绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 12925 条结果
[硕士论文] 黄晓培
公共卫生 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)是目前应用最为广泛的新型纳米纤维材料,在纤维特征和暴露方式上与石棉极其相似,故其对人体能否产生与石棉类似的危害效应受到高度关注。现有研究表明,MWCNTs能诱导动物间皮瘤(2017年被国际癌症研究机构列为2B类致癌物),对人类具有巨大的潜在威胁,但其作用机制不明;中国是MWCNTs的生产和消费大国之一。所以,研究MWCNTs致胸膜间皮瘤的分子机制,可为更准确地评价其安全性,制定有效防治措施提供科学依据,无疑具有重要的科学意义和实际意义。
  MWCNTs的炎性诱导作用是其目前较公认的主要毒效应机制之一,慢性炎症是石棉致胸膜间皮瘤发生发展中的重要因素,胸膜腔持续的慢性炎症也是MWCNTs致小鼠胸膜腔间皮瘤的显著特征。所以,慢性炎症在MWCNTs致胸膜间皮瘤过程中起什么作用,是通过何种途径实现,成为阐明MWCNTs致胸膜间皮瘤分子机制的关键问题。但目前对慢性炎症在MWCNTs致胸膜间皮瘤作用机制研究中,存在以下问题:(1)动物实验均采用高剂量、一次性注射的给药方式。MWCNTs致胸膜间皮瘤是一个长期、低剂量持续作用过程,一次性注射在暴露途径和暴露剂量上无法模拟MWCNTs的真实暴露情况。(2)体外实验多采用单细胞培养,无法模拟胸膜腔内的细胞环境。认为只有基于真实暴露剂量和暴露环境的实验体系,才有可能阐明MWCNTs致间皮瘤的分子机制。
  本研究采用低剂量、长期染毒的作用模式,通过人胸膜间皮细胞和巨噬细胞共培养体系探讨慢性炎性反应在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中的作用及其分子机制,以期为纳米材料从业人员的职业安全防护提供科学依据,为间皮瘤的治疗提供新的思路和借鉴。
  方法:
  本实验分为四组,人胸膜间皮细胞组、巨噬细胞+人胸膜间皮细胞组、MWCNTs+人胸膜间皮细胞组和MWCNTs+巨噬细胞+人胸膜间皮细胞组;MWCNTs的终浓度为0.1μg/mL;作用时间为3个月;利用以下实验进行研究:
  1.通过扫描电镜和透射电镜来考察受试MWCNTs的纤维特征是否符合“病理性纤维”的前提条件;
  2.通过比较不同组别间细胞因子的表达量变化,考察MWCNTs是否能诱导炎性反应以及间皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用;
  3.通过细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、克隆形成实验、染色体畸变实验和动物成瘤实验,考察炎性细胞在MWCNTs致人胸膜间皮细胞恶性转化中的作用;
  4.通过转录组测序技术筛选MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化中相关候选基因;并用qRT-PCR及western blot实验技术对候选基因进行验证,提出可能的分子作用机制;
  5.构建候选基因稳转敲低的胸膜间皮细胞株,在MWCNTs作用下与巨噬细胞共培养后,通过比较不同组别之间细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力,考察候选基因在MWCNTs致间皮细胞恶性转化中的作用;
  6.构建候选基因稳转敲低的间皮细胞株,通过western blot技术检测候选基因敲除的间皮细胞+MWCNTs+巨噬细胞体系中间皮细胞的蛋白表达含量,确定基因之间相互作用关系。
  结果:
  通过以上实验,得到了如下结果:
  1.本实验所用的MWCNTs平均长度范围为10-20μm,管径范围为30-50nm,符合病理性纤维的特征。
  2.MWCNTs作用于巨噬细胞可引起IL-1β细胞因子表达的显著改变;巨噬细胞与间皮细胞之间存在密切联系:MWCNTs作用于巨噬细胞所分泌的IL-1β能显著增强间皮细胞IL-8、TNF-α和IL-6等炎性因子的释放。
  3.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的间皮细胞染色体畸变增加;MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中,间皮细胞染色体畸变率均高于其它组,差异具有统计学意义;此结果表明,低剂量的MWCNTs体外长期作用于间皮细胞可使其染色体畸变有增加的趋势,巨噬细胞可能对MWCNTs致染色体畸变效应具有促进作用;
  4.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的间皮细胞发生恶性转化;MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中,间皮细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力均明显高于其它组,差异具有统计学意义;此结果表明:巨噬细胞对MWCNTs致间皮细胞的恶性转化作用具有明显的促进作用。
  5.皮下接种MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中间皮细胞的裸鼠,其肿瘤体积和成瘤组织中细胞的Ki67阳性率明显高于其它组,差异具有统计学意义;此结果提示与巨噬细胞共培养后的间皮细胞恶性转化程度更高。
  6.通过转录组测序,筛选出一系列差异表达基因;结合前部分的研究结果,认为其中NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因与MWCNTs致间皮细胞恶性转化关系最为密切;qRT-PCR及western blot实验结果显示,MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中间皮细胞的NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因和蛋白质表达量均明显升高,与其他组比较差异具有统计学意义。以上结果提示:NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中发挥作用。
  7.间皮细胞(sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬细胞共培养体系中,间皮细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力均明显低于间皮细胞(sh-NC)+MWCNTs+巨噬细胞组,差异具有统计学意义;此结果证明,NF-κB、IL-6、STAT3在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中发挥重要作用。
  8.间皮细胞(sh-NC or sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬细胞共培养体系中,敲低NF-κB(p65)后,IL-6、STAT3蛋白水平表达量均降低;敲低IL-6R后,NF-κB蛋白水平表达量不变,STAT3蛋白表达量降低;敲低STAT3后,NF-κB(p65)、IL6R蛋白表达量均不变。此结果表明在MWCNTs致胸膜间皮细胞的恶性转化中存在NF-κB/IL-6/STAT3分子级联,且NF-κB/IL-6/STAT3通路具有重要作用。
  结论:
  通过上述研究,得出了以下结论:
  1.MWCNTs刺激巨噬细胞所分泌的以IL-1β为主的细胞因子能显著增强间皮细胞炎性因子的释放;
  2.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的人胸膜间皮细胞可发生恶性转化;
  3.炎性反应可显著促进MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化作用
  4.NF-κB/IL-6/STAT3分子通路在炎性反应促MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化中发挥重要作用。
[硕士论文] 胡思颖
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:静脉血栓栓塞症是目前恶性肿瘤的一种常见并发症,而肺癌作为我国发病率最高的恶性肿瘤受到人们高度关注和重视。国内外的多项研究提示静脉血栓栓塞症与肺癌的治疗和预后密切相关。合并VTE的肺癌患者预后差,死亡率更高,而规范的预防性抗凝治疗可降低VTE的发生率。由此可见,认识肺癌合并VTE的高危因素及高发时段,并做到早期预防、早期诊断及早期治疗有着十分重要的临床意义。
  研究目的:
  分析合并静脉血栓栓塞症肺癌患者的临床特征,探寻肺癌患者发生VTE的高危因素,提高对高风险患者的预防及诊断意识。观察预防性抗凝在我院肺癌病人中的应用情况,并对比预防性抗凝治疗前后患者实验室指标的变化情况,了解预防性抗凝治疗的必要性和相关风险。
  研究方法:
  回顾性分析海军军医大学附属长海医院2012年6月至2016年6月共收治的2325例肺癌患者,选取其中有完整病历资料的50例合并静脉血栓栓塞症的患者为研究组(VTE组),分析VTE的临床特征(发生时间、发生部位、临床表现、治疗方式及临床转归)。随机选取同期入院但未合并静脉血栓栓塞症的100例肺癌患者作为对照组(非VTE组)。记录和分析两组患者的一般情况(包括年龄、性别、合并基础疾病、吸烟史),肿瘤相关情况(包括肺癌病理类型、TNM分期及肿瘤治疗方式),是否预防性抗凝治疗,实验室检查(包括凝血功能,白细胞计数,血红蛋白及血脂等)。并选取上述150例患者中预防性抗凝的47例患者作为研究对象(干预组),未预防性抗凝的103例患者为未干预组,记录干预组患者当次及下一次入院时凝血功能指标、白细胞计数及血红蛋白,对比两者是否有统计学差异。所有数据均应用SPSS21.0统计软件对结果进行统计处理和分析,检验水准α=0.05,以P<0.05差异具有统计学意义。
  研究结果:
  静脉血栓栓塞症在肺癌确诊后的6个月内发生率高达78.0%,以下肢深静脉血栓和肺血栓栓塞症最为多见。合并静脉血栓栓塞症组和未合并静脉血栓栓塞症组单因素分析结果显示,VTE组血浆D-二聚体、自细胞计数、凝血酶原时间高于非VTE组(P<0.05),肺腺癌、晚期肺癌患者(Ⅲb-Ⅳ期)、放疗、化疗的患者VTE发生率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。预防性抗凝治疗的患者静脉血栓栓塞症发生率明显低于未预防抗凝的患者(12.8%VS47.7%),P<0.001。多因素回归分析显示腺癌、化疗及凝血功能异常D-二聚体水平升高是肺癌患者合并静脉血栓栓塞症栓塞的独立危险因素(P<0.05),预防性抗凝治疗可以降低肺癌患者VTE的发生率,12.8%VS47.7%,(P<0.001)。预防性抗凝的肺癌患者血浆D-二聚体较前有明显下降,统计学有明显差异(P<0.05),凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、纤维蛋白原、白细胞计数、血红蛋白等指标均未存在统计学差异性。
  研究结论:
  肺腺癌、化疗、D-二聚体升高是肺癌合并VTE的独立危险因素;静脉血栓栓塞症多发生在肺癌确诊后的6个月内。预防性抗凝治疗可以明显降低肺癌患者血浆D-二聚体水平,有效降低VTE的发生率。而对其他凝血功能指标及白细胞,血红蛋白等均无明显影响。预防性抗凝患者出血风险并未增加。临床上应对具有以上高危因素及处于高发时段的肺癌患者提高警惕,积极检查,早期诊断,并给予及时预防性抗凝治疗干预,降低VTE的发生率。
[硕士论文] 赵家义
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  1.确定非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者鼠肉瘤病毒致癌基因(Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene,KRAS)、磷酯酰肌醇-3激酶催化亚基α基因(Phosphoinositide-3-kinase,catalytic,alpha gene,PIK3CA)及肿瘤蛋白P53(Tumor protein53,TP53)基因常见位点的突变情况。
  2.探讨KRAS、PIK3CA及TP53基因突变与NSCLC患者临床特征的关系。
  3.探讨KRAS、PIK3CA及TP53基因突变与NSCLC患者预后生存的关系,为NSCLC患者个体化治疗提供依据。
  研究方法:
  1.临床资料采集
  收集2015年1月至2016年12月于上海长海医院呼吸内科接受血液肿瘤基因二代测序且符合纳入标准的122例NSCLC患者的临床病例资料包括性别、年龄、是否吸烟、有无症状、肿瘤标记物、基因突变结果、胸部CT表现、肿瘤部位、病理类型、肿瘤TNM分期、转移部位等。本研究经过上海长海医院伦理委员会同意,并且所有患者均签署知情同意。
  2.肿瘤基因二代测序
  对上述患者进行KRAS、PIK3CA及TP53基因突变检测,KRAS、PIK3CA及TP53基因突变检测是基于高通量测序平台的肿瘤基因突变检测,采用环化单分子扩增和重测序技术(Circulating Single-Molecule Amplification and Resequencing Technology,cSMART),首先对患者抽取10ml静脉血进行样本DNA提取,其次构建高通量测序文库,然后采用cSMART方法对肿瘤组织DNA或血液中来自肿瘤细胞的游离DNA片段进行标记、环化、扩增和高通量测序,从而识别非小细胞肺癌患者KRAS、PIK3CA及TP53基因突变的类型、位点和丰度。
  3.生存随访
  所有患者均接受培美曲塞+卡铂(非鳞非小细胞肺癌患者)或者紫杉醇+卡铂(鳞癌患者)的一线化疗方案,且每接受2个周期的标准化疗后进行胸部CT复查。根据RECIST1.1标准进行,未进展的患者按美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)推荐进行治疗和随访。无进展生存期(Progression-free survival,PFS)定义为肿瘤疾病患者从接受治疗开始,到观察到疾病进展或者发生因为任何原因的死亡之间的这段时间。随访生存情况采用电话等形式得到,随访时间截至2017年6月30日。
  4.数据处理及统计学分析
  采用SPSS21.0进行数据处理。采用x2检验进行分类变量比较,Kaplan-Meier方法分析PFS,检验水准α=0.05,以P<0.05差异具有统计学意义。
  研究结果:
  1.人口学基线特征
  符合纳入标准的122例NSCLC患者中剔除信息缺失和失访患者33例,纳入本研究的患者共计89例,其中男性52例,女性37例,年龄27~90岁,平均年龄(59.4±12.2)岁,中位年龄61.0岁。75例患者病理类型为腺癌,12例患者为鳞癌以及腺鳞癌患者2例。41例患者曾有吸烟史,无吸烟史患者有48例。
  2.NSCLC患者KRAS、PIK3CA及TP53基因突变情况
  共检测89例患者样本,39例患者无任何基因突变,50例患者至少存在一种KRAS、PIK3CA及TP53基因突变,占56.1%。其中KRAS基因突变21例(21/89,23.6%),PIK3CA基因突变8例(8/89,9.0%),TP53基因突变40例(40/89,44.9%)。有17例患者样本出现多基因共突变,占19.1%,其中15例为双突变(15/89,16.8%),包括KRAS+TP53共突变10例(10/89,11.2%),PIK3CA+TP53共突变4例(4/89,4.5%)和KRAS+PIK3CA共突变1例(1/89,1.1%)。2例样本存在KRAS+PIK3CA+TP53三基因共突变(2/89,2.2%)。所有样本中有32例患者存在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变(32/89,36.0%),3例存在棘皮动物微管结合蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein like4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合突变(3/32,3.4%),3例存在c-Met跳跃突变(3/32,3.4%)。
  3.NSCLC患者KRAS、PIK3CA及TP53基因突变与其临床特征的关系
  和无基因突变组患者相比,本研究发现存在更多的KRAS基因突变组、TP53基因突变组和KRAS+TP53共突变组患者的肿瘤呈浸润性生长(76.2%vs48.7%,P=0.04;72.5%vs48.7%,P=0.03;90.0%vs48.7%,P=0.046)。故KRAS基因突变组、TP53基因突变组和KRA S+TP53基因共突变组患者在肿瘤远处转移的发生率均要显著高于无基因突变组:KRAS基因突变组、TP53基因突变组和KRAS+TP53基因共突变组在骨转移的发生率明显增高(61.9%vs25.6%,P=0.006;62.5%vs25.6%,P=0.001;70.0%vs25.6%,P=0.024);TP53基因突变组在胸外淋巴结转移的发生率也高于无基因突变组(35.0%vs28.6%,P=0.045)。而KRAS基因突变组、PIK3CA基因突变组、TP53基因突变组患者在肿瘤局部侵犯(胸膜转移)的发生率与无基因突变组相比,差异无统计学意义。除了胸部CT影像学上肿瘤分叶征外,其他绝大部分临床特征与各类型基因突变无关。
  4.NSCLC患者KRAS、PIK3CA及TP53基因突变与其生存预后的关系
  单KRAS基因突变组、单TP53基因突变组、KRAS+TP53基因共突变组和PIK3CA+TP53基因共突变组患者的PFS均小于无基因突变组(8.9±2.3月vs15.3±1.6月,P=0.045;7.8±1.5月vs15.3±1.6月,P<0.001;6.6±1.6月vs15.3±1.6月,P<0.001;7.1±2.1月vs15.3±1.6月,P=0.012);KRAS+TP53基因共突变组较单KRAS基因突变组、单TP53基因突变组患者PFS有缩短的趋势,PIK3CA+TP53基因共突变组较TP53基因突变组患者PFS也有缩短的趋势。2例KRAS+TP53+PIK3CA三基因共突变组患者的平均PFS仅6.15月,较无基因突变组明显缩短,但需进一步深入研究。
  研究结论:
  1.存在KRAS、PIK3CA及TP53基因双突变的NSCLC患者,其PFS明显低于无突变基因的患者,提示存在双基因突变是NSCLC患者预后不良的预测指标之一;
  2.双基因突变和三基因突变的患者较单基因突变患者PFS有缩短的趋势,可能存在基因“叠加作用”,提示基因突变的种类和数量也是影响患者预后的重要因素之一;
  3.存在KRAS、PIK3CA及TP53基因突变的NSCLC患者肿瘤侵袭性更强,更易发生远处转移,但基因突变与临床特征无直接关系。
  4.临床上应常规对NSCLC患者进行KRAS、IK3CA和TP53基因测序以明确基因单突变或多突变等类型,这对患者的临床特征分析、肿瘤侵袭程度和预后生存的判断有着重要的临床意义。
[硕士论文] 王万敏
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性支气管肺癌(简称肺癌)是全球最常见的实体恶性肿瘤之一,是全世界每年癌症相关死亡最常见的原因。我国最新数据表明肺癌发生率及死亡率均居恶性肿瘤的首位,其中女性发病率仍处于逐年上升趋势,年平均增长约0.9%。
  作为全球重要的公共医疗问题,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)表面抗原阳性流行率目前约为3.61%,全球统计数据结果显示全球约20亿人曾感染HBV,其中约2.4亿人为慢性HBV感染者。我国作为HBV感染最严重的国家之一,1~59岁普通人群中乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性携带率的最新数据为7.18%。
  据前期研究报道称,恶性肿瘤患者中HBsAg阳性率可达12%。合并HBV感染的肿瘤患者预后较差,认为接受化疗、放疗、靶向药物等相关病因治疗时可引起药物性肝脏损伤,还可能因乙型肝炎病毒再激活(hepatitis B virus reactivation,HBVR)导致病毒复制、机体免疫应答等因素造成进一步肝功能损伤。合并HBV感染可能是恶性肿瘤患者预后不良的独立危险因素。肺癌合并HBV感染的患者在临床上较为常见,HBV感染相关的肺癌患者治疗期间出现肝功能损伤风险的相关研究目前报道较少。
  研究目的:
  分析HBV感染的肺癌患者抗肿瘤治疗过程中肝功能损伤及HBVR的风险,旨在探讨肺癌患者肝功能损伤与HBV感染的相关性及预防性抗病毒治疗的临床的意义,从而为此类患者的个体化综合治疗提供一定的理论依据。
  研究方法:
  收集2015年6月-2017年6月在长海医院住院治疗的HBsAg阳性肺癌患者共61例(HBsAg阳性组),根据有无预防性抗病毒治疗分为预防性抗病毒组29例(干预组),未预防性抗病毒组32例(对照组),收集同期住院未合并HBV感染的肺癌患者61例为(HBsAg阴性组)。干预组在抗肿瘤治疗前1周即开始口服使用抗病毒药物恩替卡韦10mg、拉米夫定100mg,1次/天。对照组抗肿瘤治疗前未进行干预治疗。观察上述患者第1次、第3次、第5次入院时血清肝功能水平及HBsAg阳性组患者乙型肝炎病毒脱氧核糖苷酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV-DNA)水平。
  研究结果:
  1.HB sAg阳性组与阴性组比较:第3次入院时两组患者丙氨酸氨基转移酶、(P=0.048)、总胆红素(P=0.012)、前白蛋白(P=0.01)异常人数存在统计学差异。
  2.HBsAg阳性组中干预组与阴性组比较:第1次住院时丙氨酸氨基转移酶异常人数分别为4/29(13.7%)和2/61(3.3%)(P=0.029);第3次、第5次住院时干预组转氨酶水平大致恢复正常,与阴性组比较无差异。
  3.HBsAg阳性组中对照组与阴性组比较:第1次住院时肝功能异常人数差异无统计学意义(P>0.05);第3次、第5次住院时天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、凝血酶原时间异常人数均明显高于阴性组(P<0.05)。
  4.HBsAg阳性组内干预组与对照组比较:第3次入院时丙氨酸氨基转移酶(P=0.003)、天冬氨酸氨基转移酶(P=0.007)、总胆红素(P=0.024)水平均低于对照组;两组肝功能损伤发生率分别为3.4%和25%,中重度升高者占所有肝损患者的比率分别为0%和75%,两组间统计学差异有显著性(P=0.003)。
  5.HBVR发生率干预组与对照组比较明显减低(9%vs19%)。
  研究结论:
  HBsAg阳性肺癌患者肝功能损伤较HBsAg阴性者升高。预防性抗病毒可降低肝功能异常的风险及HBV再激活发生率,预防性抗病毒治疗存在其必要性。
[硕士论文] 龚海熠
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肺癌既是最常见也是死亡率最高的恶性肿瘤之一。肺癌患者的5年生存率仅为16.6%。其中约有85%的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC),其根据病理通常可分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。非小细胞肺癌骨转移发生率高达40%,可严重影响患者的生活质量,威胁患者的生存。非小细胞肺癌骨转移与患者的疼痛、病理性骨折、脊髓压迫、高钙血症等并发症密切相关,这些都意味着患者生活质量的降低和生存率的下降以及高昂的医疗费用。对非小细胞肺癌骨转移分子生物学机制的研究有助于进一步理解非小细胞肺癌骨转移的发生发展,从而指导临床治疗,提高患者的生活质量,节约社会医疗费用,对临床工作有着重大意义。
  硬化蛋白结构域蛋白1(SOSTDC1),也被称为WISE,USAG1和ectodin,此前曾有研究报道其在牙齿发育、毛囊形成、肢体形态和三叉神经节形成中起到重要作用。而其作为一种细胞分化和增殖调节器也与包括乳腺癌、胃癌、肾癌和甲状腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。然而,其在非小细胞肺癌转移特别是骨转移中的的角色和作用目前尚不清楚。
  因此希望通过对SOSTDC1在非小细胞肺癌骨转移机制中的进一步研究,为预防、诊断以及治疗非小细胞肺癌骨转移提供新的方向。
  方法:
  首先,选取了2009年1月至2015年12月期间,在第二军医大学第二附属医院接受手术的非小细胞肺癌患者的组织,包括145例非小细胞肺癌组织、141例瘤旁肺组织和49例非小细胞肺癌骨转移组织。并且收集了患者的相关临床数据,包括年龄、性别、肿瘤大小、AJCC分期、病理结果等。并通过免疫组化和qRT-PCR等方法检测了SOSTDC1在NSCLC原发灶、瘤旁肺组织和NSCLC骨转移灶间的表达差异,并通过统计IHC染色结果发现SOSTDC1表达水平与NSCLC患者预后的密切相关。
  接着,在非小细胞肺癌细胞系A549和PC9中过表达或抑制SOSTDC1,通过CCK8、Transwell以及破骨细胞分化试验研究了SOSTDC1在非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭以及诱导破骨细胞分化中的作用。
  最后,利用RNA深度测序检测了SOSTDC1刺激PC9细胞后基因表达谱的变化,通过GO分析和PEGG分析进一步探索了其可能的下游通路,并通过qRT-PCR验证了SOSTDC1对下游基因表达的调控作用。
  结果:
  我们的研究发现相较于原发肿瘤,SOSTDC1在非小细胞肺癌骨转移患者中表达下调,并进一步发现,在非小细胞肺癌患者中SOSTDC1低表达提示预后不良。在功能上,SOSTDC1的过表达可抑制NSCLC细胞增殖、迁移、浸润和癌细胞诱导的破骨细胞生成,而敲除SOSTDC1可以观察到相反的现象。此外通过非小细胞肺癌的RNA深度测序和qRT-PCR检测鉴定了一些可能和肿瘤的进展和骨转移相关的SOSTDC1下游通路,推测SOSTDC1可能通过调节PAK6、CCL3、BTG、WNT10A、CXCL1、CXCL2、CXCL8和CXCL10等基因,参与调节非小细胞肺癌的进展和骨转移。
  结论:
  基于以上研究结果,认为SOSTDC1可能在NSCLC转移特别是骨转移过程中发挥重要作用,SOSTDC1可以抑制NSCLC的增殖、迁移、浸润能力,并可抑制NSCLC细胞诱导的破骨细胞分化。且在NSCLC细胞中,SOSTDC1可能通过调节PAK6、CCL3、BTG、WNT10A、CXCL1、CXCL2、CXCL8和CXCL10等基因的表达,发挥其生理病理作用。这些研究结果对非小细胞肺癌骨转移发病机制进行了新的解释,并为今后非小细胞肺癌骨转移的预后预测和治疗提供了新的靶点。
[硕士论文] 夏国庆
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)是肺癌中恶性程度最高的病理类型,具有早期转移、易复发、预后差等临床特点。为进一步了解肿瘤标记物神经烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE)和胃泌素释放肽前体(Pro-Gastrin Releasing Peptide,Pro-GRP)在SCLC诊治中的临床意义,本研究回顾性分析了我院呼吸内科收治的103例SCLC患者的临床资料。通过对NSE和Pro-GRP水平与SCLC化疗疗效和预后的观察,再认识上述标记物在SCLC的作用为临床实用性提供理论依据和实践性指导。
  方法:
  收集2015年7月-2016年7月份我院呼吸内科收治并病理证实为小细胞肺癌的初治患者103人。化疗方案为铂类药物联合依托泊苷,每次治疗前均采集空腹静脉血测定NSE、Pro-GRP水平,NSE正常值上限(upper limit of normal,ULN)为20ug/L,Pro-GRP则为70pg/ml。每2个周期治疗后以实体肿瘤疗效反应评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)全面评估患者疗效,依据标准疗效可分为完全缓解(Complete Remission,CR)、部分缓解(Partial Remission,PR)、稳定(Stabilization of Disease,SD)及进展(Progression of Disease,PD)。选取第1次化疗前和第3次化疗前的血清NSE、Pro-GRP水平检测其对4周期治疗后SCLC疗效的评估作用。同时通过电话、门诊及病例等方式回顾和随访患者生存状态。本研究终点为无疾病生存期(Progression-free survival,PFS),以月为单位。最后应用SPSS21.0软件进行数据分析,P值<0.05认为有统计学意义。
  结果:
  103例SCLC患者中SCLC患者发病年龄<65岁占74.8%,男性(85.4%)为主,吸烟指数≥400年支的患者占多数(71.8%),初治时局限期(Limited Disease,LD)患者(64.1%)较广泛期(Extend disease,ED)患者(35.9%)多。
  CR+PR组、SD组中SCLC患者NSE、Pro-GRP水平在化疗前后存在明显差异,其P值均<0.001,有明显统计学有意义。PD组患者NSE、Pro-GRP水平化疗前后比较无明显统计学差异(P>0.05)。
  SCLC患者化疗后的NSE、Pro-GRP水平与疗效之间的相关系数分别为0.342、0.35,且化疗后的NSE(P=0.001)、Pro-GRP(P=0.001)水平在3种疗效组中有显著的统计学差异。同时PD组中化疗后的NSE水平与Pro-GRP水平最高。
  化疗后NSE、Pro-GRP水平中<ULN与≥ULN的各组疗效中SCLC患者分布不同,其P值分别为0.001、0.004,提示化疗后这两个标记物水平中<ULN组患者较≥ULN组患者化疗有效率高。
  SCLC患者化疗后的NSE水平与年龄、性别、PS评分、分期、有无转移无明显统计学意义,而化疗后Pro-GRP水平在疾病分期和有无转移中存在统计学差异,提示ED的患者较LD患者治疗后的Pro-GRP水平高,有转移的患者较无转移的患者治疗后的Pro-GRP水平高。
  单因素分析发现生存时间PFS与化疗后NSE水平(P=0.001)、Pro-GRP水平(P=0.019)、分期(P=0.032)及有无转移(P=0.040)存在明显的统计学意义,而年龄、吸烟、PS评分、性别、化疗前NSE、Pro-GRP水平与SCLC预后无明显关联。而在多因素COX回归分析中发现,分期、化疗后NSE水平是很好的预后因素,可以认为化疗后NSE水平≥ULN可能提示较短的PFS。
  结论:
  1.初治SCLC患者在行铂类药物联合依托泊苷的化疗治疗中,第3次化疗前的NSE、Pro-GRP水平对于评估SCLC患者化疗疗效有着很好的指示作用,化疗后NSE、Pro-GRP仍保持高水平预示着化疗疗效可能不佳。
  2.初治SCLC患者的第3次化疗前的NSE水平可作为SCLC患者预后的有效危险因素,化疗后升高的NSE水平可能提示疾病进展快、预后差。
[硕士论文] 张瑞瑞
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:肺癌是当前世界对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一,其高发病率及难治愈率均位于恶性肿瘤之首。癌症的主要特征是细胞迁移和侵袭,其迁移过程涉及到各种蛋白分子之间的相互协调、细胞骨架在迁移中的相互作用机制以及改变的肌动蛋白动力学。WDR1(WD-重复结构域1)是肌动蛋白解聚因子ADF/cofilin的主要辅助因子,能够强烈加速ADF/cofilin介导的肌动蛋白分解。目前,WDR1在非小细胞肺癌(NSCLC)进展中的作用尚无报道。我们通过RT-PCR实验检测发现在人类非小细胞肺癌组织中WDR1的表达水平与相邻的非肿瘤组织相比异常增加,并且高表达WDR1与非小细胞肺癌患者的不良预后相关。鉴于此,本文对WDR1在非小细胞肺癌中的生物学功能进行较为系统的研究及分析。我们利用shRNA干扰技术和过表达技术,在A549及H1299细胞中下调和高表达WDR1。结果发现在非小细胞肺癌细胞中WDR1的敲低显著抑制了细胞增殖、迁移和侵袭以及EMT进程,过表达WDR1则促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移。通过构建裸鼠模型,小鼠体内原位成瘤实验的结果与体外细胞实验结果相吻合。通过进一步的机制研究,我们发现WDR1通过促进ADF/cofilin介导的actin解聚,调控肿瘤细胞的运动能力和细胞连接,进而促进非小细胞肺癌的转移。我们的研究结果提示ADF/cofilin-WDR1-actin的特异性抑制剂有望成为治疗肿瘤转移的新靶点。
[硕士论文] 涂文婷
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 传统CT形态学特征对NSCLC患者EGFR基因突变状态的预测价值
  目的:
  探讨传统CT形态学特征预测非小细胞肺癌(NSCLC)患者EGFR基因突变状态的诊断价值,并联合临床特征构建EGFR基因突变预测模型。
  方法:
  回顾性分析病理证实为NSCLC并行EGFR基因检测的243例患者的影像学资料,其中突变型有112例,突变率为46.1%,野生型有131例。比较分析两组患者的5个临床特征(性别、年龄、临床分期、CEA水平及吸烟情况)和17个传统CT形态学特征(最大直径、密度、形状、分叶、胸膜凹陷征等)。将EGFR基因突变状态作为因变量、有差异的特征作为自变量进行多因素Logistic回归分析,并对回归预测概率和各单独特征进行ROC曲线分析。
  结果:
  单因素分析显示,性别、临床分期、最大直径、密度、纵隔或肺门淋巴结肿大、位置、空泡征及CT支气管征在两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,性别、密度和病灶位置是EGFR突变型的独立预测因素,对回归预测概率进行ROC曲线分析后,AUC为0.693(P<0.05)。对各单独特征进行ROC曲线分析后,性别、密度和病灶位置的AUC分别为0.608、0.631和0.579。
  结论:
  在NSCLC患者中,性别、病灶密度和病灶位置与EGFR基因突变密切相关,女性患者、亚实性密度以及周围型肺癌可提示EGFR基因突变阳性。
  第二部分 放射组学标签对NSCLC患者EGFR基因突变状态的预测价值
  目的:
  建立并验证基于放射组学标签的EGFR基因突变预测模型,并与形态学联合预测模型进行对比。
  方法:
  回顾性收集2012年4月至2016年2月的243例非小细胞肺癌(NSCLC)作为训练集,另外收集2015年5月至2016年10月的161例NSCLC作为独立验证集。采用组内相关系数(ICC)检验放射组学特征的一致性,采用无监督一致性聚类分析在训练集中进行放射组学标签的建立。使用Mann-Whitney U检验、卡方检验对所有特征及放射组学标签进行单因素分析,多因素Logistic回归分析用于构建EGFR基因突变预测模型。ROC曲线分析用于评价单个特征及模型的预测效能,并采用Delong检验比较两个模型之间的效能差异是否有统计学意义。
  结果:
  在485个放射组学特征中,筛选出可重复性高的313个放射组学特征,聚类分析构建了5个放射组学标签。放射组学联合预测模型由最大直径、RS1和RS2组成,在训练集和验证集中,该模型的预测效能(AUC=0.789、0.797)均高于形态学联合预测模型(AUC=0.693、0.616),Delong检验表明这两者的AUC具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  Ⅰ型RS1、Ⅰ型RS2及较小的最大直径可提示EGFR基因突变阳性,放射组学联合预测模型具有较高的预测效能,可辅助临床靶向治疗。
  第三部分 放射组学标签预测Ⅰ期NSCLC患者远处转移情况的初步研究
  目的:
  探索影响Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的术后远处转移情况的相关因素,评估放射组学标签用于预测Ⅰ期NSCLC患者预后的可行性。
  方法:
  回顾性收集2012年4月至2016年10月的404例NSCLC患者,其中243例作为训练集用于构建放射组学标签,其余161例作为验证集用于检验放射组学标签的可靠性。根据纳入标准和排除标准筛选出194例Ⅰ期NSCLC患者,并对其远处转移情况进行随访。计算7个临床特征、16个传统CT形态学特征及5个放射组学标签的风险比(HR)。采用log-rank检验进行单因素生存分析,在此基础上进行COX模型多因素分析,筛选独立预后因素。
  结果:
  随访时间为3~63个月(中位数为21个月),25例(12.9%)患者发生远处转移,其无转移生存期(DMFS)为3~54个月(中位数为15个月)。单因素分析显示,除年龄、吸烟情况、形状、分叶征、尖角征、空泡征、胸膜增厚及RS4之外,其余20个特征均与Ⅰ期NSCLC患者的远处转移相关(P<0.05)。多因素分析显示组织学亚型、胸膜凹陷征及RS1具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  在Ⅰ期NSCLC患者中,组织学亚型、胸膜凹陷征及RS1是影响其远处转移情况的独立预后因素,表现为非腺癌、Ⅱ型RS1及伴有胸膜凹陷征的患者趋向于发生术后远处转移。
[硕士论文] 王宇璐
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  探讨在中国汉族人群中,GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性的关系。并根据年龄、性别、吸烟情况、肿瘤家族史和病理类型进行分层分析,观察在各亚层中GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性之间的关联。
  研究方法:
  采用病例对照研究方法,选取上海及江苏泰州地区汉族人群中经病理诊断为肺癌患者974例和健康体检者1005例入组本研究。采集研究对象的外周静脉血标本,然后采用血液基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA,采用SNPscanTM方法对GSTP1基因rs1695位点进行基因分型。基因分型质量控制按照质量控制(QC)流程进行,包括大于95%的成功检出率、重复检出基因型、内部阳性对照样本检测以及Hardy—Weinberg遗传平衡检验。
  采用Student t检验及x2检验比较病例组与对照组在年龄、性别、吸烟状态、肿瘤家族史方面的差异,以及两组GSTP1基因rs1695位点A、G等位基因频率及AA、GA、GG基因型频率分布差异。用非条件logistic回归分析等位基因模型、基因型模型、显性基因模型和隐性基因模型与肺癌风险的关联,并对研究对象的年龄、性别、吸烟状况和肿瘤家族史进行校正,结果以比值比(odds ratios,ORs)及其95%的置信区间(confidence intervals,CIs)表示。采用SPSS19.0统计学软件进行所有统计分析,所有的p值都是双侧检验,p<0.05为具有统计学意义。
  研究结果:
  1.本研究包括974例肺癌患者及1005例健康体检者,两组性别、年龄比较差异无统计学意义(p=0.101,p=0.944)。肺癌组中吸烟者及有肿瘤家族史者均多于对照组,差异均有统计学意义(p<0.001)。
  2.本研究中基因分型检出率为99.9%。GSTP1基因rs1695A/G位点基因型频率符合Hardy—Weinberg遗传平衡(p>0.05)。
  3.肺癌组与对照组中A、G等位基因频率差异无统计学意义(x2=3.785,p=0.053),G等位基因携带者罹患肺癌的风险降低(OR=0.811,95%CI0.684-0.961,p=0.016)。两组间各基因型的分布频率差异无统计学意义(x2=4.072,p=0.131)。GG基因型使肺癌风险降低(OR=0.591,95%CI0.347-0.988,p=0.048),GA基因型与肺癌风险无明显关联(OR=0.838,95%CI0.683-1.028,p=0.091)。
  4.分层分析显示,G等位基因携带者罹患肺癌的风险在男性(OR=0.784,95%CI0.639-0.962,p=0.020)、有吸烟史的人群(OR=0.732,95%CI0.591-0.906,p=0.004)、无肿瘤家族史的人群(OR=0.782,95%CI0.643-0.950,p=0.014)以及肺腺癌患者(OR=0.798,95%CI0.641-0.990,p=0.042)中有所下降。在女性、无吸烟史的人群、有肿瘤家族史的人群以及肺鳞癌患者和小细胞肺癌患者中,是否携带G等位基因与肺癌发生风险之间无明显关联(p>0.05)。
  研究结论:
  GSTP基因rs1695位点多态性与肺癌发病风险相关联,有望成为肺癌风险预测的靶点。
[博士论文] 姚云峰
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  肺癌是致死率高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌(NSCLC)大约占肺癌类型的80%。2004年,人们发现在NSCLC中存在表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶结构域的突变,且大多数突变阳性的患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如吉非替尼及厄洛替尼等敏感。接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变阳性的NSCLC患者中位生存期较化疗明显提高。然而,即使存在EGFR敏感突变,其中仍有20-30%的患者对EGFR-TKI原发性耐药,且治疗有效的患者不可避免的会产生获得性耐药。目前,有关EGFR-TKI获得性耐药的机制研究较多,如EGFR看守基因的二次突变(T790M)(约占50%)、MET扩增(约20-25%)、肝细胞生长因子(HGF)高表达及向小细胞肺癌转化等。但有关原发性耐药机制研究相对滞后。
  Bim基因是Bcl-2家族促凋亡成员之一。有研究发现,Bim基因的表达状态可能与EGFR突变阳性患者对EGFR-TKI的疗效存在相关性,但Bim基因的表达调控机制不明。人抗原R(HuR)是胚胎致死视觉异常(ELAV)家族的RNA结合蛋白,它可调节多种分子mRNA的稳定性,如cyclin A、cyclin B、TNF-α、IL-6和IL-8等。HuR都是通过与靶基因的3'UTR端ARE元件结合,调控靶基因mRNA稳定性及蛋白的表达。我们分析Bim基因的mRNA序列后发现,其3'UTR端含有多个AU元件,具备与RNA结合蛋白相互作用的分子基础。因此,我们推测作为RNA结合蛋白之一的HuR可能会调控Bim表达。
  目的:
  研究HuR与Bim在NSCLC中的表达与EGFR-TKI药物敏感性的关系,对HuR通过调控Bim表达影响EGFR突变阳性的肺腺癌细胞株对EGFR-TKI原发耐药进行深入的研究,以期为临床判断EGFR-TKI药物治疗效果及克服耐药提供理论依据。
  方法:
  1、免疫组织化学法检测HuR和Bim蛋白在EGFR突变阳性NSCLC组织中的表达(54例临床评价敏感和27例临床评价原发耐药),并分析肿瘤HuR与Bim表达、临床病理特征间的关系,进一步亚组分析EGFR-TKI敏感患者中HuR、Bim表达与PFS之间的关系。
  2、以H1650、HCC827及PC-9肺癌细胞为主要体外模型,给予吉非替尼药物处理后,用CCK-8法检测三种细胞的增殖情况。
  3、应用Western blotting、定量RT-PCR方法检测三种细胞HuR、Bim mRNA和蛋白水平的表达。
  4、在HCC827细胞中用siRNA干扰HuR表达,用吉非替尼药物处理后,用CCK-8、AnnexinⅤ/PI双染色法检测干扰组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC50值。
  5、Western blotting和定量RT-PCR分别检测HCC827细胞干扰组及对照未干扰组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,以明确干扰HuR对Bim的影响。
  6、构建过表达HuR的慢病毒载体,包装病毒,随后感染H1650细胞;用CCK-8、AnnexinⅤ/PI双染色法检测感染组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC50值。
  7、Western blotting和定量RT-PCR分别检测H1650细胞感染组及对照组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,体外分析高HuR水平对H1650细胞Bim表达的影响。
  8、用Balb/c小鼠,建立高表达HuR的H1650细胞皮下移植瘤模型,并观察吉非替尼药物处理后移植瘤生长情况,分析高HuR水平对EGFR-TKI药物敏感性的影响。
  9、RT-PCR及Western blotting检测移植瘤HuR、Bim mRNA和蛋白表达情况。
  10、免疫组化染色检测H1650移植瘤、对照组移植瘤中HuR及Bim表达情况。
  结果:
  1、临床评价敏感组及原发耐药组NSCLC患者在性别方面存在显著差别(p=0.01),耐药组女性患者占18.5%,敏感组女性患者占57.4%。敏感组及耐药组在年龄、PS评分、突变类型、pTNM分期、是否有既往手术史、化疗史及是否存在脑转移等方面未见明显差别。
  2、在原发耐药组患者中,胞浆HuR阴性表达占81.5%;在敏感组患者中,阴性表达占20.4%;两组间表达率存在显著差异(p<0.001),耐药组患者HuR阴性表达率显著高于敏感组患者。同样,在原发性耐药的NSCLC患者中,Bim阴性表达占70.4%;在敏感组患者,阴性表达占7.4%;两组间表达率存在差异(p<0.001),耐药组患者Bim阴性表达率显著高于敏感组患者。
  3、在耐药组的患者中,胞浆HuR阴性表达与Bim阴性表达呈正相关(p<0.01);Bim表达与患者年龄、性别及突变类型不相关。
  4、在敏感组患者中,Bim阳性表达患者PFS为12.8个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,Bim阳性组PFS显著高于阴性组(p<0.01)。
  5、在敏感组患者中,HuR阳性表达患者PFS为16.5个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,HuR阳性组中位PFS显著高于阴性组。
  6、PC-9、HCC827及H1650细胞株对吉非替尼药物的细胞毒性实验结果发现:三种细胞的IC50值分别为0.05μml/L、0.004μml/L及21.28μml/L,三者比较前两种细胞对吉非替尼高度敏感,H1650细胞则对吉非替尼表现为耐药(p<0.01)。
  7、RT-PCR分析发现在三种肺癌细胞株中,HuR及Bim表达量存在差异,其中在H1650细胞株中HuR、BimmRNA表达显著低于另外两株细胞(p<0.01);Western blotting结果显示,在H1650细胞株中HuR及Bim蛋白表达显著低于另外两株细胞株。
  8、我们利用小于扰RNA对高表达HuR的HCC827细胞进行瞬时转染,转染后行吉非替尼药物毒性试验,结果发现HCC827未干扰组其IC50值为0.004μM,干扰组为8.142μM,干扰组细胞表现出对吉非替尼耐药。两组细胞给予吉非替尼药物处理后行细胞凋亡检测发现,HCC827细胞干扰组调亡率较对照未干扰组降低(p<0.05)。
  9、RT-PCR检测结果提示HCC827干扰组细胞HuR mRNA表达量低于未干扰组(p<0.01);Western blotting结果显示干扰组HuR蛋白表达显著低于未干扰组。我们对HCC827细胞Bim mRNA及蛋白进行检测,RT-PCR结果发现干扰组Bim mRNA表达明显低于未干扰组(p<0.01),Western blotting结果显示蛋白表达干扰组低于未干扰组。
  10、我们构建了过表达HuR慢病毒表达载体(GV365-HuR),转染H1650细胞后获得稳定过表达HuR的H1650细胞株。
  11、过表达HuR的H1650细胞株及对照组细胞分别给予吉非替尼处理,CCK-8法测定结果发现IC50值分别为0.875μM、21.28μM(p<0.01),提示过表达HuR增加了NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性。细胞凋亡结果提示,过表达HuR的H1650细胞凋亡率较对照组显著升高(p<0.01)。
  12、RT-PCR结果提示,过表达HuR的H1650细胞HuR及Bim mRNA表达量显著高于对照组(p<0.01);Western Blotting结果显示HuR及Bim蛋白表达水平也显著高于对照组。
  13、动物实验结果显示,过表达HuR的移植瘤经吉非替尼处理后,与对照组比较肿瘤生长明显受到抑制。处死小鼠后发现,过表达HuR的移植瘤体积及重量显著低于对照组。
  14、免疫组化结果显示,过表达HuR移植瘤肿瘤胞浆HuR阳性、Bim阳性均高于对照组。
  15、RT-PCR及Western blotting结果显示过表达HuR移植瘤HuR和Bim表达水平显著高于对照组。
  结论:
  证实Bim基因表达下调是引起EGFR突变型NSCLC对EGFR-TKI天然耐药的重要因素,同时确定HuR通过调节Bim表达,导致耐药。
[硕士论文] 程小龙
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:
  肺癌是当前全球范围内发病率及肿瘤相关病死率均最高的恶性肿瘤。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是最常见的内分泌疾病,其中绝大部分为2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)。流行病学资料显示T2DM是多种肿瘤发病及预后的危险因素。但目前关于T2DM与肺癌预后关系的研究相对较少,且结论相互矛盾。本文旨在通过对52例在我院接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ肺癌合并T2DM患者与63例同期在我院接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ肺癌不合并T2DM患者进行回顾性预后分析,探讨合并T2DM对接受一线含铂类双药联合方案化疗的晚期肺癌患者预后的影响。
  方法:
  通过检索第二军医大学附属长海医院病案管理系统,收集2011年1月至2015年12月期间在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ期肺癌合并T2DM患者为DM组,同时以1∶1的比例收集同期在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ期肺癌不合并T2DM患者为对照组,记录患者肺癌确诊时的年龄、性别、有无吸烟史、是否合并其他慢性疾病、肺癌病理类型等一般临床特征。并通过住院记录、门诊记录、电话咨询或邮件及信件联系,随访患者的无进展生存期(progression free survival,PFS)及总体生存期(overall survival,OS)。应用卡方检验及T检验比较两组患者之间一般临床特征的差异。应用单因素生存曲线比较法(Kaplan-Meier法)比较两组患者之间PFS与OS是否存在差异。行多因素生存分析(Cox回归分析),评估T2DM、年龄、性别、吸烟史、其他慢性合并症、病理类型等相关因素对晚期肺癌化疗患者PFS与OS的影响。
  结果:
  共收集到5年时间内在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗Ⅳ期肺癌合并T2DM患者88例,同时收集同期在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗Ⅳ期肺癌不合并T2DM患者88例。按照纳入标准,最终共115例患者纳入研究,其中DM组52例,对照组63例。一般临床特征比较结果显示DM组患者年龄大于对照组,平均年龄为64±7岁vs61±8岁(t=2.669,P=0.009);DM组男性、有吸烟史、有其他慢性疾病史的患者比例高于对照组,分为38/52vs32/63(X2=5.939,P=0.015)、25/52vs18/63(X2=4.630P=0.031)、30/52vs21/63(X2=6.849P=0.009)。病理类型分为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两大类,两组患者之间病理类无显著差异,SCLC/NSCLC为5/47vs3/60(X2=1.037P=0.422)。单因素生存曲线分析显示对照组与DM组患者PFS为13月(95%CI9-17月)vs8月(95%CI6-9月),(P=0.135),对照组患者PFS有长于DM组的趋势,但差异无统计学意义。而对照组患者OS显著长于DM组为36月(95%CI28-43月)vs18月(95%CI15-22月),(P<0.001)。多因素生存分析显示T2DM对患者PFS的影响为(HR=0.719,95%CI:0.451-0.145;P=0.165),对OS的影响为(HR=0.539;95%CI:0.334-0.870;P=0.011),合并T2DM以外其他慢性疾病对患者PFS与OS的影响分别为(HR=1.179;95%CI.:0.736-1.890;P=0.493)与(HR=1.756;95%CI:1.080-2.856;P=0.023)。
  结论:
  接受一线含铂类双药联合方案化疗的晚期肺癌合并T2DM患者总生存期显著短于不合并T2DM者,T2DM是此类患者长期生存独立且显著的危险因素,而T2DM对晚期接受化疗肺癌患者疾病进展期无显著影响。此外,合并T2DM以外其他慢性疾病也是晚期肺癌化疗患者长期生存独立且显著的危险因素。这说明晚期肺癌患者的治疗,是需要以病人为中心,以患者整体健康的维护与促进为目标的长期综合性健康管理。
[硕士论文] 许洋
放射医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  原花青素是目前已知的抗氧化能力最强的天然提取物,远高于日常使用的维生素C及维生素E。其具有来源广泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的优势。此外,原花青素的生物体内的半数致死剂量超过5000mg/kg,远远大于治疗剂量。原花青素对肺组织相关炎症及疾病具有较好的治疗作用:原花青素可以有效减轻角夹胶诱导的肺组织急性炎症反应,减轻小鼠哮喘模型的急性气道炎症反应,抑制肺水肿的形成,且对博来霉素诱导的肺炎具有很好的治疗作用。本实验室前期研究成果发现,原花青素可以显著减轻辐照后早期放射性肺炎的炎症渗出和晚期放射性肺纤维化的发生,降低辐射所导致的肺组织上皮间质转化程度,减轻炎症因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改变程度。另外,与其他抗氧化剂不同的是,原花青素是一种缓释抗氧化剂,他可以在血液和组织中存留7-10天,发挥持续的抗氧化作用,这对于病情进行性进展的放射性肺损伤的防治具有独到的优势。此外,原花青素还具有抗肿瘤作用。过去的十年体外细胞实验和动物实验均已经证明原花青素对皮肤癌,乳腺癌,前列腺癌,头颈部肿瘤和肺癌等肿瘤细胞增殖具有明确抑制作用。研究者还在体外实验中证实原花青素对正常细胞的生长和活力没有明显影响,而只对肿瘤细胞表现出杀伤作用。综合以上的特点,推测,原花青素有希望在肺癌放疗过程中,防护放射野内正常的肺组织的同时,对肺癌细胞又起到抑制增殖的作用。本课题将重点研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用及其分子机制。
  研究目的:
  (一)小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。
  通过原位肺内注射法建立原位肺癌模型。特点:以左肺上叶作为肺癌细胞的生长环境,通过基质胶固定细胞位置。
  (二)原花青素在肺癌放疗中的双向作用。
  1、原花青素在细胞作用中的研究。
  (1)通过CCK8检测原花青素在小鼠正常肺上皮细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的毒性;
  (2)通过流式检测及克隆形成率实验检测原花青素对肺正常细胞的辐射防护作用及对肺肿瘤细胞的辐射增敏作用。
  2、原花青素在肺癌模型中的作用。
  (1)原花青素能够抑制小鼠肿瘤的生长及转移
  ①原花青素抑制小鼠皮下肿瘤的生长;
  ②原花青素抑制小鼠肿瘤的转移。
  (2)原花青素影响荷瘤小鼠局照后的生存状况;
  (3)原花青素对荷瘤小鼠局照后肿瘤大小及肺叶重量的影响;
  (4)原花青素减少荷瘤小鼠局照后正常肺组织的炎性渗出;
  (5)原花青素能够减少小鼠肺正常组织照射后的凋亡,而促进照射后肿瘤组织的凋亡,同时抑制其增值;
  (6)原花青素能够调节Th1/Th2相关细胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的机制研究。
  1、原花青素可以明显降低辐照后A549及BEAS-2B细胞中活性氧的产生;
  2、原花青素对肺正常细胞及肿瘤细胞内的p-ERK、p-JNK及p-P38表达情况的影响具有差异;
  3、原花青素可以激活肺正常细胞及肿瘤细胞Sirt6蛋白的表达;
  4、研究肺正常细胞及肿瘤细胞过表达Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表达情况;
  5、通过抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况,判断Sirt6蛋白在原花青素中的作用。
  研究方法:
  (一)建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。
  1、用胰岛素注射器将肿瘤细胞与基质胶的混悬液注射入小鼠左上肺叶,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;
  2、使用本实验室设计的固定小鼠模具,采取铅块遮挡的方式建立肺部局照放射模型;
  3、照射方式:采用25Gy60Coγ射线单次照射,剂量率为1Gy/min。
  (二)研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用
  1、选取小鼠肺上皮细胞MLE-12、肺癌细胞LLC及人正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺腺癌细胞A549进行试验;
  (1)细胞分组:对照组、原花青素处理组、照射组、照射组加原花青素处理组,每种细胞分组相同,照射剂量为8Gy;
  (2)细胞照射及原花青素处理后对正常细胞及肿瘤细胞增殖能力的影响:流式细胞仪检测及克隆形成率;
  2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基础上检测原花青素的双向作用
  (1)小鼠分为:假手术对照组、假手术肺部照射组、肺部荷瘤对照组、肺部荷瘤原花青素处理组、肺部荷瘤照射组及肺部荷瘤原花青素加照射组,共6组,每组选用雄性8周C57BL/6小鼠3只;
  (2)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠的生存影响:检测荷瘤小鼠生存期及体重;
  (3)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠肿瘤的影响:检测肿瘤大小,H&E染色及小鼠左上肺叶重量;
  (4)免疫荧光检测正常肺组织及肿瘤组织的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;
  (5)检测原花青素对小鼠免疫细胞因子的影响:用ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-6和IFN-γ。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的分子机制
  1、检测原花青素对照射后细胞内活性氧的清除:ROS检测试剂盒;
  2、检测原花青素对照射后细胞内相关蛋白变化的影响:Western blot;
  3、检测原花青素对照射后原位荷瘤小鼠正常肺组织及肿瘤组织蛋白的影响:Western blot;
  4、通过改变细胞内Sirt6的表达检测p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达:Sirt6过表达质粒的转染、Western blot;
  5、通过选取抑制剂S1805、SP600125及SB203580分别抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况:Western blot。
  研究结果:
  (一)成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型
  1、成功建立小鼠左上肺叶原位肺癌荷瘤模型,肿瘤生长符合实验要求;
  2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。
  (二)原花青素在肺正常细胞及肿瘤细胞放疗中的双向作用
  1、对小鼠肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少小鼠肺上皮细胞MLE-12照射后的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对小鼠肺上皮细胞MLE-12具有辐射防护作用,对小鼠肺癌细胞LLC具有辐射增敏作用;
  2、对人肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少人正常肺上皮细胞BEAS-2B凋亡且促进人肺腺癌细胞A549的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞具有辐射防护作用,且能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,具有辐射增敏作用;
  (三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放疗中的双向作用研究
  1、通过观察并记录原位肺癌荷瘤小鼠的生存情况,发现:原花青素处理加照射组相比于照射组,其存活时间更长;
  2、通过对小鼠肺内肿瘤的测量,发现:原花青素处理加照射抑制小鼠左上肺叶内肿瘤的生长,相比较于单纯照射组,效果更加明显;
  3、通过荧光免疫分别标记增殖相关蛋白Ki67及凋亡相关蛋白p53,发现:在小鼠正常肺组织内,原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显降低;在肿瘤组织内,单纯处理组的Ki67的表达量相比于对照组明显降低,而原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显升高;
  4、通过ELISA检测荷瘤小鼠血清细胞因子的表达量,发现:原花青素加照射组相比于单纯照射组,能够明显抑制IL-6、提高IFN-γ的表达,促进对肿瘤的抑制,降低炎性损伤。
  (四)原花青素在肺癌放疗中的可能作用机制
  1、原花青素能够显著清除人肺癌细胞A549及正常肺上皮细胞BEAS-2B照射后所产生的自由基;
  2、在人肺癌细胞A549中,原花青素明显提高照射后p-JNK蛋白的表达;在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可以明显抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而这与其能够清除活性氧自由基有关。
  3、在人肺癌细胞A549中,原花青素通过增加Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用
  研究结论:
  在细胞层面上发现,原花青素对小鼠肺癌细胞LLC及人肺癌细胞A549具有辐射增敏作用,对小鼠肺正常细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B具有辐射防护作用。在人肺癌细胞A549中,原花青素可以通过提高Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用。在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可能通过清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎症作用。通过建立小鼠原位肺癌的放疗模型,发现原花青素能提高小鼠的生存期,可以改变血清细胞因子的表达,能够减少小鼠肺正常组织的辐射损伤,同时对肿瘤具有放疗增敏的作用。
[硕士论文] 李涛
应用统计 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。统计学习作为机器学习的一个重要组成部分,在近年来大数据背景的基础上,发展的更为迅速,其中的一些经典方法可以作为识别肺癌的工具加以运用。
  本文回顾了肺癌诊断的历史和现状,介绍并讨论了人工神经网络模型和决策树模型的背景以及对于肺癌数据的建模与预测。建模过程使用了当下机器学习里的主流方法之二:BP神经网络模型和决策树模型。在BP神经网络的模型算法中,将所获得的病例样本在一定的比例下随机分为训练集和预测集,训练人工神经网络模型,并选择合适的隐层神经元数。之后用预测集来测试该模型区分肺癌患者和正常人的能力,通过修正模型中相关的参数,直至确定最合适的神经网络模型。在决策树部分,选择合适的变量并根据其取值条件,将数据分成两个或者多个的纯度更大的数据集,直到达到预先设定的条件为止,并且选择合适的剪枝来防止过度拟合来确定最优的模型。最后,文章对两个模型进行总结并且阐述了机器学习方法在癌症诊断领域的重要使命。
[博士论文] 陈利娟
肿瘤学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目前,肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌从病理类型上分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC中约50%会发生脑转移(BM)。本研究通过组织中检测miR-375在NSCLC脑转移患者中的表达,并与未发生脑转移的NSCLC患者对照,明确miR-375在脑转移中的作用,为NSCLC脑转移提供早期诊断的分子标记物;通过生存及预后研究,明确miR-375在NSCLC患者尤其是NSCLC脑转移患者中的预后重要性。通过构建miR-375慢病毒载体并转染至非小细胞肺癌细胞中,形成稳定克隆,探讨miR-375对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响,并探讨miR-375在NSCLC发生发展及发生脑转移中的可能机制,为以后开展动物实验提供较明确的研究方向,未来可能为NSCLC脑转移的治疗提供靶点。
  目的:
  (1)检测miRNA-375在非小细胞肺癌脑转移和非小细胞肺癌未发生脑转移患者组织中的表达差异,明确miRNA-375在非小细胞肺癌发生脑转移中的作用,并分析miRNA-375在NSCLC患者和NSCLC脑转移患者预后中的作用。
  (2)通过构建miR-375和anti-miR-375的病毒质粒,转染至非小细胞肺癌细胞系中,研究miR-375对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响。
  (3)通过检测miR-375下游蛋白的表达,探索miR-375在非小细胞肺癌及发生脑转移中的可能机制。
  方法:
  (1)MiR-375作用研究收集30例非小细胞肺癌脑转移患者肿瘤组织标本(包括原发肺癌组织和脑转移瘤组织)及癌旁组织标本,通过实时荧光定量逆转录PCR方法(quatitive Real-time PCR,qRT-PCR)检测miR-375在非小细胞肺癌脑转移患者肺部原发灶、脑转移灶、癌旁组织中的表达情况;收集30例非小细胞肺癌未发生脑转移患者的肺癌原发灶、癌旁组织标本,qRT-PCR检测miR-375的表达。以上根据组织来源可分为四组来研究miR-375的表达水平,即NSCLC脑转移患者脑部转移灶、NSCLC脑转移患者肺部癌组织、NSCLC未发生脑转移患者肺部癌组织及癌旁组织组。通过t-检验比较miR-375在NSCLC脑转移和NSCLC未发生脑转移患者中表达水平的统计学差异。
  (2)统计方法研究生存、预后及NSCLC脑转移相关分子的探索通过方差分析研究miR-375的表达与患者临床病理特征(分期、淋巴结转移、脑转移)的关系。Log-rank检验和Kaplan-Meier生存曲线比较总生存时间与miR-375表达的关系。应用多因素COX回归模型明确NSCLC患者和NSCLC脑转移患者预后影响因素。PCR法检测EGFR、K-ras突变,免疫组化SP法检测VEGF、MMP-9的表达,应用卡方检验明确EGFR突变、K-ras突变、VEGF表达、MMP-9表达与脑转移的关系,并应用t-检验分析EGFR突变、K-ras突变、VEGF表达、MMP-9表达与miR-375表达的关系。
  (3)通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切及连接后产生携带miR-375-EGFP、anti-miR-375-EGFP和EGFP三个质粒,用HIV包被及转染HEK-293T细胞,后侵染非小细胞肺癌A549细胞,筛选出3个抗性克隆A549-miR375-GFP、A549-anti-miR375-GFP、A549-GFP,并用A549作为空白对照。通过培养和筛选形成,形成4组稳定的细胞系。MTT法测定细胞增殖,通过Transwell侵袭和迁移实验、划痕试验研究miR-375对非小细胞肺癌细胞生物学特征的影响。
  (4)应用体外成管实验明确miR-375的作用机制,Western blot法检测下游VEGF、MMP-2、MMP-9、EGFR的表达,探索miR-375在非小细胞及脑转移发生发展中的可能机制。
  结果:
  (1)MiR-375在非小细胞肺癌脑转移灶、非小细胞肺癌脑转移患者肺部原发癌组织、非小细胞未发生脑转移患者原发肺癌组织、癌旁组织表达量分别为:0.28±0.05,0.47±0.06,0.71±0.13,1.00±0.17。每两组之间的差别均有统计学意义(P<0.05)。与NSCLC未发生脑转移的患者相比,NSCLC脑转移患者miR-375的表达水平呈明显下调,并且同一NSCLC脑转移患者miR-375在脑转移灶中的表达低于肺部原发癌组织,且二者差别有统计学意义(P<0.05);NSCLC未发生脑转移患者原发肺癌组织中miR-375的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.01)。
  (2)MiR-375的低表达与NSCLC患者的分期晚和脑转移灶数目增多相关。对于该研究60例NSCLC患者来说,miR-375低表达组OS明显短于高表达组,且二者差别具有统计学意义(log-rank test P<0.01);同样,对于NSCLC脑转移患者来说,miR-375低表达组生存时间明显短于高表达组(log-rank test P<0.05)。MiR-375的表达是NSCLC患者独立的预后因子。与NSCLC脑转移相关的分子为VEGF和MMP-9的表达,而EGFR和K-ras突变与脑转移无明显相关;VEGF和MMP-9在miR-375低表达的患者中呈明显过表达,而EGFR和K-ras突变与miR-375的表达水平无关。
  (3)通过稳定转染,筛选并培养成功以下四个A549细胞系:A549-miR-375-GFP、A549-anti-miR-375-GFP、A549-GFP和A549。MTT增殖实验:A549-miR-375-GFP组细胞的增殖率较A549-GFP(Control)组和A549空白对照组明显降低,且差别具有统计学意义(P<0.05)。而A549-anti-miR-375-GFP组较空白对照组和Control组增殖率明显升高(P<0.01)。空白对照组和阴性对照组(Control组)二者无明显差别(P>0.05)。而观察72小时荧光显微镜下细胞增殖最快的为A549-anti-miR-375-GFP组,最慢的为A549-miR-375-GFP组。
  (4)Transwell侵袭实验结果显示,A549细胞能侵袭穿越基质胶。A549-miR-375-GFP组穿膜细胞数较少,为75.12±6.21,明显低于空白组(125±10.27)和Control组(129.51±8.28)(P<0.05);A549-anti-miR-375-GFP组穿膜细胞数最多,为199.67±9.23,明显高于空白组和Control组(P<0.05)。空白组和Control组差别无统计学意义(P>0.05)。
  (5)Transwell迁移实验结果显示,A549-miR-375-GFP组穿膜细胞数较少,为50.33±9.32,低于空白组(108±9.38)和Control组(110±7.82)(P<0.05);A549-anti-miR-375-GFP组穿膜细胞数最多,为178±10.89,明显高于空白组和Control组(P<0.05)。空白组和Control组差别无统计学意义(P>0.05)。
  (6)划痕实验:A549-miR-375-GFP组、A549-anti-miR375-GFP、A549-GFP三组分别用100ul无菌枪头垂直划痕,记为0小时,24小时候观察划痕区发现A549-anti-miR375-GFP划痕区最小,细胞几乎全部侵入;而A549-miR-375-GFP组划痕区最大,细胞迁入明显最慢,而A549-GFP组划痕区范围居以上二者中间。
  (7)体外成管实验:细胞系放入细胞培养箱中,观察成管,1周后发现3D成像,A549--miR375-GFP和A549-GFP组3D成像未发现成管现象,而A549-anti-miR375-GFP3D成像成管较多。
  (8)Western Blot检测EGFR、VEGF、MMP-2、MMP-9的表达:VEGF、MMP-2、MMP-9在PC14/B中呈明显高表达,而在PC14中呈低表达。A549细胞系中,A549-miR-375-GFP组VEGF、MMP-2、MMP-9呈低表达,而在A549-anti-miR375-GFP组中VEGF、MMP-2、MMP-9呈明显过表达,另外A549-GFP组和A549组VEGF、MMP-9无明显差别,而MMP-2在A549-GFP组中表达较A549高。EGFR在PC14和PC14/B中无明显差异,并且在A549细胞各组之间表达无明显差别。
  结论:
  1.本研究表明miR-375与NSCLC脑转移明显相关,miR-375的下调可作为预测NSCLC脑转移的因子,可用于筛查出脑转移高危人群。MiR-375有望在早期诊断中发挥作用。
  2.MiR-375的表达与分期晚和脑转移明显相关;MiR-375在NSCLC和NSCLC脑转移患者中表达水平越低,生存时间越短,并且miR-375的表达水平是NSCLC患者的独立预后因子。
  3.MiR-375的下调可促进非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移及血管生成,miR-375可能通过血管生成途径与非小细胞肺癌增殖、侵袭甚至脑转移相关。MiR-375将来可能为非小细胞肺癌脑转移的治疗提供了新的靶点或新的治疗药物。
  4.EGFR突变和K-ras突变与非小细胞肺癌脑转移无明显相关。
[硕士论文] 王鑫
生物学;细胞生物学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:真核生物的转录过程在生物个体发育以及疾病发生中具有举足轻重的地位。RNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)负责mRNA的初步合成。目前的研究表明polⅡ不能独立起始转录,在一些情况中polⅡ与通用转录因子结合后会停留在转录起始位点附近,等待合适的信号输入后,在正性转录因子(P-TEFb)的作用下磷酸化polⅡ的羧基末端,被激活的polⅡ将继续行使转录功能。这种模式被称为转录延伸检查点调控(Transcriptional Elongation Checkpoint Control,TECC)。
  超级延伸复合物(Super Elongation Complex,SEC)在这一步中发挥了重要作用,该复合物主要包括转录延伸因子ELL蛋白,正性转录延伸因子P-TEFb以及几种混合白血病易位伴侣蛋白,例如AFF1,AFF4,ENL和AF9。SEC与发育及癌症发生具有密切联系,以往的研究表明SEC中的AFF1参与急性白血病的发生,然而AFF1对实体肿瘤的作用尚无明确的报导。
  本实验室研究发现,SEC组分AFF1与非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)存在密切联系。结合RNA干扰与与基因表达差异性分析技术,我们在非小细胞肺癌细胞系中敲低AFF1表达水平后发现,CXC趋化因子的转录本含量也随之下调。通过分析转录组测序数据,我们发现在CXC家族中,CXCL1,CXCL3以及CXCL5的mRNA水平与AFF1相关。结合ChIP-Seq数据,我们发现AFF1能够结合在编码CXC因子的基因上,染色质免疫共沉淀实验显示,除了AFF1,SEC的其它组分也结合在CXC家族基因座上。我们认为AFF1对趋化因子家族的调控依赖于SEC复合物的形成。
  该研究工作揭示了实体肿瘤中AFF1蛋白对趋化因子的调控作用,能够为非小细胞肺癌的治疗提供新的思路。
[硕士论文] 张志浩
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  表皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)开启了非小细胞肺癌(NSCLC)个体化治疗时代,已经成为EGFR突变阳性的晚期NSCLC一线标准治疗。然而不可避免地是,在EGFR-TKI治疗NSCLC的过程中均出现获得性耐药。EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC的治疗策略选择尤为重要。放射治疗作为EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC的局部治疗重要选择之一,在后续治疗中发挥着重要作用。有临床研究表明:放疗作为EGFR-TKI耐药后NSCLC的治疗策略能延长患者的生存时间。但放疗抗拒是制约放疗疗效的重要原因。EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC对放疗敏感性如何?目前针对EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC放疗疗效的预测尚缺乏有效相关指标。既往研究显示,上皮-间质转化(EMT)是EGFR-TKI获得性耐药的重要机制之一,在临床研究发现EMT阳性患者放化疗效果差,而基础研究表明EMT不仅与肿瘤的侵袭、远处转移,还与肿瘤放疗抗拒密切相关。为此,我们提出科学假设:EMT状态对NSCLC获得性耐药后放射敏感性存在影响,可能是EGFR-TKI获得性耐药后预测放疗敏感性的有效指标。
  研究方法:
  本研究选用EGFR19外显子缺失突变的人肺腺癌细胞PC-9及对吉非替尼产生获得性耐药的PC-9/AB细胞株。按以下方法进行实验研究:
  1、采用PCR技术检测PC-9和PC-9/AB细胞EGFR基因突变情况,FISH法检测c-Met基因扩增情况;用细胞增殖/毒性实验(CCK8法)检测两组细胞对吉非替尼的敏感性;
  2、比较PC-9和PC-9/AB细胞的放射敏感性:采用CCK8法检测不同剂量X射线照射之后两组细胞的相对细胞存活数、平板克隆实验检测不同剂量X射线照射之后其克隆成形能力,以及流式细胞术检测4Gy剂量X射线照射之后细胞凋亡情况,对比两组细胞对X射线的敏感性;
  3、采用免疫印迹法(Western Blotting)检测两组细胞中EMT相关蛋白E-cadherin、Vementin和EMT相关转录因子Snail等表达水平,同时观察细胞形态学的变化,确定细胞株的EMT状态;再通过划痕愈合实验检测两组细胞的迁移能力;初步探讨伴EMT的获得性耐药是否影响其放射敏感性的原因;
  4、通过TGF-β1诱导PC-9细胞后获得PC-9/TGF细胞;检测EGFR基因突变情况和c-Met基因扩增情况;Western Blot检测发生EMT情况,以及划痕愈合实验检测细胞迁移能力变化情况;CCK8法检测对吉非替尼敏感性。再比较PC-9、PC-9/TGF和PC-9/AB三组细胞的放射敏感性:采用CCK8法检测不同剂量X射线照射之后三组细胞的相对细胞存活数、平板克隆实验检测不同剂量X射线照射之后克隆成形能力,以及流式细胞术检测4Gy剂量X射线照射之后细胞凋亡情况,进行多重比较,来对比三组细胞对X射线的敏感性,从正方向验证EMT与NSCLC细胞EGFR-TKI获得性耐药后放射敏感性相关;
  5、采用慢病毒转染技术将PC-9/AB细胞转染CDH1基因后获得PC-9/AB-CDH1细胞;检测EGFR基因突变情况和c-Met基因扩增情况;Western Blot检测逆转EMT情况,以及划痕愈合实验检测细胞迁移能力变化情况;CCK8法检测对吉非替尼敏感性。再比较PC-9/AB细胞和PC-9/AB-CDH1细胞的放射敏感性:采用CCK8法检测不同剂量X射线照射之后两组细胞的相对细胞存活数、平板克隆实验检测不同剂量X射线照射之后其克隆成形能力,以及流式细胞术检测4Gy剂量X射线照射之后细胞凋亡情况,来对比两组细胞对X射线的敏感性,从反方向验证EMT在NSCLC细胞EGFR-TKI获得性耐药后放射敏感性的关系。
  研究结果:
  1、经检测PC-9和PC-9/AB细胞均为EGFR基因19外显子突变,18、20、21外显子无突变,无T790m突变,无c-Met扩增。对两组细胞进行了吉非替尼的敏感性检测,结果显示:人肺腺癌细胞株PC-9/AB细胞对吉非替尼的敏感性明显低于亲本细胞株PC-9,IC50分别为9.68μmol/L和0.06μmol/L(P<0.01);
  2、获得性耐药的PC-9/AB细胞放射敏感性较PC-9显著降低:随着照射剂量的增加,PC-9和PC-9/AB细胞相对细胞存活数均逐渐减少。PC-9/AB细胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量组相对细胞存活数均明显高于PC-9细胞(P<0.05);PC-9/AB细胞在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy剂量组克隆成形率高于PC-9(P<0.05);在4Gy剂量照射下,PC-9/AB细胞凋亡率低于PC-9,凋亡率分别为(14.80±1.06)%VS(30.52±2.76)%(P<0.05);
  3、与PC-9相比,PC-9/AB细胞出现EMT表型,表现为PC-9/AB细胞生物学形态发生明显改变,细胞间连接变疏松,细胞出现梭形改变,即由上皮细胞形态向间质细胞形态转变;PC-9/AB上皮型标记蛋白E-Cadherin表达减少,间叶型标记蛋白Vimentin表达增加,与EMT相关转录因子Snail表达增加,PC-9/AB细胞较PC-9划痕愈合率明显提高,24h愈合率从(33.47±1.38)%提高至(53.23±2.18)%,48h愈合率从(49.84±0.78)%提高至(83.88%±3.35)%,迁移能力明显增强;
  4、TGF-β1诱导产生的细胞株PC-9/TGF细胞基因检测为EGFR基因19外显子突变,18、20、21外显子无突变,无T790m突变,无c-Met扩增。相对于PC-9细胞,PC-9/TGF细胞出现EMT表型,表现为PC-9/TGF细胞间连接变疏松,细胞呈梭形,即由上皮细胞形态向间质细胞形态转变,PC-9/TGF细胞的上皮型标记蛋白E-Cadherin表达减少,间叶型标记蛋白Vimentin表达增加,与EMT相关转录因子Snail表达增加;PC-9/TGF细胞较PC-9划痕愈合率明显提高,24h愈合率从(33.47±1.38)%提高至(51.05±1.34)%,48h愈合率从(49.84±0.78)%提高至(80.50±3.23)%,其迁移能力显著增强;PC-9/TGF细胞对吉非替尼的敏感性较PC-9显著降低,IC50值为6.21μmol/L和0.06μmol/L(P<0.01);
  5、诱导出现EMT的PC-9/TGF细胞放射敏感性显著降低:随着照射剂量的增加,PC-9、PC-9/TGF以及PC-9/AB三组细胞的相对细胞存活数均逐渐减少。PC-9/TGF细胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量组相对细胞存活数与PC-9相比增加(P<0.05);PC-9/TGF细胞克隆成形率较PC-9增加(P<0.05);在4Gy剂量照射下,PC-9/TGF细胞较PC-9细胞凋亡减少,分别为(15.24±2.03)%VS(30.52±2.76)%(P<0.05);而PC-9/TGF和PC-9/AB两组细胞间相对细胞存活数、克隆成形率和凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);
  6、PC-9/AB转染CDH1基因后获得的PC-9/AB-CDH1细胞基因检测为EGFR基因19外显子突变,18、20、21外显子无突变,无T790m突变,无c-Met扩增。相对于PC-9/AB细胞,PC-9/AB-CDH1细胞逆转了EMT,表现为其细胞间连接变紧密,细胞恢复类圆形,即由间质细胞形态向上皮细胞形态转变;PC-9/AB-CDH1细胞的上皮型标记蛋白E-Cadherin表达增加,间叶型标记蛋白Vimentin表达减少,与EMT相关转录因子Snail表达减少;PC-9/AB-CDH1细胞较PC-9/AB细胞划痕愈合率下降,24h愈合率从(53.23±2.18)%下降至(37.16±4.15)%,48h愈合率从(83.88%±3.35)%下降至(49.32±3.12)%,其迁移能力减低;PC-9/AB-CDH1细胞对吉非替尼的敏感性明显高于PC-9/AB细胞,IC50值为分别为1.25μmol/L和9.68μmol/L(P<0.01);
  7、逆转EMT后PC-9/AB-CDH1细胞放射敏感性较PC-9/AB细胞显著增加:随着照射剂量的增加,两组细胞相对细胞存活数均逐渐减少。PC-9/AB-CDH1细胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量组细胞相对存活数较PC-9/AB细胞减少(P<0.05);PC-9/AB-CDH1细胞在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy剂量组克隆成形率较PC-9/AB细胞减少(P<0.05);在4Gy剂量照射下,PC-9/AB-CDH1细胞较PC-9/AB细胞凋亡增多,凋亡率为(33.85±2.10)%VS(14.80±1.06)%(P<0.05)。
  研究结论:
  本研究发现:伴有EMT的对吉非替尼获得耐药EGFR突变型NSCLC细胞PC-9/AB发生了放射抵抗,与其亲本细胞PC-9相比放射敏感性显著下降,PC-9经TGF-β诱导产生EMT后,其放射敏感性下降;而逆转PC-9/AB的EMT在恢复对吉非替尼敏感性的同时也增强了放射敏感性。提示EMT在NSCLC细胞EGFR-TKI继发性耐药后放射敏感性中有重要影响,EMT与NSCLC EGFR-TKI获得耐药后发生放射敏感性下降相关,可能作为EGFR-TKI获得耐药后放疗敏感性预测指标。
[硕士论文] 李林
外科学(骨肿瘤外科) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  癌症类型中,肺癌是发病率和死亡率最高的肿瘤之一,约有30%~40%的中晚期肺癌病人会发生骨转移,严重危害人类的健康和生活质量。黑色素瘤特异性抗原(Preferentially expressed antigen of melanoma,PRAME)是于众多黑色素瘤病人群体中筛查得出,它是一种表面抗原,细胞毒性T淋巴细胞可以识别PRAME,随即引发特异肿瘤的相关性溶解。目前,国内外研究已确定PRAME可以作为一个判断该肿瘤患者预后及复发情况的重要指标,PRAME在原发性骨肉瘤,皮肤鳞状细胞癌等肿瘤中的表达高低也预示着肿瘤的演出转移情况。为了阐明PRAME在肺癌骨转移及其对下游基因信号通路调控的作用机制,设计了本实验研究。
  研究方法:
  1.检测正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及骨转移肿瘤标本中PRAME表达水平获取正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及肺癌骨转移肿瘤组织,通过蛋白质免疫印记检测蛋白电泳及实时定量聚合酶链式反应等检测明确PRAME,E-cadherin在表达水平上的差异及意义。
  2.检测PRAME对肺癌细胞系迁移及侵袭能力的影响体外验证PRAME基因在肺癌骨转移中的影响,建立稳定敲除PRAME的肺癌骨转移亚克隆细胞系PC9及A549,利用MTT,侵袭实验等技术检测细胞迁移和增殖能力及PRAME对E-cadherin蛋白水平和RNA水平的影响。
  3.小鼠骨肿瘤模型中PRAME表达水平对肺癌骨转移的影响骨内局部注射法利用上述PC9细胞系建立小鼠胫骨肺癌骨转移模型,通过实时定量聚合酶链式反应,蛋白质免疫印记检测,免疫组化等方法检测PRAME基因的表达与E-cadherin蛋白水平的关系,通过X-Ray,荧光标记活体成像等方法对小鼠肿瘤模型进行评估。
  研究结果:
  1.检测正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及骨转移肿瘤标本中PRAME表达水平蛋白质免疫印记检测及实时定量聚合酶链式反应的结果证实正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及肺癌骨转移肿瘤组织中PRAME及E-cadherin均有表达,其中正常人肺组织中的表达水平最高,骨转移组织最低。
  2.检测PRAME对肺癌细胞系迁移及侵袭能力的影响体外实验中,抑制PC9及A549的PRAME基因的表达,细胞迁移及增值活性上均明显低于对照组细胞系,同时E-cadherin蛋白表达水平与PRAME基因呈正相关。
  3.小鼠骨肿瘤模型中PRAME表达水平对肺癌骨转移的影响通过X-Ray照射发现抑制PRAME基因组的骨侵蚀的现象明显强于对照组,荧光标记活体成像结果也更加明显,取出肿瘤通过免疫组化染色等方法检测,发现抑制组PRAME基因表达明显降低,同时E-cadherin蛋白表达水平也明显降低。
  研究结论:
  肺癌骨转移肿瘤组织中PRAME的表达水平较正常肺组织及肺癌原位肿瘤组织低。下调PRAME表达水平可促进肿瘤细胞迁移和增值,E-cadherin蛋白在这一过程中起重要作用。
[博士论文] 张新丽
肿瘤学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  肺癌发病率、死亡率呈逐年上升趋势,已成为严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。由于早期缺乏明显的临床表现,30-40%肺癌患者在确诊时已经为中晚期。中央型肺癌常常伴有阻塞性肺炎,后者导致肺容积的减少最终出现阻塞性肺不张。
  肺不张和肺癌组织在常规的CT图像中显示密度相似,将肺癌和肺不张组织完全区别开来存在着一定的困难,但是将肿瘤与肺不张区别开来对于肺癌的临床分期、组织活检、肿瘤的靶区勾画以及疗效评价都具有重要意义。
  放射治疗是肺癌患者的一种重要治疗手段。肺癌的放疗靶区勾画目前多数是以增强CT为影像学基础。众所周之,CT图像的空间分辨率较高,而它的软组织分辨率则不是太理想,特别是对于合并肺不张的中央型肺癌患者,由于不张的肺组织和肺癌组织都可以表现为实体组织影像,因此单纯用CT来将肺肿瘤和不张肺组织区别开来有困难,而基于CT图像勾画的中央型肺癌的靶区精确性就存在一定的局限,如果将不张的肺组织误画为肿瘤组织,就会增加正常组织特别是肺组织的放疗受量,同时增加放射性肺炎等相关并发症的发生率,给患者的治疗后生活质量带来极大的损害。
  PET-CT是近几年发展较快的一种功能性影像学技术,该项技术的显像基础是18F-FDG在不同代谢水平组织可以出现浓聚程度的差异,而18F-FDG在组织内的浓聚程度与细胞内的糖酵解水平高低呈正相关。CT可显示机体精细的断层解剖结构,PET则能从分子水平上反映人体组织的代谢水平,因此PET-CT可以实现PET图像和CT图像的同机高精度融合。
  近年来,磁共振技术的发展较快,特别是硬件和软件水平的提高,使DWI-MRI技术在肿瘤的诊断治疗方面的应用受到了较多的关注。DWI-MRI是以细胞外组织间隙水分子随机弥散运动为基础、反映组织细胞微环境变化的医学影像技术。由于肿瘤组织具有增殖旺盛、细胞密度高、细胞内大分子蛋白含量高等特性,细胞外空间减少,导致水分子细胞外和细胞内扩散受到限制,因此在DWI图像上表现为高信号。以DWI-MRI图像作为肿瘤放疗靶区勾画的影像学基础,已经在多种肿瘤中有报道,比如在前列腺癌,头颈肿瘤等。由于肺癌组织在DWI-MRI图像上表现为高信号影像,与周围正常肺组织对比明显。因此众多的研究结果表明,DWI-MRI技术在肺癌的诊断的敏感性和特异性方面能够相媲美于PET-CT,特别是在转移淋巴结及微小转移灶的发现方面甚至优于PET-CT。
  但是应用DWI-MRI技术作为合并肺不张的中央型肺癌的靶区勾画的影像学基础目前的研究还比较少。因此我们课题的目的就是研究DWI-MRI技术在合并肺不张的中央型肺癌精确放疗中的应用,相比于PET-CT和CT技术,我们评价基于DWI-MRI技术勾画靶区的特点,比较周围危及器官的放射受量变化,从而拟为临床上应用DWI-MRI技术作为合并肺不张的中央型肺癌患者精确放疗靶区勾画的基础提供参考信息,并为以后基于DWI-MRI图像进行靶区自动勾画提供依据。
  本课题拟分两部分进行研究。
  第一部分 DWI-MRI在合并肺不张的中央型肺癌精确放疗靶区勾画中的应用研究
  世界范围内肺癌是导致患者死亡最为常见的一种肿瘤。中央型肺癌常常伴发阻塞性肺炎而后者可以导致肺不张发生。肺癌的精确靶区勾画是精确放疗的基础,而常规基于CT图像勾画的靶区由于分辨率所限,精确性和适形性方面存在着一定的局限。PET-CT在肺癌的靶区勾画方面优势明显。随着MRI技术的发展,将DWI-MRI技术作为合并肺不张的肺癌的靶区勾画的影像技术成为近期的研究热点。
  目的:
  探讨磁共振弥散加权成像技术(diffusion weightedimaging,DWI)在合并肺不张的中央型肺癌精确放疗靶区勾画中的应用价值及意义。
  方法:
  27例合并肺不张的中央型肺癌患者纳入研究,所有患者均病理学证实。所有入组患者在一周内先后行胸部强化CT、PET-CT、DWI-MRI检查,根据扫描结果将PET、DWI-MRI分别与强化CT进行图像配准,根据获得的图像分别勾画大体肿瘤靶区GTVCT、GTVPLT、和GTVMRI,计算GTV体积和变异系数并进行比较,比较GTVCT、GTVPET、GTVMRI在三维空间中的靶区中心间距,并对图像信息的ADC值和SUV值进行分析。用SAS9.3(SAS公司,USA)软件进行分析。通过单因素方差分析对三种图像方法的每个指数的平均值进行比较。我们还计算了皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)来检验三者之间的相关性。在所有的检验中,P<0.05被视为差异有统计学意义。
  结果:
  27例患者平均GTVCT为109.45±14.90cm3,GTVPET为85.23±13.10cm3,GTVMRI为83.10±14.26cm3。GTVCT较GTVMRI大,差值为26.34±6.39c m3,差异有显著统计学意义(P<0.01); GTVCT大于GTVPET,差值为24.22±5.84 cm3,差异有统计学意义(P<0.01)。GTVPET稍大于GTVMRI,差值为2.12±2.46 c m3,但是差异无统计学意义(P>0.05)。GTVCT的变异系数较大,为33.76%,GTVPET和GTVMRI的变异系数较小,分别为32.00%和26.60%。GTVCT和GTVPET靶区中心间距VCT-PLT平均为0.87±0.54cm,GTVMRI和GTVPET靶区中心间距VMRI-PET平均为0.72±0.34cm,VCI-PTT与VMRI-PET相比,差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤组织的平均ADC值小于肺不张组织,并与肿瘤的最大SUV值呈显著负相关。
  结论:
  对于合并肺不张的中央型肺癌患者,基于DWI-MRI勾画的大体肿瘤靶区体积GTVMRI可以媲美于GTVPET,都显著小于GTVCT,勾画的靶区的一致性和重复性都好于GTVCT。GTVMRI、 GTVCT与GTVPET在三维空间中的靶区中心一致性好,三者在三维空间中靶区中心无明显的空间错位。对于合并肺不张的中央型肺癌,应用DWI-MRI对大体肿瘤靶区体积及靶区外轮廓的确定有很大的指导意义,同时该措施有助于降低不同医师间靶区勾画的差异。
  第二部分 DWI-MRI对合并肺不张的中央型肺癌精确放疗计划中危及器官剂量影响
  基于扫描图像的肿瘤靶区勾画,在放射治疗计划中至关重要。近几年磁共振弥散加权成像技术(DWI-MRI)在肿瘤放疗靶区勾画方面逐渐成为一种有广阔发展前景的影像技术,在某方面可能优于强化计算机断层扫描(CT)和正电子发射断层扫描(PET)。
  我们的前期研究结果显示,对于中央型肺癌合并肺不张患者,在精确放疗大体肿瘤靶区勾画方面,DWI-MRI优于CT,可以媲美于PET-CT。评价靶区勾画及放疗计划的优劣,危及器官的照射剂量是非常重要的一个方面。在保证肿瘤靶区照射剂量的基础上,有效减少危及器官的受量有利于减少放疗并发症,从而提高患者的治疗后生活质量。
  目的:
  评价基于DWI-MRI图像勾画的合并肺不张中央型肺癌患者放疗计划中危及器官包括肺、心脏和脊髓受量的变化。
  方法:
  27例合并肺不张的中央型肺癌患者纳入研究,所有患者均病理学证实。所有的入组患者在一周内先后行胸部强化CT、PET-CT、DWI-MRI检查,根据扫描结果将PET、DWI-MRI分别与强化CT进行图像配准,根据勾画的GTV制定放疗计划PlanCT,PlanPET,PlanMRI,计算并比较危及器官肺、心脏和脊髓受量的变化。用SAS9.3(SAS公司,USA)软件进行数据的统计学分析。三种勾画方式所做的放疗计划中肺、心脏及脊髓的受量都用均数±标准差表示,危及器官的受量比较运用student's t检验。组间均数的比较采用one-way ANOVA。P<0.05视为有统计学意义。
  结果:
  我们分别计算患侧肺V5,V10 V15,V20,V25,V30,V35,V40,Dmean大小,结果发现所有计算的患侧肺剂量体积直方图参数,PlanMRI和PlanPET相似,都显著低于PlanCT,差别具有统计学意义(P<0.01)。而对于心脏受量,无论是V30,V40,V45,V50,V55,还是平均受量Dmean及最大受量Dmax,PlanMRI都和PlanPIT都相似,而都低于PlanCT,但是差别都无统计学意义。三种计划的脊髓最大受量Dmax、平均受量Dmean都无显著差别(P>0.05)。
  结论:
  对于合并肺不张的中央型肺癌患者,基于DWI-MRI图像制定的放疗计划能显著降低肺组织的照射受量,降低放射性肺炎的发生率,并能降低心脏的照射受量,但是脊髓受量并无明显改变。
[博士论文] 冯秀丽
呼吸内科 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼不同时序对肺腺癌细胞作用的体外研究
  目的:
  1.明确野生型A549细胞、EGFR外显子19突变型HCC827细胞及T790M继发耐药型H1975细胞三种肺腺癌细胞在培美曲塞、埃克替尼/厄洛替尼联合用药时序上的疗效差距。
  2.进一步探索A549细胞、HCC827细胞及H1975细胞三种肺腺癌细胞在培美曲塞、埃克替尼/厄洛替尼不同联合用药时序上疗效差距的机制。
  方法:
  1.细胞株的选择
  对于肺鳞癌患者不推荐应用EGFR-TKIs,所以我们采用三种肺腺癌细胞株,A549为野生型细胞株,H1975为T790M继发耐药型细胞株,HCC827为EGFR外显子19突变型细胞株。
  2.药物的选择
  (1)进展期肺腺癌患者的一线化疗药物:培美曲塞
  (2)分子靶向药物:埃克替尼、厄洛替尼。
  3.实验顺序的设定
  (1)埃克替尼/厄洛替尼应用48h,然后培美曲塞单独应用24h:
  (2)培美曲塞应用24小时,埃克替尼/厄洛替尼应用48h;
  (3)培美曲塞+埃克替尼/厄洛替尼同时应用48h,培养基应用24h。
  4.CCK-8法检测细胞增殖活力,明确培美曲塞、埃克替尼/厄洛替尼的IC50,并计算联合指数CI。
  5.根据流式细胞学检测法检测细胞凋亡及周期分布。
  结果:
  1.CCK-8结果
  (1)培美曲塞在A549、HCC827、H1975细胞的IC50值分别为1.9000±0.2037umol/L、1.5780±0.2504umol/L、3.3723±0.0824umol/L。
  (2)埃克替尼在A549、HCC827、H1975细胞的IC50值分别为7.7273±0.8093umol/L、0.0042±0.0007umol/L、5.7983±0.9981umol/L。
  (3)厄洛替尼在A549、HCC827、H1975细胞的IC50分别为6.6643±0.3404umol/L、0.0034±O.0005umol/L、4.8120±0.0576umol/L。
  CCK-8结果显示培美曲塞及埃克替尼、厄洛替尼均能抑制A549、HCC827、H1975细胞增殖,且呈浓度依赖性。在HCC827和H1975细胞,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼有一协同作用(CI<1),埃克替尼/厄洛替尼序贯培美曲塞有相加作用(CI=1),培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用有拮抗作用(CI>1)。
  2.细胞凋亡结果
  (1)培美曲塞序贯埃克替尼的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为6.36±0.65%,30.22±7.97%和18.12±5.09%。
  (2)培美曲塞序贯厄洛替尼的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为5.26±0.3%,50.47_+8.68%,20.1±4.07%。
  (3)埃克替尼序贯培美曲塞的凋亡率在A549,HCC827和H1975细胞分别为5.54±0.77%,18.8±0.64%,11.5±1.37%。
  细胞凋亡结果显示在HCC827和H1975细胞,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼治疗组中凋亡率明显高于其他组,具有显著疗效(P<0.05)。但在A549细胞无明显差异(P>0.05)。
  3.细胞周期结果
  (1)A549、HCC827、H1975细胞在培美曲塞组中S期明显升高,S期比例分别为34.11±1.43%、34.46±1.88%、34.48±1.26%。一
  (2)A549、HCC827、H1975细胞在埃克替尼中G1期明显升高,G1期比例分别为65.97±3.77%、63.78±2.48%、63.02±1.30%。
  (3)A549、HCC827、H1975细胞在厄洛替尼组中G1期明显升高,G1期比例分别为65.56±2.55%、67.33±2.60%、65.51±1.71%。
  结果提示培美曲塞在A549、HCC827、H1975三组细胞均阻滞于S期,埃克替尼/厄洛替尼在A549、HCC827、H1975三组细胞均阻滞于G1期,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼在A549、HCC827、H1975三组细胞S期明显升高,提示培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼加强了对s期的阻滞。
  结论:
  1.培美曲塞及埃克替尼、厄洛替尼均能抑制A549、HCC827、H1975细胞增殖,呈浓度依赖性;先埃克替尼/厄洛替尼48h后培美曲塞24小时应用对HCC827、H1975细胞有相加作用,培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用48h对HCC827、H1975细胞作用有拮抗作用,先培美曲塞24h后埃克替尼/厄洛替尼48h对HCC827、H1975细胞有协同作用,在A549细胞,无论培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用、培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼及厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞均未发现有协同作用。
  2.在HCC827和H1975细胞,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼组凋亡率较厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞组及培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用组明显升高,而在A549细胞,无论培美曲塞联合埃克替尼/厄洛替尼同时应用、培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼及厄洛替尼/埃克替尼序贯培美曲塞凋亡率均无明显影响。
  3.埃克替尼/厄洛替尼对A549、HCC827、H1975三种细胞作用后均阻滞于G1期,培美曲塞对A549、HCC827、H1975三种细胞均阻滞于S期,培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼在A549、HCC827、H1975三组细胞S期均明显升高,加强了培美曲塞对三种细胞S期的阻滞,分析培美曲塞序贯埃克替尼/厄洛替尼发生协同作用及其凋亡率增高考虑其机制可能与细胞周期相关。
  第二部分 培美曲塞联合二甲双胍对肺腺癌细胞作用的体外研究
  目的:
  1.明确二甲双胍联合培美曲塞在体外是否对肺腺癌细胞有抑制增殖、促进凋亡、影响细胞周期及减弱迁移能力的作用。
  2.进一步探讨其相关分子机制。
  方法:
  1.细胞株的选择
  我们采用三种肺腺癌细胞株,A549为野生型细胞株,H1975为T790M继发耐药型细胞株,HCC827为EGFR外显子19突变型细胞株。
  2.实验方法的设定
  (1)二甲双胍、培美曲塞单药及联合作用于三种肺腺癌细胞48小时后,通过CCK8检测法检测IC50值,并计算联合指数(CI),进而明确二甲双胍联合培美曲塞是否有抗增殖作用及治疗疗效。
  (2)根据流式细胞学检测法检测细胞凋亡及周期分布。
  结果:
  1.CCK-8结果
  (1)经应用二甲双胍48小时后,A549,HCC827和H1975细胞的IC50值分别为11.92±0.1lmmol/L,4.72±0.14 mmol/L和5.41±O.55 mmol/L。
  (2)经应用培美曲塞48小时后,A549,HCC827和H1975细胞的IC50值分别为1.824-0.17 umol/L,1.54±0.30 umol/L和3.37±0.14umol/L。
  结果提示二甲双胍单独应用能显著降低三种肺腺癌细胞系的增殖,并呈浓度依赖关系方式。二甲双胍联合培美曲塞同时应用对肺腺癌细胞的抗增殖作用起到协同的作用(CI<1)。
  2.细胞凋亡结果
  (1)二甲双胍单独治疗48小时在A549,HCC827和H1975细胞的凋亡率分别为10.40±0.57%,16.28±1.21%,12.68±1.67%,较空白组明显增多(P(O.05)。
  (2)培美曲塞单独治疗48小时在A549,HCC827和H1975细胞的凋亡率分别为14.26±1.17%,14.65±0.84%及13.22±1.60%,较空白组明显增多(P  3.细胞周期结果
  A549,HCC827和H1975细胞,空白组的G1期分别为74.75±0.35%,62.48±1.39%,53.25+1.88%;S期分别为18.67±1.27%,22.86+0.52%,29.37±2.11%;G2期分别为6.59±1.33%,14.66±0.97%,17.38i0.69%。
  总之,二甲双胍单独治疗及二甲双胍联合培美曲塞治疗对A549,HCC827和H1975三种细胞的细胞周期影响均未发现共同规律性,分析二甲双胍单药及二甲双胍联合培美曲塞对肺腺癌细胞的作用可能与细胞周期关系不大。
  结论:
  本研究结果表明二甲双胍单药及二甲双胍联合培美曲塞同时应用均能能抑制肺腺癌细胞株的生长,增强细胞凋亡,减弱迁移能力,并且其机制可能通过诱导细胞凋亡来发挥相关作用。我们的数据表明二甲双胍单药在体外对肺腺癌细胞有明显抗肿瘤作用,同时二甲双胍对化疗药物培美曲塞在抑制肿瘤方面有明显的增敏作用,这对临床上的2型糖尿病病人无论其是否合并肿瘤,在选择降糖药物方面可能有一定指导作用,但我们的研究只是在体外进行,尚需大量其他的相关研究、动物实验及临床研究来进一步证实。
[博士论文] 司立博
外科学(胸外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,在全世界范围内其死亡率在男性及女性肿瘤中均位于第一位,是肿瘤相关死亡的首要原因。在美国,肺癌的发病率及死亡率近几年来呈下降趋势,但在我国,肺癌的发病率及死亡率仍在逐年上升,据国家癌症中心2017年公布的最新统计数据(2013年)显示,2013年全国新发恶性肿瘤病例数约368万例,占世界的1/4(368万/1409万),与2012年相比,癌症新发人数继续上升,癌症已经成为夺走人们健康甚至是生命的罪魁祸首之一,其中肺癌仍然位于我国癌症发病率和死亡率的第一位。
  目前,肺癌的病因及发病机制仍未完全明确,吸烟、空气污染、放射线暴露等都是肺癌发病的高危因素,其中吸烟(包括二手烟暴露)是肺癌的最重要的危险因素,烟草中包含的多种化学物质可以导致支气管上皮细胞中的癌基因激活、抑癌基因失活,进而引起细胞的癌变。在我国,随着工业的进一步发展,空气污染、雾霾也是导致肺癌特别是女性肺腺癌高发的因素之一,而且呈现城市多于农村、女性腺癌患者较前明显增加、年轻患者较前明显增加的趋势。约75-80%的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC),尽管近年来肺癌的治疗手段如微创手术、精准放疗、靶向治疗、免疫治疗、射频消融治疗等取得了长足的发展,但其总体5年生存率仍不高,约10-20%。
  导致肺癌患者预后不良的主要原因是复发和转移,约80%的肺癌患者在就诊时就已经处于局部晚期或有远处转移,术后复发及转移更是导致治疗失败或死亡的首要原因。随着对肺癌的发生、发展以及肺癌细胞侵袭和转移分子机制的深入研究,目前已经发现并证实多种肿瘤分子标志物应用于临床肺癌患者的早期检测、肿瘤进展程度及治疗效果的监测和预后的判断。而且研究发现,上皮间质转化(EMT)在肿瘤细胞侵袭及转移过程中发挥着重要的作用,是多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、结直肠癌等)转移过程中的关键特征。上皮间质转化过程涉及多种信号通路,其中包括E-钙粘蛋白的表达缺失,这也是非小细胞肺癌转移过程中的关键步骤。但是目前的各种肺癌肿瘤标志物敏感性及特异性仍不理想,因此有待研究发现更准确更实用的分子标志物,并且希望对其进行调控来发现新的肺癌治疗手段。
  近年来,microRNA作为一类具有重要的潜在应用价值的治疗及预后预测分子,其研究受到越来越多的重视。MicroRNA(mi RNA/miR)是由19~24个核苷酸组成的高度保守的非编码短链RNA,主要通过与靶基因mRNA的3'-UTRs区域结合,使靶基因mRNA降解或抑制其翻译过程,从而调控靶基因的表达。目前研究发现约1/3以上的人类基因受到miRNA的调控,一种miRNA可以调控多达200个基因,同时一种基因也可以受多种miRNA共同调控。越来越多的证据表明,在不同的肿瘤中,miRNA的作用也不同,可以起到促进或抑制肿瘤发生发展的作用。miRNA-200家族是近年来研究较为热点的领域之一,已经证实在多种肿瘤中发挥着重要的作用。miRNA-200c是miRNA-200家族的成员之一,近期有研究发现miRNA-200c在多种肿瘤中存在异常表达,且与肿瘤细胞的侵袭转移及患者的预后相关。
  为了进一步探索miRNA-200c在非小细胞肺癌中所起的调控作用及与肺癌预后的关系,本课题拟从以下两部分展开研究,第一部分:检测miRNA-200c在非小细胞肺癌组织中的表达情况,分析其与患者各临床病理指标之间的关系,并进行其与非小细胞肺癌患者预后的相关性研究;第二部分:预测miRNA-200c在非小细胞肺癌中的潜在靶基因,应用双荧光素报告体系进行验证,并进一步在肺癌细胞系中验证其调控作用,探索调控机制。
  第一部分:microRNA-200c与非小细胞肺癌预后的相关性研究
  目的:检测非小细胞肺癌组织中miRNA-200c的表达水平,分析miRNA-200c表达与非小细胞肺癌患者临床病理特征及预后的相关性,从而探讨miRNA-200c在非小细胞肺癌中的表达与预后判定中所起的作用及其临床意义。
  方法:收集自2008年1月至2008年12月期间,在山东大学齐鲁医院胸外科行肺癌根治性切除+系统性淋巴结清扫术的原发性非小细胞肺癌患者组织标本110例,采用PCR基因扩增技术检测miRNA-200c的表达水平,收集所有患者的临床病理资料,包括年龄、性别、吸烟史、组织学类型、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分期,并对患者进行严格随访,将以上指标建立数据库。应用SPSS18.0软件进行统计学分析,应用卡方检验分析miRNA-200c与患者临床病理指标之间的关系,应用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,应用Logrank检验比较患者的生存差别及有无统计学意义,应用Cox回归多因素分析判定独立预后因素。
  结果:非小细胞肺癌组织中miRNA-200c的表达水平显著上调,110例肺癌组织中,66例miRNA-200c呈高表达,44例呈低表达。miRNA-200c的高表达与肺癌淋巴结转移显著相关(P<0.05)。术后无病生存率及总生存率的单因素分析结果显示:miRNA-200c高表达患者的无病生存率及总生存率均显著低于miRNA-200c低表达患者(15.2% versus25.0%,P=0.004;21.2%versus50.0%,P=0.000);有淋巴结转移的患者其无病生存率及总生存率显著低于无淋巴结转移的患者(9.3%versus28.6%,P=0.000;13.0% versus51.8%,P=0.000); TNM分期越晚的患者其无病生存率及总生存率显著低于TNM分期早的患者(0% versus15.6% versus30.4%,P=0.011;0% versus24.4% versus54.3%,P=0.002)。术后无病生存率及总生存率的多因素分析结果显示: miRNA-200c的表达水平及TNM分期分别是判定原发性非小细胞肺癌患者术后无病生存率(P=0.030,P=0.000)及总生存率(P=0.006,P=0.000)的独立危险因素。
  结论:1.miRNA-200c在非小细胞肺癌组织中存在高表达;miRNA-200c高表达与肺癌淋巴结转移密切相关;2.miRNA-200c高表达与非小细胞肺癌患者术后复发、转移以及不良预后密切相关,miRNA-200c可作为评估非小细胞肺癌患者预后的有效的分子标志物。
  第二部分:mieroRNA-200c在非小细胞肺癌中的潜在靶基因及其调控作用的研究
  目的:筛选并验证miRNA-200c在非小细胞肺癌的转移及预后中至关重要的潜在靶基因,并对其调控作用及调控机制进行进一步探索。
  方法:首先应用生物信息学分析数据库(TargetScan; microRNA.org; PicTar)对miRNA-200c所调控的潜在靶基因及结合位点进行预测和评分,结合文献检索,选定待研究的靶基因,合成靶基因的3'UTR调控序列并插入pcDNA3.1(+)-luciferase载体,在人胚胎肾293细胞系(HEK-293)中应用双荧光素报告体系验证选定的靶基因。然后应用RT-PCR技术进一步在非小细胞肺癌组织标本中检测靶基因mRNA的表达情况。最后应用细胞转染技术在肺癌细胞系(A549)中上调和下调miRNA-200c的表达水平,应用Western-blot法检测靶基因在蛋白水平的表达变化,应用RT-PCR检测靶基因在mRNA水平的表达变化,验证miRNA-200c在肺癌细胞系中对靶基因的调控作用,并分析调控机制。
  结果:通过生物信息学数据库的预测结果,结合文献检索,选取miRNA-200c的潜在靶基因ATRX、HFE和DLC1进行进一步验证和功能研究。应用双荧光素酶报告检测法成功验证靶基因。进一步检测非小细胞肺癌组织中靶基因ATRX、HFE和DLC1 mRNA的表达,结果显示ATRX、HFE和DLC1的mRNA表达水平均显著降低(P<0。05)。在A549肺癌细胞系中上调miRNA-200c的表达,发现ATRX、HFE和DLC1的蛋白表达水平均显著下降,ATRX和HFE的mRNA表达水平显著下降,而DLC1的mRNA表达水平无明显差异;下调miRNA-200c的表达,发现ATRX、HFE和DLC1的蛋白表达水平均显著提高,ATRX和HFE的mRNA表达水平显著提高,而DLC1的mRNA表达水平无明显差异。证实了miRNA-200c在肺癌细胞系中通过不同的作用机制对靶基因起调控作用,对ATRX和HFE的调控体现在mRNA水平,对DLC1的调控体现在蛋白水平。
  结论:1.在非小细胞肺癌中,miRNA-200c可以调控靶基因ATRX、HFE和DLC1的表达。2.在A549肺癌细胞系中,miRNA-200c通过不同的作用机制调控靶基因的表达,根据研究结果推论,miRNA-200c通过降解ATRX和HFE的mRNA来下调其表达,通过抑制DLC1 mRNA的翻译来下调其表达。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部