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[硕士论文] 徐俊
外科学(普通外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究将探讨在脓毒症发生过程中Robo4基因表达对EPCs数量和功能的影响,及其诱导EPCs定向分化作用,为临床防治脓毒症探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。
  本研究共分为三个部分,首先通过基因敲除技术构建Robo4-/+、Robo4-/-小鼠,通过盲肠穿孔+腹腔注射内毒素(LPS)制造出创伤后基因敲除小鼠的脓毒症模型。然后动态观察创伤后脓毒症发展过程中EPCs内Robo4表达水平和内皮祖细胞数量变化。最后对三种不同基因表达小鼠骨髓来源的EPCs进行体外培养和功能鉴定。
  第一部分 多器官功能障碍小鼠模型的建立
  目的:建立基因敲除小鼠脓毒症模型,为研究Robo4影响内皮祖细胞增殖和分化提供实验基础。
  方法:将体重20-25g的Robo4-/+、Robo4-/-和WT三种基因类型的小鼠100只分为2组:实验组(M组)90只,施行腹腔内毒素注射+盲肠穿孔;对照组(C组),施行假手术。观察各组动物的症状、体征、生存率、脏器功能指标(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并观察主要脏器的大体及显微镜下病理改变。
  结果:实验组小鼠的症状、体征与功能指标均发生明显变化,肺、肝、心、肾及胃肠道等脏器病理改变严重。实验组和对照组MODS发生率为(82.2%,0),死亡率(75%,10%),显著高于对照组。
  结论:采用腹腔注射内毒素+盲肠穿孔的方法,可以成功地复制出小鼠脓毒症模型,且有较高的死亡率和可重复的稳定性,并可进一步发展成为MODS。
  第二部分 脓毒症进展过程中EPCs数量的变化及EPCs内Robo4表达水平变化
  目的:监测脓毒症各个阶段正常小鼠骨髓中内皮祖细胞的数量变化,检测EPCsRobo4的mRNA和蛋白水平变化,探讨Robo4表达水平与EPCs数量变化的相关性。
  方法:按照第一部分造模后,分别在正常状态下、注射内毒素2小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取骨髓,按照密度梯度离心法获得单个核细胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×105PMC/孔的密度种于铺有纤维连接蛋白(FN)的培养板中培养,培养48小时后收集未贴壁细胞,再按1×105PMC/孔的密度接种于FN包被的培养板中进行培养,培养72小时进行贴壁细胞的计数。取1×105细胞进行裂解,利用RealTime-PCR检测MODS各个阶段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平变化。
  结果:脓毒症发展过程中,Robo4表达水平逐渐升高,至T4达到峰值,随后逐渐下降;内皮祖细胞的数量先增加,在T5时达到峰值,随后出现明显下降。相关性分析表明,二者在脓毒症进展过程中的变化成正相关。
  结论:在LPS介导的小鼠脓毒症模型中,Robo4表达水平与骨髓中EPCs数量具有相关性,因此Robo4可能参与调控EPCs的增殖。
  第三部分 三种不同基因表型的小鼠骨髓来源EPCs培养鉴定和功能特征比较
  目的:对三种不同基因表表型小鼠骨髓来源的EPCs进行分离、培养、鉴定和功能比较。
  方法:从小鼠骨髓分离出单个核细胞,进行诱导分化培养,对培养至P6代的EPC进行细胞形态学特征、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管形成功能等方法进行鉴定,并对照分析。
  结果:三种不同基因表达的EPC鉴定如下:贴壁细胞均特异性摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,摄取率均超过80%。免疫组化:Robo4-/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4+/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式细胞仪技术鉴定:Robo4-/-组:CD133阳性率:17.25±6.43%;CD34阳性率:48.75±6.83%;CD31阳性率:72.53±12.38%;KDR阳性率:87.25±10.23%;Robo4+/-组:CD133阳性率:16.55±7.29%;CD34阳性率:46.65±7.23%;CD31阳性率:75.93±11.28%;KDR阳性率:89.25±11.33%;WT组:CD133阳性率:18.25±8.57%;CD34阳性率:47.15±5.72%;CD31阳性率:74.61±10.69%;KDR阳性率:88.25±11.35%。体外血管生成功能:Robo4-/+组:28.49±4.38个/HP;Robo4-/-组:25.82±3.62个/HP;WT组:42.32±3.92个/HP(P<0.05)。粘附功能:贴壁率(Robo4-/+组:42.7±3.1%;Robo4-/-组:39.5±1.7%;WT组:64.5±2.6%(P<0.05))。迁徙功能:迁徙率(Robo4-/+组:18.5±1.7%;Robo4-/-组:13.3±2.6%;WT组:27.5±1.8%(P<0.05))。增殖功能:Robo4-/+组:23.06±2.63×104;Robo4-/-组:19.24±2.65×104;WT组:40.33±3.65×104(P<0.05)。
  结论:Robo4+/-、Robo4-/-和WT三种基因来源的EPC的细胞形态和鉴定无明显差别。基因敲除小鼠EPCs的血管形成能力、迁徙功能、粘附功能和细胞增殖能力要劣于野生型组。
  小结:通过CLP+腹腔LPS注射建立复制小鼠脓毒症模型与临床脓毒症发生的常见诱因和实际过程相近。脓毒症发展过程中Robo4表达水平和内皮祖细胞数量呈上升趋势,而随着死亡的升高,二者逐渐下降。通过对三种基因表达小鼠诱导分离骨髓来源EPCs比较分析,发现Robo4基因敲除小鼠与野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鉴定、形态学特征、双吞噬功能基本一致。基因敲除小鼠在迁徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明显低于野生型小鼠。证实Robo4基因表型对EPCs的部分功能存在调控作用。
[博士论文] 罗益滨
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:颈椎病是临床多发病和常见病之一,广义的颈椎病是由颈椎间盘退变及继发病理改变导致周围解耦的变化,出现神经肌肉相关症状的一类疾病总称,又叫颈椎综合征。据粗略统计,我国颈椎病发病率在8.1%-19.1%之间。根据颈椎病的临床表现,颈椎病有多种分型,其中,伴交感神经症状颈椎病是较为特殊的一种。所谓伴交感神经症状颈椎病,是由于各种颈椎病损(如不稳、退变、间盘突出、炎症等)刺激颈部交感神经节,引起眩晕、视物模糊、头痛、失眠、胸闷、潮热甚至腹胀等交感神经症状的颈椎病。对该类型颈椎病形成的命名、分型、形成机制、发病过程、诊断标准、治疗规范,目前还存在较大的争议,其中机制研究是伴交感神经症状颈椎病的热点和难点之一。据已经发表的文献,主要有颈椎椎间不稳学说、体液因子学说、后纵韧带交感神经学说、关节周围本体感受器刺激学说、颈部Ruffini小体受激学说等。迄今没有一种假说能完美解释这种特殊类型颈椎病的发病机制。近年来,较为热门的是颈椎后纵韧带上交感神经纤维刺激学说。现有实验表明,刺激后纵韧带上交感神经纤维可以引起颈部交感神经节电位变化,并诱发相应交感神经症状。基于此学说,临床上选择术中切断后纵韧带,以对颈段脊髓充分减压、阻断交感神经反射通路,部分患者得到症状的缓解。还有学者围绕椎动脉、心脏等效应器对颈部交感纤维与交感症状之间的对应关系做了探索。但这一学说还有不完善和不成熟的地方,本研究拟对这种机制展开进一步研究。
  目的:
  1、在前人研究的基础上,通过形态学研究,进一步明确交感神经在后纵韧带上的节段性分布形态学规律,为后续的实验和其他类型的研究提供必要的证据。
  2、进一步明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维受激惹引起的相应交感神经症状。通过选取呼吸和血压两个效应器,明确颈部交感神经节→后纵韧带上交感神经纤维→效应器的传导关系,理清伴交感神经症状颈椎病的发病机制。
  3、通过上述实验,巩固伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究的其中一种学说:即颈后纵韧带上交感神经纤维致病机制。
  4、通过研究伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究,明确症状与病变部位的对应关系,为临床上精确定位和治疗伴交感神经症状颈椎病提供客观依据。
  方法:
  实验一:研究颈椎后纵韧带上交感神经纤维的分布情况。手术切取10只实验动物新西兰白兔的颈椎后纵韧带、交感神经节,通过不同染色方法进行形态学研究。将实验兔分为两组,每组5只,第一组进行颈椎交感神经节的切取,第二组进行颈椎后纵韧带的切取。将实验动物新西兰白兔进行耳缘静脉麻醉后,妥善安置于颈椎操作台,充分伸展颈椎,术区备皮消毒。切开皮肤,显露颈椎及周围附属结构,分别切取相应的组织。取出材料后,迅速放入中性甲醛溶液固定,进行HE、NPY以及S100的组织染色,并进行读片分析,以明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维存在的证据以及神经组织的来源。
  实验二:研究电刺激不同部位颈交感神经节时,观察效应器官(以呼吸频率为参数)的变化情况。取实验动物新西兰白兔35只,实验组(颈上、中、下交感神经节组)分为3组,每组10只;对照组5只。麻醉后捆绑胸部呼吸换能器。显露颈椎及周围附属结构,对不同部位颈部交感神经节进行电刺激,测量刺激前后呼吸频率变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录呼吸频率变化。以明确不同部位颈交感神经节和呼吸频率之间的关系。
  实验三:研究电刺激不同部位颈交感神经节,观察血压变化情况以及与神经节对应关系。取实验动物新西兰白兔35只,实验组分为3组(颈上、中、下交感神经节组),每组10只;对照组5只。进行耳缘静脉麻醉后,显露颈椎及周围附属结构,游离颈动脉,进行动脉置管及换能器连接。对不同部位颈部交感神经节进行电刺激(50mV),记录血压变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录血压变化。明确不同部位颈部交感神经节和血压之间的对应关系。统计学方法:实验中涉及的计量资料以均数±标准差(x±s)表示。应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析,组内采用配对t检验的方法。3个实验组(分别为颈部上、中、下交感神经节)与对照组(0mV电刺激组)刺激后的数据组间比较,采用Dunnett-t检验。设置检验水准a=0.05,当P<0.05认为差异有统计学意义。
  结果:
  实验一:通过形态学研究后纵韧带上交感神经纤维的分布及来源。结果发现,①通过观察染色后的切片,到颈椎后纵韧带表面神经染色呈阳性反应。②阳性反应的密度较低,提示交感神经纤维分布较少。③不是所有实验动物的后纵韧带都能检测出神经染色阳性反应,提示交感神经纤维在后纵韧带上分布不具有普遍性。④经过特异性NPY染色,观察到后纵韧带表面分布的神经纤维,和颈部交感神经节的来源相同。
  实验二:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察呼吸频率的相应改变。结果发现,颈上神经节刺激组于对照组刺激后相比,呼吸频率存在的统计学意义(P<0.05)。颈中、下神经节刺激后和对照组刺激后比,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  实验三:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察血压的相应改变。结果发现,颈上、中神经节刺激组可以观察到血压的改变,和对照组相比,变化存在统计学意义(P<0.05)。颈下神经节刺激后和对照组比较,血压不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,血压变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1、形态学研究证实了交感神经纤维存在于后纵韧带本研究从形态学上进一步证实了后纵韧带上分布的交感神经纤维。通过多项神经染色技术在光镜下仔细观察,确认交感神经纤维存在于颈椎后纵韧带表面。且交感神经纤维的来源与颈交感神经节同源,这是作为后纵韧带交感神经纤维致病机制的解剖学证据。
  2、通过效应器研究明确了不同部位交感神经节和症状对应关系实验证实,刺激不同节段颈交感神经节后,可引起相应交感神经症状(以呼吸频率和血压为对象)。通过药物阻滞后纵韧带上的神经纤维,不能再次触发相应症状。结合既往发现的颈交感神经节与后纵韧带表面交感神经纤维的对应关系,得出以下结论:颈椎病变刺激后纵韧带上不同节段的交感神经纤维,可以引起对应的不同症状。其中,颈4/5节段病变对应呼吸频率变化,颈5/6节段病变对应血压变化。证实了后纵韧带上交感神经纤维致病机制的合理性。
  3、本系列实验的结果对临床诊治具有一定的指导意义本实验发现了呼吸频率和血压与颈部交感神经节之间的对应关系。通过这一结果,可以由不同症状准确定位颈椎的病变节段。这一发现,为临床上对伴交感神经症状颈椎病的精准诊断和治疗带来了新的启发。
[硕士论文] 张云
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  颈椎病是临床常见的疾病。它有4种类型,分别是神经根型颈椎病、脊髓型颈椎病、椎动脉型颈椎病以及交感神经型颈椎病。神经根型颈椎病(cervical spondylotic radiculopathy,CSR)在各型颈椎病中最常见,约占颈椎病的60%~70%。特别是进入老年化时代,颈椎病老年患者发病率越来越高。目前CSR的治疗方法主要针对病因治疗,有物理治疗、手术治疗以及微创介入治疗。物理治疗包括手法按摩、颌枕吊带牵引等,以解除肌肉痉挛,增大椎间隙,减轻对神经根的压迫和刺激,老年CSR患者多采取保守治疗,往往易复发且效果不佳,老年患者手术疗法不但费用高,创伤大、术后恢复较差,且老年患者常合并其他系统疾病,手术风险较高。很多患者因颈椎病行手术治疗,术后疼痛仍无明显缓解甚至疼痛加重。因此针对老年CSR患者其治疗方法有限。随着射频(radio frequency,RF)等微创技术的逐日成熟,为老年CSR患者提供了一种更为可选的治疗方法。本研究将超声和CT引导颈椎间孔外侧入路行射频热凝联合消炎镇痛液注射治疗同单纯消炎镇痛液注射治疗老年CSR患者进行比较,观察两种不同治疗方法对老年CSR患者的临床疗效。
  研究方法:
  采用随机数字表法将50例老年CSR患者随机分为两组,试验组(T组)和对照组(C组)各25例。治疗均先用超声进行体表定位,试验组全程CT引导下进行穿刺定位。试验组(T组,n=25)行射频热凝(55℃60s,60℃120s,65℃60s)+消炎镇痛液(配方:0.25%利多卡因+地塞米松10mg+碘海醇共4ml)注射治疗。对照组(C组,n=25)单纯行消炎镇痛液(配方:0.25%利多卡因+地塞米松10mg+无菌生理盐水共4ml)注射治疗,对照组需行4个疗程的治疗,每周注射一次,4个疗程结束后进行随访。两组均在超声引导下行病变颈椎间孔外口靶点穿刺。治疗结果从安全性和有效性两方面进行评价。安全性主要是看术中有无血管、神经损伤;术后有无麻木、神经功能障碍的发生。有效性评价主要为治疗前、治疗结束后1个月以及治疗结束后6个月对患者采用疼痛视觉模拟评分法(VAS)进行评分,使用改良Macnab标准评价治疗结束后6个月临床疗效以及两组患者对治疗的满意度。
  研究结果:
  所有患者均成功进行治疗,其中观察组有5名老年CSR患者失访,对照组有2名患者失访,3名患者中途退出治疗。最终试验组20例患者纳入统计分析,对照组也是20例患者。治疗过程中及治疗后无一例患者出现血管、神经损伤;术后无一例患者出现麻木、神经功能障碍的发生。所有患者于治疗后1个月、6个月进行随访。与治疗前相比,治疗结束后1个月试验组和对照组疼痛VAS评分均较治疗前降低(试验组:3.00±1.22vs8.1±0.77;对照组:5.25±0.89vs7.95±0.80)、治疗结束后6个月试验组和对照组疼痛VAS评分也较治疗前降低(试验组:1.4±1.32vs8.1±0.77;对照组:4.05±1.20vs7.95±0.80),其中试验组治疗结束后1个月、6个月疼痛VAS评分降低更为明显(治疗结束后1个月:3.00±1.22vs5.25±0.89;治疗结束后6个月:1.4±1.32vs4.05±1.20),两组数据对比差异有统计学意义(P<0.05),试验组临床疗效优良率高达85%,对照组优良率仅45%,两组数据对比差异有统计学意义(P<0.05),所有老年CSR患者对本次治疗的满意度较高,试验组和对照组满意度均为100%。
  结论:
  本疼痛中心通过对40例老年CSR患者治疗发现,作为介于保守治疗和手术治疗之间,超声联合CT引导颈椎间孔外口行射频热凝联合激素治疗老年CSR患者为一种操作简便且安全有效的治疗方法,其相对于单纯注射治疗而言,疼痛缓解持续时间更长,临床疗效更优,是老年CSR患者比较理想的治疗方法,与手术相比治疗费用低,对老年患者创伤较小,值得在未来临床实践中继续深入推广和研究。
[硕士论文] 杨文军
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着核能技术的不断探索与开发,电离辐射的应用已经广泛深入到生活中的各个方面。这也不可避免的引起公众对电离辐射对身体健康的潜在不利影响的关注。增殖分化旺盛的细胞对电离辐射的敏感程度比较高,比如男性生殖细胞,其作为电离辐射的敏感细胞之一,较容易受到电离辐射引起的损伤,从而对男性的生育能力造成影响。因此迫切需要探索相关可以增强机体抗电离辐射能力的药物来保护工作环境长期处于电离辐射人群的生殖健康。
  姜黄素是一种从姜黄的根茎中分离出来的酚类化合物,具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等生物学作用。研究证实氧化应激在电离辐射诱导的生殖系统损伤中发挥了关键作用,但是姜黄素是否能在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用尚未报道。本课题主要探究了姜黄素在电离辐射致男性生殖系统损伤中的防护作用以及可能的作用机制。
  本课题使用BALB/c雄性小鼠作为动物模型,探究姜黄素对电离辐射损伤男性生殖系统的保护作用。实验结果表明不同剂量的单次电离辐射导致了小鼠的生殖系统损伤。与未辐射的正常小鼠相比,经电离辐射处理后的小鼠睾丸重量以及附睾尾部精子的浓度出现显著降低,HE染色显示电离辐射破坏小鼠睾丸组织正常的生理结构;用TUNEL法检测睾丸组织内的凋亡情况,结果发现电离辐射显著增加了睾丸组织内的凋亡。同样在细胞水平上检测了电离辐射对小鼠精母细胞的影响。结果表明电离辐射处理后细胞的活力出现显著下降,细胞凋亡率明显升高。4Gy的单次辐射剂量破坏了精母细胞正常的线粒体膜电位。辐射后小鼠睾丸以及精母细胞内caspase-3的蛋白水平均升高。接着探究是否姜黄素能够减弱电离辐射对生殖系统造成的损伤。口服姜黄素可显著提高辐射后小鼠睾丸附睾尾部精子浓度,降低睾丸组织内生精细胞的凋亡情况。细胞实验同样发现姜黄素预处理可以显著降低电离辐射引起的细胞活力下降以及细胞凋亡,改善线粒体膜电位。上述实验结果表明姜黄素对电离辐射后的生殖系统具有保护作用。4Gy的单次电离辐射破坏了小鼠以及精母细胞的氧化应激系统之间的平衡。电离辐射处理后,小鼠睾丸内SOD、Total GSH表达水平出现显著降低,MDA和ROS水平显著上升。姜黄素预处理可以明显增加SOD、Total GSH的活性,降低MDA和ROS水平。
  在明确姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用的基础上,进一步探索其发挥保护作用的具体机制。Nrf-2/HO-1信号通路是机体内重要的抗氧化通路,前面的实验结果表明姜黄素预处理可以显著改善小鼠以及细胞内的氧化应激状态。基于这个实验结果,设想Nrf-2/HO-1信号通路参与姜黄素在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤的保护过程。实验结果显示姜黄素预处理可以显著增加精母细胞以及小鼠睾丸组织内Nrf2的蛋白水平,促进Nrf2蛋白从胞浆向胞核内的转移。在精母细胞内对Nrf2基因进行干扰后显著降低了姜黄素对精母细胞的保护作用。
  总而言之,本研究首次报道了姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用。其发挥保护作用的机制可能与通过调控Nrf-2/HO-1抗氧化信号通路维持机体氧化应激状态平衡有关。姜黄素作为祖国传统中草药,其具有副作用小,原料易获取等优点,有可能开发成为一种新的抗辐射损伤防护剂。
[博士论文] 张鹏
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:自上世纪30年代第一例枕颈融合手术报道以来,枕颈融合手术已有了长足的发展,在恢复枕颈交界区稳定性、提高植骨融合率及维持复位等方面均取得了令人满意的效果。但近年来,部分患者枕颈融合术后出现下颈椎曲度异常,严重者出现后凸畸形或半脱位,有的甚至需要二次手术治疗,从而引起了临床医生的关注。目前关于枕颈融合术后出现下颈椎曲度异常的研究,主要集中于影像学对枕颈角(O-C2角)与下颈椎曲度(C2-C7角)的观察随访,而其生物力学机制尚未得以阐明。另外,在离体生物力学研究中,由于标本的离断,O-C2角的测量难以实现,而后枕颈角(POCA角)的使用却不受影响,但有文献指出POCA角的可靠性尚有待进一步验证。
  目的:
  1、通过多人重复测量及统计分析,验证POCA角的可靠性。
  2、通过人尸体颈椎标本的离体生物力学研究,分析不同的POCA角对下颈椎各节段的运动范围(ROM)和椎间压力(IDP)的影响,揭示枕颈融合术后下颈椎曲度变化的生物力学机制,为枕颈融合手术术中POCA角固定大小的选择提供重要的理论依据。
  3、通过临床随访研究,对枕颈融合手术前、后以及最后一次随访时的O-C2角和POCA角以及C2-C7角的关系进行评价,揭示POCA角的临床意义。
  方法:
  1、由3名资深骨科医生对30名健康志愿者以及30名罹患枕颈部疾患需行枕颈融合手术患者的中立位颈椎侧位X光片的O-C2角及POCA角进行测量、记录。间隔至少两周以后相同的3名医生再次测量、记录,两次记录分别用不同的文档,避免影响测量结果的真实性。通过计算组内相关系数(ICC),统计分析每名医生前后两次测量之间的复测信度(intra-observer ICC)及3名医生测量之间的观察者间信度(inter-observer ICC),并对健康组和疾病组的O-C2角及POCA角进行统计分析。
  2、选用8具新近死亡的青壮年颈椎标本作为实验材料,应用强生辛迪思(DePuy Synthes)公司的枕颈融合系统,以及生物力学试验机、OptiTrack(@)运动捕捉系统、060型微型压力传感器及与之适配的P3型应变测量仪和记录器等实验工具,使用混杂测试模式模拟颈椎三维运动。其中枕颈固定节段为枕骨(C0)、枢椎(C2)及第三颈椎(C3)。测试分为6种工况分别进行,其中第1种是未行内固定的正常组,其余5种是枕颈固定时将POCA角固定于不同角度的实验组,分别为:1、中立位组(POCA=111°),2、中立位-SD组(POCA=101°),3、中立位+SD组(POCA=121°),4、中立位-2SD组(POCA=91°),5、中立位+2SD组(POCA=131°)。实验中对各运动节段(C3/4、C4/5、C5/6、C6/7)在前屈、后伸、左旋及左侧弯等4个方向上的运动范围(ROM)以及椎间压力(IDP)进行监测记录。对正常组和各实验组在各个运动方向上的ROM以及IDP进行统计分析比较。
  3、对2005年1月到2016年12月之间在海军军医大学第二附属长征医院骨科脊柱病区收治的由同一名手术医生行枕颈融合手术治疗的30名患者进行回顾性研究。统计其术前、术后第二天以及最后一次随访时的中立位颈椎侧位X光片的O-C2角、POCA角、C2-C7角等三个参数。比较、分析O-C2角、POCA角、C2-C7角之间的相关性和变化趋势。
  结果:
  1、本研究中健康组的O-C2角为:19.72°±6.80°,POCA角为:111.13°±9.71°;疾病组O-C2角为:7.12°±11.70°,POCA角为:121.23°±14.64°;两组间有的统计学差异(P<0.001,P=0.003)。3名医师对健康组O-C2角测量的复测信度分别为:0.975、0.948和0.974,观察者间信度为:0.983;对POCA角测量的复测信度分别为:0.984、0.856和0.945,观察者间信度为:0.948。3名医师对疾病组的O-C2角测量的复测信度分别为:0.990、0.988和0.986,观察者间信度为:0.995;对POCA角测量的复测信度分别为:0.998、0.997和0.997,观察者间信度为:0.999。
  2、枕颈固定以后,C0到C3之间各个方向的ROM较正常组显著减小,而C3-C7各节段间在各个方向上的ROM较正常组均有显著增加。而POCA角的改变,四个方向的测试中,其对前屈和后伸的影响最为显著,且各节段ROM的变化趋势相似。其中,在前屈方向上,随着POCA角的增大,各节段的ROM随之减小;而后伸方向上,趋势相反,随着POCA角的增大,各节段的ROM随之增大。而POCA角固定于中立位时,虽然各节段前屈、后伸时的ROM虽然仍明显大于正常组,但未出现POCA角过小时前屈方向上和过大时后伸方向上的极度增大的活动度。虽然施加内固定以后,各实验组在左侧弯及左旋转方向上的ROM均显著增加,但POCA角的改变对这两个方向上的ROM均无显著影响。而IDP的测试结果仍可看出POCA角对前屈、后伸影响的趋势,随着POCA角的增大,各节段前屈时IDP呈现减小的趋势;同样各节段后伸时IDP也呈现减小的趋势。
  3、枕颈融合手术治疗以后患者症状均获得明显改善;术前O-C2角与POCA角、C2-C7角呈负相关,POCA角与C2-C7角呈正相关;术后、末次随访时的O-C2角、POCA角及C2-C7角均较术前获得改善;末次随访时的O-C2角、POCA角及C2-C7角和术后之间无明显差异,术后及末次随访时的O-C2角与POCA角、C2-C7角呈负相关,而POCA角与C2-C7角之间无显著相关;末次随访时O-C2角的变化值和末次随访时POCA角的变化值、末次随访时C2-C7角的变化值之间呈负相关,末次随访时的POCA角变化值与C2-C7角变化值之间呈正相关。
  结论:
  1、健康组和疾病组之间的O-C2角和POCA角均存在显著差异。这两种测量方法对健康人群及罹患枕颈部疾患的人群的枕颈序列的评估均有较高的复测信度和观察者间信度。POCA角是一种临床实用性强、可靠性高的枕颈序列观测指标,可用于临床及实验研究。
  2、枕颈固定以后,固定节段的ROM显著减小,而其余运动节段均出现代偿性活动增加。POCA角中立位固定时,相较于过曲和过伸位固定,其在前屈后伸时可避免出现极度增大的活动度,且各运动节段的椎间压力也近似正常。因此,枕颈固定时,POCA角固定在中立位的111.13°±9.71°左右可获得最佳的生物力学环境。
  3、枕颈融合手术可有效改善枕颈序列并维持复位。POCA角是全颈椎序列的一个重要参数,它的变化与O-C2角的变化呈负相关,与C2-C7角的变化呈正相关。为减少枕颈融合术后下颈椎序列异常的发生,术中不应只简单过度后伸复位,应对POCA角的选择持谨慎态度,应全面考量颈椎的整体序列。对于术前下颈椎曲度较小的患者,术中固定时不宜将POCA角较术前作较大幅度的减小。
[硕士论文] 金剑
外科学(烧伤外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  人工真皮能有效修复累及真皮层的损伤,促进创面愈合,改善愈合后功能和外观。目前临床上使用的人工真皮多为双层结构,如Intgra、Pelanc等,主要由作为生长支架的胶原层和具有屏障功能的硅胶层两层结构构成。这些人工真皮主要作用于经清创等处理彻底清除坏死组织,且未发生感染的创面,因为人工真皮移植失败的主要原因是移植后感染。移植后感染多发生于移植后早期,该时期内,由人工真皮未能与创面建立良好的血供,抗菌能力较弱,且随着创面细菌侵入、增殖,细菌分泌胶原酶,降解人工真皮的胶原层,降解产物成为细菌增殖的良好培养基,进一步增加了其移植后感染风险。移植后一旦发生感染,不但会造成移植失败,还可能引发脓毒血症,威胁患者生命。移植前彻底清创、移植后加强换药、全身使用抗生素等一系列抗菌措施应用于预防人工真皮移植后感染的问题,虽然取得了一定成效,但仍无法避免移植后感染的出现。已有大量研究将各种生长因子加入人工真皮,以期进一步促进创面愈合,借鉴于此,有研究将抗菌成分加入其中以期研制一种本身就具有一定抗菌能力的人工真皮将为改善人工真皮移植后感染问题提供新的思路和方法,也将拓展人工真皮适用范围,为创面治疗提供更多的选择。本研究选择国内Lando(@)双层人工真皮修复材料作为基础人工真皮,筛选合适的临床抗菌制剂,进行人工真皮的抗菌修饰,并验证其持续抗菌能力及促创面愈合的效果。
  第一部分:赋予人工真皮持续抗菌能力的抗菌成分选择
  目的:选择一种具有较强抗菌能力的抗菌制剂,作为后续研究赋予人工真皮抗菌能力的成分。
  方法:选择临床创面消毒常用消毒剂作为备选抗菌制剂,本研究所选择消毒剂包括:碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林。采用微量肉汤法测定创面常见细菌菌种(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌)标准菌株和临床菌株(各20株)对以上消毒剂的MIC、MBC,以消毒剂临床应用于创面的浓度作为消毒剂初始浓度,计算MIC、MBC分别为消毒剂初始浓度的稀释倍数,记为MIC稀释、MBC稀释。比较临床菌株和标准菌株对同一消毒剂的MIC、MBC,将MIC和/或MBC大于标准菌株的临床菌株认为是对该消毒剂敏感性降低的菌株,计算敏感性降低菌株百分比,初步判断临床菌株对各消毒剂的敏感性情况。选择具有较小MIC稀释和MBC稀释且临床菌株对其具有较高敏感性的消毒剂成分作为本次研究的候选抗菌制剂,用以下一阶段实验制备具有抗菌能力的人工真皮。
  结果:金黄色葡萄球菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC稀释分别为2-5、2-6、2-6、2-7、2-6、2-1,MBC稀释分别为2-5、2-5、2-6、2-7、2-6、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为30%、30%、55%、5%、5%、50%。鲍氏不动杆菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC稀释分别为2-4、2-4、2-5、2-5、2-2、2-1,MBC稀释分别为2-3、2-4、2-4、2-5、2-1、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为40%、25%、60%、10%、45%、55%。肺炎克雷伯菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC稀释分别为2-4、2-6、2-6、2-7、2-2、2-1,MBC稀释分别为2-4、2-5、2-6、2-7、2-1、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为35%、20%、40%、10%、40%、45%。
  结论:金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌对PHMB具有较小MIC稀释、MBC稀释,且临床菌株对其敏感性较高,故PHMB被选择为赋予人工真皮持续抗菌能力的抗菌成分。
  第二部分:具有抗菌能力的人工真皮的制备及性状检测
  目的:以PHMB作为抗菌成分,分别采用浸泡法、微球法、夹层法处理人工真皮,检测3种方法处理后的人工真皮可持续抗菌时长,并检测相关性状。
  方法:将人工真皮分别进行如下处理:1.浸泡法:分别浸泡于0.1%、0.5%、1%、2%浓度PHMB溶液中24h;2.微球法:制作直径50μm、100μm的明胶微球,每种直径明胶微球各自分别含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB,将人工真皮浸泡于上述明胶微球水溶液中24h;3.夹层法:制作含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB的水凝胶,加入人工真皮的硅胶层和胶原层之间。分别将制备好的实验样品制成直径5mm的圆形,放置于涂抹金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌标准菌株的培养皿,每天更换新的涂抹细菌的培养皿,记录每天形成得抑菌圈大小,分析各方法可持续形成有效抑菌圈时间。选择具有最长可持续形成有效抑菌圈时间且PHMB浓度较低的实验样品用于后续研究,检测性状。体外细胞毒性卖验,以未加入抗菌成分的人工真皮作为对照,分别观察实验样品和未加入抗菌成分韵人工真皮在第3、7、14、21d对人成纤维细胞和人血管内皮细胞存活率的影响。体外自然降解实验,观察在自然环境下实验样品降解情况。体内埋植实验,将实验样品埋入大鼠皮下,观察埋入部位大体反应,并记录降解情况。扫描电子显微镜观察,比较实验样品和未加入抗菌成分的人工真皮结构差异。
  结果:使用浸泡法制备的不同浓度的实验样品对各菌种仅在浸泡后0d形成了有效抑菌圈;使用微球法制备的实验样品对3个菌种最长可持续形成有效抑菌圈时间均为1d,由浸泡于直径50μm、PHMB浓度为1%和2%的明胶微球溶液后形成;使用夹层法,1%和2%PHMB水凝胶加入人工真皮后对金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌标准菌株可持续形成有效抑菌圈时间分别为8d、7d、7d。综合分析1%PHMB水凝胶加入人工真皮胶原层和硅胶层间可作为赋予人工真皮持续抗菌能力的方法,行下一步研究检测性状。细胞毒性实验结果显示,具有抗菌能力的人工真皮对人成纤维细胞和人血管内皮细胞存活率产生影响较小,与不含抗菌成分的人工真皮比较无明显差异,P>0.05。体外自然降解实验显示,1%PHMB水凝胶降解率较低,至第6周时降解率为27.388±1.943%。体内埋植实验显示,1%PHMB水凝胶埋入部位未出现明显炎症反应,切口生长较好,水凝胶至第3周降解率为23.648±2.336%。扫描电子显微镜检查结果显示,加入1%PHMB水凝胶后,人工真皮胶原层结构无明显改变,胶原层孔隙内可观察到PHMB晶体分布。
  结论:1%PHMB水凝胶加入人工真皮胶原层和硅胶层间,能有效赋予人工真皮较长时间持续抗菌能力,生物毒性较低,降解较慢,且不改变人工真皮胶原层原结构。
  第三部分:具有抗菌能力的人工真皮的在体效果验证
  目的:验证加入1%PHMB水凝胶的人工真皮对创面愈合的影响以及抗菌能力。
  方法:清洁创面移植实验:取40只SD大鼠,制备全层皮肤缺损创面模型,随机分为2个组,分别为人工真皮组(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组(Anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),各组创面分别给予不做特殊处理、覆盖人工真皮、覆盖1%PHMB水凝胶、覆盖具有抗菌能力的人工真皮,分别于第3、7、14、21d换药,观察创面愈合及感染情况,计算每次换药时的新发感染率。换药时每组大鼠随机选取5只大鼠处死,取创面组织,分别行病理切片HE染色和CD31免疫组化,计算微血管密度(Micro-vascular Density,MVD),并行创面组织细菌定量实验。感染创面移植实验:取20只SD大鼠,随机分为人工真皮组2(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每组10只,制备感染创面模型,ADG2覆盖人工真皮,AADG覆盖具有抗菌能力的人工真皮。于第3、7、14、21d换药,观察创面感染情况,计算每次换药时的感染率,于21d换药时处死所有大鼠,取创面组织行细菌定量实验。移植后持续暴露于感染环境实验:取20只SD大鼠,随机分为人工真皮组(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组3(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每组10只,制备全层皮肤缺损创面模型,ADG覆盖人工真皮,AADG覆盖具有抗菌能力的人工真皮,每日于硅胶层外滴注1mL鲍氏不动杆菌标准菌株细菌悬液,于移植后3、6、9、12d换药观察创面感染情况,计算每次换药时的感染率。
  结果:清洁创面移植实验:ADG于第7d换药时出现1个感染创面,新发感染率均为6.67%。AADG在第3d MVD少于ADG,P<0.05,但后期AADG与ADG的微血管密度间无明显差异,P>0.05。排除感染创面后,各组未感染创面细菌含量检测,第3、7、14d AADG创面组织细菌含量明显少于ADG,P<0.05。
  结论:具有抗菌能力的人工真皮对创面愈合影响较小,移植于感染创面后能有效控制感染,且对移植后可能导致创面感染的因素具有一定抵抗能力。
[硕士论文] 王泽瑞
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:Mac-2结合蛋白(Mac-2-binding protein,M2BP)是一种N型糖基化蛋白,紫藤凝集素(Wisteria floribunda agglutinin,WFA)可与M2BP结合形成紫藤凝集素阳性的巨噬细胞-2结合蛋白(WFA-positive Mac-2-binding protein,WFA+-M2BP)。目前研究表明,WFA+-M2BP与肝纤维化程度密切相关,且可预测肝癌的发生及抗病毒药物的治疗效果。但MFA+-M2BP与肝硬化患者的相关研究却鲜有报告。
  研究目的:明确WFA+-M2BP与肝硬化患者的肝功能情况是否存在相关性及其对肝功能的预测效果。
  研究方法:本研究回顾性地入组了2013至2016年间住院治疗的197肝硬化患者。其中,160例患者完成了相关随访工作,平均中位随访时间为23个月。收集和记录患者的相关化验、检查和临床资料(如并发症、死亡等),并通过全自动分析仪,测定所有患者血清中WFA+-M2BP的水平。分别采用受试者工作特征曲线(Roc)分析、Logistic回归分析和Cox回归分析等统计学方法,测定血清WFA+-M2BP在评估肝硬化患者肝功能储备、预测失代偿和死亡等方面的准确性。
  研究结果:在入组的197例肝硬化患者中,血清WFA+-M2BP水平随Child-pugh分级的升级而增高,尤其在乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝硬化患者中明显。Roc分析发现,WFA+-M2BP用于Child-Pugh分级评估肝功能具有较高的可靠性。此外,血清WFA+-M2BP也与终末期肝病(MELD)评分呈显著正相关。更重要的是,多因素Logistic回归分析表明,WFA+-M2BP是代偿期肝硬化患者进展为临床失代偿期的独立预测指标(OR=11.958;95%CI:1.876-76.226;p=0.009)。多因素Cox回归分析证实WFA+-M2BP是肝病相关死亡的独立危险因素(HR=2.57;95%CI:1.013-6.525;P=0.047)。
  研究结论:血清WFA+-M2BP水平可作为评价肝硬化患者肝功能和预测其临床结局的可靠指标,尤其适用于HBV感染引起的肝硬化患者。
[硕士论文] 华通
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  桡动脉穿刺置管术可以进行连续、精准的血压监测,目前已经成为围手术期监护的重要技术之一。本研究主要探究在桡动脉穿刺置管术中,患者因素对首针穿刺置管失败的影响,筛选出危险因素,并建立效能较高的预测模型以便于临床操作前评估,同时指导临床教学工作和超声辅助桡动脉穿刺置管操作。
  方法:
  选择239例行桡动脉穿刺置管术患者,根据首针穿刺置管情况分为:(1)桡动脉首针穿刺置管成功组(n=171);(2)桡动脉首针穿刺置管失败组(n=68)。选择本院2017年3月至2017年9月行桡动脉穿刺置管的成年患者,ASAⅠ~Ⅲ级,收集患者、操作者和操作设施等相关信息,记录桡动脉穿刺置管操作情况。采用统计方法分析筛选桡动脉首针穿刺置管失败的患者危险因素,并建立预测模型。
  结果:
  实验纳入病例数为239例,首针穿刺置管成功组有171例,首针穿刺置管失败组有68例,首针穿刺置管成功率为71.5%。所有的失败组患者均在超声引导下穿刺成功。首针穿刺置管成功组与首针穿刺置管失败组相比,将单因素分析时P值小于0.2作为界值,纳入到Logistic回归分析中的危险因数有:年龄大于70岁的患者、术前低血压患者、血管解剖异常、肥胖患者、高脂血症、冠心病、以及心律失常。而性别、BMI过轻、正常和过重、高血压、糖尿病、吸烟、外周血管疾病、肾功能不全之间无统计学意义。
  对上述危险因素再次进行Logistic多元回归分析,发现年龄大于70岁(P<0.05)、术前低血压(P<0.05)、血管解剖异常(P<0.05)、冠心病(P<0.05)是桡动脉首针穿刺置管失败的独立危险因素。
  建立的预测模型分别为:预测模型—即危险数量模型和预测模型二即危险因素多元回归预测模型。预测模型二公式为:Logit(P)=0.819*年龄大于70岁(年龄大于70岁=1,年龄≤70岁=0)+1.566*术前低血压(低血压=1,非低血压=0)+1.659*血管解剖异常(异常=1,正常=0)+1.469*冠心病(冠心病=1,正常=0)-1.693。两个模型的ROC曲线下面积分别为0.660和0.728。
  结论:
  经过多因素筛选和分析,我们得出了影响桡动脉首针穿刺置管失败的危险因素是:年龄大于70岁、术前低血压、血管解剖异常和冠心病。同时,多元回归预测模型适合作为临床医生穿刺置管前的危险评估工具。
[硕士论文] 施犇
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种导致关节功能逐渐丧失的退行性关节疾病,其能够令患者致残并严重影响其生活质量。OA发病的原因目前尚不明确,一般认为与遗传、肥胖、年龄、免疫、机械损伤等因素有关,近来遗传因素作为OA的重要发病机制,受到人们越来越多的关注。
  缓激肽B2受体(Bradykinin B2receptor,BDKRB2)广泛存在于包括关节组织在内的全身各种组织中,介导了大多数由缓激肽引起的炎症反应。尽管BDKRB2在炎症中的作用已被阐明,但关于BDKRB2基因多态性与炎症关系的研究相对较少。既往的研究已经发现了细胞因子在OA的发病过程中有着重要作用,同时toll样受体(Toll-like Receptor,TLR)-2和TLR-4在OA损伤的软骨细胞周围表达也有上调,并且BDKRB2+9/-9bp基因多态性与骨关节炎的易感性和严重性相关,这些研究提示BDKRB2+9/-9bp基因多态性可能与OA中炎症细胞因子的表达以及TLRs的作用相关,或许其可以作为OA发生和发展的基因标记,成为重要的临床筛查指标。
  研究目的:
  本研究采用基因测序、分子生物学等技术,探究BDKRB2+9/-9bp基因多态性和膝OA中促炎性细胞因子水平的关系,以及其涉及的分子机制。将从基因多态性的角度阐明骨关节炎发生发展的分子机制,并为骨关节炎的早期诊断和临床治疗提供新思路和新靶点。
  研究方法:
  总共有156例膝关节OA患者及121名正常对照者被纳入研究。两组受试者分别采取外周静脉血,采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(Polymerase Chain Reaction—Single Strand Conformation PolymorPhism,PCR-SSCP)技术对其BDKRB2+9/-9bp基因多态性测定并分型。将两组受试者根据BDKRB2+9/-9bp基因型,每组再分成-9/-9bp、+9/-9bp和+9/+9bp三组,并用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)测定样本血清和滑膜液中的炎性细胞因子水平,包括肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)-α、白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8,比较两组内不同基因型炎性细胞因子表达水平。两组的受试者的关节滑膜组织进行实时荧光定量(Quantitative Real-time,qRT)PCR测定TLR-2和TLR-4的mRNA水平,并且对不同基因型进行比较。分离培养膝OA患者的滑膜细胞,分别加入B2受体抑制剂MEN16132,TLR-2siRNA制剂(干扰RNA),scrambled siRNA制剂(siRNA对照),以及空白对照组,4组分别在加有缓激肽(Bradykinin,BK)刺激(1μM)和正常培养的培养基质下分别进行培养,最后测定培养基质中相关促炎性细胞因子的水平并进行比较。
  研究结果:
  1.膝OA患者血清和滑液中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β促炎细胞因子水平显著高于正常对照组(P<0.01),其中-9/-9bp基因型组血清和滑液TNF-α和IL-8水平显著高于+9/+9bp组(P<0.05);而-9/-9bp和+9/-9bp基因型组IL-6水平显著高于+9/+9bp组(P<0.05)。然而各组IL-1β水平差异无统计学意义。各基因型正常对照组的促炎细胞因子差异均无统计学意义。
  2.与正常对照组相比,膝OA患者滑膜组织中TLR-2和TLR-4表达上调(P<0.01)。在膝OA患者中,TLR-2mRNA水平+9/+9bp基因型组显著低于-9/-9bp和+9/-9bp基因型组(P<0.01),但是各基因型组中TLR-4mRNA水平差异无统计学意义。正常对照组中,各基因型组中TLR-2和TLR-4水平差异均无统计学意义。
  3.BK可以刺激人OA滑膜细胞IL-6和IL-8因子的分泌增加,MEN16132缓激肽B2受体拮抗剂抑制BK的效应,同时TLR-2siRNA也显著抑制基础及缓激肽诱导的IL-6和IL-8的分泌,然而各处理组中TNF-α的分泌无显著变化。
  研究结论:
  本研究结果表明BDKRB2+9/-9bp基因多态性影响膝OA患者血清与滑液中促炎细胞因子的表达水平。BDKRB2+9/-9bp基因多态性与TLR-2表达密切相关,同时TLR-2的表达降低可以抑制膝OA患者滑膜细胞中的炎性细胞因子的水平,这进一步证明BDKRB2+9/-9bp基因多态性可以通过改变TLR-2表达影响膝OA中的促炎细胞因子水平。
[博士论文] 夏天一
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着以他克莫司为基础的肾移植术后免疫治疗方案应用愈发深入与广泛,他克莫司在长期应用过程中的肾毒性作用日益凸显。传统、保守的他克莫司基础免疫治疗方案使得其急性与慢性肾脏损伤发生率超过90%,造成移植肾功能以4%/年的速度下降,诱发一系列并发不良反应,增加肾移植患者二次肾脏替代治疗的风险,威胁肾移植患者的长期生存质量与生命安全。
  早期鉴别他克莫司肾毒性并进行有效干预是临床应用中减低他克莫司急性和慢性肾损伤的必要手段。他克莫司药代动力学/药效动力学过程呈现显著的个体差异,导致药物暴露量与毒性效应关系难以简单推断。临床实践多综合考虑药物浓度监测结果、肾功能生化指标与病理切片对他克莫司肾毒性进行非特异性鉴别,进而采取减药、换药或撤药的方式加以干预。然而上述诊断标准的非特异性/亚灵敏性/损伤性特点使得临床终点判断多处于他克莫司肾毒性效应的“既发阶段”,长期、反复的毒性效应过程造成了移植肾的不可逆损伤。
  探究他克莫司肾毒性的替代临床效应终点是实现早期、有效干预的重要方法,灵敏、特异的生物标志物是近年来被认可的临床效应终点判断指标。代谢组学技术,因其高通量、高灵敏度的特点,成为了生物标志物发掘的有力手段;其中氨基酸类物质与肾脏结构、功能关系紧密,是肾毒性亚临床病理变化指征的关键切入点。通过归纳前人研究,建立关键氨基酸代谢途径与信息节点的靶向分析方法,可以进一步实现氨基酸生物标志物的有效识别与准确判断。
  将基于氨基酸靶向代谢组学发掘的生物标志物与有效临床(药物、环境、人口)信息结合起来,运用生物信息学中数据提取、分析、判别与整合手段,可以建立针对不同患者的,大数据背景下的,多层次、多角度的个体化生物标志物体系模型,进而实现他克莫司肾毒性“高危人群”有效识别与早期临床干预。
  黄葵胶囊是由黄蜀葵花乙醇提取物制备而得的中药制剂,在免疫性肾脏病治疗中应用广泛。前期研究已经证实其具有改善蛋白尿、钠潴留,调节血糖、血脂,缓解炎症和免疫反应等药理活性。据此,本研究推测,黄葵胶囊可能影响他克莫司药效,对其毒性效应发挥缓解作用。前期关注黄葵胶囊与他克莫司合用的研究甚少,黄葵胶囊在肾移植后的临床应用较为局限。
  目的:
  探究他克莫司肾毒性临床背景下的危险因素;建立完善的血浆氨基酸靶向代谢组学分析方法(分析前阶段/分析阶段);构建整合临床危险因素和关键氨基酸的生物标志物体系模型并绘制列线图以实现数据可视化;探究黄葵胶囊与他克莫司合用时黄葵胶囊对他克莫司毒性效应的影响,提出优化的临床干预方案。
  方法:
  第一部分:展开系统综述与Meta分析,识别肾移植术后钙调神经蛋白抑制剂(CNI,包括他克莫司和环孢素)肾毒性临床背景下的危险因素。通过电子数据库检索辅助人工核对,对相关回顾性研究文献进行评价。数据分析使用Cochrane推荐的Review Manager5.2软件操作完成,运用I2检验和Q检验评估结论显著性与异质性。CNI肾毒性以生化指标、病理切片和药物浓度等常用临床终点效应事件为首要结局;移植肾功能恢复延迟为次要结局。
  第二部分:建立基于超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱的血浆23种氨基酸靶向分析方法。色谱柱选用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(3.0mm×150mm,5μm),通过在流动相中添加离子对试剂(七氟丁酸),实现多种氨基酸有效的色谱保留与分离。质谱检测在正离子多重反应监测模式下完成。
  第三部分:招募25名健康志愿者进行上臂静脉采血,按顺序分装至EDTA-2K、EDTA-3K、促凝、肝素和枸橼酸采血管中至规定刻度,并于采血管中保存6、12、24h后检测。运用第二部分建立的氨基酸含量测定方法对不同采血管中血清/血浆的氨基酸含量进行分析。使用重复测量方差分析结合球形检验进行不同保存时间的氨基酸含量测定结果比较。运用Student's t检验分析不同采血管中氨基酸含量测定结果,同时使用Bland-Altman一致性检验和Passing-Bablok回归分析探讨采血管间含量测定差异规律。
  第四部分:设计回顾性研究,收集122份发生/不发生他克莫司肾毒性的肾移植患者血浆样本,和与上述患者年龄、性别匹配的健康志愿者血浆样本一同纳入“预验证集”,进一步随机选取42份发生/不发生他克莫司肾毒性的肾移植患者血浆样本纳入“验证集”。运用第二部分建立的氨基酸靶向代谢组学分析方法,参照第三部分推荐操作完成样本采集与氨基酸分析。通过模式识别的计算机学习算法筛选氨基酸生物标志物,并同第一部分研究中指征的危险因素整合,构建生物标志物体系模型,绘制列线图以辅助实现良好的临床应用。
  第五部分:构建大鼠他克莫司肾毒性模型,将模型分为空白对照、他克莫司肾毒性和他克莫司与黄葵胶囊联合使用三组。收集模型不同阶段的大鼠血液与组织样本,进行相应的肾功能生化指标、组织病理和药物浓度分析。表征不同采样时间下氨基酸生物标志物变化,初步验证第四部分研究结论,指征氨基酸生物标志物在肾脏毒性状态下的变化规律,和与常规肾脏功能指标相比的灵敏度与特异性;探究黄葵胶囊与他克莫司合用时,对他克莫司肾毒性效应的影响和其作用机制。
  结果:
  第一部分:研究纳入了12篇回顾性研究中共计2849例样本进行分析。供体年龄(OR,1.01;95%CI,1.01-1.03;p=0.02),受体移植时动脉硬化(OR,1.44;95%CI,1.04-1.99;p=0.03)与受体CYP3A5*3/*3基因型(OR,2.80;95%CI,2.63-2.98;p=0.00)是具有统计学意义的CNI肾毒性危险因素。亚组分析与敏感性分析表明,供体年龄在亚裔和高加索人种中不存在异质性。
  第二部分:待测氨基酸在既定的考察范围内均呈现良好的线性关系。日内/日间精精密度、稳定性、累积效应和真实样本再分析结果满足《FDA生物样本分析方法指导原则》(2013版)和《中国药典》(2015版)的相关要求。该方法能够用于有效的健康志愿者和肾移植患者的血浆样本氨基酸分析。
  第三部分:肝素(其次是EDTA-3K)采血管氨基酸含量测定结果随存放时间变化较小。用于氨基酸检测的血浆样本在采血管中的存放时间推荐不超过6h。同肝素采血管氨基酸含量测定结果相比,枸橼酸采血管测定结果偏低而抗凝采血管测定结果偏高;EDTA和肝素血浆氨基酸含量测定结果差异具有统计学意义。在超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测条件下,EDTA-3K和肝素血浆氨基酸含量测定结果一致性良好。
  第四部分:胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、对称二甲基精氨酸、色氨酸、犬尿氨酸为有效的他克莫司肾毒性生物标志物。上述氨基酸参与了“精氨酸代谢”、“甲基化过程”、“色氨酸代谢”和“支链氨基酸代谢”等关键生化途径。将上述氨基酸生物标志物与第一部分发掘的危险因素整合为生物标志物体系模型,该模型在“预验证集”和“验证集”中得到受试者工作曲线的曲线下面积均>0.8。
  第五部分:动物模型结果显示,黄葵胶囊和他克莫司合用能够有效降低并延缓他克莫司肾毒性的氧化应激效应。其分子机制为降低肾间质纤维化程度、改变肾小管表型与肾小管扩张状态、降低肾间质炎症细胞浸润,但是不影响他克莫司血药浓度。氨基酸生物标志物能够在他克莫司肾毒性早期产生灵敏变化,以对称二甲基精氨酸为代表的生物标志物,其波动值较常规肾功能指标血肌酐和尿素氮更加显著。
  结论:
  供体年龄、受体移植时动脉硬化与受体CYP3A5*3/*3基因型是具有统计学意义的钙调神经蛋白抑制剂肾毒性危险因素,可以作为有效协变量,纳入他克莫司肾毒性生物标志物体系模型。本研究中建立的氨基酸靶向代谢组学分析方法能够对血浆中23种氨基酸进行准确、快速检测;通过控制样本从采集到检测过程中的两个重要变量,采血管类型和采血管中的样本保存时间,能够有效减少测定结果误差。本课题开展回顾性临床研究筛选并验证的基于氨基酸靶向代谢组学的生物标志物体系模型灵敏度高,并在动物模型中得到了初步验证。黄葵胶囊与他克莫司合用可以有效降低他克莫司所致的肾脏损伤,具有广阔的临床应用前景。
[硕士论文] 姜里强
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:椎弓根螺钉置入是目前常用的脊柱内固定技术,但由于椎弓根形态特殊,椎体旁血管及神经丰富,椎弓根穿刺及置钉过程中定位困难、风险较高,穿刺失败往往造成灾难性后果。椎弓根穿刺及置钉过程中的精准“定位”和“定向”问题是目前骨科手术导航研究的热点和难点。新型激光定位导航系统基于C臂机研发,手术路径指示直观,定位精准度高达1.0mm,其线性导航原理与传统的类GPS定位原理不同。本研究为新型激光定位导航辅助下实施椎弓根螺钉置入的应用研究,评价该新型激光导航下置钉的可行性、安全性及精确性等问题。
  方法:实验第一部分,以人体脊柱标本建立椎弓根穿刺点模型,C臂机沿脊椎长轴在-30°~30°以5°为间隔旋转并透视出椎体椎弓根影像,用激光对穿刺点的位置进行定位验证,志愿者对不同旋转角度的椎弓根及穿刺点成像进行判定,总结成像规律。实验第二部分,将正常人体脊椎CT数据三维重建后,计算机模拟确定穿刺的最佳位点、最佳角度及最佳深度,测算椎弓根穿刺及置钉过程中穿破内侧及外侧皮质的角度阈值;3D打印椎体,并在最佳穿刺点处置入钢珠,分析该3D打印椎体在C臂机上的成像,验证线性导航辅助下椎弓根穿刺及螺钉置入的可行性。实验第三部分,选择5具尸体标本,实验组及对照组分别对应同一椎体的两侧椎弓根,标本术前扫描CT,规划手术路径;实验组行激光导航辅助下经皮椎弓根螺钉置入术,对照组采用开放直视下椎弓根徒手置钉术,记录椎体及椎弓根定位时间、椎弓根置钉手术时间,术后对标本行X片及CT平扫,根据Gertzbein and Robbins评价体系判断置钉成功率;将术后椎弓根螺钉的实际进针点、实际置钉路径与最佳进针点、最佳置钉路径在CT影像上进行比对,对部分CT扫描时金属伪影较大的椎体切开,直视下判断椎弓根螺钉穿出皮质情况,评价置钉精确性。
  结果:(一)椎体椎弓根及其穿刺点在C臂机的成像随着椎体角度的变化而变化,将C臂机的透视角度调整至椎弓根轴位可结合激光线性导航。(二)椎弓根轴位透视时,最佳穿刺点(钢珠透视位点)处于椎弓根影中心处,此时C臂机的透视调整角度与计算机重建后模拟测算的椎弓根偏斜角度契合,椎弓根轴位透视位置为激光线性导航最佳穿刺引导位,此时导航设备偏斜角度可根据椎弓根偏斜角度测算,从该节段椎体“标准前后正位”至“椎弓根轴位”调整简单合理,具有可行性。当椎弓根穿刺路径为模拟的最佳穿刺路径时拥有最佳的置钉效果,其穿破皮质的角度阈值最大,手术具有最低的风险,术者的操作误差完全可以在其穿刺阈值范围之内,激光导航下椎弓根置钉具有可行性。(三)以Gertzbein and Robbins评价体系评价实验组及对照组的置钉精准度,录入SPSS19.0软件,实验组置钉成功率为94.29%(33/35),对照组对照组置钉成果率为91.42%(32/35),两组间无统计学差异(P值>0.05);进针点偏离值实验组平均为1.08±0.76mm,对照组平均为2.61±0.89mm,两组具有统计学差异(平均差1.53,95%CI=1.34~1.72,P<0.05);进针方向偏离值实验组平均为2.41±1.18°,对照组平均为4.52±0.99°,两组有统计学意义(平均差2.11,95%CI=1.59~2.52,P<0.05),实验组置钉精确性优于对照组;椎体及椎弓根定位时间,实验组平均为294.9±50.93s,对照组平均为433.3±60.78s,手术时间实验组平均506.2±63.7s,对照组平均633.7±114.9s,P值均小于0.05,两者具有统计学差异,导航下置钉可有效减少椎体椎弓根定位及置钉手术时间。
  结论:使用新型激光定位导航系统辅助椎弓根穿刺及螺钉置入术可行性强、安全性好、精准度高,为椎弓根穿刺及螺钉置入术提供了新的研究方向和理论依据,同时对于其他精准微创操作也具有借鉴意义。
[硕士论文] 刘培钊
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  一、单锚钉“回”式缝合法与传统改良Kessler缝合法修复跟腱断裂的体外力学实验
  目的:对比单锚钉“回”式缝合和传统改良Kessler缝合修复跟腱后断端的力学差异,进一步验证临床上使用单锚钉修复跟腱断裂的力学可行性。
  方法:从8名成年人尸体上获取跟腱标本共16具,排除既往跟腱病变后随机分为A、B两组,每组各8具跟腱标本,分别制作跟腱断裂的模型。A组于跟腱内侧向跟骨置入1枚锚钉,利用“回”式缝合法修复断端;B组不置入锚钉,直接使用与A组相同的缝线,按照改良Kessler缝合法修复断端。分别将两组修复后的跟腱标本放置于力学测试仪上并妥善固定,保持标本的湿润,按照预加压、循环加载、最大拉伸等步骤进行力学测试。记录循环加载至10次、100次、500次、1000次时断端的位移,最大拉伸时记录断裂载荷、断裂位移、断裂模式,根据加载时应力与位移的变化关系,绘制载荷-位移曲线,计算每组跟腱标本的刚度、屈服负荷,对两组间力学指标进行统计学分析。
  结果:循环加载时,两组标本加载至10次时断端位移无明显变化;A组加载至100次、500次、1000次时断端位移小于B组(p<0.01,p<0.01,p<0.01)。最大拉伸时,A组的断裂载荷、断裂位移均大于B组(p<0.01,p<0.01),两组间断裂模式无差异,分析载荷位移-曲线发现A组刚度、屈服负荷均大于B组(p<0.01,p<0.01)。
  结论:单锚钉“回”式缝合法修复跟腱断裂与传统改良Kessler缝合法相比具有一定的力学优势,其可以增大断端修复后的断裂负荷和抗拉伸强度,增强断端修复后的力学稳定性,为临床上实现患者早期负重提供了可能,某种程度上降低了术后跟腱再断裂的风险。
  二、有限切开单锚钉“回”式缝合法微创治疗急性闭合性跟腱断裂的临床研究
  目的:对比有限切开单锚钉“回”式缝合法与传统切开改良Kessler缝合法治疗急性闭合性跟腱断裂的临床疗效和并发症,探讨有限切开单锚钉“回”式缝合法的有效性、可行性和局限性。
  方法:回顾分析2014年1月至2017年1月在长海医院收治且符合纳入标准的64例急性闭合性跟腱断裂患者的病例资料,按照手术方法的不同分为单锚钉微创组和传统组。其中单锚钉微创组28例,均采取有限切开单锚钉“回”式缝合法进行微创修复;传统组36例,均采取传统切开改良Kessler缝合法进行修复。统计分析两组患者的围手术期指标和术后并发症发生率;随访期间采用美国足踝外科功能(American Orthopedic Foot&Ankle Society,AOFAS)评分系统和Arner-Lindholm标准评估两组患者的临床疗效,记录AOFAS评分、踝关节活动度(Range of motion,ROM)、Leppilahti评分(Leppilahti score,LS)、小腿周径差(Calf circumference difference,CCD)、术后恢复工作和运动的时间等指标来对比分析两组患者的术后疗效。
  结果:单锚钉微创组和传统组的平均随访时间分别为21.4±4.7月和21.8±4.3月。两组患者围手术期指标比较:术前住院日两组无明显差异;单锚钉微创组手术时间长于传统组(p<0.01);单锚钉微创组切口长度、术中出血量、住院时间均小于传统组(p<0.01,p<0.01,p<0.01)。术后两组患者并发症比较:单锚钉微创组软组织并发症发生率小于传统组(p<0.05);单锚钉微创组跟腱再断裂、腓肠神经损伤、深静脉血栓(Deep venous thrombosi,DVT)发生率与传统组无明显差异。两组患者术后疗效比较:单锚钉微创组术后恢复工作和运动的时间均小于传统组(p<0.01,p<0.01);单锚钉微创组患者术后3月的AOFAS评分、ROM、LS、患侧与健侧CCD均优于传统组(p<0.01,p<0.01,p<0.01,p<0.05);而单锚钉微创组患者术后12月的AOFAS评分、ROM、LS、患侧与健侧CCD与传统组无明显差异。
  结论:有限切开单锚钉“回”式缝合法是临床上微创治疗急性闭合性跟腱断裂的一种选择,具有创伤小、住院时间短、软组织并发症发生率低、康复期短、术后短期疗效好等优势,对于功能要求高的年轻患者更加适用。
[硕士论文] 杨勇
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  马尾神经是一种特殊的外周神经,与普通外周神经相比,对外界不良刺激的抵御能力偏弱,一旦发生损伤,会出现严重的下肢功能障碍、鞍区感觉障碍及二便功能障碍等症状,手术治疗效果差,神经功能恢复程度有限,给患者及其家庭带来了沉重的经济和精神负担。目前关于马尾神经损伤的基础和临床研究鲜有实质性的进展,在神经成像研究上也缺乏创新的技术和方法。在目前的马尾神经形态学研究中,最常使用的检测方法为光学显微镜和电子显微镜,对组织行切片染色后镜下观察,虽然能达到很高的分辨率,但受限于照明光束与电子束的穿透能力限制,均不能直接用于样品内部空间结构的三维成像,仅能得到局部标本的二维图像,无法观察到神经内部的三维空间结构。
  同步辐射是在环形轨道上做加速运动的带点粒子沿切线方向发出的连续分布的电磁辐射,由于其高纯度、高亮度、高准直、高偏振、准相干等独特而优异的特性,以及其在时间和空间分辨率上的巨大优势,能够对微小的组织甚至细胞进行三维和动态观察,目前已有生物学家依托同步辐射光源观察生物大分子的三维结构,进行相关的科学研究。相位衬度成像是一种新的成像理论和技术,利用X线的折射效应及不同组织折射系数的不同进行成像,具有微米量级的空间分辨率,对轻元素构成的软组织的分辨率提高1000倍以上,对神经、血管、韧带、软组织肿瘤等有良好的成像效果和很高的分辨率。目前,同步辐射相位衬度成像已经用于脑血管、脊髓血管、肝脏组织等的三维立体成像,分辨率达到数微米,能够清晰的观察到组织的内部结构及细微变化,为临床研究提供新发现。目前为止,同步辐射光源应用于马尾神经损伤的成像研究还未有报道。因此,本课题将同步辐射相位衬度成像应用于大鼠马尾神经的研究,观察正常马尾神经及急性损伤后马尾神经的内部空间结构及神经纤维的形态变化,为马尾神经损伤的治疗及神经损伤修复提供新的理论支持。
  研究目的:
  建立并改进大鼠马尾神经急性损伤模型,取得标本后马尾神经进行锇酸染色,利用上海同步辐射光源(SSRF)对正常及损伤的马尾神经进行相位衬度成像,观察正常及不同损伤程度后马尾神经内部空间结构及神经纤维的变化,并进行定量分析,为马尾神经的损伤修复提供新的理论支持。
  研究方法:
  1、选取24只成年SD大鼠,分为对照组(n=6),假手术组(n=6),模型组1(n=6)和模型组2(n=6),七氟烷吸入麻醉后,行L5-6椎板切除术。损模型组采用改良Allen's重物撞击法制作大鼠L5-L6马尾神经急性损伤模型,分别给予不同的致伤力,造成不同程度的损伤。术后行BBB评分、甩尾试验判定大鼠行为学改变,并对标本行HE染色、免疫荧光染色、LFB染色,观察损伤后马尾神经组织病理变化。
  2、对标本进行甲醛固定、酒精梯度脱水、锇酸染色、环氧树脂包埋等处理,制作同步辐射相位衬度成像实验标本。
  3、于上海同步辐射光源(SSRF)BL13W1生物医学线站对标本进行相位衬度成像扫描,获得原始投影图。
  4、采用PITRE和PITRE-BM软件对原始图片进行相位恢复、sinogram重建、slice生成;用VG Studio MAX3.0软件对slice进行三维重建,对马尾神经的进行三维成像。
  5、比较分析正常马尾神经、损伤马尾神经的内部空间结构变化及神经纤维的变化。
  研究结果:
  1、成功建立了马尾神经急性损伤模型。
  2、同步辐射相位衬度技术对马尾神经进行成像,得到高分辨率的断层图像,进一步对断层图像重建得到马尾神经及内部神经纤维的三维立体成像。相当于应用同步辐射成像技术对马尾神经进行三维CT检查。
  3、得到高分辨率的神经三维立体结构图像,通过对正常马尾神经及损伤马尾神经的断层图像及三维图像比较,发现当机械打击造成马尾神经重度损伤时,髓鞘肿胀、崩解,神经纤维走行紊乱,神经内部髓鞘所占体积比下降。而对于轻度损伤的马尾神经,因神经水肿,髓鞘肿胀导致所占体积比增加
  研究结论:
  本实验用Allen's重物打击法建立的急性马尾神经损伤模型操作简单、可重复性强,很好的模拟了机械作用下腰椎外伤时发生马尾神经急性损伤的致病过程。利用同步辐射相位衬度成像技术,对马尾神经进行三维成像,得到微米量级的马尾神经内部立体结构信息,更清晰直观的观察到正常状态和急性损伤时马尾神经内部形态结构变化。通过对神经所占的空间体积比值的定量分析,发现了不同程度马尾神经损害的神经髓鞘病变的差异,为马尾神经损伤修复提供理论和技术支持。
[博士论文] 李振江
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  升主动脉瘤是指升主动脉管壁局部异常扩张至正常直径1.5倍以上,易发生主动脉破裂而致患者猝死。而升主动脉是动脉瘤最常发生的区域,据统计升主动脉瘤约占所有胸主动脉瘤的45%。目前,升主动脉瘤的主要治疗方法为体外循环下行升主动脉置换术,需要行开胸手术和建立体外循环,创伤较大,手术风险较高。而此类疾病好发于老年人,许多患者由于高龄及并存病等因素无法接受开放手术,若单纯药物保守治疗,死亡率高达58%,升主动脉扩张病的微创治疗问题仍亟待解决。血管腔内微创治疗技术因其创伤小,死亡率及并发症率低的优势,目前已广泛应用于腹主动脉、胸降主动脉、主动脉弓部扩张性病变的微创治疗,国内外多家单位开始探索将腔内技术应用于升主动脉瘤的治疗。
  然而,现有直管型移植物需要大于15mm的正常主动脉管壁作为锚定区,升主动脉长度相对较短,近端有冠状动脉,远端有弓上分支动脉,常难以提供足够的锚定区。再者,在升主动脉搏动性血流持续冲击下,易发生移植物移位、内漏等并发症,对锚定区的要求更高。因此,既往用于胸降主动脉的传统移植物系统及相应的技术方法并不适合升主动脉瘤的形态学特征和血流动力学特点。
  由此,本课题提出一种填充型移植物的设计:覆膜支架外附一个顺应性可填充球囊,填充剂注入球囊后,球囊扩张顺应瘤腔形状填满瘤腔,填充剂固化后将移植物固定于瘤腔内,同时球囊填充瘤腔也起到密封瘤腔降低内漏风险的作用。
  本研究拟在上述移植物设计理念的指导下,研制新型升主动脉瘤填充型移植物系统,通过体外实验验证其可行性,动物实验验证其安全有效性。
  目的:
  (1)根据新的移植物设计理念,设计制作结构功能完整的填充型移植物系统,满足升主动脉瘤腔内治疗的需要;
  (2)在体外模型上完成体外模拟实验,评估填充型移植物系统的可行性,初步验证填充型移植物可提供的锚定力不劣于传统移植物;
  (3)构建成熟的升主动脉瘤大动物模型,瘤体形态位置、锚定区长度满足填充型移植物系统的评估需要,动物模型长期稳定;
  (4)完成填充型移植物系统动物实验研究,评估该移植物系统的安全有效性。
  方法:
  (1)填充型移植物系统的研制:以镍钛合金金属丝为材料,制作螺旋型聚四氟乙烯覆膜支架和Z型环涤纶覆膜支架,以顺应性好耐磨的聚氨酯薄膜裁剪热压制作外附球囊,通过光固化树脂胶水粘结制作移植物主体;在现有国产移植物输送系统的基础上整合可脱解填充导管及后释放装置,并探索移植物压缩安装方法;以双组份加成型液体硅橡胶为基础,调整基础聚合物、补强填料、交联剂的配比以及催化剂和催化活性调节剂的比例,在保持其力学性能的前提下,降低粘度,调整其固化时间,并混入金属钽粉使其具备显影性,调整钽粉的质量体积分数获得最适显影性;
  (2)体外实验研究:等比例3D打印心脏主动脉硅胶模型,在X线透视下经心尖导入移植物系统,完成定位、释放、填充和撤出等完整的操作步骤,在X线、CT扫描和肉眼下观察移植物位置、形态、管腔通畅程度,外附球囊填充瘤腔程度,瘤体有无残腔,有无遮盖冠脉开口和弓上分支动脉开口。评价移植物导入是否顺利、定位释放是否准确、输送系统脱解回撤是否顺利;填充过程是否简便可控,填充通路是否紧密无泄漏,填充结束后填充导管脱解是否顺利。进一步利用拉力计测试对比填充型移植物与不同放大率的直管型移植物在升主动脉瘤模型上的极限抗位移力。通过上述实验评估填充型移植物系统的可行性;
  (3)升主动脉瘤动物模型的构建:选择健康成年家猪作为实验动物,全麻下在升主动脉前侧壁缝合经戊二醛去抗原处理的牛心包补片,补片形成瘤袋状,侧壁阻断下剪除瘤袋内管壁组织,缝合牛心包切口形成动脉瘤。术中造影观察瘤体形态,术后超声检查瘤体内血流速度,CTA随访观察瘤体动态变化,测量瘤体直径、远近端锚定区等指标,评价该模型是否可用于验证填充型移植物的安全有效性;
  (4)动物实验研究:采用健康成年家猪另行构建升主动脉瘤模型,成功建模后,经心尖导入释放填充型移植物治疗升主动脉瘤,术中造影观察填充型移植物是否移位,瘤体是否隔绝完全无内漏,重要分支血管是否通畅,术后对实验动物随访观察,CTA检查观察随访期瘤体、移植物变化情况,心脏超声评估主动脉瓣膜功能和心功能,最后行大体解剖和病理观察,评价该移植物系统在围手术期和随访期的安全有效性。
  结果:
  (1)获得结构完整的填充型移植物样品,直径为30mm、35mm,长度为25mm,球囊充盈后初始直径为40mm;获得改进的输送系统,集成了填充通道、后释放装置等相关功能组件;获得新型双组份加成型液体硅橡胶,粘度降低为A组分27.1mPa.s,B组分42.2mPa.s,固化后力学性能为拉伸强度1.05MPa,断裂伸长率110%,撕裂强度3.13kN/m,满足填充型移植物系统的使用;确定混入金属钽粉质量体积分数为1g/ml可获得良好的显影性;
  (2)在体外模型上成功完成导入、释放、填充和回撤的过程。移植物位置形态良好,扩张完全;外附球囊外膜完好,顺应瘤腔形状充满瘤腔,不遮盖冠脉开口和弓上分支动脉开口;填充过程顺利,填充时间为2.3±0.9min,填充剂使用量为7.8±2.7ml。在体外模型上,填充型移植物极限抗位移力高于放大率为6.7%的直管型移植物组(20.7±3.0N vs3.95±0.7N)和放大率为16.7%的直管型移植物组(20.7±3.0N vs6.55±1.3N),差异有统计学意义(p<0.01);
  (3)采用牛心包缝合法,12头健康家猪中10头家猪成功建立升主动脉瘤模型。瘤口直径为22.6±5.2mm,近端锚定区长度为10.7±3.1mm,远端锚定区长度为1.0±1.3mm。术前升主动脉中段直径为26.43±1.52mm,建模手术成功后升主动脉瘤直径为46.62±1.95mm(p<0.05),为正常升主动脉的1.77倍。随访期CT示瘤体轻微增大,大体解剖观察内壁光滑与自体主动脉管腔相似,HE染色显示心包补片被成纤维细胞及胶原纤维覆盖,腔面被覆新生内皮细胞。随访期实验动物心功能无明显变化;
  (4)另取健康家猪建模成功获得12头升主动脉瘤模型动物,此12头模型动物中8头成功完成填充型移植物的腔内治疗并存活,其余4头情况为:2头动物移植物向远心端移位至主动脉弓部,1头动物移植物遮盖左冠状动脉导致室颤死亡,1头动物移植物释放后关胸过程中麻醉意外死亡。存活动物术后及随访期间移植物未发生移位,动脉瘤无内漏,直径未再增大(47.2±4.0vs48.3±2.4,P=0.218),弓上分支动脉及冠脉通畅,超声示主动脉瓣膜功能正常,升主动脉内血流速度、心功能未发生明显变化。大体解剖及病理观察可见管壁内皮完整,无损伤。扫面电镜观察可见移植物内表面被覆纤维组织。
  结论:
  新型填充型移植物系统治疗升主动脉瘤初步验证是可行的,可成功用于治疗远近端锚定区不足的升主动脉瘤模型动物,围手术期及短期随访结果较为理想,初步证实了该移植物系统的安全有效性。本移植物系统的研制及相关实验研究将为升主动脉瘤的腔内治疗提供新的思路,为将来开展临床试验研究提供参考,但仍需针对不足进一步优化改进。
[硕士论文] 王欢
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过回顾性分析泌尿系结石患者的临床病例资料,探讨梗阻性肾病的患病率及术后急性肾损伤的发病率,并分析梗阻性肾病以及结石术后急性肾损伤的危险因素,为梗阻性肾病的防治提供依据。
  方法:回顾性分析2014年9月-2017年12月在上海长海医院泌尿外科住院并行手术碎石治疗的泌尿系统结石患者的病例资料,收集泌尿系结石患者的病历信息:性别、ID号、年龄、诊断、手术方式(经皮肾镜碎石术、输尿管镜碎石术)、是否患高血压、血肌酐(术前及术后)、肾小球滤过率、是否患糖尿病、血尿酸、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、二氧化碳结合力、血白蛋白、血红蛋白、红细胞、尿白蛋白、尿红细胞、影像学资料等。其中肾小球滤过率小于60ml/(min·1.73m2)的患者为梗阻性肾病,48小时内血肌酐升高26.5μmol/L以上,或高于基础值的1.5倍为急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)。在梗阻性肾病患病的危险因素分析中,根据是否发生梗阻性肾病将研究对象分为梗阻性肾病组和非梗阻性肾病组。以是否发生梗阻性肾病为应变量,各研究变量为自变量,进行多因素Logistic回归分析。在术后AKI的危险因素分析中,根据是否发生AKI将研究对象分为AKI组和非AKI组。以是否发生AKI为应变量,各研究变量为自变量,行多因素Logistic回归分析。
  结果:3年多的时间内泌尿外科共有13496名住院患者。本次研究共纳入1313例泌尿系结石患者的病例资料。其中,梗阻性肾病236例(17.97%),非梗阻性肾病1077例(82.03%)。结石相关梗阻性肾病在我院泌尿外科的患病率为1.75%,泌尿系结石在泌尿外科的患病率为9.73%。梗阻性肾病中,女性占32.6%,男性占67.4%,年龄结构分布以51-70岁占多数(69.1%)。梗阻性肾病合并高血压共114例(48.3%),合并糖尿病共60例(25.4%)。单因素分析中,年龄、高血压、糖尿病、血尿酸、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、二氧化碳结合力、血白蛋白、血红蛋白、红细胞、尿蛋白有统计学差异(P<0.05)。再将上述有意义的变量行多因素Logistic回归分析,结果显示年龄、高血压、糖尿病、血尿酸、二氧化碳结合力、血红蛋白与梗阻性肾病患病相关。在结石术后AKI的研究中,输尿管镜碎石组共858例患者,其中52例发生AKI(6.1%),经皮肾镜碲石组共455例患者,其中43例发生AKI(9.5%)。术后发生AKI的患者共95例(7.24%)。多因素Logistic回归分析及列线图显示,手术方式、血尿酸、术前血肌酐有统计学差异(P<0.05)。
  结论:高龄、高血压、糖尿病、高尿酸血症、代谢性酸中毒等是梗阻性肾病患病的独立危险因素,与梗阻性肾病密切相关。手术方式(经皮肾镜碎石术)、血尿酸、血肌酐(术前)是泌尿系结石患者术后发生AKI的独立危险因素。
[博士论文] 王伟恒
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 富甲烷生理盐水治疗大鼠急性脊髓损伤的作用及机制
  目的:探讨富甲烷生理盐水(methane-rich saline,MS)通过腹腔注射对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的治疗作用及其可能机制。
  方法:为研究富甲烷生理盐水治疗脊髓损伤的作用及剂量效应,将大鼠SCI后每12小时以0.5,5和20ml/kg的剂量向大鼠腹膜内注射MS,在SCI后72小时后,检测大鼠受损节段脊髓苏木精伊红(Hematoxylin&Eosin,HE)染色,氧化应激,炎症反应和细胞凋亡程度确定MS治疗作用及最佳剂量。然后研究MS(20ml/kg/12h)对SCI的长期作用和保护机制。在SCI后72小时和14天后分别检测受损节段脊髓HE和小胶质细胞和星形胶质细胞细胞激活情况,并使用BBB评分评估神经功能恢复情况。
  结果:MS可显着改善SCI后脊髓的病理学改变,降低SCI后72小时的氧化应激,炎症反应和细胞凋亡。MS剂量为20ml/kg的保护效果更佳。此外,MS可显著抑制SCI后小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,并改善SCI后大鼠后肢运动功能。
  结论:腹腔注射富甲烷生理盐水可以通过抑制脊髓受损节段的炎症反应、氧化应激、细胞凋亡,发挥潜在的治疗SCI的作用。
  第二部分 水平震摇法在原代大鼠BMSCs提纯中作用
  目的:研究体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)过程中水平振摇对细胞纯度、增殖、分化和凋亡的影响,探索更为简单高效的BMSCs提纯方法。
  方法:借鉴小胶质细胞和星形胶质细胞的分离纯化方法,在全骨髓贴壁法的基础上利用差速贴壁结合不同时间和频率的振摇分选法对BMSCs进行分离纯化,检测水平震摇对原代BMSCs的细胞数量,纯度,增殖,分化和凋亡的影响。
  结果:全骨髓贴壁法分离BMSCs过程中,经过180r/min 4h振摇处理下,细胞的量并未受严重影响,且纯度最高,活性良好,经诱导分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞。但经振摇处理后,细胞的凋亡有所增加,且随着振摇频率和时间的增加细胞凋亡率增加。
  结论:全骨髓贴壁法结合适当振摇的分离方法更为高效,且成本低廉,可更早期获得高纯度、较高活性、低分化的BMSCs。
  第三部分 低氧预处理BMSCs移植治疗大鼠急性脊髓损伤的作用及机制
  目的:SCI后脊髓中低氧,高炎症等特殊微环境大大限制干细胞移植的治疗功效。本研究探索低氧预处理(hypoxia preconditioning,HP)BMSCs(H-BMSCs)治疗SCI的效果及相关机制。
  方法:体外实验中,使用不同剂量氯化钴(CoCl2)预处理BMSCs不同时间,研究低氧预处理对BMSCs增殖和凋亡的影响以选取合适的低氧预处理条件。研究低氧预处理BMSCs对血清剥夺抵抗力及细胞迁移的影响,并使用RT-PCR检测凋亡相关基因mRNA(caspase-3和bcl-2)及迁移相关基因mRNA(HIF-1α和CXCR4)的表达。体内实验中,将BMSCs和H-BMSCs通过经蛛网膜下腔注射移植到SCI大鼠体内,使用BBB评分和Reuter评分评估大鼠SCI后神经功能恢复情况,并检测脊髓受损节段HE染色组织病理学变化,炎症反应强度及移植BMSCs的迁移和分化情况。
  结果:低氧预处理能显着降低BMSCs凋亡(caspase-3表达降低,bcl-2表达增加),增强BMSCs迁移(HIF-1α和CXCR4表达增加)。体内实验表明,与BMSC相比,H-BMSC移植能显着改善神经功能,减轻脊髓损伤,抑制与小胶质细胞活化有关的炎症反应。H-BMSC组SCI核心及周边区NeuN阳性细胞数高于BMSC组,且一部分NeuN阳性细胞显示GFP阳性,提示BMSCs可分化为神经元细胞。
  结论:HP能增强BMSCs的迁移能力和神经再生能力,提高BMSCs治疗SCI的潜能。
[硕士论文] 侯钦茂
血管病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  TEVAR术是目前治疗治疗Stanford B型主动脉夹层的一线治疗方法,但目前仍有许多技术难题需要解决,如累及腹主动脉内脏区的夹层等,且目前也需要开发更多的新型移植物,这些都需要稳定的体型较大的实验动物模型来进行评价。目前在降主动脉段构建的动物模型目前构建模型的方法都存在一些问题,如假腔长度较小、动物死亡率较高、成模率较低、稳定性较差等问题,且大多采用狗进行动物实验,较少进行家猪的动物实验,而家猪的体型、血管解剖等更近似人类,更适合进行主动脉疾病的研究,希望能够在家猪身上构建出更加稳定的降主动脉段主动脉夹层动物模型。
  目前关于升主动脉夹层动物模型的研究很少,升主动脉的腔内治疗又是目前研究的需要,所以现在亟需一种简便、稳定的升主动脉夹层动物模型来满足当前及以后各种研究的需要,本研究根据降主动脉动脉段夹层动物模型的探索来进一步研究了升主动脉夹层动物模型的构建。
  升主动脉夹层的发病率及死亡率都较降主动脉段高,研究显示手术组较保守治疗组预后更佳,但目前存在一部分病人因高龄、基础疾病等原因无法进行升主动脉的开放手术治疗,即使进行了治疗,这些因素的存在也使其治疗效果不佳,而腔内隔绝术因其微创的特点可以规避这些缺点,但目前的升主动脉夹层治疗仍旧存在一些问题,如冠脉血供,如锚定区等问题,本研究希望探索腔内隔绝术在治疗实验猪升主动脉夹层动物模型上的可行性,为下一步治疗升主动脉夹层提供一些经验。
  目的:
  (1)在实验猪主动脉构建出稳定的Stanford B型主动脉夹层,进行一些技术创新与探索,为进行Stanfod A型主动脉夹层积累经验。
  (2)在实验猪主动脉构建出稳定的StanfordA型主动脉夹层,可以在该模型上进行新的器具评价,新的技术手段的探索。
  (3)统计部分实验猪的升主动脉数据,选择并准备合适尺寸的升主动脉支架,为后期设计其他支架移植物及其他实验研究进行基础性数据准备。
  (4)在构建模型成功的实验猪体内进行升主动脉夹层腔内治疗的初步探索。
  方法:
  (1)选取健康适龄实验猪8只,进行降主动脉段Stanford B型主动脉夹层模型的构建实验,分别采取不同的方法,总结选取优秀构建模型方法。
  (2)选取健康适龄实验猪8只,进行升主动脉段Stanford A型主动脉夹层动物模型的构建,采用各种不同方法,总结选取优秀构建模型方法。
  (3)对实验猪进行CT增强造影,分析其升主动脉形态学特点,做初步统计。
  (4)对构建升主动脉夹层动物模型成功的实验猪行升主动脉夹层腔内隔绝术治疗,探索其在实验动物上的可行性,为临床和下一步深入研究积累经验。
  结果:
  (1)动脉鞘水流冲击法在实验猪降主动脉动脉共进行实验4次,其中2头死于麻醉意外,其他2头猪构建模型成功,构建模型成功率为100%,总成功率为50%。
  (2)逆行导丝法在实验猪腹主动脉共进行实验4次,成功2头,失败2头,成模率为50%。
  (3)分离内膜法在实验猪升主动脉段共进行实验4次,全部构建模型成功,成功率为100%。
  (4)心包补片法在实验猪升主动脉段共进行实验4次,全部构建模型成功,成功率为100%。
  (5)实验猪的平均体重为51±4.2kg,CT增强造影显示升主动脉根部平均直径为18.4±0.7mm,升主动脉平均长度为28.5士2.9mm。
  (6)使用Cuff在构建模型成功的实验猪体内进行升主动脉腔内隔绝术2次,成功1次,失败1次,成功率为50%。
  结论:
  (1)动脉鞘水流冲击法和逆行导丝法均可在腹主动脉段构建模型成功,对比开放手术方法和腔内介入方法,开放手术方法构建模型更容易,更稳定。
  (2)分离内膜法和心包补片法均可在实验猪升主动脉段构建出稳定的动物模型。
  (3)升主动脉夹层腔内隔绝术在构建模型成功的实验猪体内具有可行性,但存在一些问题需要进一步探索和改进。
[博士论文] 石磊
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:颈椎后纵韧带骨化症(OPLL)好发于65岁以上的东亚人群,其特点表现为后纵韧带的增生、肥厚和骨化,伴随着骨化的进展,可逐渐加重椎管狭窄以及脊髓和神经根受压的程度,进而出现不同程度的神经受损表现,严重影响生活质量。目前尚无疗效满意的保守疗法,如果症状严重,患者最终会选择手术治疗,但也存在一些问题,比如风险较高;易出现严重的并发症;手术疗效对于有些患者而言并不确切。因此目前的研究重点是探寻其发病机制。经过多年的研究,遗传、微环境、代谢、力学改变等学说被广为接受,但这些尚难以解释其完整的发病机理,需要更进一步探索。①近年来有研究显示,PERK介导的内质网应激(ERS)是人体内成骨作用、骨形成不可或缺的重要机制,且可在机械应力诱导牙周韧带细胞骨化过程中发挥调控作用,但对于颈椎后纵韧带骨化的影响尚无报道,需要我们去验证该现象在机械应力诱导OPLL过程中的作用机制。②在我们的既往研究中发现,OPLL患者后纵韧带细胞表达Cx43要明显高于非骨化患者,而且初步证实在颈椎后纵韧带骨化的过程中,Cx43可能发挥了重要的调控作用;目前研究发现Cx43可通过ERK调节成骨、软骨细胞代谢,且Src/MEK/ERK通路与OPLL发病机制密切相关,因此需要探讨Cx43是否可通过MAPK相关通路调控OPLL。③有文献报道在某些病理过程中,Cx43可通过ERS发挥相应的调节作用;且ERS可激活MAPK家族信号通路,进而调控细胞的各种生命活动。明确在应力刺激作用下,Cx43是否可通过PERK介导的ERS激活MAPK信号通路,进而调控骨化,有利于进一步认识OPLL的发病机制。
  方法:自2015年12月至2017年6月,16名颈椎后纵韧带骨化和24名非骨化患者,均采取颈椎前路减压(经椎间隙或椎体次全切除)植骨融合内固定术,术中收取大块后纵韧带组织标本,尽量避免使用枪状咬骨钳嵌压韧带组织。采取酶消化法分离、培养韧带细胞,对细胞内波状蛋白进行免疫组化染色以鉴定后纵韧带细胞,并进行后续分子生物学研究。具体步骤为:①取第3代骨化和非骨化组韧带细胞,采用RT-PCR检测mRNA水平的表达,Western-blotting检测蛋白水平的表达,比较两组间PERK、CHOP、GRP78等ERS相关指标和ALP、OCN、COLⅠ等成骨标志物的表达差异;采用Flexercell应力加载系统对非骨化组细胞施加应力刺激,比较刺激前后上述指标及流式细胞仪检测活性氧(ROS)水平的改变;用PERK通路特异性抑制剂抑制非骨化组细胞的ERS,再予以应力刺激,观察各项成骨标志物的表达变化。②利用免疫组化法比较骨化组和非骨化组韧带细胞内p38MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相关指标的磷酸化水平,Western-blotting检测应力刺激对上述指标在非骨化组细胞内磷酸化程度的影响;制备Cx43的siRNA序列,采用慢病毒携带此序列转染细胞,分别从基因及蛋白表达水平检验其抑制效率,并进一步观察干扰Cx43对于机械应力激活MAPK通路的影响;依次干扰Cx43和特异性抑制p38MAPK、ERK1/2、JNK各通路后,检测应力刺激下各项成骨标志物的基因表达。③干扰非骨化组细胞内的Cx43后予以应力刺激,检测PERK、CHOP、GRP78的表达以及ROS水平,再过表达Cx43,观察上述指标的变化;观察抑制PERK介导的ERS对于机械应力激活MAPK通路的影响;在机械应力加载模型的基础上,依次用siRNA/Cx43和PERK通路特异性激活剂处理非骨化患者的韧带细胞,检测MAPK相关指标的磷酸化程度和成骨标志物的表达。
  结果:利用酶消化法培养第3代细胞生长状态良好,形态稳定,排列有序;主要以长梭形和多角形为主,胞体丰富,呈放射状、旋涡状生长。骨化组及非骨化组细胞形状无明显区别。对波形蛋白采取免疫组化染色呈阳性,证实了其成纤维细胞性质。①通过检测PERK、CHOP、GRP78等ERS相关指标和ALP、OCN、COLⅠ等成骨标志物在mRNA和蛋白水平的表达,发现骨化组均明显高于非骨化组,差异显著(p<0.05);对非骨化患者的韧带细胞施加应力刺激,发现上述指标的表达明显上调,且流式细胞仪检测ROS水平升高,与刺激前相比差异有统计学意义(p<0.05);抑制PERK介导的ERS可显著下调应力刺激诱导的成骨标志物的表达(p<0.05)。②免疫组化检测p38MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相关指标的磷酸化蛋白在骨化及非骨化组韧带中均有表达,但骨化组明显强于非骨化组;机械应力刺激非骨化患者的韧带细胞后,WB检测发现上述指标的磷酸化蛋白含量明显升高(p<0.05);成功构建了Cx43的siRNA,从mRNA及蛋白水平进行评价其抑制效率均大于70%;干扰非骨化组韧带细胞的Cx43可明显抑制机械应力激活MAPK通路(p<0.05);干扰Cx43及特异性抑制p38MAPK、ERK1/2通路可明显下调机械应力诱导COLⅠ、OCN、ALP和Runx2等成骨标志物的表达(p<0.05),但在JNK通路抑制组差异无统计学意义(p>0.05),提示在OPLL过程中JNK通路的作用不显著。③干扰非骨化组韧带细胞内的Cx43可明显下调应力刺激诱导PERK、CHOP、GRP78的表达以及ROS水平(p<0.05),过表达Cx43后发现ERS相关指标及ROS水平均出现显著上调;抑制PERK介导的ERS可显著抑制机械应力激活MAPK通路(p<0.05);在干扰Cx43的前提下,非骨化组韧带细胞MAPK磷酸化和成骨分化受到抑制,再次激活PERK介导的ERS可以恢复机械应力对MAPK通路的激活以及成骨刺激作用。
  结论:利用酶消化法可以在体外环境中成功分离、培养后纵韧带组织细胞,并可通过波形蛋白染色证实其来源。①机械应力可刺激后纵韧带细胞出现PERK介导的ERS,并可通过该反应促进韧带细胞骨向分化。②在机械应力作用下,Cx43可通过p38MAPK、ERK1/2通路促进韧带骨化,除此之外,可能还通过其它的作用通路来影响OPLL的过程。③在应力刺激作用下,PERK介导的ERS可在Cx43的下游通过ERK1/2、p38MAPK通路促进韧带骨化,除此之外,可能也还通过其他机制调控OPLL。
[硕士论文] 韩武翔
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:本研究旨在通过构建骨关节炎模型从体外及体内两方面观察探究低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)在骨关节炎发生发展中的作用,同时初步探讨LRP5/6影响骨关节炎发展的相关机制。
  研究方法:首先通过对半月板失稳术(DMM)在小鼠上构建膝骨关节炎的模型,检测LRP5/6在骨关节炎模型中的表达情况,明确LRP5/6的存在对骨关节炎发生发展的作用。而后在转基因小鼠上构建骨关节炎模型,探究LRP5/6及β-catenin的基因敲除鼠对于小鼠骨关节炎模型的影响,初步确定LRP5/6及β-catenin在骨关节炎过程中的具体作用。进而,为在体外进一步确证LRP5/6的作用,通过利用TNF-α刺激人原代滑膜细胞诱导骨关节炎细胞模型,从DKK-1促使LRP5/6下膜以及MDC促使LRP5/6回膜两方面进行探索,观察LRP5/6的上下膜对于滑膜细胞MMP13及Col2a表达的影响,从而在细胞水平验证LRP5/6在体外实验中对骨关节炎中的作用。最后,通过收集临床患者标本,初步检测临床骨关节炎患者滑膜细胞中LRP5/6的蛋白表达情况,为LRP5/6在临床应用中的进一步探索提供初步实验基础。
  研究结果:小鼠构建膝骨关节炎模型后4周,出现了小鼠关节软骨面的缺损,MMP13蛋白表达的升高及COl2a蛋白表达的降低,同时小鼠DMM模型组相比于对照组,其滑膜及关节软骨LRP5/6的表达显著增高。通过对转基因小鼠进行LRP5/6(β-catenin)基因敲除后构建小鼠骨关节炎模型,该实验结果显示,LRP5/6的缺失会加重小鼠膝关节炎的严重程度,表现为更为严重的关节软骨缺损,关节软骨细胞紊乱等,同时相比于野生型小鼠,LRP5/6敲除鼠滑膜及关节软骨中MMP13的表达明显升高,Col2a的表达明显降低;而β-catenin的缺失则会减轻小鼠膝关节炎的严重程度,呈现与LRP5/6的缺失相反的表现。
  体外实验利用TNF-α刺激人原代滑膜细胞诱导骨关节炎细胞模型,从DKK-1促使LRP5/6下膜以及MDC促使LRP5/6回膜两方面的结果表明,LRP5/6的下膜会使滑膜细胞MMP13的表达进一步增加,Col2a的表达进一步降低,而MDC的刺激会减弱DKK-1作用下的MMP13表达增加及Col2a表达降低的程度。同时,在临床滑膜组织标本检测实验中发现,骨关节炎患者滑膜相比于对照组LRP5/6蛋白表达明显升高。
  研究结论:本课题首次研究了LRP5/6在骨关节炎发生发展中的作用及初步机制。结果表明,LRP5/6对骨关节炎的发生发展起着一定的保护作用,LRP5/6的缺失会加重骨关节炎的程度,同时细胞膜上LRP5/6的表达改变存在通过非Wnt/β-catenin信号通路的途径影响MMP13及Col2a的表达,通过对关节软骨合成代谢平衡的调节,从而在骨关节炎的发展中起到一定的保护作用。
[硕士论文] 刘培培
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:近年来,胃食管反流病(Gastro-esophageal reflux disease,GERD)内镜下治疗应用而生,其中内镜下射频消融拥有较长的治疗经验。国外研究显示,射频消融治疗安全、有效且耐受性良好,推荐作为GERD一种新的治疗方法。然而,国内目前关于射频消融治疗GERD的研究缺乏,并且中国人在生理特点方面同西方人存在差异。因此,我们开展本项单中心、前瞻性、自身对照性研究,评估我国GERD患者射频消融治疗的安全性和有效性。
  方法:研究选取2015年7月1日至2017年12月18日连续就诊于海军军医大学附属长海医院的GERD患者。详细记录患者的病史资料、手术过程、随访资料等。主要观察终点事件是胃食管反流病健康相关生存质量(Gastro-esophageal reflux disease health related quality of life,GERD-HRQL)和患者满意度的变化;次要观察终点事件是患者药物使用、食管酸暴露、食管下括约肌(lower esophageal sphincter,LES)静息压力、反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)的变化及治疗相关并发症,如出血、穿孔、疼痛等的发生情况。
  结果:31例患者接受射频消融治疗,其中2例患者术后失访,2例患者随访时间不足12个月。最终27例患者纳入分析,其中男性20例,女性7例。患者的平均年龄为49.56±12.31岁,平均病史时间为5.59±4.17年。主要观察终点事件方面,射频消融治疗后患者GERD-HRQL显著改善。治疗前GERD-HRQL评分在不用药状态下为20.22±9.44分,治疗后3个月GERD-HRQL评分为9.22±5.62分,6个月时为8.85±6.34,12个月时为7.44±6.27分(P<0.001)。进一步比较射频消融和药物的治疗效果,结果显示,射频消融治疗后患者GERD-HRQL评分的下降程度显著高于药物治疗后GERD-HRQL评分的下降程度(P=0.025),提示射频消融治疗效果优于药物治疗。另外,射频消融治疗前22例患者对症状控制不满意,5例感觉中等,而治疗后12个月时26(96.30%)例患者的满意度提高(19例满意,7例中等)。
  次要观察终点事件方面,首先射频消融治疗后服用药物的患者比例显著下降。治疗前27例(100%)患者均需要服用PPIs以控制症状,而治疗3个月后,20例(74.07%)患者药物使用减少,6个月和12个月时均有23例(85.19%)患者改善(P<0.001)。其次,射频消融治疗前17例患者存在RE(B级8例,A级9例),而射频治疗后6个月和12个月,分别有11和13例患者RE减轻或愈合(P<0.001)。此外,射频消融治疗后食管酸暴露显著下降。治疗前食管pH<4的中位时间百分比为8.00%(范围为:4.50%~59.30%),治疗后6个月时为3.40%(范围为:0.20%~25.10%),12个月时为2.80%(范围为:0.40%~26.00%)(P<0.001)。LES静息压在治疗后也显著增加,治疗前LES静息压为15.83±5.92mmHg,治疗后6个月和12个月分别为16.87±5.98mmHg和16.76±5.89mmHg(P<0.001)。1(3.70%)例患者术中创面出现少量渗血,予止血夹夹闭后出血停止。整个随访过程中无严重并发症发生。
  结论:射频消融治疗显著改善了GERD患者的生存质量,减少了PPIs的使用,改善食管黏膜炎症状况,降低了食管的酸暴露并提高了LES静息压。且该技术操作简单、并发症少,易于被患者接受,值得推广用于我国GERD患者的治疗。但本研究样本量少,应继续开展大样本临床研究,进一步评估射频消融的治疗效果和安全性并对射频消融与药物的治疗效果做进一步对比。
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