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[硕士论文] 杨学
细胞生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:细菌人工染色体文库是生物基因组研究的重要资源,它们被成功地应用于图位克隆,构建物理图谱以及全基因组测序。本研究工作由两部分组成:1.放线菌BAC载体改造及放线菌0026BAC文库构建;2.矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选。
  放线菌(Actinomycetes)产生的次级代谢产物在医药和学术研究上有着重要意义。常用于构建放线菌BAC(Bacterial artificial chromosome)文库的载体为pMSBBACs,用其构建的放线菌BAC文库在进行质量检测时存在一定的缺陷。本研究通过在放线菌复合载体pMSBBACs中引入归位内切酶Ⅰ-SceI位点,改造出适用于放线菌属大片段基因组DNA克隆和异源表达的pHZAUBACFXJ复合载体。pHZAUBACFXJ1载体不仅在构建放线菌文库方面简单实用,在验证文库质量时用Ⅰ-SceI代替NotI进行酶切,也方便放线菌BAC文库外源插入片段大小的计算,评估放线菌BAC文库质量。本研究使用pHZAUBACFXJ1复合载体成功构建了一个放线菌0026的BAC文库。该文库总计3,456个克隆,保存在9块384板中,随机挑拣40个放线菌BAC克隆用Ⅰ-SceI酶切检测,平均插入片段约130kb,空载率约10%。以放线菌0026基因组8Mbp计算,约覆盖放线菌0026基因组40倍。构建了该BAC文库行列混合池,并提取行列混合池DNA。合作者已成功利用该文库筛选到克隆。
  矮牵牛(Petunia hybrida)因其花期长、花开繁盛等优点,广泛应用于街边花坛布置和园林景观摆设,在研究植物花发育中具有重要意义。为了研究矮牵牛开重瓣花的基因调控序列,本研究利用pHZAUB AC1复合载体构建了一个含有78,336个重组克隆的矮牵牛重瓣花BAC文库,保存在204块384板中。随机挑选440个矮牵牛BAC克隆检测外源DNA插入片段大小,平均外源插入片段约为120kb,空载率小于2%。以矮牵牛基因组900Mbp计算,约覆盖整个矮牵牛基因组10倍。通过构建高效二维混合池PCR筛选方法,利用6对引物(SCF1-9FR、SCF2-2FR、SCF43FR、SCF4-1FR、SCF1-12FR、SCF101FR)对矮牵牛BAC文库进行筛选,共筛选出9个阳性BAC克隆,对矮牵牛开重瓣花调控机理的研究具有重要意义。
[博士论文] 王冬
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptides synthetases,NRPSs)和环二肽合成酶(cyclodipeptides synthetases,CDPSs)是微生物中的两种非核糖体肽合成酶类。经由NRPS途径合成的杆菌肽和经由CDPS途径合成的普切明酸是地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)中具有代表性的非核糖体肽类抗菌物质。但是,目前对于两种物质合成途径的转录调控还缺乏了解,阻碍了我们对菌株的杆菌肽和普切明酸应用潜力的挖掘。本论文以杆菌肽工业生产菌株B.licheniformis DW2为研究对象,通过基因重组技术、RT-qPCR、凝胶阻滞分析等方法,考察不同转录调控因子在杆菌肽及普切明酸合成过程中的作用,验证了Spo0A-AbrB-SigH调控系统在NRPS成途径中的地位,并首次较完整的揭示了芽胞杆菌中CDPS合成途径的调控网络。本研究得到的主要结论如下:
  1.Spo0A-AbrB-SigH调控系统对杆菌肽合成的调控作用
  bacT为假定的Ⅱ型硫酯酶基因,该基因的缺失不会影响杆菌肽合成酶操纵子bacABC的转录,但是会导致杆菌肽合成效率降低,并使杆菌肽产量下降83.01%,表明该假定的Ⅱ型硫酯酶(BacT)是杆菌肽合成酶系的组成部分。
  地衣芽胞杆菌中杆菌肽合成基因的转录受到Spo0A-AbrB-SigH调控系统的调控。AbrB是bacT和bacABC的直接负调控因子。在abrB基因缺失或者转录受到抑制的菌株(DW2ΔabrB、DW2Δ0AΔabrB、DW2Δ0A/pHY-sad67)中,bacT和bacA基因的转录水平都有不同幅度的提升,单位菌体的杆菌肽产量相比于DW2菌株分别提升19.32%、25.60%和24.15%。在abrB基因表达量较高的菌株(DW2Δ0A、DW2Δabr B/pHY-abrB)中,bacT和bacA基因的转录水都被抑制,杆菌肽合成停止。凝胶阻滞实验证明AbrB蛋白可以与bacT和bacA基因的启动子结合,表明AbrB是该基因的直接负调控因子。在DW2Δ0AΔabrB菌株基础上敲除sigH基因后,bacT、bacA基因的转录水平以及菌株的杆菌肽产量并未出现显著变化,表明SigH没有独立参与杆菌肽的合成调控。
  2.AbrB-YvnA-YvmB调控系统对普切明酸合成的调控作用
  abrB基因的缺失导致普切明酸的合成时间提前4h,产量相对于DW2菌株提升103.16%,yvmC、yvnA和yvmA基因的转录水平不同程度上调,而yvmB基因的转录则被抑制。DW2/pHY-abrB菌株的普切明酸合成停止,yvmC、yvnA和yvmA基因的转录被抑制,而yvmB基因的转录水平上升。凝结阻滞分析证实AbrB是yvmC-cypX基因簇和yvnA基因的直接负调控因子,而对yvmA和yvmB基因为间接调控。DW2ΔyvmB菌株中的普切明酸产量相比于DW2菌株提升60.12%,yvmC和yvmA基因的转录水平相对DW2上调。DW2/pHY-yvmB菌株无法合成普切明酸,yvmC和yvmA基因的转录也受到抑制。凝结阻滞实验证实YvmB是yvmC-cypX基因簇和yvmA基因的直接负调控因子。DW2ΔyvnA和DW2/pHY-yvnA菌株均不合成普切明酸,普切明酸合成基因簇的转录都受到抑制。但是在DW2ΔyvnA中yvmB基因转录水平上升,而在DW2/pHY-yvnA菌株中yvmB基因转录水平下降。在DW2ΔyvnA菌株中敲除yvmB后,菌株的杆菌肽合成能力恢复。凝胶阻滞实验证实,YvnA蛋白通过直接结合的方式抑制yvmC和yvmB的转录,并间接激活yvmA的表达。总体而言,AbrB、YvnA和YvmB皆为普切明酸合成操纵子yvmC-cypX的负调控因子,同时AbrB也是yvnA基因的直接负调控因子,而YvnA则是yvmB基因的直接负调控因子。
  YvmA蛋白则与普切明酸的分泌有关,yvmA基因的缺失会导致菌株细胞内普切明酸的积累增加。
  3.地衣芽胞杆菌的普切明酸免疫机制
  在各个菌株基础上构建其yvmC缺失的对照菌株,并考察各个菌株于对照菌株在不同FeCl3浓度下的细胞生长状况,证明在铁浓度较低(3mg/L-10mg/L的FeCl3)的环境下,过量合成的普切明酸会造成铁饥饿并抑制菌株自身的生长。进一步比较DW2、DW2ΔyvmB和DW2ΔyvnAΔyvmB菌株在0mg/L、5mg/L和20mg/L的FeCl3浓度下各个基因的转录水平变化证明菌株是通过调节YvnA的表达量来控制不同铁离子浓度下的普切明酸合成,并保护自身不受到铁饥饿。
[硕士论文] 李凯峰
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:地衣芽胞杆菌是一种重要的工业微生物,可以生产出许多各种各样的生物制品。然而,低转化效率和缺乏有效的基因组编辑工具阻碍了它的研究进展。近些年来,由于CRISPR/Cas9系统具有高效、易于操作、操作周期短等优点而受到广泛的关注,并被应用于各种细胞中。但是,Cas9核酸内切酶辅以NHEJ修复途径的基因组编辑策略在应用过程中仍然存在一些问题,如脱靶效应和致死效应等。为了解决这些问题,Cas9的突变体Cas9n单切口酶被人们发现,并且常常辅以同源重组的修复模式运用在基因组编辑技术中。本研究利用一种改进的CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌DW2中构建了系统的基因组编辑策略,希望借此来提高芽胞杆菌的基因组编辑效率,并为其它基因组编辑策略的开发提供思路。
  本研究在穿梭载体pHY300的基础上添加了Cas9n表达元件,并构建了DW2/pCas9n过表达工程菌株。通过SDS-PAGE实验表明,Cas9n蛋白能在地衣芽胞杆菌中表达。为了降低基因组编辑载体的负荷,将P43启动子启动的Cas9n表达元件整合到地衣芽胞杆菌DW2的基因组上,并把Cas9n整合菌株命名为DWC9n。以DWC9n为出发菌株,构建了系统的基因组编辑策略,包括单基因敲除、多基因同时敲除、大片段敲除、单基因整合等,大幅度提高了地衣芽胞杆菌的基因组编辑效率。
  在本研究中,普切明合成酶基因yvmC被选择作为靶基因,并设计特异性的gRNA序列构建了单基因敲除策略。然后,对敲除载体同源臂的大小进行了优化,构建了同源臂大小分别为0.1kb+0.1kb、0.2kb+0.2kb、0.3kb+0.3kb、0.5kb+0.5kb、0.7kb+0.7kb、1.0kb+1.0kb的单基因敲除载体。实验结果表明,即使是在0.1kb大小同源臂的作用下,CRISPR/Cas9n系统也能很好地被应用于单基因敲除,效率达51.4%。随着同源臂大小的增加,敲除效率呈现递增的趋势,但是考虑到载体负荷和策略拓展的问题,0.3kb大小的同源臂是比较合理的选择,敲除效率达80.6%。
  同时,本研究通过将靶向不同基因的两条特异性的gRNA串联在一起实现了epr、wprA双基因的同时敲除,敲除效率达11.6%。以pHY300载体为基础,构建了基于CRISPR/Cas9n的大片段敲除载体,并一次性敲除了42.7kb的大片段DNA序列,敲除效率高达79.0%。为了建立完善的CRISPR/Cas9n基因组编辑技术,将纳豆激酶表达元件整合到地衣芽胞杆菌DWc9n的基因组上,整合效率达76.5%。
  最后,为了测试建立的CRISPP/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌中的适用性,通过敲除地衣芽胞杆菌胞内、胞外蛋白酶基因来增加异源蛋白在宿主细胞内的表达量。利用构建的基因组编辑策略敲除了epr、vpr、mpr、bprA、aprE、clpP、clpE、clpYQ、lonB、bacABC这些基因,获得了工程菌株DWc9n△10。将实验室保存的纳豆激酶表达载体pP43SNT-SsacC电转到DWC9n和DWc9n△10中进行发酵实验,结果表明,DWc9n△10具有良好的异源蛋白表达能力,其生产的纳豆激酶活力比原始菌株提高了30.4%,达到了75.0FU/mL。本研究在地衣芽胞杆菌中构建了一个系统的基因组编辑方法,并且已经被证实可以很好地被应用于地衣芽胞杆菌的菌种改造研究中。
[博士论文] 何青
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:细菌能准确感知周围环境条件如营养、压力、温度、渗透压、PH等的变化并能充分进行回应,这种能力对细菌的生存至关重要。而在这个过程中起重要的信号转导作用的是细菌的第二信使分子。近年来,环二核苷酸作为一类重要的第二信使分子被人们越来越广泛认知。研究发现细菌体内的环二核苷酸(c-di-GMP以及c-di-AMP)能调控包括细菌的移动性、毒性、细菌大小、细胞壁稳态以及生物被膜的形成等在内的许多细菌的生理活动,同时在感染宿主过程中能作为激活剂结合STING后诱导宿主Ⅰ型干扰素(IFNs)的应答。
  本论文第一部分主要对结核分枝杆菌中降解c-di-AMP的酶Rv2837c进行结构生物学以及生理生化酶活分析。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)属于革兰氏阳性菌,是引起结核病的胞内病原菌,结核病至今仍为世界上重要的传染病之一。到目前为止对于结核分枝杆菌的了解仍很有限,因此关于它的研究在结核病的预防以及治疗性疫苗的研发中非常重要。和一些革兰氏阳性病原菌相似,结核分枝杆菌胞内也存在c-di-AMP信号分子调控系统。CnpB(即Rv2837c)具有降解c-di-AMP的磷酸二酯酶活性,对结核分枝杆菌胞内c-di-AMP水平的稳定是必不可少的,同时cnpB的敲除菌株进行感染巨噬细胞及活体小鼠实验时,敲除菌株诱导巨噬细胞Ⅰ型干扰素的产生比野生型增强了十倍,且感染小鼠的毒性减弱。同时Rv2837c作为单DHH-DHHA1结构域蛋白,早在2012年就被报道作为NrnA家族蛋白可以发挥多种功能:既可以作为Orn同源类蛋白降解nanoRNA(RNA oligos<5nucleotides),又可以发挥CysQ功能将pAp去磷酸化生成AMP。Rv2837c对多种类型的底物都具有降解活性,且不同底物的降解速率不同。目前,Rv2837c对不同底物的具体降解机制并不清楚。论文本部分主要通过结构生物学、分子生物学及微生物学等多种实验方法结合来解释Rv2837c的降解机制。主要研究内容和结论如下:
  (一)解析得到2.0(A)的Rv2837c晶体结构,通过对结构进行分析比较以及突变体酶活测定确定了酶活反应需要两个锰离子参与。和其同源蛋白的多序列比对也表明两个锰参与降解反应的机制是普遍存在的。
  (二)解析得到2.3(A)的Rv2837c降解c-di-AMP反应中间态的Rv2837c/pApA复合物的晶体结构。pApA作为c-di-AMP降解的中间产物,同时也属于一类nanoRNA,这一复合物晶体结构的取得为Rv2837c降解nanoRNA类核苷酸小分子提供了准确、真实的降解模型。根据复合物结构以及生化数据提出了简单的Rv2837c水解磷酸二酯键的酶活反应机制。
  (三)测定了Rv2837c降解不同环二核苷酸(c-di-AMP、c-di-GMP、3,-5,cGAMP)以及线性二核昔酸(pGpG、pApA)的降解速率,明确了Rv2837c能特异识别并降解3'-5'磷酸二酯键。首次测定到Rv2837c能降解2'-5'cGAMP生成线性二核苷酸2'-5'-pGpA。
  (四)通过对c-di-AMP降解过程中底物及产物含量变化的实时检测,以及c-di-AMP与pApA的酶活米氏曲线的测定,并结合动力学公式计算,推导得出了Rv2837c降解c-di-AMP时需要第一步反应的中间产物pApA在蛋白内部进行翻转,接着在酶活中心进行第二步水解反应产生2个AMP。
  (五)在敲除MSMEG-2630的耻垢分枝杆菌中以及MG1655中分别过表达Rv2837c蛋白,诱导表达后测定胞内c-di-AMP或c-di-GMP浓度以及MG1655移动性,实验结果表明Rv2837c在体内能降解c-di-AMP和c-di-GMP,且能通过c-di-GMP水平调控细菌的移动性。通过细菌体内实验以及对结核分枝杆菌基因组分析,推测Rv2837c在M.tuberculosis中可能参与调控c-di-AMP、c-di-GMP两条信号通路。
  本论文第二部分主要对铜绿假单胞菌c-di-GMP调控的转录因子BrlR的晶体结构以及生理功能进行了研究。铜绿假单胞菌为革兰氏阴性菌,是医院内感染常见的条件致病菌,在烧伤菌血症感染、泌尿道感染、肺部感染及术后伤口感染中都是重要的感染来源,且这些感染是无法根除的。铜绿假单胞菌能引起诸多类型的感染主要依赖于它强大的毒力因子系统。而在临床抗感染治疗困难的主要原因在于铜绿假单胞菌能对多种抗生素产生耐药性。铜绿假单胞菌基因PA4878编码的蛋白BrlR,同源性分析表明属于MerR家族蛋白,仅在细菌生物被膜时表达且与生物被膜的耐药性相关基因的表达调控有关。随后的研究表明BrlR蛋白能结合并调控自身启动子以及mexA,mexE启动子激活外排泵的表达来增强细菌的耐药性,但是作为MerR家族蛋白却不受外排药物分子激活,而是受到c-di-GMP的结合调控,且与c-di-GMP结合比例为2∶1。最初想通过结构解析来了解c-di-GMP与BrlR的结合机制,但随着研究的深入,发现BrlR是一个复杂的转录调控因子,受多种信号通路的调控。主要研究内容和结论如下:
  (一)解析得到3.1(A)的BrlR晶体结构,通过结构比较发现BrlR蛋白三个独立的结构域在拓扑结构上与同源蛋白相比非常保守,但N端与C端的相对位置发生了改变。且同源蛋白一般为二聚体形式并以二聚体发挥功能,而BrlR相比同源蛋白形成了不同的自我封闭式的四聚体构型。
  (二)BrlR独特的四聚体构型导致其N端HTH结构域大部分被四聚体中另一亚基的C端结构域堵塞,这预示着BrlR蛋白结合DNA的能力应该很弱。随后通过FP实验以及EMSA实验验证了体外时BrlR对DNA的弱结合。
  (三)解析得到2.5(A)的BrlR/c-di-GMP复合物晶体结构,发现BrlR的DNA结合结构域有两个c-di-GMP结合位点。通过相关突变体生化实验,确定BrlR蛋白确实存在两个c-di-GMP结合位点,且两个结合位点都有助于c-di-GMP促进BrlR-DNA的结合。
  (四)对结构进行分析比较发现BrlR的C端存在保守的药物结合口袋,尤其与同源蛋白SAV2435的拓扑结构非常相似,且BrlR蛋白以及BrlR的C端结构域(BrlR-C)都能结合EB分子,经过与SAV2435/RH6G复合物晶体结构比对以及相关突变体EB染色分析,确定了BrlR-C具有结合多种药物分子的能力。利用SPR筛选结合的药物分子,最终确定BrlR能特异性结合妥布霉素和庆大霉素等氨基糖苷类抗生素。
  (五)由BrlR结合的药物分子构型,以及它可以结合EB等颜色小分子,推测其可能结合铜绿自身分泌的染料分子绿脓菌素(PYO)。通过SPR实验进行验证发现BrlR结合PYO的能力比结合妥布霉素及庆大霉素都高。经过多种晶体条件筛选,最终解析了1.4(A)的BrlR-C与PYO类似物的复合物结构。通过结构解析发现吩嗪环分子并不在经典的结合口袋而是位于紧邻其上方新的结合位置。这一新的结合位置更有利于PYO促进BrlR与DNA的结合,最终通过EMSA以及RT-PCR实验确定了BrlR蛋白也是受绿脓菌素调控的转录调节因子。首次表明铜绿假单胞菌的抗药性与自身毒力因子之间有联系。
[博士论文] 刘军峰
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:细胞分裂是所有细胞生命体的重要生命过程。在细菌中,细胞分裂过程主要由FtsZ和FtsA(MreB)介导,其中FtsZ和FtsA分别是真核生物微管蛋白和肌动蛋白的同源蛋白;FtsA可以帮助FtsZ在即将发生分裂的细胞中间位置形成收缩环,随后有超过20种蛋白在收缩环处组装形成分裂体,同时收缩环提供收缩力,最终将两个姊妹细胞分离开来。
  在真核生物中,细胞分裂的起始是由肌动蛋白和肌球蛋白在即将发生分裂的细胞分裂沟处形成收缩环,收缩环的收缩将细胞分成了两大部分,此时的姊妹细胞仍由细胞间桥和中间体连接;最后ESCRT-Ⅲ蛋白复合物被招募到中间体处,并对中间体一端的细胞膜进行切割,最终两个姊妹细胞完成分离。
  在古菌中,截至目前的研究证明至少存在三种细胞分裂方式:在广古菌(Euryarchaeota)和纳古菌(Nanoarchaeota)中,利用基于FtsZ的类似细菌的细胞分裂方式;在包含绝大多数泉古菌在内的TACK[奇古菌(Thaumarchaeota)、曙古菌(Aigarchaeota)、泉古菌(Crenarchaeota)和古古菌(Korarchaeota)]和Asgard[洛基古菌(Lokiarchaeota)、托尔古菌(Thorarchaeota)、奥丁古菌(Odinarchaeota)和海姆达尔古菌(Heimdallarchaeota)]中,利用类似真核生物的ESCRT-Ⅲ分裂机器的细胞分裂方式;在泉古菌的热变形菌目(Thermoproteales)中,利用基于古菌肌动蛋白(Crenactin)的细胞分裂方式。
  硫化叶菌细胞利用类似真核生物的ESCRT-Ⅲ分裂机器进行细胞分裂,它包含三个蛋白CdvA、ESCRT-Ⅲ(CdvB)和Vps4(CdvC);其中CdvA是古菌特有的一个蛋白,ESCRT-Ⅲ和Vps4分别是真核生物ESCRT-Ⅲ和Vps4的同源蛋白。与真核生物类似,硫化叶菌细胞中也含有多个ESCRT-Ⅲ蛋白。除了ESCRT-Ⅲ,硫化叶菌细胞同时编码另外三个ESCRT-Ⅲ的同源蛋白,分别命名为ESCRT-Ⅲ-1(CdvB1)、ESCRT-Ⅲ-2(CdvB2)和ESCRT-Ⅲ-3(CdvB3)。这三个ESCRT-Ⅲ同源蛋白是否参与到细胞分裂过程,以及包括CdvA、ESCRT-Ⅲ在内的参与细胞分裂的蛋白它们具体在细胞分裂过程的哪一阶段发挥作用都还不清楚。本文在冰岛硫化叶菌(Sulfolobusislandicus)细胞中,利用遗传学和细胞学等方法,分析鉴定了这些ESCRT-Ⅲ同源蛋白的功能,并对这些参细胞分裂过程的蛋白进行了功能定位。
  发现ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2能够定位在即将发生分裂的细胞中间形成带状(环状)结构,并且随着细胞分裂过程的进行,这些带状结构会逐渐发生收缩,说明ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2直接参与到细胞分裂过程,而ESCRT-Ⅲ-3在细胞中呈相对均一、弥散的分布,说明ESCRT-Ⅲ-3在细胞分裂过程不发挥作用;与它们发挥的功能相对应,escrt-Ⅲ-1和escrt-Ⅲ-2对冰岛硫化叶菌细胞是必需的,而escrt-Ⅲ-3是非必需的,敲除escrt-Ⅲ-3对细胞的生长和形态没有显著影响。
  分析了冰岛硫化叶菌细胞中这些参与细胞分裂过程蛋白的相互作用网络,基于这个蛋白相互作用网络和对这些蛋白二级结构的分析,构建了它们的C-端缺失突变体,以阻断这些蛋白间的相互作用。通过在冰岛硫化叶菌细胞中过表达这些突变体,证明这些蛋白分别在细胞分裂过程的不同阶段发挥重要的作用,这些结果对于阐明硫化叶菌细胞分裂的具体过程具有重要的意义。另外引人关注的是,在过表达ESCRT-Ⅲ-2蛋白C-端缺失突变体的细胞中观察到了类似真核生物细胞分裂后期的细胞间桥和中间体的结构,这是迄今为止在古菌细胞中第一次观察到这样的结构,这些结果进一步说明了硫化叶菌细胞可能采用了类似真核生物的细胞分裂机制,同时也增加了古菌和真核生物细胞所具有的新的共同特点。
  在真核生物中,ESCRT-Ⅲ蛋白除了在细胞分裂过程发挥重要作用,它们还在其它很多过程发挥功能,例如膜包被病毒的出芽过程。Sulfolobus tengchongensis spindle virus2(STSV2)是从中国云南腾冲热泉中分离的一种膜包被的单尾梭状病毒,它可以在硫化叶菌细胞中长时间的培养,并且在不同的压力条件下尚未发现STSV2能够裂解宿主细胞,因此它是古菌中研究病毒与宿主关系的一个理想的模式病毒。在本文的研究工作中,在感染STSV2的冰岛硫化叶菌野生型菌株REY15A中观察到了出芽的现象,同时发现ESCRT-Ⅲ-3能够定位在出芽位置;而在感染STSV2的△escrt-Ⅲ-3菌株中则观察不到出芽现象,这说明ESCRT-Ⅲ-3在由感染STSV2引起的出芽过程中发挥重要功能。另外,发现ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2也能够定位在出芽位置,说明ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2也可能参与到出芽过程。真核生物HIV-1、流感病毒以及埃博拉病毒等膜包被病毒一般也都采用出芽的方式从宿主细胞表面释放,ESCRT-Ⅲ蛋白在这些病毒的出芽释放过程中起到了重要的作用。我们的研究结果说明STSV2采用了类似真核生物膜包被病毒的出芽过程从宿主细胞表面释放的机制,在这个过程中ESCRT-Ⅲ蛋白发挥了重要的作用。
  现在越来越多的比较基因组学及系统进化分析数据支持真核生物的古菌起源学说,但其中最大的不足是它们缺少实验证据的支持。我们的研究结果从实验层面上支持了真核生物古菌起源的进化学说,在进化上具有重要的意义;同时也可为研究真核生物细胞分裂和膜包被病毒的出芽过程提供一定的参考,也有可能为将来在辅助治疗人类HIV-1、流感病毒以及埃博拉病毒方面提供一定的帮助。
[博士论文] 韩俊成
环境工程 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:异化金属还原菌(Dissimilatory Metal-reducing Bacteria,DMRB)是一类能够将胞内有机底物代谢获得的电子转移至胞外,并耦合胞外金属氧化物还原的微生物。DMRB独特的胞外电子转移过程能以不溶性金属氧化物和固态电极为最终电子受体,在金属元素的地球化学循环和能源回收领域起到重要作用。同时,DMRB独特的胞外电子转移过程对于环境中的有机污染物的转化也起到促进作用,加速其在环境中的迁移转化过程,因而在环境污染修复领域中具有巨大的潜在应用价值。因此,DMRB作为一种特殊的功能细菌而受到微生物、环境、电化学等不同学科领域研究人员的广泛关注。为了进一步研究DMRB的胞外电子传递机制及其在污染物转化中的作用机理并拓展DMRB在环境污染修复领域中的应用,本论文以DMRB模式菌株之一的希瓦氏菌为研究对象,探索自分泌电子传递媒介——核黄素在生物合成受抑制条件下的希瓦氏菌胞外电子传递过程,深入研究了胞外电子传递在有机砷化合物(洛克沙胂)转化中的作用及机理,考察了胞外电子传递途径在重金属铬还原过程中的同位素分馏效应中的作用。上述研究工作为希瓦氏菌的胞外电子传递在环境修复中的应用提供了更多的理论依据和技术指导。主要研究内容和研究结果如下:
  1.Shewanella oneidensis MR-1的胞外电子传递的调控机制。研究了S.oneidensis MR-1在其自分泌的电子传递媒介——核黄素的生物合成受抑制条件下的胞外电子传递规律。通过构建ribBA基因突变菌株,抑制了黄素类物质的分泌水平。与野生菌株相比,ΔribBA分泌黄素水平相比于野生型菌株下降了50%,但ΔribBA在电化学池中比野生型菌株产生了较高的产电电流;胞外电子传递相关基因的表达分析结果表明mtrD、mtrE、cymA、omcA、fccA等相关基因发生了上调。这些结果表明,在核黄素合成受抑制条件下,胞外电子传递网络的内部调控能够重新增强胞外电子传递过程。因此,S.oneidensis MR-1自分泌的黄素类物质在胞外电子传递中的作用需要从全细胞系统水平上进行重新评估。该研究结果加深了对胞外电子传递过程的可塑性的认识,也为调控微生物胞外电子传递能力提供了新的途径。
  2.Shewanella putrefaciens CN32对洛克沙胂的厌氧转化机制。通过对Shewanella putrefaciens CN32厌氧转化洛克沙胂过程的研究,验证了该菌株对洛克沙胂的转化能力,通过对相应的转化产物的分析,进一步阐明了洛克沙胂转化过程的新机理。在以S.putrefaciens CN32为模式菌株的洛克沙胂转化机理研究表明,MtrC和UndA在胞外还原过程的关键蛋白;mtrC和undA基因的敲除使S.putrefaciens CN32在最初48 h对洛克沙胂的还原速率降低了70%;同时存在的胞外还原和胞内还原过程,最终导致了以As(Ⅲ)为主要形态的无机砷的释放。常见电子传递媒介蒽醌-2,6-磺酸钠(AQDS)、核黄素(RF)能够加速转化过程。因此,自然环境中丰富矿物和腐殖酸等天然有机物能够进一步促进异化金属还原菌对洛克沙胂的转化,增加As(Ⅲ)释放环境风险。此外,对几种常见的异化金属还原菌转化洛克沙胂的能力也进行了进一步验证,结果表明它们都具有迅速转化洛克沙胂的能力,而且其转化产物中的无机砷形态主要是毒性较高的As(Ⅲ)。在厌氧环境中普遍分布的异化金属还原菌具有很高的洛克沙胂耐受水平。以S.putrefaciens CN32为例,其对洛克沙胂在好氧条件下的耐受水平高达6 mM。这些结果对于理解异化金属还原菌在环境中有机砷转化过程的作用有重要意义。
  3.Shewanella oneidensis MR-1的Cr同位素分馏机制。研究了S.oneidensis MR-1及其胞外电子传递外膜蛋白突变菌株ΔmtrC/ΔomcA对Cr(Ⅵ)的不同还原过程以及相应的铬同位素分馏效应。还原实验结果表明,野生型菌株和突变菌株在前4h的平均还原速率分别为11.12±0.38 μM Cr(Ⅵ) h-1 (n=2)和4.91±0.48μM Cr(Ⅵ) h-1 (n=2);突变菌株的还原速率仅为野生菌株的44.2%;TEM观察发现野生型菌株表面有含铬的颗粒沉积物出现,而突变菌株表面没有这一现象。S.oneidensis MR-1能够通过不同的还原途径还原去除Cr(Ⅵ);进一步的铬同位素分馏分析中,使用瑞利分馏模型对两种体系中的分馏过程进行拟合,获得相应的度量同位素分馏程度大小的分馏系数ε值,结果表明两种还原过程的ε值无明显差异,野生菌株和突变菌株的相应值为-2.42±0.68‰和-2.70±0.22‰。基于此,提出以S.oneidensis MR-1为代表的非异化还原依赖的微生物Cr分馏机理模型,从而增进了对微生物Cr同位素分馏机理的理解。
[硕士论文] 钟越
微生物学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:为解决聚乙烯塑料在环境中难降解的问题,本研究筛选出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验和16SrDNA序列分析;将菌株先后接种于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw>100000)为唯一碳源的基础液体培养基中,28℃,180rpm培养;每24小时,用分光光度法测定菌体生长浓度和胞外蛋白含量;培养60天后,称取残留PE重量,用扫描电子显微镜观察膜片表观,用拉力测试机、水接触角测定仪以及红外光谱仪测定膜片性能。
  为进一步提高原始菌株对高分子量PE的降解能力,本研究对原始菌株进行了诱变处理。采用紫外辐照、微波热效应、LiCl、盐酸羟胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法对菌株进行诱变;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度筛选法,对诱变菌株进行筛选;通过诱变菌株在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中的菌体生长情况、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指标,选出降解性能最优的菌株,再将该菌株与原始菌株在相同培养条件下(以PE膜片为唯一碳源)培养60天,测定膜片力学性能。
  为找出降解PE的关键基因和代谢通路,我们将原始菌株在不同碳源培养条件下的(G组:以可溶性淀粉为唯一碳源;W组:以PE为唯一碳源)基因表达情况进行转录组测序分析,经RNA提取纯化、建库、测序、质控等过程,再进行GO、COG、KEGG数据库注释比对、聚类和富集分析;对两个处理组的基因表达量进行差异比较;最后随机选取差异基因进行RT-PCR表达量验证。
  结果表明,筛选出的菌株为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),命名为ZEL-1。该菌在分子量越低的聚乙烯培养液中,菌浓度、胞外蛋白含量、还原糖含量、聚乙烯失重率越高,菌液pH值下降得越快;电镜观察发现膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸强度降低74.15%,断裂伸长率减少84.90%,力学性能显著下降;水接触角从78.58±0.10°变小到41.25±0.16°,亲水性增大;红外光谱研究结果表明,膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。
  诱变育种结果表明,紫外辐照50s,微波诱变800Hz、120s,0.02%吖啶橙,0.7%LiCl,0.6%盐酸羟胺,为各方法的最优的诱变剂量。复合诱变采用紫外50s的突变菌株为出发菌株,再用0.02%吖啶橙诱变。PE培养基中菌体生长趋势,除盐酸羟胺组外,其他组均优于原始菌株组;紫外组胞外蛋白含量较原始组平均提高2.06倍,微波组平均提高1.24倍,吖啶组平均提高2.70倍,盐酸羟胺组平均提高1.60倍,复合诱变组平均提高3.30倍;盐酸羟胺组膜片失重率低于原始菌株组,其他组均高于原始菌株组,复合诱变组膜片失重率最大,高于原始组2.28倍;选择复合诱变组菌株UV-AO-1为优势菌株,PE降解60天后,UV-AO-1组水接触角比原始菌株组减小2.5°;拉伸强度减小3.37Mpa,断裂伸长率减少39.62%。
  转录组测序结果表明,此次共得到12372(63.24%)个非冗余Unigene,其中2095条Unigene富集于代谢过程组中;与COG数据库比对,有3328条Unigene与COG数据库中的基因具有同源性;涉及到代谢活动相关的Unigene占50.57%;发现差异表达基因423个,与G组相比,W组有293个基因表达上调,130个基因下调;AlkB基因差异表达最为显著。与KEGG Pathway数据库比对,有5776条转录本比对到KEGG数据库中,有92个代谢通路出现差异;碳代谢、氨基酸合成、丙酮酸代谢途径的差异基因表达上调数量较多,乙酰-CoA合成、脂肪酸代谢的相关基因表达差异上调显著,柠檬酸循环的差异基因下调明显。
  实时荧光定量PCR验证结果表明,荧光定量PCR得出的表达量与转录组测序结果的差异基因表达量上下调模式基本一致,证明此次转录组数据结果可信。
  综上所述,本研究菌株ZEL-1能够直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;诱变菌株UV-AO-1的降解性能优于原始菌株,具有更大的应用潜力。原始菌株在PE碳源的培养条件下,菌株代谢倾向于碳架构建,减少了糖类物质的合成和代谢;推测菌株ZEL-1对聚乙烯的降解始于Alk B基因编码的烷烃单加氧酶对聚乙烯的末端氧化断链作用,经由脂肪酸β氧化,完成PE的无机矿化。ZEL-1降解聚乙烯的基因表达差异,基本反映了不同碳源引起的代谢通路差异,为后期深入研究聚乙烯降解机理提供了理论依据。
[硕士论文] 景艳军
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种应用性很强的工业微生物菌种,鉴于其较好的重金属抗性,可用于贵金属的浸提、环境污染的治理等领域。铁氧还蛋白作为一种广泛存在并参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌新陈代谢过程诸如铁硫簇组装等重要环节的蛋白质,研究其结构和功能对了解嗜酸氧化亚铁硫杆菌的代谢过程、电子传递及重金属抗性具有重要意义。本研究的内容和结果如下:
  (1)从甘肃省兰州市、白银市和陇南市3个典型矿区采集的样品中分离出四株嗜酸氧化亚铁硫杆菌,一株氧化亚铁钩端螺旋菌。选取生长周期短、菌体富集量大的菌株BYSW1进行后续的研究。首先选取温度、pH值、接种量、能源种类利用单因素实验对其生长条件进行优化。在pH为2,于30℃下接种10%的菌液,BYSW1生长最好,葡萄糖和蛋白胨会明显抑制其生长。
  (2)在NCBI数据库中找出铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ),在BYSW1中扩增出目的片段,连接到pET-32(a),转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)DH5α。自BYSW1扩增出的铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ)与数据库汇总的序列一致性分别为83.92%和85.59%,编码的蛋白与数据库中的序列一致性分别为89.47%和85.59%。
  (3)重组的质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。选取温度、时间、IPTG浓度进行单因素实验,优化重组蛋白的表达条件,并用蛋白质印记法进行验证。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。FdⅠ和FdⅡ分别在25℃下加入0.5mM IPTG诱导6h、25℃下加入0.3mM IPTG诱导6 h表达效果最佳。FdⅠ和FdⅡ分别可用100mM咪唑和50mM咪唑自亲和柱中洗脱下来。
  (4)挑取五种重金属(Cd2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+),对其重金属抗性进行研究;对重金属(Cu2+和Cd2+)驯化前后的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的菌体形态和基因组变化、重组蛋白表达差异、宿主菌体的生长情况进行了研究。结果表明:BYSW1具有较强的重金属抗性,分别在0.04mol/L Cd2+、0.04mol/L Cu2+、0.15mol/L Mn2+、0.08mol/L Ni2+和0.08mol/L Zn2+存在时生长良好,但是高浓度(大于0.04mol/L)的Cu2+和Cd2+会明显抑制BYSW1的生长。Cu2+和Cd2+胁迫后,BYSW1的菌体细胞明显变小,且表面粗糙,但基因组仍然能保持完整。不同浓度、不同种类的重金属胁迫前后,铁氧还蛋白的表达存在显著差异,且Cd2+对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的影响比Cu2+显著;不同浓度、不同种类的重金属对于重组蛋白的表达宿主菌体生长影响不同,0.25mM的Cu2+和Cd2+能明显抑制宿主菌体的生长。
[硕士论文] 魏清伟
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)是生物浸矿应用中最为重要的微生物之一,A.ferrooxidans对多种重金属都具有很高的耐受能力。通过研究其重金属抗性机制,对深入了解微生物细胞维持体内重金属平衡的机理非常重要。
  目前,A.ferrooxidans铜、镉代谢机理的遗传学研究报道还比较少。A.ferrooxidans中许多与金属抗性相关基因的研究大多集中于生物信息学预测,缺乏相应的实验数据支持,因而我们在A.ferrooxidans全基因组注释信息中挑选了三个与金属抗性相关的基因,分析了其氨基酸序列信息,同时分别构建了这些基因的过表达菌株,为探究这些基因的具体生物学功能提供实验数据支持。研究工作主要有以下几个方面:
  1、本实验室从甘肃省兰州市七里河区阿干镇煤矿收集酸性矿坑废水分离纯化得到一株A.ferrooxidans L1,革兰氏阴性菌,短杆状;该菌株以Fe2+为能源物质,且具有较高的硫氧化活性,其生长曲线特征显示延滞期较长,约43h,稳定期约14h;生长70h后进入衰亡期;通过驯化试验,该菌株对不同重金属离子显示出不同的耐受能力:在相同培养条件下,Cu2+、Cd2+对A.ferrooxidans L1生长的抑制作用大小为Cu2+>Cd2+,最高耐受浓度分别是0.04mol/L和0.08mol/L。
  2、运用生物信息学在线分析软件对基因编码的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能结构域、系统发育以及可能参与的代谢通路等进行了预测。推测AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495这三种蛋白均分布在胞外或细胞膜上,参与金属离子的吸附转运等机制。
  3、为探究A.ferrooxidans中AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495的功能特性,以本实验室分离鉴定的A.ferrooxidans L1为材料,采用PCR扩增技术克隆了afe-1948、afe-1862、afe-RS11495基因。将其转化E.coli BL21(DE3),通过SDS-PAGE分析,确定其在大肠杆菌中的最佳表达条件。
  4、为了进一步地了解这三个基因的功能,采用过表达分析的方法考察了其转入受体菌之后的抗性的变化。结果表明:在不同浓度Cu2+、Cd2+胁迫下,E.coli BL21导入目的基因后,相对于对照组,菌体的生物量明显下降,说明其抗性下降,但是其胞内目的蛋白的含量却有所增加,推测是由于导入目的基因后胞内重金属的含量明显上升导致的。
[硕士论文] 修磊
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌胞外多糖(Lactic acid bacteria exopolysaccharide,LAB EPS)具有多种生物活性,对其研究与开发具有重要的实际意义与良好的应用前景。本研究以实验室保存鉴定的乳酸菌为出发菌株,筛选能够增强细胞免疫活性的乳酸菌EPS,随后将其进行分离纯化及结构初步鉴定,在此基础上探讨其对免疫细胞活性及机体特异性免疫应答的影响。
  本研究主要内容包括:⑴对实验室保存鉴定的110株乳酸杆菌所产EPS进行测定,筛选10株高产EPS乳酸杆菌,其中Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS可以增强巨噬细胞增殖、吞噬以及NO释放能力。⑵将上述Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS经过DEAE-Sepharose Fast Flow和SepharoseCL-6B色谱柱进行分离纯化后获得主要均一组分:TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS。紫外光谱和红外光谱扫描发现三种EPS均不含核酸和蛋白质,且均具有多糖的特征吸收峰,存在α型吡喃糖环构型;多角度激光光散射仪检测其分子量分别为4.908×104 Da、3.423×104 Da和3.737×104 Da;离子色谱检测单糖组成发现,三种EPS均由氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及葡萄糖醛酸等7种单糖组成,其中TCP086 EPS各主要组分摩尔比氨基葡萄糖∶氨基半乳糖∶甘露糖∶葡萄糖醛酸约为2.6∶1.6∶1.2∶1; SXJ29 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基半乳糖∶氨基葡萄糖约为3.1∶1∶1;SXJ30 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基葡萄糖∶甘露糖约为1.4∶1.1∶1。⑶以纯化的TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS刺激巨噬细胞,对其增殖能力、吞噬中性红能力、NO释放能力、细胞因子分泌以及表面分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达进行检测后发现,巨噬细胞的免疫增强活性与EPS的浓度呈正相关,且SXJ30 EPS对巨噬细胞的免疫增强活性最强。⑷在体外成功利用IL-4和GM-CSF诱导获得小鼠骨髓来源树突状细胞,显微镜下观察SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后,细胞突起增多,体积增大;流式细胞术和ELISA法检测后发现,SXJ30 EPS能显著增强小鼠BMDCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达以及细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12)的分泌。⑸将SXJ30 EPS与OVA抗原免疫小鼠,发现SXJ30 EPS可以显著提高小鼠脾脏DCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达量;与铝盐(Alum)佐剂相比,SXJ30 EPS可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的滴度;此外,SXJ30 EPS还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF-γ和IL-4的分泌;显著提高脾脏IL-4+ CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞以及IFN-γ+ CD8+T细胞的比例,与Alum佐剂相比差异显著。
[硕士论文] 张永利
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌因其多种优越的性能而被研究者关注。本研究首先从奶制品中分离乳酸菌,并根据乳酸菌的菌落形态特征、过氧化氢酶接触试验以及革兰氏染色试验对乳酸菌进行初步鉴定。再利用16S rDNA序列分析、生理生化特性以及碳水化合物发酵试验进行进一步鉴定。然后通过人工胃液耐受力、胆盐耐受力以及粘附能力试验进行益生性乳酸菌的初步筛选。最后用筛选的6株乳酸杆菌灌胃小鼠,LPS/D-GalN诱导小鼠急性肝损伤,通过观察小鼠的体重、肝脏的病理变化及重量,检测小鼠外周血以及肝脏中AST与ALT的分泌量,肝脏与小肠中TNF-α与IL-6的表达量,研究这6株乳酸杆菌对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护效果。
  本研究主要内容包括:⑴从奶制品中共分离出107株乳酸菌,属于17个种。其中乳酸杆菌71株属于9个种,乳酸球菌36株属于8个种:Lactobacillus brevis、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillu helveticus、Lactobacillusplantarum subsp.argentoratensis、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillusdiolivorans、Pediococcus pentosaceus、 Enterococcus faecalis、Leuconostocmesenteroides、Pediococcus acidilactici、Pediococcus.sp、Enterococcus.sp、Lactococcus.sp、Leuconostoc.sp。这17种乳酸菌中有88.3%为同型发酵乳酸菌,11.7%为异型发酵乳酸菌,部分菌株可以在低pH、高盐、低温、高温的条件下生长。⑵对139株乳酸菌进行耐人工胃液(pH=3.0)、耐胆盐以及粘附Caco-2细胞的试验,共筛选出6株具有较强耐受和粘附能力的的乳酸杆菌,它们分别是: L.paracasei subsp.paracasei WXD5、L.casei SXJ30、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD55、 L.plantarum subsp.argentoratenis WXD100、 L.subsp.argentoratenis WXD106、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD101。⑶研究WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30这6株乳酸菌对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤保护作用。⑷结果显示,与模型组相比,灌胃乳酸菌WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30的小鼠肝脏病变程度得到不同程度的缓解,AST、ALT、IL-6以及TNF-α因子的表达量也显著下降,且以灌胃乳酸菌WXD5保护效果最为明显,可以为急性肝损伤的研究提供技术支持与理论依据。
[硕士论文] 李娟
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:抗生素的过量使用和滥用导致大量耐药菌的出现,特别是超级耐药菌的出现,对人类健康造成严重的威胁。寻找新的更为安全高效的抗生素,以及不易产生细菌耐药性的抗生素替代物,对于保障人类健康,以及健康食品生产和动物养殖具有重要意义和迫切需求。抗菌肽类物质是天然抗菌物质,具有稳定性好、无毒副作用、不会出现细菌耐药性等突出优点,也具有替代某些抗生素的潜力。因此,本项研究的目的是利用基因工程的方法,构建人工合成抗菌肽和抗菌酶基因的重组表达质粒,将重组质粒导入毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中进行异源表达,获得了酵母表达的抗菌肽和抗菌酶,旨在为抗菌肽类物质的实际应用提供技术资料。本论文报道了几种抗菌肽类物质和具有抗菌作用的葡萄氧化酶的酵母异源表达的主要研究结果。
  1、构建了对革兰氏阴性菌有很好抗性的抗菌肽AP基因重组表达载体pPICAP,将其导入毕赤酵母SMD1168中,获得了抗E.coli的毕赤酵母菌株AP26,该菌株在培养的72 h时抑菌活性最高,之后抑菌活性降低,表明72 h时抗菌肽AP的表达量最高。进一步研究表明,在培养的72h后,重组菌抑菌活性降低是因为发生了质粒的丢失。LC-MS结果表明重组菌株正确表达了抗菌肽AP。对菌株AP26进行了亚硝基胍(NTG)诱变,筛选到了抗菌肽AP表达量最高的诱变菌株APmu4,其抗菌肽AP最高生物效价达到1.7×109 U/L。对影响抗菌肽AP表达量的因素进行了研究,发现pH为7.5、接种量为50g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AP的表达量。
  2、构建了具有广谱抗菌活性的抗菌肽AB基因的重组载体pPICAB,将其导入到毕赤酵母SMD1168菌株中,获得分泌表达抗菌肽AB的毕赤酵母菌株,该重组菌株对E.coti有抗性,LC-MS结果表明该菌株正确表达了抗菌肽AB。对重组菌株进行了NTG诱变,筛选到超量表达抗菌肽AB的诱变菌株ABN97。为了进一步提高诱变菌株抗菌肽AB表达量,构建了颤藻血红蛋白基因vgb的重组载体,将其导入到菌株ABN97中,筛选出了抑菌效果最好的菌株ABN97vgb,抗菌肽AB生物效价达到4.53×108 U/L。对影响抗菌肽AB表达量的因素进行了研究,发现pH为6.0、接种量为50 g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AB的表达量,最高表达量提高了14倍。
  3、构建了对革兰氏阳性菌有良好抑菌活性的抗菌肽菌丝霉素Plectasin基因重组质粒pPICPle,将其导入毕赤酵母并成功异源表达抗菌肽Plectasin。对重组菌株进行NTG诱变并筛选得到高效表达Plectasin的诱变菌株Ple100,其Plectasin的表达量提高了1.93倍。对影响菌株Ple100 Plectasin表达量的因素进行研究,结果表明盐浓度较高的YDFMY培养基和酵母提取物能提高菌株Plectasin表达量。
  4、构建了抗菌肽PSI基因的整合型载体pLACPSI和游离型载体pKDUPSI,将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,筛选到分泌表达抗菌肽PSI的重组菌株。对重组菌株发酵液中抗菌肽PSI进行硫酸铵沉淀法和阳离子交换柱纯化,SDS-PAGE检测验证了抗菌肽PSI。对重组菌株产抗菌肽PSI的发酵条件进行优化,结果表明中性或偏碱性、酵母提取物和盐度较高的YDFMY培养基更有利于抗菌肽PSI的表达。纯化的抗菌肽PSI对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、三线镰刀菌(Fusarfum tricinctum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、平头炭疽(Colletotrichumtruncatum)有抗性。水果保鲜实验表明纯化后的抗菌肽PSI也具有开发为新型果蔬保鲜剂的潜力。
  5、构建了葡萄糖氧化酶(GOX)基因的整合型载体pLACGOX和游离型载体pKDUGOX,成功将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,获得了一株能超量分泌表达GOX的乳酸克鲁维酵母菌株,其GOX最大表达量为70±7 kU/L,SDS-PAGE检测验证了GOX正确表达。研究了影响GOX酶活的因素,结果表明pH4件下GOX酶活最高,温度为37℃时GOX稳定,YPGal培养基中的高盐浓度对GOX有抑制作用。
[硕士论文] 姜金融
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:空气微生物是城市生态系统的重要组分,更是评估环境质量的重要指标之一,它既可以造福人类,亦会危害人类的生活和健康。近年来,随着城市空气环境恶化以及雾霾事件的不断发生,对城市空气微生物的研究越来越受到重视。研究兰州市空气微生物浓度分布特征及多样性以期为准确了解兰州市空气微生物群落与生态功能奠定基础,为空气微生物对居民健康、空气环境质量影响评价提供科学依据。
  本研究以兰州市不同功能区,即风景区(Scenic Area, SA)、交通干线(Main TrafficLine,MTL)、公共服务区(Public Service Area,PSA)、文教区(Culture and Education Area,CEA)空气微生物样品为研究材料,采用恢复培养手段和Biolog方法研究空气中微生物浓度、粒径时空分布特征和空气微生物群落碳代谢功能多样性,阐明空气微生物浓度及群落功能多样性与环境因子的相关性,利用分子生物学技术对兰州市春季可吸入肺空气细菌粒子进行群落组成和致病性分析,得到以下主要结果:
  (1)兰州市空气中微生物总浓度、细菌、真菌浓度具有明显的空间、季节和日变化规律,空气微生物浓度变化与环境因子之间具有较好的相关性。兰州市空气微生物总浓度范围为196~3752 CFU/m3,空气细菌浓度范围为83~3344 CFU/m3,空气真菌浓度范围为102~1315 CFU/m3,从均值看,兰州市空气细菌浓度为916 CFU/m3,空气真菌浓度为322 CFU/m3,空气中细菌所占比例较大,为66.5%;四个功能区空气微生物总浓度和细菌浓度大小排列一致:MTL>PSA> CEA> SA,空气真菌浓度大小排列依次为:SA>PSA>CEA>MTL。对兰州市各功能区空气微生物污染状况进行评估,结果显示,MTL、PSA空气细菌为较清洁等级,其他功能区空气微生物总浓度及空气真菌均为清洁等级;空气微生物浓度在春、夏季较高,秋、冬季较低,其中,空气细菌浓度均在秋季达到最低值。由于雾霾天气原因,进入冬季后细菌浓度有所升高,不同功能区空气真菌浓度季节变化差异不大;SA空气微生物浓度均表现为13:00时较高,9:00和17:00较低,MTL、PSA空气总微生物浓度和细菌浓度变化特征为:9:00>17:00>13:00,而真菌浓度变化特征为:13:00>9:00>17:00,CEA空气微生物浓度变化特征为:9:00>17:00>13:00;兰州市空气微生物总浓度、细菌浓度与温度呈显著正相关,与风速、湿度呈负相关,空气真菌浓度与温度、湿度、风速相关性较弱。
  (2)兰州市空气微生物粒径呈现明显的时空分布特征。细菌粒子主要分布在一到三级(>3.3μm),呈偏态分布,而空气真菌粒径呈正态分布,粒径范围在2.1μm~7.0μm的粒子居多;在四个功能区空气中,可吸入肺细菌粒子占23.1%~28.9%,可吸入肺真菌粒子占33.7%~40.7%;一年四季中,可吸入肺细菌粒子浓度在秋冬季较高,可吸入肺真菌粒子浓度在春秋季较高;在一天不同时段,可吸入肺细菌粒子浓度在9:00和13:00时较高,而真菌粒子浓度在9:00和17:00时较高;兰州市空气细菌中值直径约为3.68μm,空气真菌中值直径约为3.15μm,空气细菌中值直径大于空气真菌的中值直径;空气细菌在不同季节中值直径变化范围为3.06μm~4.11μm,在春夏两季中值直径较大,空气真菌中值直径季节变化范围为2.74μm~3.59μm,在夏季中值直径较大;空气细菌中值直径在9:00时段较大,而空气真菌中值直径在17:00时段较大。
  (3)各季节四个功能区空气微生物的碳源利用强度存在显著差异,在春季和秋季,SA和PSA空气微生物碳源代谢强度高于其他两个功能区,夏季SA空气微生物碳代谢强度最高,冬季CEA、PSA、SA空气微生物碳代谢强度较高;各季节不同功能区空气微生物Shannon指数和Simpson指数差异性不大,表明四个功能区空气中微生物群落丰富度和优势度相似,而McIntosh指数差异较大,表明不同功能区空气微生物群落均一度受不同环境地域、气象条件的影响较大;各季节空气微生物群落碳代谢功能呈现区域性差异,且导致这种差异的主要碳源分异类型不同,氨基酸类是导致春秋两季兰州市空气微生物群落碳代谢功能区域性差异的主要分异类型,导致夏季不同功能区空气微生物碳代谢功能差异的主要分异类型是糖类,冬季主要分异类型是醇类。四个功能区不同季节空气微生物碳代谢强度亦存在差异,SA空气微生物碳代谢能力在春、夏季较高,MTL和PSA空气微生物群落碳代谢能力在秋冬季较高,CEA空气微生物碳代谢能力在冬季较高,夏季与秋季差异不大;各功能区不同季节空气微生物Shannon指数和Simpson指数差异性不大,说明同一功能区空气中微生物群落丰富度和优势度随着季节变化不会发生太大的改变,而McIntosh指数季节差异较大,说明同一功能区空气微生物群落均一度受季节环境变化的胁迫以及气象因子的影响较大;四个功能区空气微生物群落碳代谢功能呈现季节性差异,糖类是导致SA和PSA空气微生物群落碳代谢功能季节性差异的主要分异类型,导致MTL和PSA空气微生物碳代谢功能季节差异的主要分异类型是氨基酸类。
  (4)兰州市不同功能区可吸入肺空气细菌群落组成存在差异,共检测出48属,分布在六大门类,分别为Actinobacteria、Cyanobacteria、Deinococcus Thermus、Firmicutes、Proteobacteria、Saccharibacteria;CEA和SA细菌群落相似性较高,MTL、PSA进化过程较独立,具有较大的差异性;可吸入肺带菌粒子粒径小于3.3μm,在空气中停留时间越长,传播距离更远,其导致疾病传播以及人体感染的风险也就越大,兰州市可吸入肺空气细菌中检测到9种致病菌或条件致病菌,致病菌的分布也存在空间差异,且人群密集的功能区检出率更高。
[硕士论文] 付宇婷
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起哺乳动物感染的关键病原菌之一,易侵入乳腺组织诱发乳腺炎。乳腺炎对人畜造成的负面影响极大,影响乳品的质与量。乳蛋白是乳品重要的组成成分,乳腺上皮细胞中氨基酸的种类、含量直接影响其合成,氨基酸代谢是影响乳蛋白合成的重要因素。细菌侵袭乳腺上皮细胞会影响乳蛋白的合成与分泌,但对于氨基酸代谢的影响与机制目前还不清楚。
  本研究以人乳腺上皮细胞MCF-10A为模型,利用金黄色葡萄球菌(ATCC27543)侵袭细胞,检测宿主细胞六种氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白的表达情况。六种酶包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和谷氨酸脱羧酶(GAD),分别涉及转氨、脱氨、联合脱氨和脱羧等过程。首先,利用金黄色葡萄球菌侵袭细胞,qPCR检测细胞中氨基酸代谢关键酶基因及β-酪蛋白基因的表达,ELISA检测细胞内外相关基因产物的合成与分泌,westernblot检测mTORC1信号通路活性;其次,用肽聚糖刺激人乳腺上皮细胞,同样用qPCR和ELISA方法检测氨基酸代谢关键酶基因及其产物的表达与分泌,western blot检测mTORC1通路及几种转录因子活性;最后,在前两部分实验的基础上探究mTORC1信号通路对相关转录因子活性和氨基酸代谢关键酶表达的调控作用。通过特异性抑制剂Rapamycin及RNA干扰技术降低mTORC1活性,检测金黄色葡萄球菌侵袭与非侵袭条件下氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白基因及其产物的表达变化,并检测几种可能同氨基酸代谢相关的转录因子的活性变化。结果表明:⑴金黄色葡萄球菌能侵入体外培养的人乳腺上皮细胞内,随着侵袭过程的进行,细胞内氨基酸代谢关键酶含量呈先上升而后下降的趋势,细菌侵袭8h后,β-酪蛋白的合成量与分泌量显著下降(p<0.001)。同时,细菌侵袭过程中mTOR信号通路的活性也呈现先上升而后下降的趋势;⑵肽聚糖刺激MCF-10A细胞,诱导细胞内氨基酸代谢关键酶表达,含量显著上升(p<0.001),而对β-酪蛋白的合成与分泌没有显著影响(p>0.05)。同时mTOR信号通路和几种转录因子的活性增强;⑶Rapamycin能够显著抑制上述细菌侵袭和肽聚糖刺激对氨基酸代谢关键酶基因的诱导表达(p<0.01),导致氨基酸代谢关键酶在细胞内的含量显著下降(p<0.01),β-酪蛋白的合成与分泌也受到抑制(p<0.01),mTORC1信号通路和相关转录因子的活性均有不同程度的下降;⑷通过靶向siRNA沉默mTORC1关键组分Raptor编码基因,进而抑制mTORC1信号通路,所得结果与上述Rapamycin处理结果一致,印证了mTORC1信号通路对氨基酸代谢关键酶和β-酪蛋白的合成与分泌具有调控作用。
[硕士论文] 李旦旦
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本论文以分离自南海和北极海域表层海水样品的四株细菌作为研究对象,利用多相分类方法,详细研究了这四株细菌的表型,细胞化学组成及分子遗传学等方面的分类特征,最终基于分类特征分析分别确定了它们的分类地位。
  1.菌株SM1501T的多相分类研究
  菌株SM1501T分离自南海表层海水样品。菌株SM1501T的革兰氏染色反应为阴性,其细胞为短杆状,无鞭毛,好氧。该菌株生长的温度范围为7-42℃,生长的NaC1浓度范围是0-11%(w/v)。菌株SM1501T的主要脂肪酸是C17∶1ω6c,C15∶02-OH,C17∶1ω8c和C18∶1ω7c。该菌的极性脂包括磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),鞘糖脂(sphingoglycolipid,SGL),双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG)及磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)。该菌的主要细胞呼吸醌是泛醌10(ubiquinone-10,Q-10)。菌株SM1501T的细胞基因组DNA G+C含量为66.8mol%。
  菌株SM1501T与Erythrobacter属成员的16S rRNA基因序列相似性最高(94.2-97.4%),基于16S rRNA基因序列的系统进化树显示菌株SM1501T与Erythrobacter luteus,Erythrobacter atlanticus,Erythrobacter gangjinensis及Erythrobacter marinus成簇,但形成一个独立的进化分支。
  基于以上多相分类学数据,菌株SM1501T代表Erythrobacter属的一个新种,命名为Erythrobacter nanhaiensis sp.nov.,菌株SM1501T(=KCTC42669T=CCTCC AB2015396T)为该新种的模式菌株。
  2.菌株SM1502T的多相分类研究
  菌株SM1502T来源于北极海域表层海水样品。菌株SM1502T革兰氏阴性菌,细胞为杆状,无鞭毛。菌株SM1502T生长的温度范围为10-40℃C,生长的NaCl浓度范围为0-8.0%(w/v)。
  菌株SM1502T的主要脂肪酸为iso-C15∶0,iso-C17∶1ω9c,iso-C17∶03-OH,iso-C15∶1G,C15∶0及unknown ECL13.565;其主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE),一种未鉴定结构的氨基磷脂及一种未鉴定结构的极性脂类。菌株SM1502T的主要呼吸醌类为甲基萘醌6(menaquinone6,MK-6)。菌株SM1502T基因组DNA的G+C含量为37.0 mol%。
  菌株SM1502T与Flavobacterium suzhouense的16S rRNA基因序列相似性最高(96.0%);在基于16S rRNA基因序列的系统进化树中,菌株SM1502T和Flavobacterium属内包括Flavobacterium suzhouense在内的六个已知种成簇,同时形成单独的簇内分支。
  以上多相分类数据表明,菌株SM1502T代表Flavobacterium属内的一个新种,命名为Flavobacterium arcticum sp.nov.,菌株SM1502T(=KCTC42668T=CCTCC AB2015346T)为该种的模式菌株。
  3.菌株SM1503T的多相分类研究
  菌株SM1503T分离自南海表层海水样品,为革兰氏阴性菌,其触酶及氧化酶为阳性。菌株SM1503T生长温度范围在8-45℃之间,生长的NaCl浓度范围是0-7.5%(w/v)。菌株SM1503T可以还原硝酸盐为亚硝酸盐,可水解Tween20、40及60。
  菌株SM1503T的主要脂肪酸包含C17:1ω6c,C17∶0,C15∶0,C18∶1ω7c,C17∶1ω8c以及C16∶0;主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG),鞘糖脂(sphingoglycolipid, SGL)和磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)。该菌主要呼吸醌为泛醌10(ubiquinone-10,Q-10),其基因组DNA的G+C含量为61.6 mol%。
  16S rRNA基因序列比对分析表明菌株SM1503T与Sphingomonadaceae科内Blastomonas及Parablastomonas属已知种有最高的序列相似性(95.2-95.8%),根据16S rRNA基因序列构建的系统进化树显示菌株SM1503T在Blastomona及Parablastomonas进化分支的根部形成一个独立的进化分枝。
  上述多相分类数据表明,菌株SM1503T应属于Sphingomonadaceae科内的一个新属,命名为Pseudoblastomonas gen.nov.,而菌株SM1503T代表该属内的一个新种,命名为Pseudoblastomonas maris gen.nov.,sp.nov.,菌株SM1503T(=KCTC42715T=CCTCC AB2015347T)是该新种的模式菌株。
  4.菌株SM1504T的多相分类研究
  菌株SM1504T来源于北极海域表层海水样品。菌株SM1504T革兰氏阴性菌,严格好氧,无运动性。菌株SM1504T生长的温度范围为4-30℃,生长的NaCl浓度范围为0-4.0%(w/v)。菌株SM1504T可水解七叶苷和明胶,但不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
  菌株SM1504T的主要脂肪酸为summed feature3(包含C16∶1ω7c和/或iso-C15∶02-OH)和iso-C15∶0;菌株SM1504T的极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)和一种未鉴定的极性脂类。菌株SM1504T的主要呼吸醌类为甲基萘醌7(menaquinone7,MK-7)。菌株SM1504T基因组DNA G+C含量为40.8 mol%。
  基于16S rRNA基因序列的系统进化树显示菌株SM1504T在Cytophagaceae科内与Lacihabitans,Emticicia,Fluviimonas及Leadbetterella属成员紧密成簇,但形成独立的簇内分枝,而该菌株与这些属成员的16S rRNA基因序列相似性非常低(88.9-91.6%)。
  基于上述多相分类数据分析,菌株SM1504T应隶属于Cytophagaceae科内的一个新属,命名为Arcticibacterium gen.nov.,而菌株SM1504T代表该新属内的一个新种,命名为Arcticibacterium luteifluviistationis gen.nov.,sp.nov.,菌株SM1504T(=KCTC42716T=CCTCC AB2015348T)为该种的模式菌株。
[博士论文] MARIA KANWAL ALI
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:钾离子维持细菌正常生理活动的必须的金属离子。Kdp-ATPase是一个对钾离子有强亲和作用的诱导型钾离子转运系统,在细菌中广泛存在,并受KdpD/KdpE双组份调节系统的调控。本研究以耻垢分枝杆菌为模式菌株,我们发现Kdp-ATPase编码基因kdpFABC在低K+浓度、高Na+或NH4+浓度下被诱导表达;而在高K+或蔗糖以及不同的pH条件下,kdpFABC的表达均不受影响。我们发现KdpE是一个转录调节因子,它能够识别并结合kdpFABC操纵子特异的22-bp的序列并正调控该操纵子的表达。并且KdpE识别位点在分枝杆菌kdpFABC操纵子中很保守。我们通过5'-RACE实验发现,在kdpFABC的转录起始位点位于MSMEG_5391基因的开放阅读框内,该转录起始位点和后面120-bp的5'-非翻译区及87-bp的kdpF基因共同组成了一个独立的转录本。我们发现,kdpE缺失会导致细菌在低K+时生长速率的改变。另外,在K+缺乏的情况下,细菌会转录同时含有kdpFABC和kdpDE操纵子的转录本kdpFABCDE。本研究首次在分枝杆菌中揭示了双组份调控系统KdpD/KdpE对kdpFABC基因的调控机制。
[硕士论文] 许晓潇
微生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:细胞的生长和分裂是所有生命的基本过程,细胞分裂方式对维持原核生物的形态多样性具有重要作用,为了研究红球菌R04细胞的分裂方式及联苯对其形态和生长分裂的影响,本研究利用荧光显微镜、扫描电子显微镜及透射电子显微镜分析红球菌R04在不同培养条件下的分裂方式,结果表明,红球菌R04细胞表现出对称分裂(约占30%)和不对称分裂(约占70%)两种分裂方式,且培养条件不影响具有不对称分裂细胞亚群所占的比例。隔膜的定位主要分布于细胞长度的30%到50%之间。在代谢联苯的过程中,红球菌R04细胞的生长分裂会受到联苯的抑制,但不影响红球菌R04细胞的分裂方式,在联苯胁迫下,细胞形成丝状化,表现出异常分裂,随着培养时间的延长,在细胞分裂指数后期至转换期,细胞能够进行正常分裂。说明联苯/多氯联苯对其降解菌——红球菌R04的生殖和生长有较强影响,但这种影响是可以被红球菌R04所拮抗的,红球菌R04能够自我修复,恢复正常分裂。
  通过转录组测序分析发现红球菌R04的RHOGL008438蛋白可能与细胞分裂有关。为研究其生理功能,通过构建融合表达质粒在大肠杆菌BL21中异源表达RHOGL008438蛋白,并在荧光显微镜下观察该蛋白对大肠杆菌细胞形态的影响。结果表明,过量表达RHOGL008438蛋白会使大肠杆菌细胞出现丝状化,表明RHOGL008438蛋白干扰了大肠杆菌细胞隔膜的正常形成导致细胞丝状化。通过序列同源性分析,确定RHOGL008438蛋白为细胞分裂过程中的主要分裂蛋白FtsZ。活细胞成像拍摄红球菌R04细胞的生长过程同样表明其具有不对称分裂方式,经FITC标记的万古霉素(FV)作用红球菌R04细胞后荧光显微镜检测,结果显示细胞两极发生荧光,表明红球菌R04细胞属于两极生长模式。确定了红球菌R04细胞中的FtsZ蛋白以及该细胞的生长模式对于后续深入研究其分裂机制具有重要的意义。
[硕士论文] 张月
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:目前在农业生产上主要依赖于化学农药,但是化学农药的使用带来了一系列的问题,因此使用一种具有特异、高效的生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)占主要地位,它广泛用于农业、林业及医学害虫的防治,其生产量和使用量占微生物农药的95%以上。苏云金芽胞杆菌可产生晶体蛋白和可溶性分泌蛋白,并且这些蛋白对靶标害虫具有高效特异的杀虫活性,因此在全球范围内得到普遍应用。正是这种杀虫蛋白的效用,也促使我们识别和鉴定出具有不同特异性的新的杀虫蛋白,从而在土壤环境中分离出更多的新型Bt资源,并且具有杀虫特性的Cry蛋白已经广泛被应用于农业害虫的防治,但目前仍然有其他的Bt蛋白还未有明确其靶标害虫。近年来由于在我国农业害虫的逐年加重,农作物的产量逐年下降。因此,现在急需寻找新型的杀虫活性基因这对我国农业害虫的防治具有非常重要意义。本文针对我国棉田鳞翅目害虫进行了菌株的筛选与杀虫基因克隆的研究。
  本研究主要内容包括:⑴从中国海南地区采集到2300份土壤,分离出Bt菌株755株,其伴胞晶体类型有长双锥体形、短双锥体形、球形等,本实验根据已知的基因序列设计通用引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法,对2300株Bt菌株基因池DNA混合样品进行PCR鉴定。序列分析结果表明,这些Bt菌株基因池中含有2种cry2类基因,分别为cry2Ab基因和cry2Ag基因,扩增得到cry2Ab和cry2Ag的全长基因序列,分别为1902bp和1891 bp,已提交cry2Ab基因序列(GenBank登录号为KX357382)和cry2Ag基因序列(GenBank登录号为KX236449)。分别构建pEB-Cry2Ab和pEB-Cry2Ag表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,两种Cry2类蛋白均可以表达出分子量为70 kDa的杀虫晶体蛋白。将得到的两种杀虫晶体蛋白分别对鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)进行生物活性的初筛测定,选取初筛活性较高的蛋白再进行复筛,复筛结果显示,成功表达的两种蛋白对小菜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性。⑵对实验室保存的海南地区菌株Bt BJH500、Bt BJH498进行基因鉴定,通过PCR鉴定发现其中含有cry4基因,再利用全长引物进行扩增,结果获得cry4-like全长基因序列。该序列已提交GenBank注册,登录号为KX244950。将得到的全长基因与pEB载体相连,构建表达载体在大肠杆菌BL21中成功表达,通过SDS-PAGE结果显示,可以在大肠杆菌中表达出分子量为43 kDa的晶体蛋白。将表达得到的晶体蛋白对小菜蛾和棉铃虫进行生物活性初步测定,其校正死亡率都较低,结果分析该蛋白对小菜蛾、棉铃虫均无显著杀虫活性。⑶针对实验室保存的海南地区菌株,进行菌株筛选、基因型的鉴定与杀虫活性的测定,获得有效菌株Bt BJH500和Bt BJH498。通过聚合酶链式反应(PCR)方法成功克隆杀虫基因3个。研究结果发现两种Cry2类蛋白对三种鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有一定的杀虫活性。
[硕士论文] 李垚
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:近年来科学家们在探寻新型抗生素的筛选途径时,发现昆虫内生菌能够产生许多种类多样的次生代谢产物,尤其那些能够帮助宿主抵御病原菌入侵的放线菌,其中一些具有新颖的结构并表现出较好的生物活性。由于这些化合物能够存在于真核宿主体内,且不危害宿主,所以它们很有可能对人类也没有毒副作用。因此这些昆虫内生放线菌具有很大产生人类药用的抗生素潜力,所以近年来昆虫内共生放线菌受到越来越多科学家的关注,昆虫内生放线菌也将是持续地发现新抗生素的重要领域之一,这对于对抗日益增多的抗药病原菌和新型疾病具有重要意义。
  本研究以实验室筛选得到的30株蚂蚁内生菌为材料,通过培养特征观察、抗菌活性测试和16S rRNA序列测序结果分析,发现两株潜在的放线菌新种3H-GS17T和2H-TWYE14T和一株具有良好抗菌活性放线菌1H-GS2,对它们分别进行了系统的分类学鉴定和活性物质的分离鉴定,结果如下:
  (1)16SrRNA分析结果显示菌株3H-GS17T是珊瑚放线菌属的一株菌,与Actinocoralliaglomerata JCM9376T(98.13%)和Actinocorallia longicatena JCM9377T(97.64%)的16S rRNA序列相似性最高。化学分类学特征也与Actinocorallia的特征一致。而DNA-DNA杂交结果和表型分析结果显示菌株3H-GS17T明显不同于与它相近的菌株,进一步的实验证明菌株3H-GS17T和珊瑚放线菌属的其他菌株都不相同。因此确定菌株3H-GS17T是珊瑚放线菌属的一个新种,命名为Actinocorallia lasicapitis,典型菌株是3H-GS17T(=DSM100595T=CGMCC4.7282T)。
  (2)16S rRNA分析结果显示2H-TWYE14T是链霉菌属的一株菌,与Streptomyces niveusNRRL2466T(98.84%)的16S rRNA序列相似性最高。gyrB基因分析结果同样显示2H-TWYE14T属于链霉菌属。化学分类学特征也与链霉菌属的其他菌株相一致。而2H-TWYE14T与S.niveusNRRL2466T之间的DNA-DNA杂交结果和表型分析结果显示2H-TWYE14T明显不同于S.niveus NRRL2466T。因此确定菌株2H-TWYE14T是链霉菌菌属的一个新种,命名为Streptomyces camponoticapitis,典型菌株是2H-TWYE14T(=DSM100523T=CGMCC4.7275T)。
  (3)活体生物活性检测显示菌株1H-GS2对部分测试真菌具有较好的生物活性,将菌株进行发酵,发酵产物同样显示良好的真菌抑制活性。对发酵产物中的化合物进行分离纯化后,利用现代光谱学进行结构分析鉴定,最终得到化合物白诺菌素(Albonoursin)。
[硕士论文] 潘通
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:现如今我们所接触到的抗生素、酶制剂以及一些胞外聚合物,大部分都是由放线菌所产生。由于已知产物的大量重复筛选以及病原菌耐药性的不断加强,人们对发现新构型和高活性天然药物给予极高希望。然而,常规生态环境的放线菌由于反复开发利用,阻遏了人们发现新药的脚步。在极端环境下,微生物的适应过程使其存在不同寻常的生理机制,因此对极端微生物的代谢产物、代谢途径以及功能性分已成为国际热门的研究领域。
  由于缺乏盐碱环境下微生物分离、培养方法的系统研究,人们对于盐碱环境下微生物资源的认识仍处于初级阶段。在本次实验中,我们选择了特殊生境中的盐碱土壤作为分离源,目的在于了解盐碱土壤中放线菌优势类群以及在该环境下筛选得到拮抗活性较好的菌株,为日后研究嗜盐碱放线菌的生理、遗传机制打下基础。大庆市位于黑龙江省西部,众多因素叠加造成其土地荒漠盐碱化严重,具有代表性。因此,本研究选取黑龙江省大庆市的盐碱土作为分离对象,对其进行放线菌的分离、耐盐碱特性以及拮抗菌株活性的研究。研究结果如下:
  (1)本实验对大庆盐碱土的放线菌进行了筛选,共从HV、高氏一号、改良CMKA培养基、甜醇培养基和XXA培养基上分离得到232株放线菌,通过菌落纯化形态对比合并为85株。发现烬灰类群和白孢类群为优势类群,这些菌株中的大多数属于链霉菌菌科(Streptomycetaceae),其次为黄色类群的小单孢菌菌科(Micromonosporaceae),稀有菌属占比很小。
  (2)对分离得到的放线菌进行了耐盐碱测试,有21株菌可耐受10%的NaCl,39株菌可耐受5%的NaCl,71.8%的菌株属于轻度耐盐菌。有65株菌可耐受pH10,27株菌可耐受pH11,说明大部分供试菌都具有耐碱特性。
  (3)对分离得到的放线菌进行活性实验,其中有36株放线菌可以抑制1种以上的植物病原真菌,其中的3株(S4HV2,S4GS38,S7GS2)对3种以上的植物病原真菌具有较强的活性,对其余植物病原真菌均具有较强或较弱的抑制作用。菌株S7GS2对4种病原真菌(Sclerotinia sclerotiorum,Rhizoctonia solani,Phytophthora sojae,Phytophthora capsici)的抑制率超过80%。其中菌株S4HV2和S4GS38的发酵浸提液对部分植物病原菌及两种指示细菌均具有较强的抑制作用。
  (4)对一株形态较为少见、耐盐碱且有微弱活性的菌株NEAU-ZJC8进行了系统的分类学地位鉴定。然后通过对该菌株与相似菌株在培养特征、生理生化实验、化学组分以及分子水平的同源性等方面的比较,确定NEAU-ZJC8属于链霉菌属的一个新种,并命名为Streptomyces daqingensis。
  (5)在放线菌的分离过程中,得到一株细菌cbsb5。16S测序和系统进化建树分析后,对其进行了分类学鉴定实验,结果表明该菌株为芽孢杆菌属,并且各项实验数据均表明其可能为潜在新种。
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