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[博士论文] 田斌
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的疾病,一直对全世界的公共卫生造成极大的威胁,并导致每年约59000死于狂犬病。狂犬病的致病原为狂犬病毒(Rabies virus,RABV),其逃逸宿主中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)天然免疫的机制目前仍未完全清楚。我们之前的研究发现,在小鼠和犬感染模型中,狂犬病毒实验室固定毒株(弱毒株)能够激活天然免疫反应,而野毒株则不能激活。星状胶质细胞是组成血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)的重要元件,其被证实可在中枢神经系统中通过激活天然免疫和调控BBB通透性来限制或清除病原微生物的感染,对中枢神经系统起到重要的保护作用。
  本文研究中,我们重点探索了星状胶质细胞在狂犬病毒感染时发挥的各方面功能。首先,为了验证本研究中所使用的狂犬病毒(DRV-AH08,简称DRV)具有野毒株的特性,我们建立了小鼠感染模型,发现DRV感染的小鼠死亡时间明显早于弱毒株B2c感染的小鼠,且DRV感染小鼠后并未表现出炎症反应和外周免疫细胞入侵中枢神经系统的现象,表明本研究中所使用的野毒株DRV具有野生型狂犬病毒的特性,符合后续实验需求。其次,我们分离、纯化和培养了原代星状胶质细胞(Primary astrocyte),并用DRV和B2c分别对原代星状胶质细胞进行感染,我们发现B2c表现为暂时性感染,而DRV则可以持续的感染星状胶质细胞。我们进一步比较了DRV和B2c感染星状胶质细胞后MAVS通路关键分子的表达水平,结果显示B2c感染后的MAVS通路激活水平显著高于DRV,且这种激活是由于病毒复制转录过程中产生的RNA引起的。因此,我们继续对狂犬病毒两种不同毒株感染星状胶质细胞后dsRNA的产生水平进行了分析,结果表明B2c感染星状胶质细胞后产生的dsRNA水平要明显高于DRV感染组。我们进一步利用MAVS和TLR7基因敲除小鼠进行了体内、体外的感染实验,发现B2c能够持续感染从MAVS基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,但依旧不能感染TLR7基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,验证了MAVS通路是狂犬病毒强弱毒株感染星状胶质细胞后产生差异的关键通路。此外,我们还发现B2c感染星状胶质细胞后产生的与MAVS通路相关的炎症因子要明显高于DRV,与DRV感染相比,狂犬病毒B2c感染星状胶质细胞后能够显著增加体外BBB模型对大分子物质的通透性,且B2c感染的星状胶质细胞培养上清能显著降解紧密连接蛋白ZO-1。
  总之,本研究发现星状胶质细胞在限制狂犬病毒感染中发挥这重要作用,具体表现在它可以通过活化MAVS通路产生IFN和ISG来直接限制狂犬病毒弱毒株的复制,同时可以产生大量的炎症因子促使BBB通透性增加来促进中枢神经系统中的病毒清除;与之相反的,狂犬病毒的野毒株在感染星状胶质细胞后则可通过限制dsRNA的产生来逃避MAVS通路的激活,从而实现持续性感染,不改变BBB的通透性,使病毒逃避被清除。本研究结果为阐明狂犬病毒的野毒株逃逸天然免疫的机制奠定基础,并对狂犬病的临床治疗提供了新的思路。
[博士论文] 雷卫强
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:寄生线虫不仅给养殖业造成严重的经济损失,而且还可以感染人,严重影响人类的健康。WHO组织评估全球有超过10亿人口感染寄生线虫,在伤残调整生命年中,寄生线虫的影响超过了糖尿病和肺癌患者。大规模和长期抗寄生虫药物的使用已经诱导出寄生虫抗药性的产生,因此新药的开发迫在眉睫,而新型抗寄生线虫药物以及疫苗的研发需要对寄生线虫发育过程中关键基因的功能进行深入研究。蛋白激酶在寄生线虫发育生物学和生殖发育学等过程中发挥着重要作用,以蛋白激酶作为药物靶标治疗疾病的研究已有报道,但在寄生线虫中的研究还寥寥无几。
  RIOK-2蛋白激酶是一种新发现的非典型蛋白激酶,在酵母和人细胞核糖体生物合成、细胞周期调节等过程中发挥着重要作用。尽管如此,该分子在线虫中的功能还所知甚少。本项目选取人兽共患寄生线虫粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)作为研究对象,从结构和功能两方面对粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2进行了研究;同时利用模式生物自由生活的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的转基因和RNAi技术研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ce-riok-2的功能。
  (一)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的结构分析
  本研究通过RACE-PCR获得了Ss-riok-2基因的cDNA序列,其中编码区为1572bp,共编码523个氨基酸。通过氨基酸比对发现编码的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能结构域。利用生物信息学软件对Ss-RIOK-2蛋白三级结构进行同源建模,预测了Ss-RIOK-2蛋白与ATP、金属离子结合的关键活性位点,为开发以RIOK-2蛋白作为潜在的抗寄生虫药物靶标奠定理论基础。通过Genomewalker PCR获得Ss-riok-2基因的gDNA,其长度为1620bp,包含一个48bp的内含子。预测的Ss-riok-2基因启动子序列全长1308bp,含有真核生物保守的调控元件。
  (二)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的表达、转录水平及定位分析
  体外原核表达和纯化了Ss-RIOK-2融合蛋白,进一步的激酶活性实验验证了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通过转录组分析,Ss-riok-2基因在虫体各个阶段都有转录且在寄生雌虫中最高。转基因实验表明Ss-riok-2基因启动子可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。
  (三)秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因的功能分析
  预测的Ce-riok-2基因启动子序列全长1269bp,转基因实验表明Ce-riok-2基因启动子也可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。当幼虫进入deaur时期时表达减弱。反转录PCR检测到Ce-riok-2基因在性腺组织中也有转录。通过dsRNA饲喂法干扰Ce-riok-2基因在秀丽隐杆线虫中的表达,结果导致Ce-riok-2基因转录水平下调,同时引起Ce-vit-2基因转录水平上调且导致虫体发生以下表型变化:1.虫体的发育减慢;2.虫体不育;3.虫体的阴门突出;4.成虫的性腺细胞减少和细胞大小紊乱。
  本研究首次研究了寄生线虫粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2基因的结构和功能,并验证了自由生活线虫秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上结果为进一步阐明RIOK蛋白激酶在秀丽隐杆线虫、粪类圆线虫及相关寄生线虫生长发育过程中的分子生物学功能奠定了基础。
[硕士论文] 刘志祥
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大脑作为人体最为复杂、精密的器官,由数百亿个神经元构成。单个神经元通过突触结构与其他神经元连接并形成具有功能的神经网络,从而赋予动物个体意识与行为。基于组织样本投入的传统建库测序技术会掩盖神经元彼此间存在的异质性,不适用于单神经元研究,同时,不同神经元的形态、功能以及基因表达存在的差异性由表观遗传因素所决定。因此研究提出了一种对单神经元示踪标记及其细胞核分离的研究方法,并选取表观遗传的重要形式——DNA甲基化作为研究对象。
  在对重组腺相关病毒(rAAV)的构建工作中,本课题首先构建了表达目的核膜蛋白的腺相关病毒重组载体pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag,分别用广谱启动子CMV和神经元特异性启动子hSyn在细胞系转染实验体外表达和鼠脑神经元活体表达表达目的核膜蛋白。构建载体被转染进HEK-293T细胞以进行验证,转染后的细胞通过荧光显微镜观察,可见荧光信号呈圆形分布、边缘更加明亮,说明目的核膜蛋白如预期实现核膜定位标记。但通过病毒鼠脑注射实验对所包装重组病毒载体进行验证,未能在脑切片上观察到荧光信号。由于可能存在因启动子差异或是实验操作因素造成阴性结果的可能,本研究也构建包装了腺相关病毒重组载体rAAV-hSyn-eGFP-NLS,并对其进行活体注射,在脑切片可观察到大量被荧光标记的神经元,成功实现对海马投射内嗅皮层神经元的逆向标记,从而排除上述可能性。
  在分离被标记细胞核的研究过程中,本课题通过细胞转染的方式模拟被重组病毒标记的神经元。研究过程中,首先对转染后的细胞进行匀浆处理及密度梯度离心,以分离细胞核。分离到的细胞核形态完整且杂质较少。之后通过免疫共沉淀的方式对被标记细胞核细胞核进行捕获,所捕获细胞核阳性率约为70%,捕获率在65%~85%。同时对照组阴性细胞核漂洗后的残留率仅为0.18%,因此可认为实验组中阴性细胞核已基本漂洗干净,该实验方法可己满足后续研究需求。
  在利用单细胞进行DNA甲基化测序建库的研究过程中,本课题参照单细胞亚硫酸盐测序(scBS-seq)的方法,先后分别以寡量细胞及单个神经元作为建库投入,成功获得DNA甲基化测序建库。所建文库经琼脂糖凝胶电泳检测,文库片段分布大小与预期相符(300bp~500bp),同时条带明亮,满足上机测序要求。同时对测试样本的测序结果进行生物信息学分析,发现文库测序质量较好,且组间因建库操作造成的差异较小,因此认为该方法具有较好的可重复性。
  针对本课题所遇到AAV载体装载容量受限的问题,本文最后还对如何现有提高AAV装载容量的研究进行论述,并提出对衣壳蛋白编码基因cap进行人工进化的改进的新思路。此外也单细胞DNA甲基化测序技术在医学检测中的应用进行论述。
[硕士论文] 胡锦阳
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)是一种常见且分布广泛,危害严重的肠道寄生线虫,主要感染犬、人和其它灵长类动物。由于粪类圆线虫独特的生活史,它可以在宿主体内和体外进行交替繁殖。同时粪类圆线虫自由生活雌虫具有性腺合胞体结构,与雌雄同体的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)结构非常相似,因此可以将转基因质粒显微注射至其性腺,达到研究其基因的目的。针对寄生线虫,目前没有有效的疫苗,只能依靠化学药物进行杀灭和控制。但是由于几十年来重复使用几种常用杀虫药物,使得虫体对其产生了耐药性,因此开发抗寄生线虫疫苗和寻找新的潜在的药物作用靶点迫在眉睫,而转基因技术则是应用于研究寄生线虫基因功能所必须的一种重要工具。
  起源于细菌和古细菌经过长期适应性免疫逐步形成的Ⅱ型成簇的有规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9(Cas9),CRISPR/Cas9],配合向导RNA(gRNA)成为CRISPR/Cas9系统,近年来被改造成为基因组高效定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、修饰效率高、成本低廉和适用于多种真核、原核生物等多种优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。目前CRISPR/Cas9遗传修饰技术在非寄生性的秀丽隐杆线虫中有很多应用,近几年来,该系统也己应用于在几种寄生原虫中。但是,CRISPR/Cas9是否能在寄生线虫中运用,并研究打靶基因的功能仍然是未知数。为此本课题主要进行了以下几个方面的研究:
  (1)改进和优化长爪沙鼠、建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型
  本实验对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,包括感染所使用的iL3数量(从1000条降至170条),缩短粪便的排虫时间(从35天缩短至11天),提高了感染率(从6.5%提高至77.8%),使粪类圆线虫感染长爪沙鼠实验动物模型更加适应我们的研究目的。同时首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型,DAPI染色寄生雌虫并观察细胞状态,测定宿主感染前后血液生理,血清生化等多个指标,发现阳性相比阴性嗜酸性细胞百分比增加,血红蛋白和红细胞计数都出现下降,说明虫体成功感染宿主并引起了宿主出血。对感染的比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠的十二指肠进行组织病理检查,可以观察到虫体。对沙鼠体内的寄生雌虫(PF),自感染三期(L3a),后寄生四期(PL4)进行形态学描述。
  (2)粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究
  以Ss-rps-21为启动子,构建表达GFP的转基因质粒pAJ20,用来分别注射自由生活的雌性成虫和雄性成虫。首先尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺,观察到P0代的性腺和子宫内的卵表达了GFP蛋白,其F1代L1全身广泛表达GFP蛋白,并且在其生殖原基(GP)处表达量最高。接着尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活雄虫的睾丸,然后挑野生型雌虫与其交配,观察其后代表型。经过不断尝试虫体发育时期、注射部位和质粒浓度,发现虫体在体外23.5℃温箱发育40h,注射部位在雄虫咽部下方,质粒浓度为900-1000ng/ml时,可以观察到F1代L1表达GFP蛋白,虽然也是全身广泛表达以及在生殖原基处表达量较高,但是在虫体的头部和咽部表达量也较高。
  (3)CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用
  本实验统计粪类圆线虫密码子使用情况,并分析了其使用密码子的偏好性,对CeCas9蛋白进行了优化,使其更好的在粪类圆线虫体内表达。在Wormbase上找到15个鼠类圆线虫(Strongyloides ratti)U6基因,多序列比对它们的蛋白序列,找到相对保守的位点,然后再往其上下游延伸,得到512bp大小的序列作为gRNA的启动子。同时利用软件和文献报道的规律设计8条gRNA打靶于Ss-dpy-2第一个外显子。为了验证软件设计的8条gRNA是否具有良好的打靶效率,做了spCas9/gRNA体外酶切效率检测实验,发现gRNA4、7和8切割效率较高。为了验证经优化的SsCas9和gRNA是否都在粪类圆线虫发生转录,我们将pAJ50-Cas9质粒和pXL-BACII-gRNA4显微共注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺中。提取后代虫体的RNA进行反转录PCR扩增。发现扩增得到SsCas9和gRNA片段,说明SsCas9和gRNA完成了转录,也表明构建的质粒的启动子Ss-rps-21和Sr-U6具有催化转录活性。我们针对gRNA4、7和8这3个打靶位点,构建相应的同源修复模板。将pAJ50-Cas9分别与pXL-BACII-gRNA4、pXL-BACII-gRNA7和pXL-BACII-gRNA8及其相应的同源修复模板进行显微共注射,提取后代的基因组,进行巢式PCR扩增鉴定,凝胶电泳没有发现扩增条带。扩增Ss-dpy-2第一个外显子测序,没有杂峰现象,说明Ss-dpy-2没有发生突变,CRISPR/Cas9系统仍然需要进一步探究。
  本研究对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型。通过粪类圆线虫雄虫的生殖细胞实现转基因,并解析Ss-rps-21启动子通过雄虫生殖细胞进行转基因F1代的表达谱。初步尝试构建适用于粪类圆线虫的CRISPR/Cas9系统,验证了Ss-rps-21和Sr-U6启动子活性,为后续的粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立奠定了坚实的基础。
[硕士论文] 李彬酉
兽医公共卫生与食品安全 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一类特殊的人兽共患和食源性病原菌,它存在于正常的肠道菌群中,但却能够导致机体其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生儿脑膜炎等,严重威胁着人和动物的健康。有效疫苗的缺乏、耐药性的增加和生物被膜的形成给ExPEC防控带来了巨大的困难。
  生物被膜(Biofilm)是细菌的一种特殊生存形式。与浮游菌不同,生物被膜能够抵御机体的免疫清除作用,导致抗生素和消毒剂的作用效果下降,引起机体感染的反复发生。在食品加工设备和食品原料表面的生物被膜给食品安全造成严重危害。因此,研究生物被膜形成机制和控制对策具有重要意义。
  外膜蛋白TolC是构成革兰氏阴性菌外排泵的重要的成分,是细菌对多种抗菌药的抗性的重要原因。本实验室前期研究表明TolC蛋白缺失会造成ExEPC在M9高渗培养基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,转录组学分析发现TolC缺失后会引起Cpx双组份系统周质间隙蛋白CpxP编码基因的上调表达。Cpx双组份系统可响应细菌对高渗信号的识别,激活后能够抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系统可能在tolC缺失后影响ExPEC生物被膜形成中发挥作用。本研究通过对ΔtolC菌株中Cpx双组份系统感应蛋白CpxA和效应蛋白CpxR进行突变,探究其在ΔtolC菌株影响生物被膜形成中的作用。主要研究内容和结果如下:
  1.基因缺失菌株的构建
  设计引物以ExEPC PPECC42基因组为模板扩增cpxA上下游同源臂,并通过Overlap PCR方法连接,将同源臂插入自杀性载体pRE112,转化大肠杆菌x7213感受态细胞构建x7213-pRE-ΔcpxA。并以此为供体菌,分别以ExEPC PPECC42野生株及ΔtolC株为受体菌进行同源重组,利用Cm和SacB筛选得到ΔcpxA基因缺失株和ΔtolCΔcpxA双基因缺失株。利用同样方法,构建ΔcpxR基因缺失株和ΔtolCΔcpxR双基因缺失株。
  2.回补菌株和CpxA磷酸化位点定点突变菌株的构建
  以PPECC42基因组为模板,设计引物扩增cpxA基因全长,并插入pHSG396质粒,构建pHSG-cpxA表达载体,电转化至ΔtolCΔcpxA菌株中,构建回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA。运用同样的方法构建出Cm-R-ΔtolCΔcpxR。
  通过预测和翻译分析,找出CpxA磷酸化位点对应的核酸序列位点,设计点突变引物以pHSG-cpxA质粒为模板扩增出突变的质粒,测序鉴定后电转化ΔtolCΔcpxA菌株中,以构建CpxA磷酸化位点突变菌株M-A-ΔtolCcpxA。
  3.实验菌株的部分生物学特性研究
  首先测定试验菌株的生长情况,在M9和1/2M9培养基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失对ExPEC的生长速率无影响,试验菌株在8h后可以达到稳定期。
  其次使用7种抗菌药测定了试验菌株的MIC,结果表明ΔtolC和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR菌株对氯霉素和环丙沙星的敏感性显著升高,而cpxA和cpxR单缺失对这7种抗菌药的敏感性并未发生明显变化。
  4.试验菌株生物被膜形成能力分析
  使用结晶紫染色法测定试验菌株生物被膜形成能力,发现在M9高渗培养基中与WT相比ΔtolC菌株生物被膜形成能力显著下降;双基因缺失株ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR与WT相当;回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA和Cm-R-ΔtolCΔcpxR生物被膜形成能力恢复到ΔtolC的水平;M-A-ΔtolCΔcpxA生物被膜形成能力与WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培养基中均无差异。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培养基中试验菌株的生物被膜形成能力与M9中类似。
  5.扫描电子显微镜观察生物被膜细菌微观形态
  使用扫描电镜观察试验菌株生物被膜细菌微观形态发现在1/2M9+0.06mol/LNaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高渗培养基中ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈现与WT相似大量黏附于玻片表面,且菌体之间存在大量黏连,但ΔtolC菌株在玻片上黏附较少,细菌菌体之间黏连情况也较少。
  6.Curli菌毛合成能力分析
  刚果红平板试验表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培养基中,ΔcpxA和ΔcpxR单基因缺失突变株和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR双基因缺失株能够形成与野生型菌株WT类似的rdar菌落形态,而Cm-A-ΔtolCΔcpxA、Cm-R-ΔtolCΔcpxR的菌落形态与ΔtolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA则可以形成与WT类似的菌落。在1/2M9-CR平板上试验菌株的菌落形态均与WT相似。这表明Cpx双组份系统确实在高渗条件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的过程中发挥了作用,而且是通过抑制Curli菌毛合成而影响的。
[硕士论文] 李娜
生物医药工程 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在Aβ25-35诱导人源性SH-SY5Y损伤细胞上,筛选能差异化表达并与MRTF-A相关的miRNA,探讨MRTF-A介导miRNA对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制。
  方法:
  1.在Aβ25-35诱导SH-SY5Y损伤细胞模型中,用基因芯片筛选与MRTF-A调控相关的miRNA:建立细胞模型;细胞分组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理,24h后,用western blot方法检测MRTF-A的蛋白表达水平,并提取RNA。用Agilent RNA6000Nano/Pico Assay法检测各组RNA质量合格后,使用miRNA OneArray芯片技术分析各组中发生显著差异变化的miRNA。得到各组显著变化的miRNA,再通过各组间相互比较得到MRTF-A调控的miRNA。筛选出差异性表达最为显著的miRNA,并用RT-qPCR检测MRTF-A对目标miRNA的调控作用。
  2.MRTF-A对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制:
  1)MRTF-A对细胞自噬的影响:实验分为4组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  2)miR-1273g-3P对细胞自噬的影响:实验分为4组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic,miR-1273g-3p mimic control+Aβ25-35,miR-1273g-3pmimic+Aβ25-35)。转染miR-1273g-3p48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白检测LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  3)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p有关:实验分为5分组(control,Aβ25-35,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予Aβ25-35处理24h后,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  4)miR-1273g-3p对靶基因mTOR的作用:采用mirwalk、targetscan软件预测其靶基因,并验证其对靶基因(自噬上游靶基因)mTOR表达的影响。实验分为2组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic);转染miR-1273g-3p mimic48h后,提取RNA和蛋白,分别检测mTOR蛋白表达水平。
  5)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p抑制mTOR有关:实验分为5组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3pinhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测mTOR的蛋白表达水平。
  结果:
  1.基因芯片筛选miRNA:在给予Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,MRTF-A蛋白表达水平明显降低,转染MRTF-A质粒使细胞过表达MRTF-A,将各组通过RNA质检的RNA进行miRNA基因芯片杂交,依据|Fold change|≧0.585且P-value<0.05的条件筛选条件,共筛选出295个显著差异的miRNA。将得到的295个miRNA在各组间交集比较,共得到8个与MRTF-A调控相关的miRNA;其中上调的有miR-1273g-3p,下调的有hsa-miR-6772-3p、hsa-miR-6736-3p、hsa-miR-6740-3p、hsa-miR-7106-3p、hsa-miR-6747-3p、hsa-miR-6776-3p及hsa-miR-3653-5p。我们选择上调明显的miR-1273g-3p,用RT-qPCR验证显示MRTF-A能明显上调miR-1273g-3p的表达,与芯片结果一致。
  2.MRTF-A调控miR-1273g-3p促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生:结果显示,在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,过表达MRTF-A能明显增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,说明MRTF-A促进经Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,转染miR-1273g-3p mimic也能明显促进LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,表明miR-1273g-3p也能够促进自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,共转染MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达较单转MRTF-A有明显降低,提示miR-1273g-3p参与了MRTF-A促进自噬的的作用。
  3.MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现:利用mirwallk、Targetscan软件总共预测到1090个miR-1273g-3p靶基因,并找到负性调控自噬的靶基因mTOR。RT-qPCR和western blot结果显示,单转miR-1273g-3p能明显抑制了mTOR的mRNA和蛋白表达水平;另一方面,单转MRTF-A也能抑制mTOR的表达,而共转MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后能逆转MRTF-A对mTOR表达的上调,提示MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现。
  结论:
  MRTF-A能够促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生,而miR-1273g-3p通过抑制mTOR的表达促进细胞自噬的发生;另一方面,MRTF-A能够上调miR-1273g-3p的表达,MRTF-A促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬可能与其上调miR-1273g-3p抑制mTOR的表达相关。
[博士论文] 沈奇骢
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:表观转录组学(Epitranscriptome)是生命科学领域新兴的前沿研究热点,主要关注各种RNA水平的修饰,及其在细胞转录组中的分布和表观调控作用,如近年来被广泛研究的6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)修饰在生理状态下存在于包括mRNA的多种RNA中。然而作为一种可逆的化学修饰,其动态调控机制还不清楚,特别是还没有发现其特异性的去甲基化酶。另外,作为一种在哺乳动物RNA中普遍存在的修饰方式,其生理和病理功能尚不清楚,特别是其在基因表达调控中的功能尚有待于深入研究。研究mRNA中5-mC的调控及其功能是表观转录组的一个重要方向。Tet蛋白(Ten-eleven Translocation,Tet)作为DNA甲基化的氧化酶,也能够在体外氧化RNA中5-mC。Tet蛋白是否在哺乳动物细胞中调控mRNA中的5-mC修饰,其在不同的生理过程中发挥着怎样的调控作用?这些科学问题有待进一步研究。
  天然免疫是抵御病原体的第一道防线,如何快速高效的识别和清除病原体,并维持免疫稳态,是天然免疫的根本科学问题。病原体感染激活免疫系统,诱导炎症反应,产生各种细胞因子进一步动员造血干细胞向髓系细胞分化,放大天然免疫应答效应是机体快速清除病原体的重要手段。髓系发生(Myelopoiesis)是急性或慢性感染的关键应答反应,其表观遗传学机制尚未见报道,值得探究。Tet2不仅在造血干细胞的自我更新和分化中发挥着重要的调控作用,多项研究也发现Tet2在造血系统多种恶性肿瘤中存在多位点突变,且Tet2基因突变导致的催化功能缺失与造血系统恶性肿瘤的发生发展密切相关,特别是在髓系恶性肿瘤中,表明Tet2可能是一种重要的抑癌基因。此外,Tet2在炎症消退过程中也发挥着重要的调控作用。Tet2是否也参与病原体感染诱导的髓系免疫细胞分化还有待研究。
  本课题围绕Tet2是否参与感染诱导的髓系发生及其表观调控机制展开研究。发现,Tet2能够通过抑制Socs3的mRNA水平而促进脓毒症感染和寄生虫感染诱导的髓系免疫细胞的分化扩增。Tet2通过Adar1抑制Socs3的表达,Adar1通过结合双链RNA并以RNA编辑非依赖的方式降低Socs3mRNA的稳定性。进一步机制研究发现Tet2抑制了mRNA上5-mC的水平,Tet2缺失导致Socs3mRNA3'-UTR区域5-mC水平上升,可能通过5-mC特异性的结合蛋白影响该区域RNA双链的形成,从而减少Adar1的结合。本研究揭示了DNA甲基化氧化酶Tet2分子能够促进感染诱导的髓系天然免疫细胞的发生,从而促进机体对病原体的抵抗能力,为机体抵抗病原体感染的效应机制提出了新观点,也为有效防治感染性疾病提供了新思路和潜在药物研发靶标。同时,Tet2一直被认为是通过调控染色质状态来介导基因转录水平的调控,而本研究首次提出了Tet2作为RNA结合蛋白能够在mRNA修饰水平参与转录后调控的全新功能,为进一步研究Tet2的生理病理功能开辟了新的研究方向。
  第一部分 Tet2通过抑制Socs3的表达而促进感染诱导的髓系免疫细胞分化
  在病原体感染过程中,机体需要从骨髓大量动员免疫细胞到外周血,以快速高效地清除入侵的病原体。同时,刺激造血的细胞因子以及炎性细胞因子促进了更多髓系细胞的发生。为了观察Tet2在此过程中的作用,首先构建了盲肠结扎穿孔诱导脓毒症的小鼠模型,发现Tet2缺失显著降低小鼠脓毒症CLP模型的死亡率和临床评分,其原因主要是Tet2缺失使得髓系终末细胞的动员显著降低而避免了炎症因子风暴导致的组织器官损伤;另外还构建了血吸虫感染(慢性感染模型)诱导肥大细胞分化扩增的模型,发现Tet2缺失也能够抑制寄生虫感染诱导的肥大细胞的分化。说明Tet2在病原体感染诱导的髓系细胞分化中起着关键作用。为了进一步探究Tet2促进髓系发生的分子机制,对野生型和Tet2敲除的骨髓来源的肥大细胞进行了表达谱分析,发现PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路的多个基因在Tet2缺失细胞中表达有显著变化,其中包括JAK-STAT信号通路的关键抑制分子Socs3。进一步检测发现Tet2敲除的造血祖/干细胞和肥大细胞中IL-3诱导的Socs3mRNA和蛋白水平显著增高,并且Tet2敲除细胞中,IL-3信号通路活化障碍,STAT5和AKT的磷酸化水平降低。而在Tet2敲除的细胞中通过siRNA沉默Socs3的表达后,IL-3信号通路活化水平有所恢复。这些结果提示Tet2通过抑制Socs3的表达,从而促进IL-3等细胞因子信号通路的活化,这可能是Tet2促进病原体感染诱导髓系免疫细胞发生的关键机制。
  第二部分 Tet2通过Adar1在转录后水平抑制Socs3的表达
  进一步研究Tet2抑制Socs3表达的分子机制,发现Tet2抑制Socs3的表达并不是通过调控Socs3基因区的DNA甲基化水平,而是在转录后水平。这一结果提示了Tet2作为一种RNA结合蛋白可能具有广泛的转录后调控功能。通过构建紫外交联免疫共沉淀结合高通量测序体系,在全基因组范围内寻找Tet2结合的靶RNA分子。结果发现Tet2结合的RNA种类中,80%属于已知基因转录的mRNA,其中包括Socs3的3'-UTR区域。同时在RNA-seq数据中,发现野生型对照组中A-to-G突变的数目显著高于Tet2敲除组,且更多富集于mRNA的3'-UTR区。Socs3mRNA的3'-UTR区域也包含A-to-G突变位点。Adar1结合双链RNA并介导A-to-I编辑,提示Adar1可能参与这些位点的编辑。在野生型细胞中干扰Adar1后Socs3表达上升,但报告基因结果显示Adar1对Socs3的调控不依赖其酶催化活性。有文献报道Adar1能够其他RNA结合蛋白在转录后水平调控基因表达,而不依赖其RNA编辑功能。通过免疫共沉淀联合质谱检测发现,Adar1能够与调控mRNA稳定性的RNA结合蛋白结合,可能通过这些蛋白发挥抑制Socs3的功能。通过进一步探究Tet2在Adar1介导的Socs3抑制功能中的作用,发现在Tet2敲除细胞中干扰Adar1不能升高Socs3的表达,结合过表达实验发现,Tet2以酶活性依赖的方式促进Adar1对Socs3表达的抑制作用,而同时又不依赖于其DNA结合功能。
  第三部分 Tet2通过抑制mRNA中5-mC的水平而参与Socs3的转录后抑制
  Tet2能将DNA上的5-mC催化氧化成为5-hmC,同时,RNA上的5-mC修饰也被发现存在果蝇和人类细胞系中。为了研究Tet2能否通过氧化的方式降低mRNA中5-mC,构建了Tet2体外催化体系,通过质谱和点杂交检测发现Tet2能够在体外和体内以底物依赖的方式降低mRNA上的甲基化修饰水平,并且在Tet2敲除细胞中,发现mRNA上的5-mC修饰水平升高。而野生型细胞中胞嘧啶上的其他甲基化氧化修饰5-hmC、5-fC和5-caC的含量则很低。通过建立RNA甲基化组分析,发现在mRNA上存在5-mC修饰,且在Tet2敲除细胞中5-mC水平显著升高。以上结果说明Tet2能够以氧化依赖的方式抑制mRNA上5-mC的水平。进一步实验发现5-mC的存在能够抑制Adar1与其靶RNA的结合。DNA或者RNA的修饰能够招募特异性蛋白发挥表观调控功能,通过RNA5-mC结合蛋白实验分析,发现5-mC能够结合一些ATP依赖的RNA解旋酶,这些蛋白跟RNA二级结构的改变和双链解旋有关,而Adar1结合双链RNA。以上结果说明mRNA上的5-mC修饰能够抑制Adar1功能,可能是通过抑制双链RNA的形成使Adar1结合减少的原因。
  综上所述,Tet2能够通过氧化依赖的方式降低mRNA上5-mC修饰的水平,Tet2的缺失使mRNA上5-mC修饰的水平升高,从而抑制Adar1的功能。发现Tet2可能通过抑制5-mC水平促进双链RNA的形成,而双链RNA是Adar1结合所必需的。结合野生型和Tet2敲除细胞中转录组突变位点的对比分析,也揭示了Tet2和Adar1功能上的广泛联系。此外,还发现,内源性mRNA上5-hmC的数量远远少于5-mC,说明从5-hmC如何转换为未甲基化的胞嘧啶需要其他的酶或者更多催化步骤。Tet2在转录后水平降低JAK-STAT信号通路的关键负调控分子Socs3的mRNA的稳定性,维持了细胞因子如IL-3信号通路的持续活化,促进了病原体感染诱导的髓系天然免疫细胞的分化,为抗感染免疫的表观调控提供了新的机制。
[硕士论文] 陈翔
口腔医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  上颌第三磨牙萌出时间较晚,而且位于上颌牙弓最末端,往往由于萌出空间不足而埋伏或阻生,常引起一系列的并发症。在临床上处理其根管时多面临视野不佳、操作难度大、根管形态结构变化大及牙根存在弯曲等因素而影响治疗效果,故一般建议拔除。上颌第三磨牙拔除术虽相对简单,但由于其解剖结构变异性大,仍有可能发生严重的并发症。同时随着口腔技术的提高与器械材料的发展,将上颌第三磨牙作为自体牙移植供牙、作为基牙修复邻近牙缺失,甚至纳入正畸范畴的技术广泛应用于临床,对上颌第三磨牙进行根管治疗也成为常规操作。无论是上颌第三磨牙拔除术或是对其进行根管治疗都需要医师对上颌第三磨牙的解剖学结构熟悉掌握。锥形束CT(cone beam computed tomagraphy,CBCT)可构建高精度的三维影像,且属于非侵袭性操作,近年来在阻生牙拔除术术前检查及根管系统研究中应用较多。本研究通过CBCT对上颌第三磨牙解剖学结构进行观测及分析,以期为各种临床操作尤其是以上颌第三磨牙为供体的自体牙移植术提供参考依据,以达到提高诊疗效果的目的。
  方法:
  回顾性分析本院口腔种植门诊2016年2月~2017年2月收治的620例患者的第三磨牙(708颗)CBCT的影像学资料。数据经由计算机软件导入,观察第三磨牙两侧牙根数目、根管形态分类、根管类型分布等数据,并分析上颌第三磨牙根管数目与性别的关系、牙根与上颌窦窦底的关系(A类:牙根根尖和上颌窦窦底处于同一水平;B类:牙根根尖水平比上颌窦窦底高;C类:牙根根尖水平比上颌窦窦底低)。采取SPSS21.0统计学软件对所得数据进行统计学分析。通过本次研究结果作为解剖学的依据,来指导临床进行以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植手术。
  结果:
  708颗上颌第三磨牙牙根数目方面,三根牙占40.40%,其次依次是融合根牙占39.26%,双根牙占18.36%,四根牙占1.98%;按照左右位置的不同可分为:三根牙(左侧占40.11%,右侧占40.69%)最多,融合根牙(左侧占38.44%,右侧占40.11%)次之,后面依次是双根牙(左侧占18.94%,右侧占17.77%)与四根牙(左侧占2.51%,右侧占1.43%),左右两侧牙根数目比较差异无统计学意义(P>0.05);
  708颗上颌第三磨牙根管形态分布方面,三根管占48.73%,其次依次为单根管占27.12%,双根管占17.09%,四根管占7.06%;单根管的男性占26.94%,女性占27.30%;双根管的男性占17.22%,女性占16.95%;三根管的男性占48.33%,女性占49.14%;四根管的男性占7.50%,女性占6.61%,男、女上颌第三磨牙根管形态比较差异无统计学意义(P>0.05);
  低位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占15.29%、4.55%、80.16%,中位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占33.19%、10.21%、56.60%,高位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占55.84%、14.72%、29.44%。
  上颌第三磨牙萌出方向为垂直位关系的数量最多,占72.04%,其中腭向倾斜位较为少见,仅为2.41%;萌出方向为远中位关系的牙齿数量其次,占22.88%;萌出方向为近中位关系的数量最少,占5.08%。
  上颌第三磨牙各侧骨壁中腭侧的厚型骨壁的数量最多,占55.80%;远中骨壁的厚型骨壁数量最少,占15.12%。
  在以CBCT提供的上颌第三磨牙的解剖学资料的指导下,将其作为供牙的自体牙移植术成功率较高。
  结论:
  上颌第三磨牙的解剖形态与位置复杂多样且变异较大,运用CBCT可明确了解其牙体形态和与相邻解剖结构之间的关系,能为阻生牙拔除术提供重要的指导并减少并发症的发生;同时通过CBCT对上颌第三磨牙根管形态的研究,能指导临床医师了解上颌第三磨牙根管形态的类型,明显提高对其根管治疗的成功率。因此能提高以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植术及其他临床治疗的成功率。
[硕士论文] 卢光照
药剂学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着科学技术的发展,研究者针对肿瘤微环境探索出许多微环境特定响应型药物载体——刺激响应性载体,刺激响应性载体包括pH响应性载体、还原响应性载体、光响应性载体、超声响应性载体、磁场响应性载体和热响应性载体以及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)响应载体。ROS响应性载体已成为近年来药物载体研究的热点,相继出现了含硫多聚物ROS响应性载体、含硒多聚物ROS响应性载体、含碲多聚物ROS响应性载体和含不饱和磷脂ROS响应性载体等。在众多的ROS响应性载体中,含不饱和磷腊ROS响应性载体最具发展潜力,不饱和磷脂能被1O2快速氧化,从而实现载体中药物的快速释放。然而在具有多个病理情况时,单一地依靠ROS响应性载体并不能保证药物在特定部位释放,而光敏剂在光照后可以产生1O2,含不饱和磷脂载体能够实现1O2为基础的ROS响应。
  ROS响应脂质体材料DLPC是一种不饱和磷脂,具有四个不饱和双键,具有很强的ROS响应活性。PdPC(OBu)8是一种高效光敏剂,在光照的情况下可以产生大量1O2,能使不饱和磷脂快速氧化。光敏剂在特定波长光照射下能产生1O2,1O2不仅具有氧化不饱和磷脂的特性,而且具有光动力治疗的作用,从而改善ROS响应脂质体的治疗效果。
  因此,本研究设计并研究载光敏剂ROS响应性载体,以二亚油酰磷脂酰胆碱(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DLPC)为ROS响应材料,1,4,8,11,15,18,22,25-八丁氧基酞菁钯[1,4,8,11,15,18,22,25-octabutoxypalladium phthalocyanine,PdPC(OBu)8]为产生1O2的光敏剂,构建以DLPC为响应物质的光敏ROS响应脂质体(LPD),探究LPD的体内外抗肿瘤活性。
  首先,合成了光敏剂PdPC(OBu)8并进行了结构鉴定,然后建立了盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride,DOX)和PdPC(OBu)8的含量检测方法。采用荧光分光光度法测定DOX含量,DOX浓度在1-20μg·mL-1时,线性回归方程为F=8.9337C+0.2412(R2=0.9995)。然后对DOX的HPLC方法进行了探索,DOX线性范围浓度为0.2-25μg·mL-1,线性回归方程为A=0.4494C+0.0100(R2=1)。采用紫外可见光分光光度法测定PdPC(OBu)8的含量,PdPC(OBu)8浓度在2-12μg·mL-1时,线性回归方程为A=0.0823C+0.0157(R2=0.9994)。本文还对PdPC(OBu)8的HPLC检测方法进行了探索,PdPC(OBu)8线性范围浓度为0.5-20μg·mL-1,线性回归方程为A=0.1002C-0.0054(R2=1)。
  其次,进行了LPD的处方筛选及表征。LPD的最优处方为DLPC用量为5%,胆固醇用量为40%,DSPE-PEG2000用量为5‰DSPC用量为50%(摩尔比),PdPC(OBu)8投药量为药脂比(m∶m)1∶200。LPD粒径为(169.3±1.2)nm,PDI为0.198±0.003,粒径均匀,分散性良好,zeta电位为(-39.8±0.8)mV。PdPC(OBu)8的包封率约为(84.43±3.12)%,载药量为(0.42±0.01)%。DOX的包封率为(91.03±3.33)%,载药量为(9.84±0.40)%。LPD具有良好的储存稳定性和良好的血清中稳定性。实验表明LPD在未光照的情况下,药物基本不释放;在光照(730nm,300mW·cm-2)的情况下,照射5min药物释放率达到(95.5±2.5)%(P<0.05),说明LPD具有ROS响应快速释放药物的特性。LPD光照前不产生1O2,光照(730nm,300mW·cm-2,3min)后产生大量1O2,因此LPD在光照时实现ROS响应。
  再次,以乳腺癌MCF-7细胞为模型细胞,探索了LPD的体外抗肿瘤活性研究。实验发现光照强度对MCF-7细胞没有毒性。PdPC(OBu)8脂质体(LP)在未光照前对MCF-7细胞具有较弱的毒性,光照(730nm,1200mW·cm-2,3min)后细胞毒性显著增强。LPD可以促进DOX在MCF-7细胞中的摄取,并且DOX经细胞摄取后主要分布于溶酶体。LPD进入细胞是通过小窝蛋白介导的能量依赖型内吞途径,并且LPD在活细胞内能产生少量ROS,光照(730nm,1200mW·cm-2,3min)后产生大量ROS。
  最后,以乳腺癌MCF-7细胞为模型细胞,以裸鼠为模型动物,探索了LPD的体内抗肿瘤活性研究。DOX的HPLC-MS分析方法特异性良好,线性范围在1-1000ng·mL-1,线性回归方程为ADOX/ADNX=0.0003C+0.0116,R2=0.9986,具有良好的基质效应和提取回收率,具有较好的准确度和精密度,因此,该DOX的HPLC-MS分析方法可以作为DOX药代动力学的检测方法。游离DOX的半衰期为1.42h,LPD的半衰期为7.16h,是游离DOX半衰期的5.04倍,具有显著性差异;非ROS响应脂质体(HPD)的半衰期为11.39h,是游离DOX半衰期的8.02倍,具有显著性差异;表明LPD与HPD均可以延长DOX的半衰期。相对于游离DOX,LPD具有清除率小,AUC大的特征。载Amplex UltraRed光敏ROS响应脂质体(LPU)在不光照时,经活体成像扫描发现肿瘤部位没有荧光,脂质体给药后光照(730nm,1200mW·cm-2,5min),经扫描发现肿瘤部位具有明显的荧光,表明LPU光照后能够产生ROS。游离DiR在肝、脾具有明显荧光,表明游离DiR主要分布在肝、脾部位。载DiR光敏ROS响应脂质体(LDiR)在肝、肿瘤具有明显荧光,表明DiR主要分布在肝、肿瘤部位。因此,说明LPD具有被动靶向性。空白脂质体(BP)和LP无抗肿瘤活性。游离DOX、DOX脂质体(LD)、光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的DOX脂质体(LD+hv)以及LPD具有相似的抗肿瘤活性,光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的LP具有较好的抗肿瘤活性,说明光照显著增强LP的抗肿瘤活性。光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的LPD(LPD+hv)具有最为显著的抗肿瘤活性,原因可能是DOX的化疗作用与PdPC(OBu)8光照产生的单线态氧光动力治疗的联合作用。未光照处理的HPD具有抗肿瘤活性,光照(730nm,1200mW·cm-2,5min)后抗肿瘤活性增强。然而LPD未光照时就具有与HPD光照后相似的抗肿瘤活性,光敏ROS响应脂质体光照(730nm,1200mW·cm-2,5min)后抗肿瘤活性显著增强。因此光敏ROS响应脂质体光照后具有最为显著的抗肿瘤活性。
  总之,本研究初步证明了LPD具有ROS响应特性,能够增强细胞毒性,增强细胞摄取,在动物体内的靶向特征明显,体内抗肿瘤活性显著,同时具有光动力治疗、化疗与光敏释药的作用,具有较好的发展前景。此外,LPD制备过程简单,对纳米药物产业化具有一定的指导意义。
[硕士论文] 蔡晓敏
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  由于上颈椎周围的神经血管结构复杂,上颈椎前外侧入路手术在技术上要求很高。临床上可以采取高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)处理上颈椎病变。上颈椎前外侧入路的解剖结构对于进行安全的上颈椎手术至关重要,通过以上两种入路显露上颈椎,记录入路中遇到的重要解剖结构,并对比两种入路区别。
  研究方法:
  使用经10%福尔马林充分固定的颅颈完整的成人湿性尸体标本10具,对左右侧均先进行高位颈前咽后入路解剖,显露上颈椎,而后模拟标准颈前路显露上颈椎,获得共20组数据。在解剖过程中,记录所有解剖标志、重要的神经血管结构,特别是限制暴露的结构。测量神经血管结构出动脉鞘和入内脏鞘点至喉结的垂直距离、直接距离等解剖数据,分析他们与颈椎体、椎间盘解剖关系,并对比两种入路中区别。最后将数据进行统计学分析。
  研究结果:
  1、上颈椎前外侧入路中的重要神经血管结构,不存在左右侧显著性差异;舌下神经、喉上神经等是限制暴露的主要结构。2、有4例喉结相当于C5水平。3、舌下神经和舌动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,鞘膜之间走行部分大多位于枢椎水平。喉上神经内支与喉上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C3,入内脏鞘点大多位于C4。喉上神经内支和舌下神经伴行的垂直距离及直接距离具有显著性差异。喉上神经外支与甲状腺上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C4,入内脏鞘点大多位于C5,与喉结相当靠近,且13/20位于喉结下方。喉上神经内外支入内脏鞘点的垂直距离、直接距离及椎体水平具有显著性差异。
  研究结论:
  1、在上颈椎前外侧入路中,二腹肌为寻找舌下神经的重要标志。2、舌下神经和喉上神经是妨碍上颈椎前外侧入路的重要解剖结构。3、在前外侧入路中,喉结是定位神经血管结构、椎体水平及选择手术切口的重要参考。4、高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)均是处理上颈椎病变的有效方法。高位颈前咽后入路能够更好地显露,可提供C2/3椎间盘处的垂直视角,向上可显露至斜坡下1/3,但需将喉上神经、喉上动脉及舌下神经、舌动脉完全解剖游离,并分别向下、向上牵拉。5、标准颈前路无需特意将血管、神经解剖游离,选择距喉结上方垂直距离约13~21.8mm的切口,从靠内脏鞘一侧进入,一般上从喉上神经外支和甲状腺上动脉上方及舌下神经和舌动脉下方,显露上颈椎,损伤血管神经的概率较低,较为安全。但标准颈前路只能提供C2/3椎间盘处的斜视角,且显露寰枢椎及斜坡困难,易损伤神经血管。所以当病变局限于枢椎体或C2/3椎间盘病变时可考虑采用标准颈前路。
[硕士论文] 陈梦佳
神经生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:嗅觉是动物重要的感官之一。哺乳动物的嗅觉系统主要由位于中枢的嗅球、嗅皮质和位于外周的嗅粘膜组成。嗅粘膜又分为嗅上皮层和固有层。嗅上皮层主要包含基底细胞,嗅受体神经元和支持细胞。其中,基底细胞位于嗅上皮的基底层,紧贴固有层,是嗅上皮的干细胞。嗅受体神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)是嗅觉系统的一级神经元,它位于嗅上皮基底层的上方,由基底细胞分化而来。伴随着ORNs分化成熟的过程,其胞体从上皮基底层向顶端迁移,使得不同分化程度的ORNs位于不同的细胞层面,其中未成熟ORNs的胞体靠近基底层,而成熟ORNs的胞体位于未成熟ORNs上方接近上皮顶端。嗅上皮的发育对于维持动物正常嗅觉功能至关重要。嗅神经元的发生是一个极其复杂的过程,包括嗅上皮干细胞的增殖、分化和成熟等几个阶段,每个阶段都受到严格的调控,但是人们目前对其调控机制了解十分有限。
  血红素结合蛋白Hemopexin是一种血浆糖蛋白,属于炎症相关的急性期蛋白家族。有趣的是,hemopexin在外周神经系统中也有表达,并且在神经轴突变性的过程中表达上调,提示hemopexin可能参与了神经损伤的再生过程。Hemopexin分子和基质金属蛋白酶和玻连蛋白都有一个由两个四叶β-螺旋组成的相同结构域,称为血红素结合蛋白样结构域。研究表明,后两者可通过其参与调节多种细胞的增殖和分化并能调节神经发生过程等。目前尚没有Hemo、exin参与了神经发生的相关报道。为了深入认识Hemopexin在神经系统发育中的作用,本研究运用基因敲除小鼠模型,分析了Hemopexin在嗅上皮神经发生过程中的作用及机制。
  取得的主要结果如下:
  1、对hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮形态学分析显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮变薄、上皮的细胞总数减少;嗅上皮的成熟ORNs减少,而未成熟ORNs增加,并且未成熟的ORNs结构层次产生异常。
  2、运用免疫组化等方法,进一步发现hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮增殖细胞数量无明显改变,而凋亡细胞增多;嗅上皮的干细胞HBCs无明显异常。
  3、嗅觉功能检测显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅觉识别能力仍然存在,但是区别结构相似气味的精细嗅觉功能丧失。
  综上所述,我们发现hemopexin在嗅上皮的神经发生过程中发挥了重要作用,具有促进ORNs的成熟,抑制其凋亡以及维持精细嗅觉的功能。本研究不仅助于揭示嗅上皮神经发生调控过程的新机制,有助于深入认识神经发育的机理,而且为hemopexin蛋白对嗅觉功能障碍相关疾病的潜在治疗价值提供理论依据。
[硕士论文] 刘清桂
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:细胞衰老是指在DNA损伤、端粒酶活性丢失等内在因素和细胞间通讯改变、体液循环因子改变等外在条件的刺激下,细胞发生一系列形态结构的改变,导致细胞永久性退出分裂周期,无法发挥正常生理功能。而衰老细胞的累积会导致组织器官的衰老,进而引发组织器官衰老问题,如机体的结构和功能异常和各种衰老相关疾病的发生。
  肝脏是一个以代谢为核心功能的器官,而肝细胞是肝脏组织中最主要的实质细胞。胆汁合成、肝糖贮存、脂质代谢等多种肝功能都是由肝细胞来承担的。随着年龄增长,老年肝脏肝细胞的形态、结构和功能发生了一系变化,比如肝细胞体积变大,数量减少、增殖能力降低、肝细胞核出现空泡,胞质出现脂褐素沉积、DNA含量异常,巨核肝细胞比例升高等。然而,由于衰老肝细胞的结构改变和功能异常,导致老年个体更容易发生各种肝脏疾病。比如老年个体容易出现肝脏脂肪性病变,老年小鼠中应对CCl4等化学药物的能力下降,肝脏的炎症水平升高,加速肝脏纤维化病症的发生发展。由此可见,肝细胞衰老与肝脏疾病发生发展紧密相关。因此,探寻肝细胞衰老逆转的途径是老年肝脏疾病治疗的必然要求。然而由于肝脏衰老模型小鼠缺乏等各种困难,目前仍无法获得肝细胞衰老逆转的深入研究。
  本项目研究中,基于联体共生模型,使得联体的两只小鼠可以共享彼此的血液微环境途径而用来探讨微环境对肝细胞衰老逆转的作用。首先,分别建立了2月龄和24月龄小鼠间联体(联体的2月龄为Het-Y,联体的24月龄小鼠为Het-O)、相同月龄的年轻小鼠间联体(联体的同月龄小鼠都称为Iso-Y)和相同月龄的老年小鼠间联体(联体的老年小鼠都称为Iso-O)3种联体共生模型。通过流式分析结果显示联体小鼠间血液交换率接近50%。成功构建联体共生模型后,使得联体小鼠共同生活5周,然后分别对不同组联体小鼠肝脏肝细胞进行生物学特征和肝细胞功能的分析,评价年轻微环境对衰老肝细胞逆转的作用。细胞衰老相关指标的检测结果显示,在年轻血液微环境的作用下,与Iso-O小鼠相比,老年小鼠SA-β-gal阳性率从38.23%±1.86%降低到4.84%±0.71%;γ-H2A.X阳性率从53.98%±3.78%降低到15.46%±1.86%;衰老指标细胞周期抑制因子P53、P21和P16的表达明显降低(p<0.01);炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平也降低(p<0.01)。其次,老年小鼠肝脏多倍体肝细胞数量增加,而多倍体肝细胞发生衰老的可能性增加。通过肝细胞比例分析发现,在年轻微环境的作用下,与Iso-O相比,老年小鼠八倍体肝细胞比例从33.35%±0.85%降低到15.97%±0.84%;二倍体肝细胞比例从7.41%±0.54%升高到27.27%±0.71%。进一步对肝细胞数目和大小进行分析,结果显示,在年轻微环境作用下,相同视野范围内,老年肝脏肝细胞数目从402±18个增加到617±42个,细胞面积也从645.99±32.72μm2减小至356.93±22.33μm2。前期的研究表明随着年龄的增加肝细胞增殖能力降低,体现在小鼠肝脏肝切后肝脏再生能力减弱和衰老肝细胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年轻小鼠血液的影响下,其增殖能力发生了明显变化。原位肝组织增殖能力检测和原代肝细胞体外短期培养结果都显示,年轻微环境作用下,衰老肝细胞增殖能力得到恢复,增殖水平与年轻小鼠相类似。上述结果证实:在年轻微环境作用下,衰老肝细胞的衰老指标消失了,衰老肝细胞的形态、结构发生了衰老逆转,且重新获得了类似年轻肝细胞的增殖潜能。
  衰老肝细胞发生系列形态结构和功能的改变,导致其对外界刺激的耐受力下降,因而慢性肝炎、肝纤维化、肝癌等肝脏疾病在老年个体中发生机会增加。随着年龄的增长,衰老肝细胞出现脂质代谢障碍,肝脏内脂肪累积的水平提高,老年肝脏脂肪病变的发生几率明显增加。在联体共生模型中,发现老年小鼠在年轻血液微环境的调控下,老年肝脏脂肪累积程度得到明显的缓解。肝脏脂滴原位染色结果显示,年轻微环境的作用下,于Iso-O相比较,油红O的阳性面积从24.01%±3.48%降低到4.15%±2.95%,且尼罗红的阳性面积也降低4倍。血清学指标也显示老年小鼠TG、胆固醇和LDL-c水平明显降低(p<0.01),且肝损伤指标ALT和AST的表达水平也降低(p<0.01)。
  综合上述实验结果,可以得出结论:在年轻血液微环境的作用下,老年衰老肝细胞的衰老表型发生逆转,多倍体肝细胞比例降低,增殖能力得到提高。而且年轻血液微环境促进了衰老肝细胞脂肪累积水平的降低,不仅提高了肝细胞的脂质代谢能力,也改善了衰老肝脏的肝功能水平。这一重要发现,为解决衰老肝细胞增殖缓慢和老年个体肝衰竭相关疾病高频病发而难治愈问题提供新的思路,也为理解衰老和微环境的关系、衰老肝细胞发生“返老还童”机制和延缓或有效控制肝细胞衰老提供了理论基础。
[硕士论文] 苗卉
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:出生缺陷是一项影响广泛的重要全球公共卫生问题,同时在一些国家出生缺陷也是引起早期自然流产,终止妊娠,婴幼儿致死和残疾的主要原因。据报道,近70%的出生缺陷可以被预防,或者在良好的护理下治愈或改善。叶酸作为一种重要的微量元素,叶酸的补充在预防出生缺陷方面的作用已被公认。基于以上原因,许多国家开始将全人口的强制性的叶酸添加作为一项预防出生缺陷的公共卫生政策加以实施。然而,叶酸与发育之间的确切关系尚未明确,尤其是不同个体的叶酸摄取能力差异巨大,叶酸补充对出生缺陷的益处或叶酸过量所造成的危害也有待进一步澄清。
  在本研究中,建立了不同叶酸饲料喂养小鼠的动物模型,发现,其子代小鼠肝脏组织中的干性标记物分子的表达随体内叶酸水平的升高而增加。高叶酸摄入对子代小鼠干性标志物的表达影响巨大。因此,进一步利用E14小鼠胚胎干细胞(mESCs)作为研究对象,检测了不同叶酸浓度培养6个月mESCs的生物学特性、干性和多能性的改变。并成功建立了mESCs注射裸鼠皮下形成的畸胎瘤模型。通过上述实验发现,相对于常规培养的mESCs,叶酸的补充可增强其体外增殖,集落形成和干性相关标志物的表达,并能在体内良好的促进其多能性。在明确叶酸对于mESCs的相关作用的基础上,进一步探索了补充叶酸促进mESCs增殖的机制。通过转录组测序技术,对培养的细胞的差异表达的转录本进行分析,最终筛选并确认一种在高叶酸水平下,mESCs中上调表达的重要的母源印记基因印记长非编码RNA(lncRNA)Meg3(母系表达基因3,以下简称Meg3)。结合重亚硫酸的测序发现,这种Meg3的上调是由启动子的低甲基化所导致的,同时通过调控细胞中Meg3的表达可以回复叶酸补充的作用。通过进一步的筛选和机制研究,成功证实了Meg3和其靶蛋白LYAR(Cell growth-regulating nucleolar protein)的相互作用关系,结果显示Meg3通过抑制LYAR的泛素化降解来稳定LYAR,进而促进mESCs的干性和分化潜能。
  综上所述,认为,母体高叶酸摄入可能对子代的生长发育带来一系列影响,我们的研究阐释了长期高叶酸摄入与后代出生缺陷的相关性以及母系印记LncRNAMeg3参与长期叶酸摄入异常导致后代发育异常、出生缺陷的具体机制。高叶酸水平可以引起Meg3启动子区域的低甲基化水平,诱导了Meg3上调表达,进而维持了LYAR的稳定性,促进了mESCs的干细胞分化能力和多能性。我们的研究结果为辩证看待叶酸补充在预防出生缺陷中的作用提供了理论依据,我们的研究成果将能够对于指导临床的叶酸补充带来帮助。
[博士论文] 魏婷婷
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)作为一类条件致病菌,主要寄居在人体的皮肤和粘膜(如口腔、消化道和阴道)表面。在机体免疫功能正常时,白念珠菌与免疫系统维持相对稳态,不会引发感染;而当机体的免疫功能受到抑制时,白念珠菌与机体共存的稳态被打破,白念珠菌迅速繁殖,由共生菌转为致病菌。白念珠菌感染作为最常见的真菌感染,可有不同的临床表现,轻者常引发局部粘膜损伤,重者可穿透组织、侵入外周血液循环,表现为播散性念珠菌病,严重威胁患者生命。近些年来,由于抗生素滥用的现象仍未得到有效解决,且肿瘤放化疗患者以及HIV感染病人的日益增多,导致白念珠菌感染的发病率不断增高,而且播散性感染的病死率居高不下,这些至今仍是难以解决的临床问题。因此,研究白念珠菌的致病机制、特别是深入研究机体免疫系统抗白念珠菌感染的调控过程,可为其相关的感染性疾病的治疗提供帮助。
  机体抵抗白念珠菌感染的第一道防线是由树突状细胞(dendritic cells,DCs)、中性粒细胞、巨噬细胞等组成的固有免疫应答系统。该系统可以在第一时间通过非特异杀伤的方式清除致病菌,但持续时间不长而且不具备免疫记忆功能。DCs作为专职的抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs),其表面表达较高水平的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。这些PRRs的主要生物学功能在于可以识别病原体表面的保守结构,即病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并由此开启针对病原体感染的免疫应答。白念珠菌细胞壁的PAMPs一旦被DCs表面的PRRs识别,可迅速活化DCs,分泌多种炎症因子和趋化因子,促进对白念珠菌的非特异性免疫清除。DCs的活化机制十分复杂,其核心事件是NF-κB、核转录因子激活蛋白-1(nuclear transcription factor activation protein-1,AP-1)等转录因子的核转位,最终调节多种细胞因子和趋化因子的表达。另一方面,DCs还可以通过PRRs吞噬病原体,并将病原体抗原加工、递呈给T细胞,诱导T细胞分化,指导后续的特异性免疫应答的类型和持续时间。固有免疫是获得性免疫的起点和驱动,而获得性免疫可在固有免疫的基础上发挥更持久且具有记忆功能的免疫效应。值得注意的是,机体抗白念珠菌的免疫应答过程需要多种机制的精细调控,若免疫反应强度过弱,则无法有效清除病原体;但若免疫应答强度过高或持续时间太长,则容易导致机体组织的炎症性损伤。
  microRNAs(miRNAs)是一类长度约20个碱基左右的单链非编码RNA,可以与靶基因mRNA的3'非编码区(3'UTR)的碱基不完全互补结合,导致mRNA发生降解,或者直接抑制mRNA的蛋白质翻译过程,从而发挥转录后水平的调节作用。miRNAs的作用特点是一个miRNA可以同时在转录后水平对多个基因进行调节,而一个基因的表达强度也可以受到多个miRNAs的调节,miRNAs对靶基因的调节具有明显的时空特异性。近些年来,越来越多的研究表明,miRNAs在免疫细胞的发育和免疫应答的进程中发挥不可忽视的调控作用。在前期的研究中,我们采用microRNA芯片分析了白念珠菌刺激单核源DCs内miRNAs的表达谱变化,结果发现多种miRNAs异常表达,其中miR-155表达显著上调。再者,以往的研究表明miR-155在抗细菌、病毒的免疫反应中具有活跃的调节功能,但目前miR-155在真菌感染免疫中的生物学功能尚不明确。基于以上研究背景,本课题探讨了miR-155在树突状细胞抗白念珠菌感染的固有免疫应答中的调节作用及其作用机制。
  第一部分 热灭活的白念珠菌对树突状细胞及CD4+Th细胞的活化作用及功能影响
  目的:研究白念珠菌感染对树突状细胞的成熟及其功能的影响,进而对CD4+Th细胞的活化和分化的影响。
  方法:采用磁珠分选的方法从人外周血中分离CD14+单核细胞和CD4+Th细胞,加入GM-CSF和IL-4诱导CD14+单核细胞分化为未成熟的DCs。用热灭活的白念珠菌刺激DCs,检测DCs的成熟表面标志物的表达及炎症因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌。然后将负载了白念珠菌的DCs与CD4+Th细胞共培养,通过流式细胞术检测Th细胞的活化及IFN-γ、IL-17等细胞因子的表达变化。
  结果:热灭活的白念珠菌可以显著上调DCs表面的成熟标志物CD83、CD86的表达,促进细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的释放。负载白念珠菌的DCs与CD4+Th细胞共培养后,T细胞表面的活化标志物CD69表达上调,胞内细胞因子IFN-γ、IL-17的分泌水平明显升高。
  结论:热灭活的白念珠菌可以促进树突状细胞成熟,并诱导CD4+Th细胞活化分化,发挥有效的抗真菌效应。
  第二部分 热灭活的白念珠菌可以上调树突状细胞内miR-155的表达
  目的:研究热灭活白念珠菌能否促进miR-155的表达和分泌。
  方法:用热灭活的白念珠菌刺激DCs,qRT-PCR检测胞内miR-155的表达。收集白念珠菌刺激DCs后的培养上清液,并提取外泌体,检测上清液和外泌体中miR-155的表达。通过qRT-PCR检测白念珠菌刺激DCs后不同时间点炎症因子的变化情况,以及在DCs、单核细胞、THP-1细胞和RAW264.7细胞中miR-155的表达变化。
  结果:热灭活的白念珠菌可以显著上调DCs内miR-155的表达,并且白念珠菌刺激DCs的培养上清及外泌体中miR-155表达也明显上调。白念珠菌诱导的炎症因子的表达呈先升高后降低的趋势,而miR-155的表达呈持续上升趋势,后期与炎症因子的表达趋势相反。此外,在单核细胞、THP-1和RAW264.7细胞内,白念珠菌同样可以持续上调细胞内miR-155的表达。
  结论:热灭活的白念珠菌可以持续上调miR-155的表达,且miR-155可以通过外泌体分泌到细胞外基质中。同时白念珠菌刺激下炎症因子的表达呈先升高后降低的趋势,在炎症后期与miR-155的表达趋势相反。
  第三部分 miR-155对DCs分泌炎症因子的调节作用及机制研究
  目的:探究miR-155对白念珠菌诱导的DCs分泌炎症因子的调节作用以及分子机制。
  方法:将miR-155的模拟体和抑制体转染DCs,然后加入热灭活的白念珠菌,分别采用qRT-PCR和ELISA检测炎症因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的变化。采用生物信息学软件TargetS can、miRDB和microRNA.org预测miR-155的靶基因,并通过western blotting和荧光素酶报告基因的方法检测miR-155对靶基因的调节作用,最后转染siRNA干扰靶基因的表达,检测对下游炎症因子分泌的影响。
  结果:转入miR-155的模拟体后,白念珠菌诱导的炎症因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌明显降低;而转入miR-155的抑制体后,炎症因子的变化趋势与之相反。在白念珠菌刺激的DCs中,miR-155可以与转录因子NF-κB p65和上游BCL10的3'UTR端靶向结合抑制其表达。此外,干扰BCL10可明显抑制NF-κB信号通路的激活,减弱白念珠菌上调炎症因子的表达能力。
  结论:在白念珠菌感染中,持续表达上调的miR-155对炎症因子的分泌具有明显的负向调节作用,其作用机制可能与靶向抑制BCL10及NF-κBp65的表达,进一步影响NF-κB通路的激活有关。
  第四部分 白念珠菌活化的DCs内miR-155表达上调的机制研究
  目的:探究热灭活白念珠菌上调miR-155表达的相关机制。
  方法:加入Dectin-1的激动剂,采用qRT-PCR检测miR-155的表达变化。在白念珠菌刺激DCs前加入Dectin-1的抑制剂或siRNA预处理,然后检测miR-155的表达变化。分别采用细胞免疫荧光、Western blotting检测热灭活白念珠菌刺激DCs后转录因子NF-κB p65的核转位情况以及MAPK信号通路相关分子的磷酸化表达。在白念珠菌刺激的DCs之前预先加入NF-κB或MAPK信号通路的特异性抑制剂,研究这两条通路对白念珠菌上调miR-155表达的影响。
  结果:加入Dectin-1的激动剂可以明显上调miR-155的表达,而加入Dectin-1受体的特异性阻断剂或siRNA均会抑制白念珠菌上调miR-155表达的能力。热灭活的白念珠菌可以促进NF-κB p65的磷酸化和核转位,并激活MAPK的ERK、JNK通路及下游转录因子c-Jun的磷酸化;进一步加入NF-κB p65的活化抑制剂可明显抑制miR-155的表达,而ERK、JNK通路的抑制剂可通过抑制c-Jun的活化,降低白念珠菌诱导miR-155表达的能力。
  结论:DCs表面受体Dectin-1的激活及胞内NF-B和MAPK信号通路均参与了白念珠菌诱导miR-155表达上调这一过程。
[硕士论文] 王子
输血医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分 不同储存时间点更换添加液对红细胞储存的影响
  目的:
  探索在悬浮红细胞储存期间不同时间点(储存第14天和储存第28天)更换添加液对红细胞储存的影响。
  方法:
  30名献血员体检后按照献血流程采集全血,按照标准流程制备悬浮红细胞后,分为更换组1(储存第14天更换添加液),更换组2(储存第28天更换添加液)和对照组,每组10例。在红细胞储存第3天、7天、14天、21天、28天和35天进行采样检测。应用血球计数仪检测红细胞形态、大小变化情况;采用生化分析仪检测各组红细胞上清液Na+、K+、葡萄糖和乳酸浓度;应用流式细胞分析仪检测红细胞表面磷酯酰丝氨酸阳性率;应用瑞氏染色观察红细胞形态改变情况。通过检测指标探索不同时间点更换添加液对红细胞储存的影响。
  结果:
  悬浮红细胞储存3-35天,对照组上清液中Na+浓度从(114.1±6.17)mmol/L下降到(80.3±6.46)mmol/L; K+浓度从(6.97±1.38)mmol/L上升到(35.17±8.61)mmol/L;葡萄糖浓度从(28.06±2.77)mmol/L下降到(16.19±4.11)mmol/L;乳酸浓度从(3.44±0.46)mmol/L上升到(10.74±0.12)mmol/L。更换组1更换添加液后(储存21-35天),上清液中Na±浓度和葡萄糖浓度始终高于对照组(p<0.05);K+浓度和乳酸浓度始终低于对照组(p<0.05)。更换组2更换添加液后(储存第35天)上清液中Na+浓度和葡萄糖浓度高于对照组(p<0.05);K+浓度和乳酸浓度低于对照组(p<0.05)。储存第35天时,更换组2上清液中乳酸浓度低于更换组1(p<0.05);Na+浓度、K+浓度和葡萄糖浓度均无显著差异(p>0.05)。悬浮红细胞储存3-35天,更换组1、更换组2和对照组PS阳性率、红细胞棘球率和MCV均无显著差异(p>0.05)。
  结论:
  红细胞储存期间更换添加液(SAGM,pH5.1)可以改善储存环境的离子分布状态,补充葡萄糖,去除乳酸等代谢产物,恢复部分糖酵解,并且不会影响红细胞的PS阳性率、MCV和红细胞棘球率。在纠正离子失衡及恢复糖酵解方面,储存第14天更换添加液优于储存第28天更换添加液。
  第二部分 储存第14天更换添加液对红细胞储存的影响
  目的:
  探索在悬浮红细胞储存第14天更换添加液在氧化应激、溶血率、渗透脆性等更多方面对红细胞储存的影响。
  方法:
  10名献血员体检后按照献血流程采集全血,按照标准流程制备悬浮红细胞后,同一袋悬浮红细胞平均分为更换组(储存第14天更换添加液)和对照组,每组10例。在红细胞储存第3天、7天、14天、21天、28天和35天进行采样检测。应用血球计数仪检测红细胞形态、大小变化情况;采用生化分析仪检测各组红细胞上清液Na+、K+、葡萄糖和乳酸浓度;应用流式细胞分析仪检测红细胞表面磷酯酰丝氨酸阳性率;应用红细胞渗透脆性试验检测红细胞脆性;应用脂质过氧化物试剂盒、还原型谷胱甘肽试剂盒和游离血红蛋白试剂盒分别检测脂质过氧化物、还原型谷胱甘肽和游离血红蛋白并计算溶血率;应用pH计测量上清液pH值。通过检测指标探索储存第14天更换添加液对红细胞储存的影响。
  结果:
  悬浮红细胞储存3-35天,对照组上清液中Na+浓度从(115.4±3.34)mmol/L下降到(89.4±3.72)mmol/L; K+浓度从(6.62±0.85)mmol/L上升到(31.67±2.85)mmol/L;葡萄糖浓度从(28.76±0.81)mmol/L下降到(18.66±1.16)mmol/L;乳酸浓度从(3.44±0.41)mmol/L上升到(9.59±0.07)mmol/L;红细胞溶血率从(0.08±0.03)%上升到(0.20±0.08)%;pH值从7.23±0.07下降到6.94±0.07。悬浮红细胞储存3-14天,对照组上清液中LPO从(7.99±5.14)μmol/L下降到(3.43±0.74)μmol/L,储存14-35天上升到(4.98±1.38)μmol/L。更换组更换添加液后(储存21-35天),上清液中K+浓度、乳酸浓度、红细胞溶血率、LPO和pH值始终低于对照组(p<0.05):葡萄糖浓度始终高于对照组(p<0.05)。更换组与对照组Na+浓度、PS阳性率、MCV、渗透脆性和GSH均不存在显著差异(p>0.05)。
  结论:
  储存第14天更换添加液(SAGM,pH5.1)可以减轻红细胞储存损伤的离子失衡、乳酸堆积、氧化应激、溶血率增加等问题。
  第三部分 连续(每14天)更换添加液对红细胞储存的影响
  目的:
  探索在悬浮红细胞储存期间连续(每14天)更换添加液对红细胞储存的影响。
  方法:
  10名献血员体检后按照献血流程采集全血,按照标准流程制备悬浮红细胞后,储存每14天更换添加液。以溶血率大于0.8%作为检测终点。在红细胞储存第3天、14天、28天、42天、56天、70天、84天进行采样检测。应用血球计数仪检测红细胞形态、大小变化情况;采用生化分析仪检测红细胞上清液Na+、K+、葡萄糖和乳酸浓度;应用流式细胞分析仪检测红细胞表面磷酯酰丝氨酸阳性率;应用红细胞渗透脆性试验检测红细胞渗透脆性;应用脂质过氧化物试剂盒和游离血红蛋白试剂盒分别检测脂质过氧化物和游离血红蛋白并计算溶血率;应用pH计测量上清液pH值。通过检测指标探索连续(每14天)更换添加液对红细胞储存的影响。
  结果:
  悬浮红细胞储存3-84天,上清液中Na+浓度从(114.1±6.17)mmol/L逐渐下降到(88.4±5.89)mmol/L(p<0.05);K+浓度从储存第3天的(6.97±1.38)mmol/L上升到储存第14天的(20.09±3.40)mmol/L,随后又下降到储存第84天的(2.99±0.45)mmol/L(p<0.05);葡萄糖浓度从储存第3天的(28.06±2.77)mmol/L下降到(25.55±1.10)mmol/L,随后又上升到储存第56天的(39.59±1.48)mmol/L,然后又下降到储存第84天的(35.91±2.69)mmol/L(p<0.05);乳酸浓度从储存第3天的(3.44±0.46)mmol/L上升到储存第14天的(8.99±0.41)mmol/L,随后又逐渐下降到储存第84天的(0.46±0.06)mmol/L(p<0.05);PS阳性率从(0.31±0.30)%上升到(3.07±1.39)%,随后又在储存第56天时下降到(0.40±0.21)%;然后又在储存第84天时上升到(2.33±1.15)%(p<0.05); MCV从(91.51±2.33)fL下降到(87.86±2.63)fL,随后又上升到(94.95±2.34)fL(p<0.05);渗透脆性从储存第3天的(4.16±0.25)NaCl g/L上升到储存第14天的(5.08±0.19)NaCl g/L,随后又下降到储存第84天的(4.05±0.19) NaClg/L(p<0.05);溶血率从(0.15±0.06)%逐渐增加到(0.97±0.24)%(p<0.05); LPO从储存第3天的(9.17±5.98)μmol/L下降到储存第56天的(2.36±0.47)μmol/L,随后又上升到(5.40±1.17)μmol/L(p<0.05);pH值从7.22±0.08下降到6.18±0.04(p<0.05)。
  结论:
  连续(每14天)更换添加液(SAGM,pH5.1),在第3次更换后会加重红细胞储存损伤,并在更换5次后溶血率超过国家标准。
[硕士论文] 高荣
生物学(微生物学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)主要通过血液途径感染肝脏,引起急性及慢性病毒性肝炎。目前全球约有1.7~2亿人感染HCV,中国健康人群HCV抗体阳性率为0.7%~3.1%。大多数HCV感染易演变为慢性感染,部分HCV慢性感染可进展为肝硬化及肝细胞癌。HCV感染已成为危害健康的严重问题。聚乙二醇α干扰素(pegylated interferon-α,PEG-IFN-α)联合利巴韦林(ribavirin,RBV)是目前抗HCV感染的经典治疗方案,但由于IFN严重的毒副作用、不同HCV基因型敏感性不同、干扰素抵抗等多种因素限制了其疗效及使用范围。近年来,随着对HCV不断深入的研究,抗HCV治疗方面取得较大成果,如抗HCV的小分子药物蛋白酶抑制剂——直接抗病毒药物(direct-acting antiviral agents,DAAs)的临床应用,相较于联合疗法持续性病毒学应答(sustained virological response,SVR)明显提高。但由于HCV基因型多、易变异且DAA治疗费用昂贵等应用受限,且近期有报道DAAs可能会增加肝细胞癌的发病率及术后复发。因此,对HCV感染相关宿主因子的探索及靶向抗HCV治疗仍是目前HCV研究的热点。
  HCV是单股正链RNA病毒,为黄病毒属成员,多个宿主因子被报道参与包括入侵、复制、组装和释放等在内的复制周期。microRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA。大量研究表明,miRNAs可参与调控细胞分化、增殖、凋亡、代谢、细胞周期等多个环节,并与炎症性、感染性、代谢性疾病及肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关,其主要生物学功能是通过与其靶标分子的3'-UTR结合来抑制翻译或降解mRNA,进而调控基因表达。多种miRNAs已被证实在HCV诱导的肝癌(HCV-HCC)的发生发展中具有重要的作用。miRNAs在HCV的复制、诊断、治疗中同样扮演重要角色。例如,研究发现miR-122及miR-141具有促进HCV复制的作用,miR-122的小分子互补拮抗剂Miravirsen(SPC3649)目前已进入Ⅲ期临床试验阶段。
  细胞因子信号转导抑制分子3(SOCS3)是SOCS家族的重要分子之一,大量研究表明SOCS3在多种疾病的发生发展中具有重要作用。现有研究发现SOCS3可以负性调节多种细胞因子和激素(包括IL-6、IL-10、IFN-α、LPS、瘦素、胰岛素等)产生的信号传导,从而在炎症、感染及肿瘤等多种疾病的发生发展中发挥重要作用。SOCS3在病毒感染中的作用主要与其可负性调节酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录激活(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路有关,而JAK-STATs通路是Ⅰ型和Ⅱ型IFN发挥抗病毒作用的信号通路。SOCS3的表达与HCV在细胞内的复制程度密切相关。已有研究表明,HCV患者肝样本中SOCS3蛋白表达增加,而高水平SOCS3表达与HCV患者IFN治疗抵抗相关。同时,肝细胞SOCS3水平可反应HCV感染IFN治疗的效果。SOCS3基因的多态性与宿主对抗病毒治疗的反应相关。已有报道表明SOCS3是HCV在体内复制中重要的宿主因子之一,近年来的研究表明多种miRNA可通过调节SOCS3的表达而影响多种疾病的发生发展,但鲜有靶向SOCS3的miRNAs对HCV复制及IFN抗HCV作用的影响。基于SOCS3在HCV复制中的重要作用,本课题探讨了靶向SOCS3的miRNAs对HCV复制及IFN抗HCV作用的影响。
  本研究中,首先通过SOCS3的siRNA验证了SOCS3在细胞水平对HCV复制的影响:将si-SOCS3及si-NC转染Huh7细胞,相较于si-NC,si-SOCS3除可抑制HCV在细胞内的复制,IFN-α还可进一步增强si-SOCS3对HCV复制的抑制作用。进而,以mimicNC(mNC)作为阳性对照,通过转染miRNA mimic模拟miRNA在细胞内的过表达,证实了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p对SOCS3具有明显的抑制作用。进一步的实验中,构建含有SOCS33'-UTR(WT)及miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p与SOCS33'-UTR结合位点突变的质粒,利用双荧光素酶报告基因验证了SOCS3是miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p的靶标分子。在此基础上,通过利用HCVcc感染,在细胞模型上证实了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p在抑制HCV复制的同时也抑制了SOCS3的表达。而在用IFN-α处理后,miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p对HCV复制的抑制作用进一步加强。以往的研究已证实SOCS3是JAK-STATs通路重要的负性调节因子之一,而IFN-α抗HCV的作用正是通过作用于JAK-STATs通路,IFN-α上调该通路下游p-STAT1的表达发挥其抗HCV的作用。因此,分别转染si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic、miR-30c-5p mimic及对照,结果发现,相较于对照,si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic及miR-30c-5p mimic均可明显上调p-STAT1的表达,从而进一步证实了IFN-α增强靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p抑制HCV复制的作用是通过共同加强JAK-STATs通路作用而实现的。
  基于上述发现,靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p可在细胞模型中抑制HCV复制,其作用是通过互补结合SOCS3mRNA的3'-UTR抑制了SOCS3蛋白的表达。这一抑制作用解除或削弱了SOCS3对JAK-STAT通路的负性调节作用,明显上调了p-STAT1的表达,而p-STAT1是IFN-α发挥抗HCV效应的中介因子之一。因此,靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p表现出抑制HCV复制及协同IFN-α抗HCV的作用。该研究有助于将SOCS3作为对IFN治疗反应的标志物提供更多的证据,同时为研发基于SOCS3的潜在疗法奠定基础,为拓宽IFN治疗HCV感染提供更多依据。
[博士论文] 张华
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:机体天然免疫系统(innate immune system)能够识别和清除感染病原体,从而抵抗病原体感染与损伤。天然免疫系统主要由天然免疫细胞以及相关细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),启动细胞内天然免疫信号转导,产生Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ)和促炎细胞因子,以抵抗病原体感染。
  RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptors,RLRs)属于PRRs中的一类关键受体,在细胞浆中识别RNA病毒,介导抗病毒天然免疫反应,在机体天然免疫应答中发挥着至关重要的作用。RIG-Ⅰ作为RLRs中的最关键的受体分子,可以通过识别RNA病毒或病毒复制中产物,通过接头分子MAVS,活化TBK1-IRF3信号,激发IFN-Ⅰ产生,从而抵抗病毒感染。在RIG-Ⅰ发挥功能的过程中,磷酸化修饰和泛素化修饰以及相关的酶分子发挥了重要的调控作用,影响着RIG-Ⅰ信号的起始、传递和终止等进程,进而维持着机体的免疫平衡。基于我们前期对RIG-Ⅰ信号转导通路的研究,我们通过IP-MS技术鉴定与RIG-Ⅰ相互作用的蛋白质分子及其翻译后修饰类型。通过分析质谱数据,我们发现RIG-Ⅰ的相互作用分子中包括甲基转移酶、乙酰基转移酶、E3泛素连接酶、激酶/磷酸酶、代谢以及RNA修饰相关分子等,小鼠RIG-Ⅰ(mRIG-Ⅰ)的翻译后修饰类型包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化修饰等;其中,许多相互作用分子和翻译后修饰在RIG-Ⅰ信号转导通路中的功能尚未知。我们对质谱数据进行了验证并克隆了mRIG-Ⅰ修饰位点的突变载体,开展了相关功能学研究。
  蛋白精氨酸甲基转移酶是一类在组织细胞中广泛表达的酶分子,其主要包含9个家族分子,介导蛋白精氨酸残基的甲基化修饰,参与调控多种细胞进程,影响肿瘤、炎症、代谢、DNA损伤修复等生命活动过程。随着抗体开发技术和蛋白组学技术的发展,PRMTs和精氨酸甲基化修饰的研究得以广泛开展,但是其在天然免疫,尤其在抗病毒天然免疫中的功能还没有相关报道。
  在质谱鉴定的RIG-Ⅰ的相互作用分子中,我们发现多个PRMTs家族的成员,提示PRMTs可能参与调节天然免疫应答。我们克隆了PRMTs的9个分子,利用报告基因实验对PRMTs影响IFN-β表达的功能进行筛查,发现9个PRMTs分子都能调控IFN-β的表达,而PRMT6是其中抑制IFN-β表达效应最显著的分子。我们还通过构建PRMTs稳定过表达的Raw264.7细胞株,用VSV病毒感染,发现PRMT6稳定过表达可以显著抑制病毒感染诱导的IFN-Ⅰ和IL-6的产生,相应的IRF3活化也显著低于对照。此外,在Raw264.7细胞、NIH3T3细胞和A549细胞中瞬时过表达PRMT6分子,再用病毒刺激,也获得类似的结果。以上结果证实了PRMT6可以负向调节抗病毒天然免疫反应。
  为了检测PRMT6的体内效应,我们构建了Prmt6基因敲除小鼠。首先,我们发现Prmt6缺失并不影响小鼠的正常生长发育和免疫系统的发育。通过VSV病毒感染同窝小鼠,我们发现,Prmt6缺失可以显著提高小鼠的生存率。进一步用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中细胞因子水平,发现Prmt6缺失小鼠血清中的IFN-α、IFN-β和IL-6显著高于对照小鼠,相对应的,Prmt6缺失小鼠的肝脏、脾脏和肺脏中VSV病毒的复制显著低于对照。组织学检测肺部炎性细胞浸润情况也显示Prmt6缺失小鼠的肺部炎性细胞浸润明显低于对照小鼠。这些结果表明了Prmt6缺失可以显著增强小鼠抵抗病毒感染的能力,证实了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能。我们进一步用RNA和DNA病毒分别刺激Prmt6缺失的BMDM细胞,发现VSV病毒和HSV-1病毒刺激均能够诱导Prmt6缺失的BMDM细胞产生更多的IFN-α、IFN-β和IL-6,这与体内实验结果是一致的。我们进一步分析了信号转导通路变化情况,发现Prmt6缺失可以显著增强病毒诱导的RF3的活化,而不影响TBK1的磷酸化以及NF-κB和MAPK信号。这些结果说明了PRMT6通过抑制IRF3活化来抑制IFN-Ⅰ产生,从而抑制抗病毒天然免疫反应。
  体内体外的结果明确了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能,病毒感染是否会引起PRMT6表达水平和细胞定位的改变呢?我们利用Western Blot分析了病毒感染细胞的蛋白变化,发现病毒感染可以显著上调小鼠和人巨噬细胞中PRMT6的蛋白水平,同样,病毒感染也可以引起人肿瘤细胞A549和HepG2中PRMT6的蛋白增加。与此同时,GDS5093、GDS1667和GDS2164中的公共数据也提示病毒感染可以上调PRMT6的表达,而且这种变化可能与病程密切相关。我们利用Western Blot检测了巨噬细胞中PRMT6的胞浆胞核分布情况,发现PRMT6主要分布在细胞浆中,只有很少量的PRMT6分布于细胞核中,而且PRMT6的分布不随病毒感染而改变。这些结果与PRMT6通过调控IRF3磷酸化水平抑制IFN-Ⅰ产生的效应相吻合。
  PRMTs功能的发挥大多依赖其甲基转移酶活性,PRMT6抑制抗病毒天然免疫反应是否依赖其甲基转移酶活性呢?我们根据已有的文献信息,构建了PRMT6的酶活性突变体PRMT6(dead)。通过报告基因实验,我们发现PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、RIG-Ⅰ-2CARD、MAVS、TBK1、IRF3-5D等诱导的IFN-β的表达,而PRMT6(dead)并不能有效地逆转PRMT6的抑制效应。这些结果证实了PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,表现出与常规PRMTs不一样的功能特征。接头分子TRIF、STING、MAVS均可以通过TBK1-IRF3信号激活IFN-Ⅰ的产生,而我们的报告基因结果也证实了PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、MAVS诱导的IFN-β的产生,这说明了PRMT6可能靶向TBK1-IRF3信号。进一步的报告基因实验结果也证实了PRMT6确实可以通过靶向TBK1-IRF3复合体来抑制IRF3活化,从而抑制IFN-β表达。结合前面Prmt6缺失可以增强IRF3磷酸化,但并不影响TBK1活化的结果,我们进一步检测PRMT6是否影响TBK1的激酶活性。通过体外激酶实验,我们发现PRMT6并不影响TBK1的激酶活性。以上结果证实了PRMT6靶向TBK1-IRF3复合体进而抑制IRF3的活化,这一过程不依赖其甲基转移酶活性,也不影响TBK1的激酶活性。
  既然PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,也不影响TBK1活化和TBK1的激酶活性,那么,PRMT6是否可以直接结合TBK1或者IRF3,从而抑制信号的传递呢?通过免疫共沉淀实验,我们发现PRMT6可以直接结合IRF3,而不结合TBK1、IKKε和IRF7。通过检测内源性的蛋白结合情况,发现在静息的小鼠和人的巨噬细胞中,PRMT6可以结合IRF3,而当病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强。在Prmt6缺失的BMDM细胞中,发现Prmt6缺失可以显著促进病毒诱导的TBK1与IRF3的结合,从而增强IRF3的活化。利用HEK293T细胞过表达实验也证实了PRMT6可以结合IRF3,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF3磷酸化。研究结果表明,PRMT6可以结合IRF3,而且,在病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF3的活化,使IFN-Ⅰ产生减少,抑制机体抗病毒天然免疫反应。
  我们进一步根据PRMT6的结构域特征构建了PRMT6的截短体表达载体,通过免疫共沉淀实验,发现PRMT6与IRF3的结合主要依赖其N端结构域,而PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能则主要依赖其AA189-318结构域。这些结果也提示了PRMT6发挥功能可能依赖其N端结构域结合IRF3,进而通过空间位阻效应阻碍TBK1与IRF3的结合,从而抑制IRF3活化和抗病毒天然免疫反应。
  综上,在本研究中,我们鉴定了RIG-Ⅰ的相互作用分子和翻译后修饰类型,揭示了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的效应与机制,将PRMTs与天然免疫联系起来,为PRMTs的生物学研究提供了新的视角,也为病毒感染的干预和治疗提供了潜在靶点和理论依据。同时,我们的研究所揭示的具体机制也可能是病毒逃逸免疫系统攻击的一种策略,在一定程度上增加了我们对病毒逃逸机制的认识。
[硕士论文] 纪逸萱
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胚胎的成功植入和胎盘的正常发育对正常妊娠至关重要。胎盘滋养层细胞侵入子宫内膜,为胚胎发育所必须的营养、激素环境提供条件。胎盘发育需要经历一系列复杂的细胞事件,首先从绒毛外滋养层细胞的形成和分化开始。滋养层细胞干分化成绒毛外滋养层细胞,它是人类胚胎中最先分化、最先发育的细胞类型之一,为母体-胎儿界面仅有的可与母体免疫系统直接接触的胎儿细胞。该细胞具有多种功能,涉及细胞增殖、胚胎着床。在胚胎植入过程中、母体-胎儿免疫耐受的过程中发挥重要作用。滋养层细胞增殖、迁移、侵袭不足和过度均造成早期胎盘发育异常,进一步导致胚胎、胎儿死亡,引起流产和其他妊娠相关疾病。因此滋养层细胞功能的研究一直受到广泛关注。
  同源框基因在胚胎发育过程中具有重要的调控作用,含同源域因子GATA-3表达于滋养层细胞中,妊娠高血压疾病发展中,破坏Th1/Th2平衡,与妊娠高血压疾病的发展及严重程度密切相关。绒毛膜癌BeWo细胞系中,HOXA11低表达促进细胞滋养层向合体滋养层分化,促进了绒毛膜癌的发生发展。提示同源框基因对滋养层细胞发育具有重要调控作用。HOXA10在胚胎发育过程中若发生基因突变可引起苗勒管发育异常,引起双子宫、子宫纵隔等畸形。而它在胚胎早期发育阶段,即早期胎盘发育阶段所发挥的作用尚未有相关研究。
  本研究通过基因芯片技术发现HOXA10在早期胎盘组织中表达量显著高于中、晚期胎盘组织,提示它对早期胎盘发育有重要影响,进一步探讨了HOXA10对滋养层细胞增殖能力调控的必要性及相关分子机制。
  方法:
  1.以小鼠胎盘发育为模型,取小鼠胎盘发育的第6.5d,14.5d和19.5d的组织各3例,进行mRNA芯片检测。差异基因筛选条件为Fold change>2.0,P<0.05,筛选出与早期胎盘发育过程相关的同源框基因HOXA10。
  2.在C57小鼠胎盘组织、人胎盘组织中通过RT-PCR及western blot验证芯片结果。
  3.在滋养层细胞系HTR-8/SVneo中进行功能实验,利用小干扰RNA干扰HOXA10表达后,进行增殖功能实验,并检测细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物p57表达量变化。
  4.通过免疫组化法检测葡萄胎绒毛组织、人工流产绒毛组织、自然流产绒毛组织中HOXA10表达情况。验证HOXA10对滋养层细胞增殖力调控的重要性。
  结果:
  1.HOXA10在人早期胎盘组织中的表达量显著高于中、晚期胎盘组织;
  2.人滋养层细胞HTR-8中干扰HOXA10表达后,细胞增殖能力明显减弱。
  细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物p57是人早期滋养层细胞中表达最高的周期调节剂,干扰HOXA10后p57高表达,抑制细胞周期;流式细胞仪检测各周期细胞数结果:G1期细胞数显著增加,S期细胞数明显减少;CCK8实验结果进一步验证干扰后细胞增殖能力明显减弱(P<0.05)。
  3.人滋养层细胞中干扰HOXA10表达后,细胞凋亡水平无明显变化。
  滋养层细胞中干扰HOXA10后,通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平,差异无统计学意义,HOXA10表达量改变不影响滋养层细胞凋亡(P>0.05)。
  4.免疫组化法检测出人工流产绒毛组织中HOXA10表达明显低于完全性葡萄胎组织,显著高于自然流产绒毛组织。
  结论:
  1、HOXA10在胎盘发育过程中的表达具有时间特异性,主要参与早期胎盘发育。
  2、HOXA10通过调控细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物p57,影响滋养层细胞增殖能力,避免过度增殖和增殖不足,是保证妊娠顺利的基础。
[硕士论文] 徐媛
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  曲霉菌(Aspergillus)是一类广泛分布于自然界的丝状真菌,约300余种,其中大多数曲霉菌种仅无性阶段被描述,属于半知菌;少数菌种如烟曲霉已同时发现并描述无性及有性阶段,被归入子囊菌。曲霉菌常见于湿润的土壤、发霉腐烂的面包、谷类等,其中少数菌种可感染人类导致严重疾病。近年来,由于免疫抑制人群数量的增多,侵袭性曲霉感染的发病率呈上升趋势,尤其是易于累及造血干细胞、实体器官移植后及接受免疫抑制剂治疗的患者,其早期诊断困难,死亡率长期居高不下。
  烟曲霉是临床最主要的致病曲霉菌种,近年来发现其对唑类药物耐药率不断上升,且非烟曲霉感染引起的侵袭性曲霉菌病也不断增加。值得注意的是,曲霉菌各菌种对抗真菌药物的敏感性有显著不同。目前临床上传统的曲霉菌鉴定模式,不能及时准确的将菌株鉴定至种的水平,这常常制约临床采取恰当的治疗方案。目前中国绝大多数地区,包括上海等医疗中心城市,有关的曲霉菌临床分离菌株的遗传多态性及体外对抗真菌药物敏感性监测等研究工作还很不够,尤其缺乏系统地持续性监测调查。因此,本研究随机选取了上海地区2家三级甲等医科大学附属医院,对分离自深部体液样本的曲霉菌株进行了持续2年的分离、培养及保藏,并应用最新的分子标记技术及药敏监测操作规范,对相关曲霉菌临床分离株的种群遗传多态性以及药物敏感性进行研究,为提高上海乃及中国的曲霉病临床诊治水平提供有价值的参考依据及研究基础。
  目的:
  第一,通过多基因测序及序列分析等分子标记技术对相关曲霉菌株进行分子鉴定及遗传多样性分析,明确相关曲霉菌株的种群构成及种内遗传变异特征;第二,通过体外药敏试验调查相关菌株对现有抗真菌药物敏感性特征,为临床合理用药提供科学参考;第三,对筛选出的曲霉菌耐药烟曲霉菌株,检测其唑类耐药突变位点,初步分析其耐药的演化分子机制。
  方法:
  第一部分对分离自上海地区两家教学医院住院患者的深部体液样本的相关菌株,采用核酸扩增技术分别对ribosomal internal transcribed spacer region(ITS)、β-tubulin和calmodulin三个基因片段进行扩增测序,与NCBI数据库进行BLAST比对后初步鉴定至种水平;分别利用上述三个基因及联用其序列,利用MEGA7.0软件,采用K2+G模型和K2+G+I模型,利用最大似然法构建系统发育树,将每一菌株鉴定至种的水平,并比较ITS,β-tubulin和calmodulin三个单基因片段序列对鉴定曲霉菌属的优劣。
  第二部分利用最新的肉汤微量稀释法(CLSI M38-A2方案),对相关曲霉菌临床分离株进行9种临床一线抗真菌药物的体外敏感性试验,并筛选出耐药菌株。
  第三部分将药敏试验中筛选出的对唑类耐药烟曲霉进行cyp51A基因的扩增及测序,与唑类敏感烟曲霉菌株(GenBank accession no.AF338659)进行序列比对,确定其耐药突变位点。
  结果:
  第一部分本研究中收集的菌株菌种构成包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)共9种曲霉菌,其中以烟曲霉(54.6%;59/108)为主。相关菌株主要分离自呼吸系统标本(90.7%;98/108),且烟曲霉(58.2%;57/98)为呼吸系统的最主要致病曲霉菌;然而在来自非呼吸系统标本的曲霉菌株中,非烟曲霉菌(75%;6/8)多于烟曲霉(25%;2/8)。
  第二部分在本研究中应用的棘白菌素类、唑类和多烯类等9种抗真菌药物中,棘白菌素类药物对相关曲霉菌菌株的抗菌活性最高(MEC500.03μg/ml;MEC900.25μg/ml),其次为唑类(MIC500.5μg/ml;MIC902μg/ml)及多烯类(MIC501μg/ml;MIC902μg/ml)。其中棘白菌素类药物中以阿尼芬净的敏感性最高(MEC500.03μg/ml;MEC900.03μg/ml);唑类药物中以泊沙康唑的敏感性最高(MIC500.25μg/ml;MIC900.5μg/ml)。另外,发现相当比例的菌株(34.3%的MIC值≥2μg/ml)对两性霉素B敏感性下降,值得警惕及后续相关研究进一步监测。
  第三部分本次研究中发现烟曲霉的唑类耐药率约6.8%,且首次在上海地区发现存在TR46/Y121F/T289A突变位点的烟曲霉菌株;同时,还发现了2株对唑类耐药的烟曲霉菌株同时存在F46Y,G89G,M172V,N248T,D255E的突变位点。
  结论:
  本研究中收集自2所教学医院的曲霉菌临床分离菌株种类主要包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、聚多曲霉、溜曲霉、构巢曲霉和土曲霉这8个菌种,烟曲霉仍是优势致病曲霉菌种。体外抗真菌药敏试验提示,棘白菌素类药物对本次研究收集的曲霉菌株的抗菌活性最高,其次为唑类、多烯类。烟曲霉菌株对唑类耐药率有所上升,且相关耐药突变位点存在丰富的多样性,且首次在上海地区发现含TR46/Y121F/T289A突变位点的交叉耐药烟曲霉菌株,提示相关耐药菌株存在多种起源及演化途径,值得真菌病学、医学真菌学及流行病学等领域的学者警惕,未来在上海地区就烟曲霉临床与环境分离菌株对唑类药物的耐药趋势进行系统的、长期的监测研究对于临床侵袭性曲霉病的诊治是非常必要的。
[硕士论文] 晏亮
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文从以下两部分进行了阐述:
  第一部分:外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布和体外药敏分析
  外阴阴道念珠菌病(VVC)是女性的常见病,病原菌包括最常见的白念珠菌以及光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌等。许多药敏研究报道了VVC念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性降低,然而新疆地区VVC致病菌的菌种分布以及体外药敏的信息很少,因此本研究对新疆地区236株VVC念珠菌进行了菌种鉴定,并依照M27-A3方法检测了其对11种抗真菌药物(包括棘白菌素类以及新三唑类药物)的体外敏感性。
  结果显示236株VVC念珠菌由207株白念珠菌、18株光滑念珠菌、9株克柔念珠菌、1株近平滑念珠菌、1株热带念珠菌构成。
  新疆VVC白念珠菌分离株对棘白菌素类体外敏感性好,对卡泊芬净敏感性劣于另外两种棘白菌素类;对两性霉素B、5-氟胞嘧啶敏感性好;对氟康唑敏感性较好,但对伊曲康唑、伏立康唑敏感性差,且对伏立康唑耐药率高于其他报道;对新三唑类药物的敏感性好,但MIC值明显低于IFI念珠菌分离株;部分菌株对三唑类药物出现交叉耐药现象。新疆VVC光滑念珠菌分离株和克柔念珠菌分离株对卡泊芬净敏感性差,但对米卡芬净、阿尼芬净敏感性好;对两性霉素B、5-氟胞嘧啶体外敏感性好;对氟康唑、伊曲康唑敏感性差,对新三唑类药物的敏感性好;伏立康唑对光滑念珠菌分离株MIC50/90为0.5/1 ug/ml,克柔念珠菌分离株对伏立康唑敏感性好。唯一的近平滑念珠菌对11种抗真菌药物均敏感,但唯一的热带念珠菌对卡泊芬净、伊曲康唑剂量依赖,对氟康唑、伏立康唑耐药,对其余7种抗真菌药物敏感。
  第二部分:Candida Africana的分子鉴定
  Candida africana是白念复合体中的一个新物种,其能形成芽管但不能形成厚膜孢子,不能利用N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖、海藻糖和DL-乳酸作为唯一的碳源,实验室普通的鉴定手段难以将其从白念复合体中区分开来。Candida africana易感染/定植女性阴道粘膜,全球各地都有分离出该物种的报道,但目前对这一新物种的流行病学、遗传学分布及特征等信息了解尚少。本研究收集了来自新疆和上海的VVC菌株,运用HWP1基因扩增测序方法成功鉴定出4株Candida africana分离株,并对其进行多位点序列分型分析,发现3株属于亚洲特有的ST型—ST型782,另1株属于新的ST型(提交MLST数据库后被命名为ST型3432)。这4株Candidaafricana分离株对11抗真菌药物均具有良好的体外敏感性。
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