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[硕士论文] 姜金融
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:空气微生物是城市生态系统的重要组分,更是评估环境质量的重要指标之一,它既可以造福人类,亦会危害人类的生活和健康。近年来,随着城市空气环境恶化以及雾霾事件的不断发生,对城市空气微生物的研究越来越受到重视。研究兰州市空气微生物浓度分布特征及多样性以期为准确了解兰州市空气微生物群落与生态功能奠定基础,为空气微生物对居民健康、空气环境质量影响评价提供科学依据。
  本研究以兰州市不同功能区,即风景区(Scenic Area, SA)、交通干线(Main TrafficLine,MTL)、公共服务区(Public Service Area,PSA)、文教区(Culture and Education Area,CEA)空气微生物样品为研究材料,采用恢复培养手段和Biolog方法研究空气中微生物浓度、粒径时空分布特征和空气微生物群落碳代谢功能多样性,阐明空气微生物浓度及群落功能多样性与环境因子的相关性,利用分子生物学技术对兰州市春季可吸入肺空气细菌粒子进行群落组成和致病性分析,得到以下主要结果:
  (1)兰州市空气中微生物总浓度、细菌、真菌浓度具有明显的空间、季节和日变化规律,空气微生物浓度变化与环境因子之间具有较好的相关性。兰州市空气微生物总浓度范围为196~3752 CFU/m3,空气细菌浓度范围为83~3344 CFU/m3,空气真菌浓度范围为102~1315 CFU/m3,从均值看,兰州市空气细菌浓度为916 CFU/m3,空气真菌浓度为322 CFU/m3,空气中细菌所占比例较大,为66.5%;四个功能区空气微生物总浓度和细菌浓度大小排列一致:MTL>PSA> CEA> SA,空气真菌浓度大小排列依次为:SA>PSA>CEA>MTL。对兰州市各功能区空气微生物污染状况进行评估,结果显示,MTL、PSA空气细菌为较清洁等级,其他功能区空气微生物总浓度及空气真菌均为清洁等级;空气微生物浓度在春、夏季较高,秋、冬季较低,其中,空气细菌浓度均在秋季达到最低值。由于雾霾天气原因,进入冬季后细菌浓度有所升高,不同功能区空气真菌浓度季节变化差异不大;SA空气微生物浓度均表现为13:00时较高,9:00和17:00较低,MTL、PSA空气总微生物浓度和细菌浓度变化特征为:9:00>17:00>13:00,而真菌浓度变化特征为:13:00>9:00>17:00,CEA空气微生物浓度变化特征为:9:00>17:00>13:00;兰州市空气微生物总浓度、细菌浓度与温度呈显著正相关,与风速、湿度呈负相关,空气真菌浓度与温度、湿度、风速相关性较弱。
  (2)兰州市空气微生物粒径呈现明显的时空分布特征。细菌粒子主要分布在一到三级(>3.3μm),呈偏态分布,而空气真菌粒径呈正态分布,粒径范围在2.1μm~7.0μm的粒子居多;在四个功能区空气中,可吸入肺细菌粒子占23.1%~28.9%,可吸入肺真菌粒子占33.7%~40.7%;一年四季中,可吸入肺细菌粒子浓度在秋冬季较高,可吸入肺真菌粒子浓度在春秋季较高;在一天不同时段,可吸入肺细菌粒子浓度在9:00和13:00时较高,而真菌粒子浓度在9:00和17:00时较高;兰州市空气细菌中值直径约为3.68μm,空气真菌中值直径约为3.15μm,空气细菌中值直径大于空气真菌的中值直径;空气细菌在不同季节中值直径变化范围为3.06μm~4.11μm,在春夏两季中值直径较大,空气真菌中值直径季节变化范围为2.74μm~3.59μm,在夏季中值直径较大;空气细菌中值直径在9:00时段较大,而空气真菌中值直径在17:00时段较大。
  (3)各季节四个功能区空气微生物的碳源利用强度存在显著差异,在春季和秋季,SA和PSA空气微生物碳源代谢强度高于其他两个功能区,夏季SA空气微生物碳代谢强度最高,冬季CEA、PSA、SA空气微生物碳代谢强度较高;各季节不同功能区空气微生物Shannon指数和Simpson指数差异性不大,表明四个功能区空气中微生物群落丰富度和优势度相似,而McIntosh指数差异较大,表明不同功能区空气微生物群落均一度受不同环境地域、气象条件的影响较大;各季节空气微生物群落碳代谢功能呈现区域性差异,且导致这种差异的主要碳源分异类型不同,氨基酸类是导致春秋两季兰州市空气微生物群落碳代谢功能区域性差异的主要分异类型,导致夏季不同功能区空气微生物碳代谢功能差异的主要分异类型是糖类,冬季主要分异类型是醇类。四个功能区不同季节空气微生物碳代谢强度亦存在差异,SA空气微生物碳代谢能力在春、夏季较高,MTL和PSA空气微生物群落碳代谢能力在秋冬季较高,CEA空气微生物碳代谢能力在冬季较高,夏季与秋季差异不大;各功能区不同季节空气微生物Shannon指数和Simpson指数差异性不大,说明同一功能区空气中微生物群落丰富度和优势度随着季节变化不会发生太大的改变,而McIntosh指数季节差异较大,说明同一功能区空气微生物群落均一度受季节环境变化的胁迫以及气象因子的影响较大;四个功能区空气微生物群落碳代谢功能呈现季节性差异,糖类是导致SA和PSA空气微生物群落碳代谢功能季节性差异的主要分异类型,导致MTL和PSA空气微生物碳代谢功能季节差异的主要分异类型是氨基酸类。
  (4)兰州市不同功能区可吸入肺空气细菌群落组成存在差异,共检测出48属,分布在六大门类,分别为Actinobacteria、Cyanobacteria、Deinococcus Thermus、Firmicutes、Proteobacteria、Saccharibacteria;CEA和SA细菌群落相似性较高,MTL、PSA进化过程较独立,具有较大的差异性;可吸入肺带菌粒子粒径小于3.3μm,在空气中停留时间越长,传播距离更远,其导致疾病传播以及人体感染的风险也就越大,兰州市可吸入肺空气细菌中检测到9种致病菌或条件致病菌,致病菌的分布也存在空间差异,且人群密集的功能区检出率更高。
[硕士论文] 李旦旦
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本论文以分离自南海和北极海域表层海水样品的四株细菌作为研究对象,利用多相分类方法,详细研究了这四株细菌的表型,细胞化学组成及分子遗传学等方面的分类特征,最终基于分类特征分析分别确定了它们的分类地位。
  1.菌株SM1501T的多相分类研究
  菌株SM1501T分离自南海表层海水样品。菌株SM1501T的革兰氏染色反应为阴性,其细胞为短杆状,无鞭毛,好氧。该菌株生长的温度范围为7-42℃,生长的NaC1浓度范围是0-11%(w/v)。菌株SM1501T的主要脂肪酸是C17∶1ω6c,C15∶02-OH,C17∶1ω8c和C18∶1ω7c。该菌的极性脂包括磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),鞘糖脂(sphingoglycolipid,SGL),双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG)及磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)。该菌的主要细胞呼吸醌是泛醌10(ubiquinone-10,Q-10)。菌株SM1501T的细胞基因组DNA G+C含量为66.8mol%。
  菌株SM1501T与Erythrobacter属成员的16S rRNA基因序列相似性最高(94.2-97.4%),基于16S rRNA基因序列的系统进化树显示菌株SM1501T与Erythrobacter luteus,Erythrobacter atlanticus,Erythrobacter gangjinensis及Erythrobacter marinus成簇,但形成一个独立的进化分支。
  基于以上多相分类学数据,菌株SM1501T代表Erythrobacter属的一个新种,命名为Erythrobacter nanhaiensis sp.nov.,菌株SM1501T(=KCTC42669T=CCTCC AB2015396T)为该新种的模式菌株。
  2.菌株SM1502T的多相分类研究
  菌株SM1502T来源于北极海域表层海水样品。菌株SM1502T革兰氏阴性菌,细胞为杆状,无鞭毛。菌株SM1502T生长的温度范围为10-40℃C,生长的NaCl浓度范围为0-8.0%(w/v)。
  菌株SM1502T的主要脂肪酸为iso-C15∶0,iso-C17∶1ω9c,iso-C17∶03-OH,iso-C15∶1G,C15∶0及unknown ECL13.565;其主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE),一种未鉴定结构的氨基磷脂及一种未鉴定结构的极性脂类。菌株SM1502T的主要呼吸醌类为甲基萘醌6(menaquinone6,MK-6)。菌株SM1502T基因组DNA的G+C含量为37.0 mol%。
  菌株SM1502T与Flavobacterium suzhouense的16S rRNA基因序列相似性最高(96.0%);在基于16S rRNA基因序列的系统进化树中,菌株SM1502T和Flavobacterium属内包括Flavobacterium suzhouense在内的六个已知种成簇,同时形成单独的簇内分支。
  以上多相分类数据表明,菌株SM1502T代表Flavobacterium属内的一个新种,命名为Flavobacterium arcticum sp.nov.,菌株SM1502T(=KCTC42668T=CCTCC AB2015346T)为该种的模式菌株。
  3.菌株SM1503T的多相分类研究
  菌株SM1503T分离自南海表层海水样品,为革兰氏阴性菌,其触酶及氧化酶为阳性。菌株SM1503T生长温度范围在8-45℃之间,生长的NaCl浓度范围是0-7.5%(w/v)。菌株SM1503T可以还原硝酸盐为亚硝酸盐,可水解Tween20、40及60。
  菌株SM1503T的主要脂肪酸包含C17:1ω6c,C17∶0,C15∶0,C18∶1ω7c,C17∶1ω8c以及C16∶0;主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG),鞘糖脂(sphingoglycolipid, SGL)和磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)。该菌主要呼吸醌为泛醌10(ubiquinone-10,Q-10),其基因组DNA的G+C含量为61.6 mol%。
  16S rRNA基因序列比对分析表明菌株SM1503T与Sphingomonadaceae科内Blastomonas及Parablastomonas属已知种有最高的序列相似性(95.2-95.8%),根据16S rRNA基因序列构建的系统进化树显示菌株SM1503T在Blastomona及Parablastomonas进化分支的根部形成一个独立的进化分枝。
  上述多相分类数据表明,菌株SM1503T应属于Sphingomonadaceae科内的一个新属,命名为Pseudoblastomonas gen.nov.,而菌株SM1503T代表该属内的一个新种,命名为Pseudoblastomonas maris gen.nov.,sp.nov.,菌株SM1503T(=KCTC42715T=CCTCC AB2015347T)是该新种的模式菌株。
  4.菌株SM1504T的多相分类研究
  菌株SM1504T来源于北极海域表层海水样品。菌株SM1504T革兰氏阴性菌,严格好氧,无运动性。菌株SM1504T生长的温度范围为4-30℃,生长的NaCl浓度范围为0-4.0%(w/v)。菌株SM1504T可水解七叶苷和明胶,但不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
  菌株SM1504T的主要脂肪酸为summed feature3(包含C16∶1ω7c和/或iso-C15∶02-OH)和iso-C15∶0;菌株SM1504T的极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)和一种未鉴定的极性脂类。菌株SM1504T的主要呼吸醌类为甲基萘醌7(menaquinone7,MK-7)。菌株SM1504T基因组DNA G+C含量为40.8 mol%。
  基于16S rRNA基因序列的系统进化树显示菌株SM1504T在Cytophagaceae科内与Lacihabitans,Emticicia,Fluviimonas及Leadbetterella属成员紧密成簇,但形成独立的簇内分枝,而该菌株与这些属成员的16S rRNA基因序列相似性非常低(88.9-91.6%)。
  基于上述多相分类数据分析,菌株SM1504T应隶属于Cytophagaceae科内的一个新属,命名为Arcticibacterium gen.nov.,而菌株SM1504T代表该新属内的一个新种,命名为Arcticibacterium luteifluviistationis gen.nov.,sp.nov.,菌株SM1504T(=KCTC42716T=CCTCC AB2015348T)为该种的模式菌株。
[硕士论文] 冯帅
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:氮循环与农业生产和生态环境息息相关。人类通过施加氮肥来增加作物产量,但与此同时,氮肥流失破坏了氮原有的平衡,进而导致全球性的环境问题。植物根际是土壤介质、植物和微生物交互作用的微界面,也是物质和能量交换的区域。大量研究表明接种联合固氮菌能促进玉米的产量,但是接种效率和稳定性容易受到环境因素的影响;同时接种对土壤及根际微生物群落影响的研究报道甚少,其中的微生物机理和生态效应也存在疑问。本研究将固氮施氏假单胞菌A1501和玉米作为模式对象,考察该菌在根部的定殖效率,利用15N同位素稀释法定量生物固氮对玉米氮素的贡献。同时考察不同水分条件下接种固氮施氏假单胞菌 A1501对玉米的促生效应及根际氮循环功能微生物群落及活性的影响,为深入了解联合固氮菌和宿主植物间的相互作用,提高微生物的固氮效率及减少农业生产的氮肥用量提供理论依据。主要研究结果如下:
  一、分别在营养液和土壤培养条件下,通过平板计数和扫描电镜方法观察固氮施氏假单胞菌A1501在玉米根系的定殖情况。结果表明,固氮施氏假单胞菌A1501能够在玉米根系定殖。
  二、盆栽试验结果表明,无菌土壤介质中种植的玉米生长量受到水分条件和固氮菌接种的显著影响。接种固氮施氏假单胞菌A1501后第60天的玉米植株生长量在干旱条件和水分充足时分别提高22.7%和32.5%。未灭菌的自然土壤介质种植的玉米生长量也受到水分条件的显著影响;固氮菌接种提高了玉米生长量,但是结果不显著。15N同位素稀释法测定结果表明水分条件显著影响了固氮施氏假单胞菌A1501的固氮贡献量,水分充足条件下固氮贡献率为31.6%,而干旱条件下为20.1%。因此本实验条件下接种固氮施氏假单胞菌A1501可以为玉米提供生长所需的部分氮素。
  三、采用绝对定量qPCR和高通量测序技术,分析不同水分条件和固氮施氏假单胞菌A1501接种对玉米不同土壤区域(根际土和表层土)氮循环功能微生物种群数量、转录活性及群落结构的影响。结果表明水分条件措施显著影响了根际土固氮菌nifH基因、氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因数量和转录活性,但对表层土和根际土的微生物群落结构没有显著影响。固氮施氏假单胞菌A1501接种显著影响了玉米根际固氮菌nifH基因、氨氧化细菌和古菌amoA基因拷贝数和转录数,同时对根际土中细菌和固氮菌群落结构产生显著影响。不同土壤区域的细菌和固氮菌群落多样性也表现出差异,固氮菌更多地存在于根际土中,而氨氧化细菌和氨氧化古菌在表层土中数量更高,表明不同土壤区域(生态位)是影响土壤微生物及氮循环关键功能微生物最主要的因素,这很可能是土壤特性如有机碳和氮含量差异造成的。
  本论文阐释了固氮施氏假单胞菌A1501和玉米的联合固氮作用,表明固氮施氏假单胞菌A1501能够在玉米根际定殖并通过固氮作用对植株贡献氮;同时接种固氮菌对微生物群落的影响显著小于土壤生态位的影响。
[硕士论文] 伍朝亚
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:黄渤海域是中国的陆源浅海,其海底沉积物中蕴藏着丰富的微生物资源,在海洋生态系统氮循环中扮演着重要的角色。本研究采用传统平板培养法和现代分子生物学方法分别对渤海和北黄海海底沉积物中产胞外蛋白酶、脂肪酶细菌多样性进行分析,揭示渤海和北黄海沉积物中可培养产胞外蛋白酶、脂肪酶细菌的多样性,增加人们对黄渤海域生态系统中产胞外酶细菌多样性的认识,为挖掘海洋产蛋白酶、脂肪酶微生物提供菌群资源。
  采用酪蛋白明胶培养基,从北黄海5个海底沉积物样品中分离到66株蛋白酶的细菌菌株,通过16S rRNA基因系统进化分析表明,这66株菌隶属于4个不同门的7个属,包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)四个门的7个属,其中Pseudoalteromonas(69.9%)、Sulfitobacter(12.1%)和Salegentibacter(10.6%)是优势属。沉积物样品中的可培养的产蛋白酶细菌达到104 CFU/g的丰度。分别测定胞外蛋白酶活性并对选定菌株进行基于苯甲基磺酰氟(PMSF,丝氨酸蛋白酶抑制剂)、邻菲罗啉(o-phenanthroline,O-P,金属蛋白酶抑制剂)、E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)和pepstatinA(天冬氨酸蛋白酶抑制剂)四种抑制剂的酶活抑制实验以及所有菌株对三种底物(酪蛋白、明胶、弹性蛋白)的水解能力分析这些细菌所产胞外蛋白酶的特性及多样性,实验结果显示有39株菌能够产生足够量的酶用于蛋白酶抑制剂实验。抑制剂实验表明39株测定菌株产生的胞外蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶,仅有少数菌株所产蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶活性。对所有菌株进行三种底物的水解实验表明,所有菌株能降解酪蛋白和/或明胶,Pseudoalteromonas和Salegentibacter菌株具有水解弹性蛋白的能力,Salegentibacter菌株对三种底物具有更强的蛋白水解能力。
  用同样的方法,从渤海菜州湾7个沉积物样品中筛选到121株产蛋白酶细菌,它们隶属于Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria和Bacteroidetes四个门的17个属,Bacillus、Pseudoalteromonas和Photobacterium是优势属。蛋白酶抑制剂实验表明,有62株菌能够产生足够量的酶用于蛋白酶抑制剂实验且均被PMSF抑制,抑制率为19.36%~100%,27株菌的蛋白酶酶活被OP抑制,抑制率为21.12%~66.37%,E-64对7株菌的蛋白酶酶活有抑制作用,抑制率为12.14%~65.11%, Pepstatin A对7株菌的蛋白酶酶活有抑制作用,抑制率为12.91%~34.5%,测定菌株所产胞外蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶。通过对所有菌株进行三种底物的水解实验表明,Bacillus属的菌株对酪蛋白、明胶和弹性蛋白表现出较高的水解能力。
  采用吐温80培养基和三丁酸甘油酯筛选平板,从8个渤海沉积物样品中分离获得51株产脂肪酶细菌,通过对这51株菌的16S rRNA基因系统进化分析表明,这些菌株隶属于Bacteroidetes、Proteobacteria和Firmicutes三个门的8个属,其中Pseudoalteromonas(35.2%)、Marinobacter(23.5%)和Sulfitobacter(17.6%)是优势菌群。以对硝基苯酚棕榈酸酯(PNPP)为底物,利用对硝基苯酚法测定所有菌株胞外脂肪酶活性,结果显示所有测定菌株都能够分泌脂肪酶,菌株70623分泌的脂肪酶酶活最高,为42.4 U/mL。
  综上所述,渤海和北黄海海域沉积物中可培养产蛋白酶、脂肪酶细菌类群较为丰富,菌株所产的蛋白酶种类主要是是丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶,获得了一株高效产脂肪酶菌株Marinobacter sp.70623,具有有良好的开发应用价值。
[博士论文] 王鹏
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:二甲基巯基丙酸内盐(Dimethylsul foniopropionate,DMSP)是全球硫循环和碳循环的重要载体物质。海洋浮游植物、大型藻类和临海被子植物是DMSP的主要生产者。每年DMSP的产量可以达到109吨。在大洋表面的某些区域,DMSP的产量可以达到碳固定总量的10%。微生物介导的DMSP的分解代谢是全球硫循环和碳循环的重要步骤。海洋玫瑰杆菌类群细菌(Marine Roseobacter Clade,MRC)是分解代谢DMSP的主要微生物类群之一。微生物利用胞内DMSP裂解酶裂解DMSP产生二甲基硫(Dimethyl sulfide,DMS)和丙烯酸(Acrylate)。DMS具有挥发性,是连接海洋硫库和大气硫库的重要媒介。同时,它也是重要的影响气候的小分子物质,可以通过影响地球对太阳辐射的反射率影响全球气候环境。而丙烯酸则是重要的海洋碳源,很多微生物可以利用其作为唯一碳源生长。研究海洋细菌对DMSP的分解代谢对于更好认识全球硫循环和碳循环以及微生物代谢过程对环境的影响具有重要意义。在本论文中,我们以海洋玫瑰杆菌类群细菌为研究对象,主要从DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制、DMSP裂解酶的进化机制、DMSP裂解产物丙烯酸胞内代谢的分子机制以及DMSP分解代谢的动力学调控机制等几个方面进行了研究。
  1.海洋玫瑰杆菌类群细菌裂解DMSP产生DMS的分子机制
  每年通过微生物的DMSP裂解酶裂解DMSP产生的DMS可以达到约3亿吨。DMSP裂解酶种类丰富,到目前为止一共发现了8种不同的DMSP裂解酶。但DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制研究较少。DddP是海洋中最丰富的DMSP裂解酶之一,主要来自于海洋玫瑰杆菌类群细菌。在本论文中,我们以来自Ruegeria lacuscaerulensis ITI_1157的DMSP裂解酶RlDddP为研究对象,研究了DddP催化DMSP裂解的分子机制。我们首先利用RT-qPCR技术和酶活检测实验手段验证了RlDddP的功能。实验结果表明RldddP基因能够被DMSP诱导上调表达,重组表达纯化的RlDddP具有显著的DMSP裂解酶活性。然后我们检测了RlDddP的酶学性质。RlDddP的最适pH为6.0,最适温度为60℃,Km值为17.1±0.98 mM。邻菲罗啉(o-phenanthroline,o-P)和2,2-联吡啶(2,2-bipyridine)能够显著抑制RlDddP的活性,而典型的金属螯合剂EDTA和EGTA则对RlDddP的活性无显著影响。然后,我们分别解析了RlDddP结合底物类似物吗啉乙磺酸(MES),RlDddP结合产物类似物磷酸根,RlDddP突变体Y366A结合产物丙烯酸,RlDddP突变体D377A结合产物丙烯酸的晶体结构。RlDddP在溶液中以二体形式存在。RlDddP单体有两个结构域,两个结构域之间的夹角约90°,是典型的“pitta-bread”结构。每个RlDddP二体含有两个催化中心,每个催化中心螯合两个Fe3+作为金属离子辅基,并有10个保守的氨基酸。其中377位的天冬氨酸位于DMSP的β-C附近,很可能是催化过程中的亲核攻击碱。突变验证结果表明突变377位的天冬氨酸会导致RlDddP酶活的丧失,验证了该氨基酸为攻击碱的推断。接着,我们对已解析的四个结构进行了叠合分析,发现RlDddP的二铁离子辅基中的一个Fe3+在催化过程中存在“ion-shift”现象。Fe3+的移动有助于DMSP的结合并且增加了DMSP的α-H的酸性,是RlDddP实现催化功能的关键一步。最后,在综合实验结果的基础上,我们提出了RlDddP裂解DMSP的分子机制。本研究对更好的认识微生物裂解DMSP产生丙烯酸释放DMS的过程具有重要意义。
  2.M24金属蛋白酶来源的DMSP裂解酶DddP的进化机制
  序列和基因组分析认为DMSP代谢是在其它已存在的代谢途径的基础上进化产生的。DMSP裂解酶种类丰富,已发现的DMSP裂解酶分属于不同的家族。DMSP裂解酶的多样性暗示着DMSP裂解酶可能具有不同的进化来源。在本论文中,我们以来源于R.lacuscaerulensis ITI1157的RlDddP为例,研究了DddP从金属蛋白酶进化为DMSP裂解酶的机制。因为序列分析显示DddP属于M24金属蛋白酶家族,所以我们首先利用RT-qPCR技术和酶活检测实验手段检测了RlDddP的蛋白酶功能。研究发现RldddP基因不能被短肽和酪蛋白诱导,重组表达纯化的RlDddP也检测不到蛋白酶活性,说明RlDddP从金属蛋白酶进化为DMSP裂解酶后完全丧失了蛋白酶功能。然后,我们分别对DddP的蛋白全长及N端结构域进行了系统发生分析。研究发现,DddP在M24金属蛋白酶家族中形成了一个独立的分支,而且拥有一个不同于其他M24金属蛋白酶的全新的N端结构域。结构分析结果显示全新的N端结构域使得RlDddP形成了一个紧密的二体结构,从而使得RlDddP的底物入口仅能允许DMSP进入而不允许短肽进入。接着,我们对RlDddP与M24金属蛋白酶极为相似的C端结构域进行了结构叠合分析。结果显示在金属蛋白酶中起稳定反应中间态作用的氨基酸突变成了DMSP裂解酶中的关键的催化碱。催化中心关键氨基酸的突变导致了RlDddP蛋白酶催化能力的丧失和DMSP裂解酶催化能力的形成。最后,在综合N端结构域和C端结构域研究结果的基础上,我们提出了DddP从金属蛋白酶进化为DMSP裂解酶的机制。这一研究有助于更好地认识DMSP裂解酶的进化机制。
  3.海洋玫瑰杆菌类群细菌胞内代谢丙烯酸的分子机制
  丙烯酸是重要的海洋微生物碳源,同时丙烯酸及其代谢产物丙烯酰辅酶A具有很高的细胞毒性,丙烯酸需要在胞内实现快速代谢从而避免对微生物的生存造成影响。但是到目前为止,丙烯酸代谢的分子机制尚不清楚。在本论文中,我们以代谢DMSP的主要类群海洋玫瑰杆菌类群细菌为研究对象,研究了DMSP代谢菌株胞内代谢丙烯酸的分子机制。首先,我们验证了该类群胞内代谢丙烯酸的代谢途径。研究发现,该类群主要通过以丙酸辅酶A连接酶(PrpE)和烯酰辅酶A还原酶(AcuI)为关键酶的PrpE-AcuI途径实现丙烯酸的代谢。然后,我们分别解析了Dinoroseobacter shibae DFL12的PrpE和R.pomeroyi DSS-3的AcuI的结构。PrpE在溶液中以单体形式存在。它的拓扑结构与同家族的其它酰基辅酶A连接酶相似,拥有两个结构域,一个N端结构域和一个C端结构域。AcuI则在溶液中以二体形式存在。它的拓扑结构与来自大肠杆菌的YhdH相似,拥有一个典型的rossmann折叠结构用以结合辅酶NADPH。接着,我们分别研究了PrpE和AcuI催化中心保守的氨基酸的功能。PrpE具有两个构象,即腺苷酸形成构象和硫酯形成构象。PrpE高度保守的588位的赖氨酸和502位的甘氨酸分别位于两个构象的活性中心,且突变会导致PrpE的酶活丧失。因此,PrpE588位的赖氨酸很可能是PrpE催化腺苷酸形成半反应的关键氨基酸,而502位的甘氨酸则很可能是硫酯形成半反应中的关键氨基酸。AcuI的催化中心结合一个NADPH辅基。NADPH烟酰胺基团附近的亲水氨基酸中仅有323位的精氨酸突变会显著影响AcuI的酶活。因此,323位的精氨酸很可能是AcuI催化过程中接受电子的广义酸,而NADPH则很可能在AcuI的催化过程中提供反应的还原力。最后,综合实验结果,我们提出了PrpE和AcuI共同参与胞内代谢丙烯酸的分子机制。本研究对更好的认识微生物的胞内丙烯酸代谢具有重要意义。
  4.海洋玫瑰杆菌类群细菌分解DMSP的动力学调控机制
  DMSP在细菌胞内的分解代谢是一个复杂的过程,涉及到多步反应,需要多种酶分工合作,相互协调。DMSP除了作为重要的硫循环和碳循环的载体物质之外,还具有重要的生理功能。DMSP代谢菌株往往会在胞内积累DMSP作为渗透压保护剂、抗氧化剂或防冻剂。DMSP在胞内的浓度可以达到毫摩尔量级,而DMSP裂解过程的产物丙烯酸,尤其是丙烯酰辅酶A,具有很强的胞内毒性,需要快速代谢。因此,DMSP分解代谢需要一个调控机制来维持胞内的DMSP浓度并保证丙烯酸,尤其是丙烯酰辅酶A,的快速代谢。而到目前为止,尚没有文献涉及DMSP分解代谢的调控。在本论文中,我们以代谢DMSP的主要类群海洋玫瑰杆菌类群细菌为研究对象,研究了DMSP裂解过程的动力学调控机制。首先,我们研究了已报道的多种DMSP裂解酶、丙烯酸代谢相关酶PrpE和AcuI的Km值。研究发现绝大多数的胞内DMSP裂解酶的Km值>PrpE的Km值>>AcuI的Km值。而后,我们比较了多种DMSP裂解酶,丙烯酸代谢相关酶PrpE和AcuI的kcat/Km值。结果表明,绝大多数的DMSP裂解酶的kcat/Km值>PrpE的kcat/Km值>>AcuI的kcat/Km值。在此基础上,我们提出了DMSP裂解过程的动力学调控机制,即DMSP裂解酶、PrpE和AcuI底物结合能力和催化效率的不同保证了DMSP的胞内积累和其代谢产物丙烯酸,尤其是丙烯酰辅酶A的快速代谢。接着,我们通过研究PrpE和AcuI在自然界的丰度发现PrpE和AcuI不仅在海洋玫瑰杆菌类群细菌中存在,在不同生境不同生物域的生物中均有分布。而且,除DMSP分解代谢外,多种代谢——如DMSP去甲基化代谢、乳酸代谢、丙酸代谢、β-丙氨酸和葡萄糖代谢——都可以产生丙烯酸和丙烯酰辅酶A。因此,DMSP裂解过程的动力学调控机制不仅对来自海洋的玫瑰杆菌类群细菌的DMSP分解代谢具有意义,同时具有扩展到其它生境的其它生物的其它代谢过程中的潜力,具有较为广泛的意义。
  本论文对海洋玫瑰杆菌类群DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制、DMSP裂解酶的进化机制、DMSP裂解产物丙烯酸胞内代谢的分子机制及DMS分解代谢的动力学调控机制进行了较为深入的研究,研究结果有助于我们更好的认识DMSP的分解代谢过程,更好的认识地球硫循环和碳循环。
[硕士论文] 郭令云
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:近海沉积物中微生物多样性丰富,蕴藏大量的潜在新菌资源。本研究通过细菌富集分离手段,对不同富集时期的近海沉积物样品进行新菌资源挖掘,并通过454FLX+平台宏基因组测序探究了不同富集时期富集培养液中细菌区系演替规律。本研究发现了大量潜在新茵,并对7株海洋新茵进行了多相分类。本研究发现慢生单胞菌新菌B210具有捕食现象,并对其进行了初步探究。
  通过富集分离,获得326株细菌,包括49株潜在新菌。通过宏基因组测序分析得出:不同富集时期,富集培养液中有其独特的细菌区系,为以后有目的性地挖掘海洋新菌提供指导;物种丰富度会随着富集时间的增加而降低,而至第30天时,呈上升趋势;某些丰富度极低的细菌门类通过富集,数量得到了剧增,如酸杆菌门细菌。
  菌株Z1T和JL1分别分离自石花菜和真江蓠,可降解琼胶。呼吸醌为Q-8。菌株Z1T的主要脂肪酸是C18∶1ω7c、C16∶0和summed feature3(C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH)。主要极性脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和1种未知的氨基脂。DNAG+C含量是45.1 mol%。与最相近物种的16S rDNA序列相似性低于92.3%。根据多相分类,菌株Zlr和JL1代表Gammaproteobacteria的一个新属新种,命名为Marinagarivorans algicola gen.nov.,sp.nov。模式菌株为Z1T(=ATCC BAA-2617T=CICC10859T)。
  菌株NC2-42T分离自威海近海沉积物,革兰氏染色可变。呼吸醌是MK-7。细胞壁含二氨基庚二酸。极性脂组分包括磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、2种未知的糖脂、1种未知的磷脂、1种未知的氨基磷脂、1种未知的脂质。主要脂肪酸是anteiso-C15∶0、iso-C16∶0和C16∶0。基因组DNA G+C含量58.1 mol%。菌株NC2-42T与Paenibacillus profundus有最高16S rDNA序列相似性(92.32%)。通过多相分类,NC2-42T为Paenibacillaceae的一个新属新种,命名为Marinicrinis sediminisgen.nov.,sp.nov。模式菌株为NC2-42T(=KCTC33676T=MCCC1K01238T)。
  菌株XDB06T分离于威海近海沉积物,革兰氏染色阴性。呼吸醌是Q-8。主要脂肪酸是iso-C15∶0和C16∶0。极性脂成分为双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、2种糖脂和4种磷腊。基因组DNA G+C含量65.0 mol%。与Wenzhouxiangella marina的16S rDNA相似性最高,为96.5%。通过多相分类,菌株XDB06T是Wenzhouxiangella的一个新物种,命名为Wenzhouxiangella sediminis sp.nov。模式菌株为XDB06T(=KCTC52041T=MCCC1K02285T)。
  菌株0W14T分离于文登海洋盐田,革兰氏染色阳性。MK-7是唯一呼吸醌。肽聚糖类型是A4βL-Om-D-GIu。主要脂肪酸组分是anteiso-C15∶0。极性脂组分是双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、2种未知的糖脂和4种未知的磷脂。基因组DNAG+C含量44.6 mol%。菌株0W14T与Virgibacillus litoralis具有最高16S rDNA相似性(96.0%)。根据多相分类,菌株0W14T代表Bacillaceae的一个新属新种,命名为Marinisalinus sediminis gen.nov.,sp.nov。模式菌株为0W14T(=KCTC33835T=MCCC1H00171T)。
  菌株NC2-31T分离于威海近海沉积物,革兰氏染色阳性。呼吸醌为MK-7,肽聚糖中含二氨基庚二酸。主要极性脂是双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。基因组DNA G+C含量46.3 mol%。主要脂肪酸为iso-C15∶0、anteiso-C15∶0、iso-C16∶0和Summed Feature3(C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH)。基于16S rDNA序列的系统发育分析表明菌株NC2-31T在Bacillus内形成独立分支。根据多相分类,菌株NC2-31T代表Bacillus的一个新物种,命名为Bacillus marinisedimentorumsp.nov。模式菌株为NC2-31T(=KCTC33721T=MCCC1K01239T)。
  菌株WDN1C137T分离于文登海洋盐田,革兰氏染色阴性。Q-10是唯一醌型。主要脂肪酸成分为C18∶1ω7c、cyclo C19∶0ω8c、C16∶0。主要极性脂为磷脂酰甘油、磷酸糖脂、1种未知的糖酯、1种未知的脂质、2种未知的氨基脂和3种未知的磷脂。基因组DNA G+C含量71.4 mol%。菌株WDN1C137T与Roseivivaxjejudonensis有最高16S rDNA相似性(94.5%)。根据多相分类,菌株WDN1C137T代表Rhodobacteraceae的一个新属新种,Rhodosalinus sediminis gen.nov.,sp.nov。模式菌株为WDN1C137T(=KCTC52478T=MCCC1H00170T)。
  菌株B210T分离于威海小石岛近海沉积物,革兰氏染色阴性。呼吸醌是MK-7。极性脂组分是双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、1种未知的磷脂、1种未知的脂质。主要脂肪酸是iso-C15∶0。基因组DNA G+C含量是64.7 mol%。系菌株B210T与Bradymonas sediminis FA350T有最高16S rDNA序列相似性(89.2%)。通过多相分类,B210T为Bradymonadales的一个新属新种。模式菌株为B210T(=KCTC42951T)。
  对鉴定的慢生单胞菌新菌B210捕食现象进行了初步探究。其捕食谱广泛,能捕食革兰氏染色阳性和阴性细菌,这同黄色黏球菌的捕食谱相似,而不同于只能捕食革兰氏阴性菌的蛭弧菌;通过扫描电子显微镜观察、捕食接触性试验推断其捕食需要细胞间接触。通过对菌株B210发酵液不同组分的抑菌作用的探究,发现其发酵上清液和胞内产物都不具有抑菌作用,这进一步佐证了其捕食行为需借助与猎物的细胞接触。
[硕士论文] 石明菁
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:近海海洋沉积物中海洋细菌资源丰富,存在很多潜在功能细菌和潜在新物种,具有重要的研究价值。本文以威海荣成海参养殖池沉积物样品为实验对象,结合纯培养和免培养测序技术,探究了样品中细菌的群落组成以及在富集前后细菌区系的变化,并发现了56株潜在新物种。同时,完成了五株海洋新菌的多相分类分析,丰富了海洋细菌的资源。
  本次富集培养分为两种处理,一种为传统的富集培养方法,命名为A处理,一种是在传统富集培养体系中添加具有捕食能力的沉积物慢生单胞菌,命名为F处理。两种处理中纯培养和免培养测序结果均证明,与富集前相比,富集后细菌的数量显著增加,多样性有所提高。在富集培养过程中,可培养细菌多样性表现为先增加后减少,在第21天多样性最高。本方法尤其适用于拟杆菌门,厚壁菌门和梭杆菌门细菌类群的富集分离,Parcubacteria和热袍菌门在富集培养后出现,但对于蓝藻门的分离不适用。同时,与A处理相比,F处理在对应时间点的细菌数量和多样性减少,群落结构差异明显。据此,可以指导实验方法的进一步改进,同时对拟杆菌门等特定细菌类群的分离提供借鉴意义。另外,通过本次实验结果可知,在威海荣成海参养殖池沉积物样品中,含有丰富的海洋细菌资源,有待于进一步开发。
  从威海近海沉积物中分离到三株海洋新菌,菌株编号分别是FA042T,HF004T,D2T,经多相分类分析,确定FA042T为李玄淳属的新种,命名为红色李玄淳菌(Hyunsoonleella rubra)。HF004T为海球菌属的新种,命名为海泥海球菌(Halioglobus lutimaris)。D2T为卵链菌属的新种,命名为沉积物卵链菌(Catenovulum sediminis)。
  FA042T菌落呈红色,绝对好氧菌,杆状,没有鞭毛,不能滑动。生长的最适条件是:温度33℃,pH7.0-7.5,盐度为2-3%。基于16S rDNA分析结果,FA042T与济州岛李玄淳菌(Hyunsoonleella jejuensis)最相近,相似度为95%。主要脂肪酸成分为iso-C15∶0,iso-C15∶1G,C15∶0,iso-C17∶03-OH和iso-C15∶03-OH。主要呼吸醌型为MK-6。主要极性脂为三种未知脂质,两种未知的氨脂和磷脂酰乙醇胺。DNA G+C含量为38.5 mol%。建议FA042T(=KCTC42398T=MCCC1H00110T)代表拟杆菌门李玄淳属的新种,命名为红色李玄淳菌(Hyunsoonleellarubra)。
  菌株HF004T是绝对好氧菌,杆状(长1.3-1.8μm,宽0.4-0.6μm),不能滑动,革兰氏阴性菌。生长的最适条件是:温度28℃,pH7.5-8.0,盐度为2-3%。通过分析16S rDNA,HF004T与海球菌属最相近,相似度为95.6%-96.1%。主要呼吸醌型为Q-8。主要脂肪酸成分为summed feature3(i.e.C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH),C17∶1ω8c和C181ω7c。主要极性脂为双磷脂酰甘油,磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。DNA G+C含量约56.9 mol%。建议HF004T(=KCTC42395T=MCCC1H00127T)代表变形菌门海仙菌科海球菌属的新种,命名为海泥海球菌(Halioglobus lutimaris)。
  菌株D2T为绝对好氧菌,杆状,噬琼脂,侧生鞭毛,革兰氏阴性菌。生长最适条件是:温度37℃,pH7.5-8.0,盐度为2-3%。通过分析16S rDNA,D2T与卵链菌属最相近,相似度为93.9%-96.3%。主要呼吸醌型为Q-8。主要脂肪酸成分为summed feature3(i.e.C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH),C16∶0,C1o∶03-OH,C18∶1ω7c和C12∶0。主要极性脂为磷脂酰乙醇胺,磷脂酰甘油和两种氨磷脂。DNAG+C含量约40.4 mol%。建议D2T(=KCTC42869T=MCCC1H00129T)代表变形菌门交替单胞菌科卵链菌属的新种,命名为沉积物卵链菌(Catenovuhumsediminis)。
  从海南省陵水县黎安港采集的红藻表面分离到两株海洋细菌,分别编号为0182T,DC003T。经多相分类签定,确定0182T为藏红花黄色线菌属的一个新种,命名为藻居藏红花黄色线菌(Crocinitomix algicola)。DC003T为赖兴巴赫氏菌属的一个新种,命名为变色赖兴巴赫氏菌(Reichenbachiella versicolor)。
  菌株0182T为绝对好氧菌,没有鞭毛,菌落颜色为黄色,革兰氏阴性菌,杆状(长0.9-2.5μm,宽0.2-0.4μm)。生长最适条件是:温度30℃,pH7.0-7.5,盐度为2-3%。通过分析16S rDNA,0182T与产触媒藏红花黄色线菌最相近,相似度为94.6%。主要呼吸醌型为MK-7。主要脂肪酸成分为iso-C15∶0,C15∶0,iso-C17∶03-OH和iso-C15∶1G。主要极性脂为氨磷脂,两种未知的氨脂和四种未知的磷脂。DNA G+C含量为35.4 mol%。建议0182T(=KCTC42868T=MCCC1H00128T)代表拟杆菌门藏红花黄色线菌科藏红花黄色线菌属的新种,命名为藻居藏红花黄色线菌(Crocinitomix algicola)。
  菌株DC003T为绝对好氧菌,没有鞭毛,噬琼脂,革兰氏阴性。生长最适条件是:温度28℃,pH7.0-7.5,盐度为2-3%。通过分析16S rDNA,DC003T与赖兴巴赫氏菌属最相近,相似度为93.1%-94.7%。主要呼吸醌型为MK-7。主要脂肪酸为iso-C15∶0,summed feature3(i.e.C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH),C161ω5c和summed feature5(i.e.Ct8∶2ω6,9c and/or C18∶0 ANTE)。主要极性脂为三种未知脂质,两种氨磷脂,一种未知成分的磷脂和磷脂酰乙醇胺。DNA G+C含量约37.0 mol%。建议DC003T(=KCTC42867T=MCCC1H00130T)代表拟杆菌门赖兴巴赫氏菌属的一个新种,命名为变色赖兴巴赫氏菌(Reichenbachiellaversicolor)。
[硕士论文] 宁传德
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:南极地区极端的气候条件使其成为地球上最严酷的陆地生境之一,其特殊生境条件孕育了独特的微生物类群。南极区域少有人类活动,其深海沉积物不仅地质学特征复杂,所含矿物成分种类众多,是复杂的微生物栖息地,也是一种特殊的生态环境。罗斯海(Ross Sea)是南太平洋深入南极洲的大海湾,位于罗斯陆缘冰(Ross ice shelf)之北,维多利亚地阿代尔角西(Cape Adare)与爱德华七世半岛的科尔贝克角东(Cape Colbeck)之间(158°W-170°E)。本论文对南极罗斯海沉积物中可培养微生物的多样性和低温酶活性进行了研究,并采用遗传学、表型特征、生理生化指标和化学分类指标等多项分类法鉴定出1株南极细菌新种。
  利用传统平板培养法,对采集自罗斯海的6份沉积物样品进行了细菌和真菌的分离培养,选择形态差异较大的细菌和真菌进行了16SrDNA和ITS鉴定。16SrDNA序列分析结果显示需盐杆菌属7株,芽孢杆菌属7株,海洋杆菌属4株,动球菌属6株,嗜冷杆菌属12株。ITS鉴定结果表明筛选得到的真菌属于6个属:枝孢属、链格孢属、弯孢属,蜡蚧菌属、定殖真菌属、青霉菌属,其优势真菌为枝孢属菌株。以上菌株中,88.89%的细菌可产生α-葡萄糖苷酶,72.22%的细菌可以产生蛋白酶,83.33%的细菌可产生脲酶,69.44%的细菌可产生β-半乳糖苷酶,69.44%的细菌能将硝酸盐还原成亚硝酸盐和氮气;产淀粉酶、纤维素酶和酪蛋白酶的真菌分别占真菌菌株总数的37.93%、34.48%、61.54%;8株菌株对至少一种受试菌株有拮抗作用,且其拮抗活性主要针对真菌(辣椒疫霉)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、鳗弧菌),未发现对革兰氏阳性细菌(枯草杆菌)有明显抑制作用的菌株。由以上结果可以看出,罗斯海沉积物中的微生物具有丰富的多样性,这为筛选具有特殊功能的菌株和发现新菌种提供了基础。
  利用传统平板培养法,以海水R2A培养基,对一株南极细菌2PM7进行分类鉴定。结果显示,该细菌是革兰氏阴性菌,严格需氧,呈杆状,无鞭毛,无运动性;在0-20℃条件下生长状况良好,该菌株适合生长的pH值为4.0-8.0,适合在低于0.9%(w/v)NaCl的培养基中生长;具有氧化酶、过氧化氢酶活性。该菌DNA的G+C含量为44.4mol%,细胞呼吸醌为甲基萘醌7(MK-7),主要脂肪酸为iso-C15∶0(18.1%)、C16∶1ω5c(14.2%)和Summed feature3(40.5%)。2PM7与粘液杆菌属(Mucilaginibacter)的一株细菌标准菌株Mucilaginibacterrugui sp.nov.的相似度为96.8%,另外与该科其他细菌的同源相似性均低于96.8%。构建的系统进化树显示,2PM7形成了一个独立的分支。因此,根据该菌在遗传学特征和表型特征上所表现出来的特殊性,认定该菌属于黏液杆菌属的一个新种,命名为Mucilaginibacter ning sp.nov.。
[硕士论文] 许振兴
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:能源、资源、环境问题是21世纪制约社会经济可持续发展的主要瓶颈。为进一步解决能源紧缺问题,从海洋中寻找新的生物能源途径越来越引起科研人员的重视。海洋面积占地球总面积的70%以上,其中蕴藏丰富自然生物资源,并且含有大量可进行生物质转化的藻类。琼胶作为一种海洋功能多糖,是海洋红藻细胞壁的主要成分,总量巨大,是生物质能转化的重要来源之一。另外,琼胶经水解后的寡糖也由于水溶性好,易被机体吸收的特点,在食品,医药,化妆品等领域有着巨大应用前景。微生物作为降解琼胶的初级消费者,是研究琼胶生物质转化以及制备琼胶寡糖的主要物种来源。因此,本文以细菌的琼胶降解为研究主线,开展了一系列研究工作。
  首先,本文完成了包括两株琼胶降解菌在内的四株海洋新菌的分类鉴定工作。分离自青岛养殖池海水并且具有琼胶降解能力的菌株QM50T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白、DNA以及吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,基因组分析以及16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为科尔韦尔氏菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶科尔韦尔氏菌(Colwellia agarivorans sp.nov.)。分离自条斑紫菜表面并且具有琼胶降解能力的菌株HZ1T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白以及吐温80,呼吸醌类型为MK-6,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和三个未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征以及16S rRNA序列的系统发育分析,菌株HZ1T为黏着杆菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶黏着杆菌(Tenacibaculum agarivorans sp.nov.)。分离自鲨鱼腮的中度嗜盐菌SS9T,革兰氏阴性菌,最适生长盐度为6%,能够积累PHA,呼吸醌类型为Q-9,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,16S rRNA序列的系统发育分析以及MLSA分析,该菌为是盐单胞菌科的一个新属新种,建议将其命名为橙色鲨鱼球菌(Pistricoccus aurantiacusgen.nov,sp.nov.)。分离自威海近海沉积物的菌株N211T,革兰氏阴性菌,可以水解明胶和吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺,磷脂酰甘油和一种未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征和16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为深海杆菌属的一个新物种,建议将其命名为沉积物深海杆菌(Thalassotalea sediminis sp.nov.)。另外,还对鉴定的两株琼胶降解菌进行了基因组测序,结果显示菌株QM50T的基因组大小为4.7 Mb,GC含量为35.8%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌株存在5条β-琼胶酶基因,4条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。菌株HZ1T的基因组大小为5.6 Mb,GC含量为30.9%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌存在11条β-琼胶酶基因,1条α-琼胶酶基因,2条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。并且这两株菌还注释出不完全相同的半乳糖代谢通路。
  然后,本文对来源于本实验室之前鉴定的两株琼胶降解菌HQM9T和QIT的11条琼胶酶基因和6条新琼二糖水解酶基因进行了外源表达分析。利用生物信息学分析,除琼胶酶AgaAJ属于GH86家族,琼胶酶Q1B2属于GH118家族外,其余9条琼胶酶基因都属于GH16家族,6条新琼二糖水解酶基因属于GH117家族。并且经过对琼胶降解酶基因的外源表达过程,我们成功构建了11条琼胶酶的基因工程菌,经表达检测及酶活分析,9条琼胶酶进行了重组蛋白表达并显示出一定活性。而6条新琼二糖水解酶基因中只有四条基因被成功表达,除了NABH1表达可见的可溶性重组蛋白外,其余3条基因均表达包涵体,经底物水解检测,这四条重组的新琼二糖水解酶没有显示出降解底物的能力。对多个重组酶进行纯化,最后利用亲和层析结合包涵体复性的方式成功纯化出重组琼胶酶Q1B1,对其进行生理生化特征鉴定,重组酶Q1B1在底物为1%时的比酶活为222.84U/mg,并且具有琼胶底物专一性,它的最适反应温度为40℃,最适底物浓度为1.6%,最适反应的pH值为8,DTT对酶活的促进有很大影响。纯化后的重组酶以琼脂糖为底物时的最终降解产物为新琼四糖和新琼六糖,它的最小降解底物为纯的新琼六糖。
  最后,本文还从基因转录水平分析了菌株Q1T在琼脂糖诱导条件下,在不同时间琼胶降解相关基因的表达差异。结果显示琼胶降解酶基因的表达集中于菌株诱导生长的前期,并随着菌株生长持续减弱,至菌株生长至稳定期后期时,琼胶降解基因基本停止表达。另外,根据琼胶降解基因在基因组上的分布,菌株Q1T中的琼胶降解酶基因大部分可能属于单独调控型,虽集中表达,但表达量只与诱导条件有关,而与基因所处位置无关。
[硕士论文] 李风娥
生物化学与分子生物学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:河口位于海陆交汇的地带,其各种生物地球化学过程之间的相互作用十分活跃。氮是组成生物有机体的主要元素,也是影响河口富营养化发生和演变的关键生源要素之一。黄河入海口位于黄河、渤海湾和莱州湾的交汇处,是胜利油田的所在地,黄河携带的大量泥沙、陆源污染物以及周边人类活动的影响使得该地区生态环境极为复杂多变。目前大量人为氮素的输入使黄河入海口环境日益恶化,使其承受着巨大的生态压力。反硝化被认为是去除活性氮的关键过程。本研究以黄河入海口5个典型采样点(SA-SE)的沉积物样品为研究对象,利用克隆文库和定量 PCR的方法研究两种基因型反硝化细菌的多样性、群落结构及丰度,结合理化因子进行相关性分析,揭示环境因子与反硝化细菌群落的关系。主要研究结果如下:
  (1)以 nirK、nirS基因为分子标记,建立克隆文库,得到阳性克隆子并测序,获得nirK基因有效序列370条,nirS基因有效序列356条。将序列按照95%的相似性进行OTU(操作分类单元)划分,nirK基因共获得120个OTUs,nirS基因共获得126个OTUs。对于nirK基因,每个采样点的OTUs个数在19-55之间,nirS基因各个采样点OTUs的个数在30-39之间。
  (2)基于OTU水平的α-多样性分析表明,入海口nirS型反硝化细菌多样性整体略高于nirK型反硝化细菌多样性,且无论nirK或nirS基因,均表现为采样点SE反硝化细菌多样性较高。基于OTU水平的β-多样性分析结果表明,两种基因型的反硝化细菌其物种组成的空间分布方式不同,对nirK型反硝化细菌,SB和SE点的物种组成相似,而SA和SE点的nirS型反硝化细菌物种组成较相似。
  (3)NirK基因系统发育分析表明,与绝大部分OTUs亲缘关系较近的克隆序列主要来自黄河入海口水体、旧金山湾河口沉积物、重金属污染的土壤、活性污泥、沿海微生物垫和各种农田土等环境。NirK基因系统进化树可划分为7个Clusters(Cluster I-VII),其中,Cluster I、III、IV、V的绝大部分序列主要分布在溶解氧含量较低的采样点(SB、SC、SE),其他Clusters则分布在溶解氧含量较高的采样点(SA、SD)。NirS基因系统发育分析表明,与绝大部分OTUs亲缘关系较近的克隆子主要来自长江入海口、东湖、海河、北运河、珠江口和切萨皮克湾等河口沉积物环境,nirS基因系统进化树可划分为5个Clusters(Cluster I-V),与nirK型反硝化细菌群落结构不同,nirS型反硝化细菌群落结构不存在类似的空间分布模式。
  (4)利用定量PCR估算nirK和nirS型反硝化细菌丰度,nirK型反硝化细菌丰度为4.17×103-9.72×105 copies/g(干重), nirS型反硝化细菌丰度为4.34×104-2.62×105 copies/g(干重)。单因素方差分析显示,样品SA、SC和SD中的nirS型反硝化细菌丰度显著地高于其他采样点(P<0.05)。对于nirK,样本间的基因丰度显著不同(P<0.001)。对两种基因型反硝化细菌丰度比较分析,相比nirS,nirK型反硝化细菌在潮汐区域(SA、SC和SD)显示较高的丰度,在河流汇合点(SB和SE)丰度较低。
  (5)环境因子与两种基因型反硝化细菌的多样性、丰度及优势 OTUs的斯皮尔曼(Spearman)相关性分析表明,相比nirK型反硝化细菌,黄河入海口沉积物nirS型反硝化细菌的多样性及丰度对环境因子的响应更为敏感。基于优势OTUs与全部OTUs的典型对应分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)表明,nirK型反硝化细菌群落结构对环境因子的响应较为敏感,即 nirK型反硝化细菌群落结构受到溶解氧的显著影响(P<0.05),而nirS型反硝化细菌群落结构受环境因子影响较小,可能主要受其他未被检测到的环境因子所影响。
[硕士论文] 徐丹丹
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:大部分的HNH核酸内切酶都能切割3-5bp的双链DNA片段,具有DNA切割活性。大部分的HNH核酸内切酶具有相似的结构,包括两条反向平行的β折叠片和一条α螺旋及一个金属离子结合中心。深海嗜热噬菌体GVE2(deep-seathermophilic bacteriophage Geobacillus virus E2)HNH核酸内切酶在噬菌体的生命周期中作为一个很重要的组装机器,对噬菌体的繁殖及侵染有很重大的意义。
  本研究通过X射线晶体学的方法解析了高分辨率的GVE2 HNHE-Mn2+和GVE2 HNHE-Zn2+的三维结构。本实验通过结构和生化两方面深入的研究了深海嗜热噬菌体HNH核酸内切酶的作用机制。这是深海嗜热噬菌体内HNH核酸内切酶的首次研究报道。生物信息学分析表明GVE2 HNHE属于HNH核酸内切酶超家族的一员。本实验通过结构比较显示,除了含有额外的α-螺旋之外,GVE2HNHE具有与来自其它噬菌体的HNH内切核酸酶类似的典型的ββα-金属折叠结构和Zn-指状基序,这表明在噬菌体中这些酶具有很高的保守性。生化实验研究表明,HNH结构域中的保守氨基酸H93,N109和H118的突变体H93A,N109A和H118A分别降低了90%、80%、60%的切割活性。通过圆二色谱实验分析,与野生型GVE2 HNHE相比突变体H93A的构象并未发生很大的变化,突变体N109A和H118A的整体构象发生了很大变化。除此之外,通过圆二色谱测定野生型GVE2 HNHE和突变体蛋白的热稳定性发现,突变体蛋白(H93A,N109A和H118A)的热稳定性与野生型相比下降了很多。Mn2+和Zn2+对GVE2 HNHE的切割活性的影响各不相同。然而高浓度的锰离子对突变体N109A和H118A对DNA的切割活性产生促进作用,锌离子会抑制二者的切割活性。通过与其它类型的HNH核酸内切酶的结构比较,发现GVE2 HNHE的构象与其它核酸酶的构象有很大不同,这也许是这种酶高温耐热的基本原因。通过结构生物学的实验方法解析了深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶的两种高分辨率三维结构,并通过后续的生化实验研究验证了核酸内切酶的生理生化特性,为HNH核酸内切酶在深海嗜热噬菌体生命周期内的作用提供了证据和线索。
[硕士论文] 周玥
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:极地自然环境条件苛刻恶劣,具有严寒、强风、强紫外辐射等特点,因而高等动植物罕见,微生物如细菌、真菌、放线菌等资源丰富多样。为了适应极地特殊的自然生态环境,极地微生物在基因组成与表达、酶学及相关代谢调控方面形成独特的分子生物学特性,因而可产生结构新颖、活性独特的次级代谢产物,并具有丰富的生物学活性,如抗肿瘤、抗菌活性等,可成为新型化学药物的重要来源。
  在本课题组前期研究中,采用PTP1B抑制活性为指征及TLC香兰素显色分析方法筛选得到真菌Penicillium sp.S-1-18。采用含0.3%酵母提取粉,0.5%胰蛋白胨,0.3%麦芽糖,1%葡萄糖及5%蔗糖的培养基,在初始pH7.0,18℃,180 r/min的条件下培养14d,发酵结束后滤出菌体,菌液部分浓缩并用乙酸丁酯萃取,最终得到总浸膏约60 g。在此基础上展开对代谢产物的鉴定和生物学活性研究。首先采用石油醚和二氯甲烷对总浸膏进行分步萃取,进而对二氯甲烷相浸膏进行系统分离纯化,分别采用减压柱层析、Sephadex LH20凝胶柱层析、反相ODS柱层析、正相硅胶柱层析及高效液相等色谱分析方法,最终分离得到9个化合物,分别是butanolide A(1),guignarderemophilane F(2),xylarenone A(3),penicyclone A(4),4(3H)-喹唑啉酮(5),环-(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)(6),环-(L-脯氨酸-4R-羟基-L-脯氨酸)(7),callyspongidipeptide A(8)和N-(2-羟基丙酸)-2-氨基苯甲酸(9)。其中化合物1和2为新化合物,其绝对构型分别通过改良的Mosher法和ECD/CD比对法进行了确定。对该菌株中所得化合物进行生物学活性评价,结果显示化合物1有一定的PTP1B抑制活性,其IC50为27.4μM,此外化合物4、5和8有微弱的抑制鲍曼不动杆菌活性,IC50值均为64μM。
  与此同时,采用TLC显色指征法筛选出一株南极海洋来源真菌Penicillium sp.S-2-10。以TLC显色及产物浸膏量为参考,对其发酵条件进行初步优化,最终确定选用含1.0%NaCl的GPY培养基,在24℃,180 r·min-1条件下振荡培养12 d进行规模发酵。发酵90 L后用纱布过滤菌体和菌液,用二氯甲烷与甲醇等体积萃取菌体,用乙酸乙酯萃取菌液,合并萃取液浓缩得到约16 g总浸膏。采用Sephadex LH20凝胶柱层析、正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析及高效液相等色谱分析方法对总浸膏进行系统分离纯化,通过核磁(1H-NMR和13C-NMR等)及质谱(MS)等波谱分析方法,并与相关文献比较,确定了7个化合物结构,分别为benzoic acid,2-(2,6-dihydroxybenzoyl)-3-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-methyl,methyl ester(10),大黄酚(11),volemolide(12),ergosta-6,8(14),22-trien-3-ol(13),2-aminophenoxazin-3-one(14),2-苯并噻唑酮(15)和苯甲酸(16)。其中,化合物12和13首次从青霉属真菌中获得。对所分得的化合物进行生物学活性评价,发现化合物12具有微弱的肿瘤细胞抑制活性,对SMMC-7721肿瘤细胞的增殖抑制IC50为42.70μM,对SGC-7901肿瘤细胞的增殖抑制IC50为49.98μM。化合物11、12、13和15有微弱的抑制鲍曼不动杆菌活性,IC50值为64μM。
[硕士论文] 刘晓辉
海洋科学 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:本文采用DAPI染色计数、构建细菌克隆文库和高通量测序技术等方法,对长江口及邻近海域表层海水中的细菌丰度、群落结构组成及时空分布规律进行了研究,并同时监测相应的环境指标,分析了细菌群落结构变化与环境因子的关系。首先,通过DAPI染色计数和克隆文库法研究长江口及邻近海域大面站10个站点表层海水中的细菌。结果显示长江口及邻近海域表层海水中细菌丰度总体较高,但生物量变化较大,总体趋势从长江口向外海增加。细菌克隆文库分析表明:共发现11个细菌门类,分别为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝细菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、浮霉菌门、疣微菌门、纤维杆菌门和柔膜菌门,其中变形菌门为主要优势类群(60.61%),其次是拟杆菌门(15.18%)和放线菌门(14.79%),另外柔膜菌门和SAR类群在研究海域中比较少见。MDS和聚类分析将10个采样点的细菌群落组成分为6类。RDA分析表明TP、DO、pH和TSP是影响浮游细菌群落结构的主要环境因子。多样性分析结果显示长江口及邻近海域部分站点中细菌多样性显著,与研究海域水产养殖活动有关,并受到区域洋流和海洋化学环境(如低氧带)的影响。
  从长江口及邻近海域D03连续站采集9个表层海水样品,通过DAPI染色计数和高通量测序的方法,对样品中细菌丰度和群落结构的昼夜变化进行研究。结果表明海水中细菌丰度总体较高,但呈现出白天稍高于夜间的现象,pH和P043-是细菌丰度昼夜变化的重要影响因子。本次共发现28个门类的细菌,主要包括变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝细菌门、SAR406、疣微菌门、柔膜菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和一些丰度极低的类群,其中变形菌门是各样品的优势类群,其次为拟杆菌门和放线菌门。各细菌类群在昼夜波动下的变化趋势不同,影响细菌群落结构变化的因素主要有潮汐、光照、营养盐、浮游动物的摄食和病毒的裂解等。这些研究结果充分说明了长江口海域表层海水中具有较高的细菌多样性水平,细菌群落结构随昼夜周期的变化规律及影响因素十分复杂。
[硕士论文] 方静
生物学 上海交通大学 2016(学位年度)
摘要:本研究以冷泉富集样本为例,来研究甲烷厌氧氧化富集样本中的微生物的组成、代谢途径以及相互作用关系。首先,分别统计宏基因组和宏转录组两组数据中的16S rRNA基因的构成,我们发现该样本中存在着大量并活跃着的ANME-2和 SRB;还发现了大量的属于γ-变形纲的细菌,不过其活跃度不高。基于与KEGG和COG数据库的比对,存在着由ANME-2介导的AOM过程和由SRB介导的SR过程,并且这两个过程为该样本的主要代谢途径。除了AOM和SR过程,样本中还发现了属于细菌的完整的TCA循环和部分硝化反应以及属于ANME-2的固氮反应中的关键酶。这些都说明了该样本中不仅存在着AOM-SR过程,还存在着大量其他的代谢途径来共同维持着整个微生物群落的稳定。然后,通过对宏基因组原始序列中 CRISPR结构的查找,发现总共有216条含有CRISPR结构的序列,这些CRISPR序列总共包含了733条间隔序列。基于重复序列的序列相似性的聚类,216个CRISPR位点可以被分为19个类别,并且Clu04和Clu06是冷泉富集样本中的两个广泛存在的CRISPR类别。最后,我们尝试利用CRISPR的结构特点将 CRISPR所在序列的物种信息和间隔序列的物种信息相结合,并成功地建立起了冷泉富集样本中的微生物间的潜在的相互作用关系:在冷泉富集样本中,γ-变形纲菌不仅会与其他微生物(比如 Halobacteriales和α-变形纲菌)进行遗传物质的交流,还会受到来自 Myoviridae等病毒的侵染;而 Methanosarcinales会受到来自Mimiviridae病毒的侵染。我们尝试将找到的微生物间的相互作用关系与 CRISPR的种类相联系,但由于数据太少无法给出明确的结论。不过这种利用宏基因组数据和 CRISPR的结构特点来研究微生物间的相互作用关系的全新的方法,仍然能够给许多研究者带来启示。另外,我们对该样本的宏基因组和宏转录组的深入分析也将会为进一步对研究甲烷厌氧氧化提供帮助。
[硕士论文] 李国强
微生物学 兰州交通大学 2016(学位年度)
摘要:青藏高原是非常具有代表性的极端环境,其具有的高海拔、低气温和高紫外辐射强度使其在生态环境和物种多样性方面具有非常高的研究价值。青藏高原典型水域中微生物多样性受青藏高原环境条件的影响,特殊的环境条件变化对青藏高原水域生态和物种多样性都具有非常高的指示作用。开展青藏高原水域中微生物多样性研究能更好地评估高海拔湖水生态系统中微生物多样性资源及环境变化与微生物多样性之间的相互关系,具有重要的理论研究价值。
  本论文对青藏高原不同海拔湖水及青海湖表层沉积物中微生物多样性及环境生态因子相关性进行了研究,为进一步开展高海拔湖泊微生物多样性资源研究提供了基本的科学资料。本研究以采自运城盐湖、青海湖和纳木错湖湖水和青海湖表层沉积物样品为研究材料,运用平板菌落计数法、Biolog技术、Miseq宏基因组测序技术等,对湖水及表层沉积物样品中微生物群落物种多样性、微生物群落功能多样性及其与环境生态因子的相关性进行研究,得到以下主要研究结果:
  (1)应用Miseq宏基因组测序技术分析了青藏高原不同海拔湖水中微生物多样性,结果表明:青海湖十月份(Q10)和八月份(Q8)湖水样品中微生物群落丰富度最大,群落多样性最高。而纳木错湖四月份(N4)湖水样品中微生物群落丰富度最小,群落多样性最低;通过对青海湖和纳木错湖微生物物种的相似度进行分析,结果表明:青海湖与纳木错湖湖水中微生物物种具有非常高的相似性,其优势菌主要集中在拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria);对微生物多样性与环境生态因子相关性进行分析,结果表明:青海湖和纳木错湖湖水中微生物群落多样性主要受水温、UVB和pH的影响,且与水温、UVB和pH呈负相关。其中,pH对群落多样性影响最大,水温对群落多样性影响最小。
  (2)青海湖表层沉积物中可培养微生物数量研究结果表明:0~5cm层与5~20cm层表层沉积物中可培养细菌与真菌数受环境变化影响程度显著(P<0.05),其中0~5cm层与5~20cm层可培养细菌菌落数均在八月份达到最大值,分别为1.28×108CFU和1.8×108CFU。0~5cm层与5~20cm层可培养真菌数分别在十月份与六月份达到最大值,分别为1.32×105CFU和3.58×105CFU。
  (3)Biolog-ECO微平板研究结果表明:青海湖表层沉积物中微生物群落的功能多样性呈现季节性变化,其微生物群落功能多样性大小的排序为:八月份>六月份>十月份>四月份>五月份。
  (4)青海湖表层沉积物Miseq宏基因组测序结果表明:在0~5cm层中,五月份样品(2a)的微生物群落丰富度最大,八月份样品(4a)的群落多样性最大。而在5~20cm层中,十月份样品(5b)的微生物群落丰富度最大,八月份样品(4b)的群落多样性最大;优势菌种的统计结果表明:与0~5cm层中的优势菌相比,5~20cm层中的变形菌门比例较高,而拟杆菌门比例较低。酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门和疣微菌门比例基本相同,且所占的比例较低。同时,在六月份到八月份之间,浮霉菌门的比例会明显升高。
  (5)环境生态因子相关性分析结果表明:可培养微生物数量与微生物群落多样性主要受水温、气温和光照强度的影响。可培养微生物数量与其呈正相关,微生物群落多样性与其呈负相关。其中UVB与光照强度对优势菌的比例影响较大,pH对优势菌的比例影响最小。
[硕士论文] 吴小梅
生物学 集美大学 2016(学位年度)
摘要:在养殖中不可避免地直接或间接使用过抗菌药物,如此养殖出来的水产品往往携带耐药细菌,不仅削弱抗菌药物对动物细菌性疾病的控制效果,且还存在向人类致病菌传播耐药性的潜在风险。本文研究美洲鳗鲡及其养殖水体分离耐药细菌,并分析耐药细菌的种属组成、耐药性、特定耐药基因及耐药整合子,进而利用传代实验研究细菌耐药性的消除。
  经抗性平板筛选出108株耐药菌,由16S rDNA鉴定属于4纲20个属,γ-变形菌纲的气单胞菌属(24.1%)、柠檬酸杆菌属(17.6%)和不动杆菌属(16.7%)的出现频率最高。
  对17种抗菌药物的药敏试验结果显示,108株耐药菌株对阿莫西林的耐药率高达90.7%,对四环素、抗叶酸类、酰胺醇类、利福平类的耐药率也在60%~80%之间。93.5%(101/108)的菌株对3种及以上的药物具有抗性,其中有两株对13种抗菌药具有抗性,两株对14种抗菌药具有抗性。美洲鳗鲡的肠道、表皮、鳃部及水样分离菌株的多重耐药指数中水样的最高。分离菌株数较多菌属中柠檬酸杆菌属和克雷伯菌属的耐药水平最高,而不动杆菌属则相对较低。
  对29种抗性基因的PCR检测结果显示,耐药菌株中耐β-内酰胺类药物的基因blaTEM检出率高达100%,耐药基因tetC和sulI的检出率也高达96.3%。其次,aadA和floR的检出率分别为74.1%和69.4%,qnrB、arr2/3的检出率在50%左右。此外,在本研究中,所有菌株至少检测到两种抗性基因,其中肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)C11检测到18种抗性基因。
  108株耐药菌株中86株含有I型整合子,10株携带II型整合子,没有检测到III型整合子。10株携带II型整合子的菌株均同时携带I型整合子。I型整合酶阳性菌株有74株成功扩增可变区,其中33株携带空整合子,另外41株菌的整合子共含有14种不同基因盒排列。包括一种新的基因盒排列:dfrB4-catB3-blaOXA-10-aadA1,基因盒排列dfrA12-orfF-aadA2分布最为广泛。基因盒排列中优势基因盒为dfr和aad基因家族。10株intIII阳性菌株全部都扩增出可变区,均含有相同的基因盒排列dfrA1-catB2-sat2-aadA1。
  耐药菌株T4以空白MH肉汤进行传代培养,随着代数的累加,对TET耐药的菌群比例迅速下降。紫外照射不影响T4菌株耐药性。而低浓度TET和37℃高温实验组传代子的耐药率基本保持在100%,这意味着低浓度抗生素和高温等逆境可以保持细菌耐药性的稳定。此外SDS的存在也不利于T4耐药性的消除。T4原代所携带的基因中,经PCR扩增检测到strA/B、aphA1和blaTEM基因在耐药性消除菌株中仍然稳定存在未被消除,而tetD、floR、dfrA12和I型整合子均消除未见。
  本研究分析了美洲鳗鲡养殖生态群落中耐药菌的多样性、种属分布以及多重耐药情况;补充了美洲鳗鲡动物源细菌在抗性基因和整合子研究方面的匮乏和不足;同时研究了耐药性消除的影响因素,以探索消除细菌耐药性的可能途径。
[硕士论文] 郭树源
预防兽医学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:沙门菌属是肠杆菌科中的一个大属,血清型繁多,是危害人类与畜禽的一类重要病原菌。近年来,沙门菌污染畜禽产品的问题已引起养殖人员及公共卫生界的极大重视。近年来随着抗生素的使用甚至滥用,使得沙门菌的耐药性越来越严重,对养殖业构成极大的威胁。
  本研究先后从山东省不同地市采集不同动物源的样品,通过选择培养基、革兰氏染色和16s rRNA分离沙门菌,并做生化试验查看其生化特性。通过玻片凝集试验,确定分离株的血清型。通过微量肉汤稀释法对分离的沙门菌进行多种药物的药敏试验,来检验其耐药性,同时检测分离菌株的17种耐药基因的存在情况。测定沙门菌常见的四种毒力基因,了解分离沙门菌毒力基因的变异特点。通过多位点序列分型技术对分离株进行分型,了解沙门菌的基因序列型。通过鉴定总共分离获得了78株鸡源沙门菌、56株鸭源沙门菌和20株猪源的沙门菌。不同动物源沙门菌血清型实验结果为:鸡源检出6种血清型,其中血清型为肠炎沙门菌最多,占88.5%;鼠伤寒沙门菌占1.3%;山夫登堡沙门菌占1.3%;印第安纳沙门菌占5.1%;汤卜逊沙门菌占2.6%;阿格玛沙门菌占1.3%。鸭源检出2种血清型,其中血清型为肠炎沙门菌最多,占67.9%;鼠伤寒沙门菌占32.1%。猪源共检测出3种血清型,其中血清型为鼠伤寒沙门菌最多,占65%;肠炎沙门菌占15%;德贝儿沙门菌占20%。通过MLST技术,鸡源检出7种ST型:ST11、ST19、ST26、ST128、ST14、ST17和New1,鸭源检出3种ST型:ST11、ST19和New2,猪源检出3种:ST34、ST40和ST3007,整体来看,分离菌的血清型和ST型数量比较接近,二者分型能力相近。通过药敏试验,鸡源菌株中,氨苄西林和多粘菌素的耐药率最高,达到了80%以上,对环丙沙星和头孢噻呋的耐药率也达到了59.0%和57.7%。鸭源菌株中,对环丙沙星和多粘菌素耐药率为100%,恩诺沙星为83.9%,对多西环素、庆大霉素和新霉素耐药率高于60%。猪源菌株中,对多西环素的耐药率最高为95%,其次为氨苄西林为80%和氟苯尼考为45%,在统计学分析中发现,不同动物源之间的耐药率差异显著现象普遍存在。耐药基因中的qnrA和qnrB在三种动物源中检测中均高于70%,其次是四环素类的耐药基因 tetA,在鸭源菌中为42.9%,在其他两种动物源中均高于50%,β-内酰胺类的耐药基因blaTEM的检出率在三种动物源中均高于30%,此外blaSHV、aph(3')-IV、tetB、qnrC和qepA基因在三种动物源中的检出率为零,但三种动物源耐药基因检出率差异显著的情况比较少。毒力基因检测发现四种毒力基因同源率很高,但部分存在碱基突变,猪源均未发生变异。invA基因:鸡源和鸭源主要有两个位点发生变异,但在氨基酸水平上并没有发生变异。hilA基因:仅鸡源在两个位点发生变异,氨基酸比对发现,在碱基199位的变异导致了氨基酸改变。siiE基因:仅鸡源发生了四处碱基位点变异,突变均在开放阅读框内,并没有发生氨基酸水平上的变异。invH基因序列没有发现碱基变异。本实验从多个层面分析了不同动物源的沙门菌的特性,从而使得我们对山东省部分地区不同动物源沙门菌有了初步认识,有助于更好地防治该菌引起的感染,从而有针对性的做出预防对策。
[硕士论文] 马睿霄
食品科学 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:海洋放线菌是一类革兰氏阳性菌,经过亿万年的进化,形成了以自我生物活性次生代谢产物为主体的化学防御体系,其次生代谢产物中常蕴含大量结构新颖、生物活性良好的单体化合物,为海洋来源药物先导化合物的开发奠定了基础。本课题对64株海洋放线菌进行活性初筛,结合HPLC-DAD-UV图谱的导向作用,选择3株次生代谢产物丰富、生物活性良好的菌株Streptomyces sp. SCSIO5003、Streptomyces sp. SCSIO1662、Streptomyces sp. SCSIO ZS0361进行放大发酵培养、萃取分离,并对得到的单体化合物进行细胞毒活性和抑菌活性测试。
  本研究主要内容包括:⑴菌株Streptomyces sp. SCSIO5003(M-AM6培养基)放大发酵培养后,分别以丙酮(1:1, v/v)和丁酮(1:1.5,v/v)萃取菌丝体及菌液,采用硅胶柱色谱、RP-MPLC及半制备型HPLC多种色谱方法对萃取浸膏进行分离纯化,获得化合物5003-A1、5003-A2、5003-A3、5003-A4、5003-A5、5003-A6、5003-A7、5003-A8、5003-A9和5003-A10。经ESI-HRMS,1D NMR及2D NMR鉴定5003-A2为Marihysin A,5003-A3、5003-A4、5003-A5为同分异构体,5003-A6、5003-A7为同分异构体经SciFinder查询为新化合物。⑵菌株Streptomyces sp. SCSIO1662(M-ISP2培养基)放大发酵培养后分别用丙酮(1:1, v/v)和丁酮(1:1.5,v/v)萃取菌丝体及菌液,采用硅胶柱色谱、RP-MPLC及制备型RP-HPLC多种色谱方法对萃取浸膏进行分离纯化,获得化合物1662-B、1662-C、1662-D、1662-E、1662-F、1662-G、1662-H及1662-I。经ESI-HRMS,1D NMR鉴定1662-B为Dibutylphthalate,1662-D为 Indole-3-acetic acid,1662-F为1H-Indole-3-carbaldehyde,1662-G为3-Hydroxyacetylindole,1662-I为1H-Indole-3-carboxylic acid。⑶菌株Streptomyces sp. SCSIO ZS0361(M-ISP2培养基)放大发酵培养后分别用丙酮(1:1, v/v)和丁酮(1:1.5,v/v)萃取菌丝体及菌液,经 HPLC检测成分基本相同合并,采用硅胶柱色谱、RP-MPLC及制备型RP-HPLC多种色谱方法对合并后的总浸膏进行分离纯化,获得化合物ZS0361-B、ZS0361-C、ZS0361-D、ZS0361-F、ZS0361-G。经ESI-HRMS,1D NMR及2D NMR鉴定ZS0361-B为Bafilomycin D,ZS0361-D为1H-Indole-3-carbaldehyde, ZS0361-G为3-Hydroxy-2-methylpyrone(maltol);ZS0361-F经SciFinder查询为新化合物。⑷对23个单体化合物采用微量肉汤稀释法和海虾生物致死法进行最小抑菌浓度(MIC)及细胞毒活性测试,其中5003-A2、5003-A3、5003-A4、5003-A5、5003-A6、5003-A7、5003-A8、ZS0361-C对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有抑制作用,MIC值均为128?g/mL;ZS0361-B、ZS0361-C对耐甲氧西林表皮葡萄球菌有抑制作用,MIC值分别为64?g/mL和16?g/mL;5003-A8、1662-I、ZS0361-C对苏云金芽孢杆菌有抑制作用,MIC值分别为16?g/mL,32?g/mL和16?g/mL;ZS0361-C对粪链球菌有抑制作用,MIC值为32?g/mL;ZS0361-B、ZS0361-C对藤黄微球菌有抑制作用,MIC值分别为64?g/mL和8?g/mL;5003-A2、5003-A3、5003-A4、5003-A5、5003-A6、5003-A7具有较弱海虾致死活性,ZS0361-F具有中等海虾致死活性,1662-C具有较强海虾致死活性,表明上述化合物具有潜在的细胞毒(抗肿瘤)活性。
[博士论文] 米见对
生态学 兰州大学 2016(学位年度)
摘要:青藏高原被称为世界“第三极”,拥有全球海拔最高、面积最大和唯一被四季放牧利用的高寒草地。独特的高寒生态环境(高海拔、寒冷、缺氧、紫外线强、牧草季节供应严重失衡),使得生存于此的牦牛种群在协同进化过程中产生了一系列特殊的适应机制。近年来的研究发现,与黄牛相比,牦牛在消化器官组织结构、牧食行为、氮素利用效率、甲烷排放、瘤胃甲烷菌菌群结构、季节间能量分配等方面均优于黄牛;并从牦牛全基因组测序中找到了适应高寒营养胁迫的相关功能基因。为此我们推断,长期的极端环境与营养胁迫,使细菌/甲烷菌在牦牛瘤胃和不同肠道部位中分别形成了特殊的时间动态和空间分布模式,以帮助宿主提高能量利用效率和有效应对每年长达8个月的冷季营养匮乏。本试验以牦牛为研究对象,主要利用通用引物515F/806R通过16S二代高通量测序,分析了细菌/甲烷菌在瘤胃中的定植过程(3、14、60、180、365和730天)、季节动态(春、夏、冬)和不同肠道部位(19个部位)的空间分布,拟寻找牦牛肠道微生态系统中有助于宿主适应高寒严酷生态系统的特殊微生物群落,为进一步通过调控肠道微生态系统提高牦牛生产性能和实现藏区畜牧业的可持续发展提供理论基础和技术支撑。
  本研究主要内容包括:⑴牦牛瘤胃细菌/甲烷菌定植过程中丰度指数Chao1的增加分为三个梯度,3和14天为第一阶段,60、180和365天为第二阶段,730天为第三阶段;多样性指数Shannon在3、14天低于其它年龄组(P<0.05),其它年龄组之间没有差异(P>0.05)。⑵牦牛瘤胃细菌定植过程中优势门水平的细菌是厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)三大类,约占85%。其中厚壁菌门(Firmicutes)所占的比例最高,在不同年龄组之间维持在约50%;拟杆菌门(Bacteroidetes)从3天的23%增加到了730天的43%;变形菌门(Proteobacteria)从3天的17%降低到了730天的2.3%。以上两种菌门的增加/降低都呈现出幼龄段(3、14天)、发育段(60、180天)和成年段(365、730天)阶梯式的变化。⑶牦牛瘤胃甲烷菌—广古菌门从3天的0.3%增加到60天最高的2%,随后在成年组(365、730天)维持在约1.3%。⑷瘤胃微生物定植过程中的途径主要是通过母畜唾液,将从母畜瘤胃中反刍带到口腔的瘤胃微生物转移到幼龄反刍动物的瘤胃中。⑸牦牛瘤胃细菌/甲烷菌季节变化过程中的丰度指数Chao1从大到小的顺序是春>夏>秋。U多样性指数 Shannon与丰度指数呈现相同的趋势,但是春夏两季之间多样性更加接近。同一季节组内相似性春季最低,夏季最高。⑹不同季节间以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌,在春、夏、冬三个季节所占的比例分别为75%、80%和77%。其中拟杆菌门的组成比例在春季最低约45%,在夏冬两季基本相同约为54%;而厚壁菌门在春夏冬三个季节的比例分别是30、26、23%。⑺在冷季(春冬两季),由于牦牛采食牧草中的纤维含量增高,瘤胃微生物中分解纤维的菌属高于暖季(夏季),而夏季中降解植物次级代谢产物和利用可溶性糖、氨基酸的菌属高于冷季。春季中的纤维降解菌属的种类和比例高于冬季。牦牛瘤胃甲烷菌的比例在冬季最低,而春夏两季的比例基本相同。⑻在相同的低氮日粮下,牦牛和黄牛不同肠道部位的细菌/古菌Alpha和Beta多样性没有差异。细菌/甲烷菌在不同肠道部位的丰度指数(Chao1)和多样性指数(Shannon),都是在前肠道内容物和大肠最高,前肠道壁次之,小肠中最低。不同肠道部位同一样品组内微生物多样性在小肠部位最低,其次是大肠,前肠道(内容物和肠道壁)中相似性最高。⑼忽略不同的肠道部位,在门水平的优势细菌是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),在前肠道和小肠约占75%,而大肠中的占比高达90%。厚壁菌门(Firmicutes)在小肠和大肠中的比例高于前肠道,而拟杆菌门(Bacteroidetes)在前肠道部位高于小肠和大肠。甲烷菌的比例在小肠高于肠道其它部位。Cyanobacteria菌门在牦牛不同肠道部位的比例高于黄牛。⑽在前肠道壁分布的优势菌属主要参与氧气、尿素和挥发性脂肪酸的吸收利用;前肠道部位内容物中比例较高的菌属主要负责来自日粮中的纤维素、植物次级代谢产物、淀粉和糖类的降解与利用;小肠中具有优势的菌属很少,主要是参与维生素的合成和黏素的降解;大肠主要负责吸收和利用一些没有被前肠道部位消化吸收的糖类、次级代谢产物和盐类。PICRUSt功能分析显示牦牛肠道微生态中比黄牛存在更多未知的菌群。与 KEGG数据库比对,牦牛高于黄牛的基因家族的数量要多于黄牛高于牦牛的数量,其中能量储存、脂质代谢和聚糖合成和代谢的三大基因家族在牦牛要高于黄牛,这些基因家族的差异,可能会帮助牦牛提高能量利用效率。
[硕士论文] 李阳
海洋生物学 国家海洋局第一海洋研究所 2016(学位年度)
摘要:南极具有长年低温、干燥、低营养、强辐射及温度变化大等特点,蕴藏了极为丰富和特殊的微生物资源。转录组学研究表明,南极适冷菌Psychrobacter sp. G经冷激(0℃)和热激(30℃)胁迫后,分别有11和46、12和48个基因的表达量显著上调和下调,其中包括许多功能未知基因。本文对其中3个表达量显著变化的功能未知基因进行了基因克隆与序列分析,并利用qRT-PCR和 western blotting技术分别从 mRNA水平和蛋白水平进一步研究了其在不同温度/盐度胁迫条件下的表达情况,以期揭示该菌株适应南极特殊环境的分子机制。本研究主要内容包括:
  ⑴转录组测序比较分析表明,菌株G的假定蛋白基因 PSYCG_03870(AGP48309.1)经热激(30℃)后表达量可显著上升(log2FC=2.5,FDR≤0.05);基因序列分析表明,该基因ORF为177 bp,基因上下游的调控序列包括-10、-35、TIS和RBS等调控区,以及3′端终止密码子的下游有一个多聚腺苷酸信号序列AATAAA;氨基酸序列的疏水性分析表明,该基因编码的蛋白 C端带有较强的疏水区域(score>0),无跨膜区存在。BLASTP分析表明,与之相似性最高的功能蛋白为未命名蛋白产物(unnamed protein product,CCW68256.1)(37%)。在mRNA水平上,该基因的表达显著被低温抑制,高温诱导;盐度胁迫时,该基因显著被低盐抑制,高盐诱导;温/盐协同胁迫下,该基因可显著被低温低盐(0℃,15)和低温高盐(0℃,90)诱导,高温低盐(30℃,15)和高温高盐(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,低温和高温胁迫下其蛋白表达量均可增加;盐度胁迫时,该蛋白表达亦可被低盐抑制,高盐诱导;温/盐协同胁迫下,6 h时,在高温低盐(30℃,15)条件下蛋白表达量变化不大,并且除在2 h、6 h时被高温高盐(30℃,90)诱导以外,其余条件下均被抑制。
  ⑵转录组测序比较分析表明,菌株G的假定蛋白基因 PSYCG_10180(AGP49518.1)经冷激(0℃)后表达量可显著上升(log2FC=4.1,FDR≤0.05);基因序列分析表明,该基因ORF为624 bp,基因上下游的调控序列包括-10、-35、TIS和RBS等调控区,以及位于起始密码子ATG下游10 bp处长14 bp的下游框;氨基酸序列的疏水性分析表明,该基因编码的蛋白 C端带有较强的疏水区域(score>0),其中181-203 AA为典型的跨膜区域,表明该蛋白可能为跨膜蛋白。BLASTP分析表明,与之相似性最高的已知功能蛋白为蓝光传感蛋白(blue light sensor protein,WP_010201745.1)(37%)。在mRNA水平上,该基因的表达显著被低温诱导,高温抑制;盐度胁迫时,所有盐度均显著抑制其表达;温/盐协同胁迫下,该基因显著被低温低盐(0℃,15)诱导,高温高盐(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,温度胁迫时,其蛋白表达于6 h内均被抑制,较长时间(12 h)内均被诱导;盐度胁迫时,蛋白表达均可被低盐和高盐抑制;温/盐协同胁迫下,蛋白表达除在2 h时被高温低盐(30℃,15)诱导以外,其余条件下均被抑制。
  ⑶转录组测序比较分析表明,菌株 G的假定蛋白基因 PSYCG_06740(AGP48869.1)经冷激(0℃)后表达量可显著下降(log2FC=-6.4,FDR≤0.05);基因序列分析表明,该基因ORF为1236 bp,基因上下游的调控序列包括-10、-35、TIS和RBS等调控区,位于位于-35区上游1 bp处的AT-rich UP element以及位于起始密码子ATG下游10 bp处长14 bp的下游框;氨基酸序列疏水性分析表明,蛋白没有明显的疏水区域,也不存在跨膜区域。BLASTP分析表明,与之相似性最高的已知功能蛋白为 ATP相关结构域蛋白(ATP-grasp domain-containing protein,WP_011513612.1)(97%)。在mRNA水平上,该基因的表达显著被低温抑制,高温诱导;盐度胁迫时,低盐和高盐胁迫下基因表达均被显著抑制;温/盐协同胁迫下,该基因的表达在低温低盐(0℃,15)时可极显著被诱导,高温高盐(30℃,90)时极显著被抑制。在蛋白水平上,其蛋白表达亦可被低温抑制,高温诱导;盐度胁迫时,蛋白表达均可被低盐和高盐诱导或抑制;温/盐协同胁迫下,蛋白表达在短时间(2 h)内均可被诱导,较长时间(12 h)内均被抑制。
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