酸,亲水性部分是一分子槐糖(葡萄糖-β-1,2-葡萄糖苷),分为内酯型和酸型两大类。本实验室从环境中分离出的非致病性拟威克酵母菌株(Wickerhamiella domericqiae Y2A)可产生320 g/L的槐糖脂,具有极大的商业化应用潜力。因此对槐糖脂深入研究有助于我们得到具有优良表面特性的新型槐糖脂,为扩展槐糖脂在日化、食品及医药等众多领域的应用奠定基础。
   本论文主要的研究内容及结果如下:
   1.对中等碳链长度槐糖脂的分离、纯化及鉴定。
   在发酵培养基中添加中等碳链长度的烷烃(正辛烷、正癸烷、正十二烷和正十四烷)为亲脂性底物,同时以只添加葡萄糖的发酵培养基为对照,采用HPLC-MS的方法分析拟威克酵母所产槐糖脂的种类,并采用GC-MS的方法分析槐糖脂粗品中脂肪酸的碳链长度、不饱和度、末端羟基化的程度。以正辛烷为亲脂性底物时,采用两种分析方法均未检测到中等碳链长度槐糖脂及脂肪酸的存在。以正癸烷为亲脂性底物时,HPLC-MS分析可检测到一定量的碳链长度为14的酸型槐糖脂的存在。当发酵培养基中加入正十二烷时,两种方法均可检测到较大含量的碳链长度为12和14的酸型槐糖脂。以正十四烷为亲脂性底物时,可检测到对应长度的饱和及单不饱和的酸型槐糖脂。四种培养条件下均检测到正常碳链长度的酸型和内酯型槐糖脂,未检测到中等碳链长度的内酯型槐糖脂的存在。这些结果表明,通过向培养基中添加碳链长度12以上的烷烃,可得到大量碳链长度为12和14的酸型槐糖脂。
   2.实时荧光定量PCR检测与脂肪酸碳链延长和代谢相关基因的转录分析。
   分别选取四个与脂肪酸代谢和β氧化相关的基因和一个线粒体内与脂肪酸延长相关基因,检测5个基因在以四种中等碳链长度的烷烃为亲脂性底物合成槐糖脂时的表达差异。与加入正辛烷相比,拟威克酵母在十四烷烃培养条件下,与脂肪酸代谢和β氧化相关的四个基因的表达量较大;同理,与正癸烷相比,在正十二烷烃培养条件下,与脂肪酸代谢相关的四个基因的表达量较大。这表明拟威克酵母对较长碳链的烷烃的降解幅度较大。
   3.编码脂肪酸合酶α亚基基因的敲除及该基因敲除株(△F)所产槐糖脂组分分析。
   依据基因重组的原理和double-joint PCR的片段融合方法,构建了长度为6157 bp的携带潮霉素B抗性基因的编码乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因(ura3)的敲除盒。采用电转化的方法,成功得到尿嘧啶营养缺陷型的拟威克酵母菌株。以此菌株为出发菌株,构建长度为4395 bp的携带ura3基因的敲除盒,将该同源同组片段通过电转化的方法转入尿嘧啶营养缺陷型的拟威克酵母菌株。以十二烷烃为发酵的亲脂性底物,采用GC-MS和HPLC-MS的方法检测脂肪酸合酶α亚基基因的敲除株与野生拟威克酵母菌株发酵产物的差异。以正十二烷烃为亲脂性底物,脂肪酸合酶α亚基基因被敲除后,拟威克酵母所产槐糖脂的主要组分是亲脂性基团为油酸的双乙酰化的酸型槐糖脂。
[硕士论文] 张成家
微生物学 山东大学 2012(学位年度)
摘要:嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)是一种中度嗜热嗜酸化能自养革兰氏阴性硫氧化细菌,能够氧化还原型无机硫化合物以获得生长所需的能量。嗜酸性喜温硫杆菌在生物浸矿过程中发挥着重要作用,但是由于其生长速率慢,有机质敏感,嗜酸性环境,硫代谢系统复杂等不利因素的影响,使得对嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢的研究进展缓慢。
   硫氰酸酶是一种硫代硫酸盐硫转移酶,广泛存在于各种生物体的各种代谢过程中。虽然已经发现了七十余年,由于其生物学底物不是很清楚,所以其功能仍然备受争议。在嗜酸性喜温硫杆菌A.caldusMTH-04基因组中发现四个硫氰酸酶基因,其中rhd2475所在的基因簇在其他嗜酸性喜温硫杆菌菌株以及氧化亚铁嗜酸硫杆菌中通过组学方法被证明可能参与硫代谢过程。
   为更好地阐述硫氰酸酶在嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢过程中的作用,本论文通过异源表达并纯化得到硫氰酸酶,鉴定其酶学性质。同时通过基因敲除的方法对硫氰酸酶的作用进行研究。首先通过启动子分析以及反转录PCR实验讨论了硫氰酸酶基因敲除的可行性,而后构建置换敲除自杀质粒pRE-rhd,利用接合转移的方法在卡那霉素抗性平板上筛选敲除菌株,结果发现得到的57株菌株全部为单交换菌株,可能由于硫氰酸酶为必需基因,敲除造成致死突变。因而构建了I-SceⅠ的表达及硫氰酸酶回补质粒pIS-rhd,并且在置换敲除自杀质粒pRE-rhd的基础上,加入归位内切酶I-SceⅠ识别位点,构建了无痕敲除自杀质粒pML-rhd。通过接合转移的方法利用抗生素筛选得到单交换菌株,将质粒pIS-rhd导入单交换菌株中,胞内表达产生的I-SceⅠ识别整合到染色体上的特异性位点,并切割后诱发细胞内的重组修复机制,从而增加同源重组的概率并得到无痕敲除菌株。在挑取的150个菌落中筛选得到了3个突变菌和7株野生菌,对嗜酸性喜温硫杆菌中必需基因的无痕敲除进行了探索。
[硕士论文] 冯泽华
微生物学 苏州大学 2012(学位年度)
摘要:琼脂酶在海藻的单细胞分离、原生质体制备以及具有生理功能活性的海藻寡糖的酶法生产和结构研究中具有重要使用价值。目前研究的琼脂酶主要由海洋细菌产生。不同的废水中含有大量化合物,拥有丰富的微生物资源。本文从印染废水中分离到一株产琼脂酶细菌Q5,经伯杰氏菌种鉴定手册和16SrDNA序列分析鉴定,将其归属于红球菌属(Rhodococcussp.),这是首次报道该属菌的产琼脂酶特性。
   对Q5的生长及产琼脂酶条件进行初步优化。结果表明,Q5在培养基初始pH值4.0-9.0、温度15℃-35℃、NaCl浓度0%-5%条件下能生长。Q5所产的琼脂酶为诱导酶,实验中除乳糖之外的糖对其产酶起抑制作用。Q5能利用淀粉,不能利用纤维素、羧甲基纤维素(CMC)。当乳糖或淀粉作为唯一碳源、能源时,培养基中也能检测到琼脂酶活性。Q5具有自生固氮作用,能在不含氮源的培养基中生长。有机氮源比无机氮源更有利于Q5生长、产酶,且较低浓度的有机氮源(蛋白胨)更有利于产酶。Q5的最佳生长及产酶条件为:培养基初始pH6.0、温度30℃、接种量1%、250-mL的摇瓶装液量50mL、摇床转速140r/min、NaCl1%、琼脂0.5%、乳糖0.1%、蛋白胨0.05%,培养36h后发酵液中酶活达到最高,为0.254U/mL。
   Q5所产琼脂酶是一种诱导型的胞外酶,发酵液经低温离心、硫酸铵盐析、透析、浓缩后得到琼脂酶粗酶。将粗酶进行native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)、酶活性染色,确定了该菌株发酵产生的蛋白中只有一个具有琼脂酶活力的组分。切割具酶活性的PAGE片段捣碎后溶解于PBS缓冲液(20mmol/L、pH7.0)中过夜,离心后得到的上清液作为纯的琼脂酶液,再次进行native-PAGE、酶活性染色得到验证。
   酶的性质研究表明,琼脂酶的相对分子量为54kDa;其最适反应温度、pH分别为40℃、6.0,酶活力在40℃以下及pH5.0-8.0范围内相对稳定;酶反应的最适琼脂底物浓度为0.7%;Na+、K+、Ca2+对其酶活力无影响,而试验中其它重金属离子及SDS、EDTA则抑制其活性;琼脂酶的Km和Vmax分别为1.47mg/mL和0.98μmol/min/mL。
   利用琼脂酶酶解0.7%琼脂底物制备琼脂寡糖,经线性离子阱质谱分析表明,产物主要为三糖,另有少量二糖、四糖、五糖、六糖。
[硕士论文] 朱宁
生物工程 中南大学 2010(学位年度)
摘要:随着铁呼吸机制的深入研究,Acidiphilium sp.菌株的重要性也越来越被人们所重视。在生物冶金方面,利用Acidiphilium sp.菌株与其他微生物协同浸矿,可通过降低有机物对自养菌的毒害作用以及提供低pH环境而有效提高浸矿效率,并可再生Fe2+;在生物燃料方面,Acidiphilium sp.可在低pH环境中做为生物燃料电池的正极生物催化剂。
   本文通过提取Acidiphilium cryptum DX1-1菌株膜相关蛋白,通过SDS-PAGE将膜蛋白分开,之后利用胶内酶解技术,采用液相色谱-串联质谱技术先对酶解后的蛋白进行分离,分离后的肽片段直接进入质谱仪离子源进行一级和二级质谱的分析,构建Acidiphilium cryptumDX1-1菌株细胞膜相关蛋白质的表达图谱。通过Mascot数据库进行搜库比对,鉴定得到262个匹配蛋白。
   对这262个蛋白输出信号及亚细胞定位进行预测,并对其功能进行分析和预测。这些已鉴定的这些已鉴定的蛋白中13.7%有Sec-type信号肽,27.86%具有双精氨酸转运信号肽(Tat),18.32%的蛋白具有脂蛋白信号肽(Lipo),14.9%含有C末端GPI锚定信号序列的有,2.67%同时含有C端和N端锚定信号序列GPI锚定蛋白。统计等电点及分子量得知,蛋白质的pH主要分布在4~12之间,40%蛋白质的pI小于7;60%蛋白质pI大于7;27.48%蛋白pI大于10。
   与Acidiphilium cryptum DX1-1细胞壁蛋白比对,得到30个重复蛋白,包括3个能量代谢相关蛋白,8个运输与结合蛋白,2个蛋白质合成相关蛋白,2个蛋白质修饰相关蛋白,3个假定蛋白,8个细胞包被蛋白以及4个功能未知蛋白。
   Acidiphilium cryptum DX1-.1细胞膜相关蛋白的表达图谱的建立,为以后各种环境中细胞膜相关蛋白的研究提供了有价值的基础性研究。从蛋白质组学角度探讨浸矿微生物铁呼吸相关的蛋白质,为微生物铁呼吸机理的研究提供一些依据。
[硕士论文] 刘鹏
微生物学 中南大学 2010(学位年度)
摘要:微藻生长迅速、生物量高并且富含油脂,因此是生产生物柴油的理想原料。许多微藻在兼养培养条件下与光能自养条件下相比具有更高的生长速率。在本文中对三种微藻眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata HQW03)、盐生杜氏藻(Dunaliella salinaHQW04)和小球藻(Chlorella sorokiniana CS-01)在以葡萄糖为有机碳源的兼养培养条件下的生长、脂类和蛋白质含量的变化进行了研究。结果表明当培养基中葡萄糖浓度达到最适浓度时,眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata HOW03)、盐生杜氏藻(Dunaliella salinaHQW04)和小球藻(Chlorella sorokiniana CS-01)的生物量分别是自养培养条件下的1.4、2.2和4.2倍。同时,脂类和蛋白质含量也有所增加(眼点拟微绿球藻:23%和201%;盐生杜氏藻:20%和43%;小球藻:86%和215%)。通过比较三种微藻脂类产量,平均每天的脂类产量以及添加葡萄糖后增加的脂类产量发现小球藻CS-01与其他两种微藻相比在许多方面都是最理想的藻种,如生长速率,脂类产量以及生产速率和葡萄糖利用率等。
   通过Real-time PCR对小球藻CS-01在不同浓度葡萄糖培养条件下的三种脂类合成相关基因(accD,acc1和rbcL)的表达差异进行了研究。结果表明:异质型乙酰辅酶A羧化酶是小球藻CS-01脂类合成的关键酶,accD基因的表达水平能够反映微藻在兼养条件下稳定期脂类含量的情况;另外,编码同质型乙酰辅酶A羧化酶的acc1基因的表达水平很低甚至不表达;rbcL基因的不同表达水平表明小球藻CS-01在兼养培养条件下,光能自养和化能异养生长不是独立进行的,并且有机碳源的利用可以减小光合作用效率。
[硕士论文] 宋以菊
微生物学 南京师范大学 2010(学位年度)
摘要:细胞极性(CellPolarity)是指由于细胞内不同的膜组分以及不同的细胞骨架结构分布在细胞的不同部位导致细胞行使功能或生长的不均等或方向性。由于丝状真菌构巢曲霉具有许多独特的优势,因此可以作为研究细胞极性生长很好的模式生物。
   已有的研究表明,MobB和CotA是形态建成调节网RAM(RegulatesbothAce2pactivityandcellularMorphogenesis)信号通路中调节极性生长的两个蛋白。我们实验室的前期研究发现CotA与MobB缺陷菌株在A.nidulans中的表型相似,即菌丝极性生长缺失并且完全丧失了产分生孢予的能力。渗透逆境胁迫可以使MobB和CotA缺失菌株菌丝极性生长恢复;但是,钙通道的抑制剂或钙离子螯合剂能够抑制这种极性生长恢复。提示CotA与MobB缺失菌株的逆境极性恢复这一现象受钙信号系统调控。本文在此基础上,采用荧光蛋白标记技术和真菌有性杂交、qRealtimePCR等方法研究了钙信号系统相关基因在RAM缺失菌株逆境恢复过程中的作用及应答。结果表明:(1)发现RAM和钙调磷酸酶CnaA双缺陷菌株以及RAM和钙离子通道蛋白MidA双缺陷菌株在逆境条件下都不能恢复极性生长;(2)RAM和钙调磷酸酶CnaA双缺陷菌株对胞钙离子超敏感,3mM的钙离子可以引起菌丝内胞质喷出,最终致死细胞;(3)钙离子通道蛋白CchA和RAM的双缺陷菌株则在逆境条件下可以恢复极性生长;(4)定量PCR分析表明RAM缺陷菌株在逆境条件下,钙信号通路相关基因cnaA,crzA,pmrA以及钙离子通道蛋白midA的mRNA表达量都有显著升高。
   这些结果建议RAM缺陷菌株逆境恢复受Ca2+-MidA-Calcineurin钙信号通路中的重要元件所调控,RAM途径与钙信号通路在调控细胞极性生长过程中是平行互补的关系。然而,质膜钙离子通道CchA对于RAM缺失菌株逆境恢复影响不明显。
   本论文首次报道了钙信号系统在RAM缺失菌株逆境恢复过程中的作用,对于掌握与真菌侵染性密切相关的极性生长的分子机理以及分析真菌适应周围环境变化的应答基础具有十分重要意义。
  
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