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[硕士论文] 欧阳生群
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:节球藻毒素-R(NOD-R)是由丝状浮游蓝藻节球藻(Nodularia spumigena)产生的一种蓝藻肝毒素。研究表明,NOD-R不仅具有强烈的促癌作用,而且还是一种致癌剂。NOD-R的水溶性强、热稳定性好,而且耐受pH变化,因此,现有的自来水处理工艺,如沉淀、过滤和活性炭吸附等都无法将其完全去除。吸入NOD-R污染的水和误食NOD-R污染的水产品是导致中毒的主要途径。NOD-R是通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1(PP1)和2A(PP2A)的活性来发挥毒性作用的,其中毒症状主要表现为腹泻、乏力、厌食等,甚至死亡。目前,常用的NOD-R的检测方法主要有三种,即生物分析法、物理化学分析法和免疫化学法。但是,这些检测方法都存在一定的局限性,例如特异性差、成本高、耗时长等,亟需发展一种可以克服传统方法缺点的新型检测方法。
  适配体是一种新型分子识别元件,被誉为“化学抗体”。研究者们通过将其与生物传感器相结合,开发出了新的检测方法,并被广泛应用于毒品检测、食品安全和分析诊断等领域。本课题组通过磁珠筛选法(MB-SELEX)获得了NOD-R的最佳适配体N13,该适配体能够以很高的亲和力(KD=138 nM)和NOD-R特异性结合。根据在线工具themfold web server对适配体N13二级结构的预测结果,本课题组对适配体N13进行了截短优化,并获得了其核心区域N13-T-O2。优化后,适配体N13-T-O2与NOD-R之间的亲和力有所提高(KD=29.6 nM)。
  生物膜干涉(BLI)技术是一种无需标记的技术,可以提供实时、高通量的生物分子相互作用信息。因此,借助BLI技术平台,本课题组以适配体N13-T-O2为识别分子,成功构建了一种灵敏度高、特异性强的NOD-R适配体传感器。该适配体传感器能够在15 min内完成NOD-R的检测,其线性检测范围为40-200 nM,检测限为167 pM,而且不和NOD-R类似物MC-LR以及其他类型的毒素,如GTX、STX、BTX和PTX等发生交叉反应。另外,该适配体传感器具有很好的稳定性和重复性(CV=8.23%)。为了评估该适配体传感器在实际样品检测中的应用潜能,本课题组还将该其应用于自来水中NOD-R的检测,结果表明该适配体传感器具有较高的回收率(91.92~102.16%)和较低的CV值(1.31~3.73%)。
  综上所述,本课题组获得了高亲和力、强特异性的NOD-R适配体N13-T-O2,并且,基于该适配体,构建了BLI适配体生物传感器,具有特异性强、灵敏度高、以及稳定性好等优点。因此,我们相信,这种新型BLI适配体传感器检测法有望成为NOD-R准确和快速检测方法的雏形,并为传统NOD-R检测方法的更新提供基础。
[博士论文] 张子腾
卫生毒理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  当前人们工作竞争激烈,生活节奏加快,不可避免地处于应激状态。持续的应激状态会对人体的正常生理机能造成严重影响,进而导致多种疾病发生发展,其中就包括疲劳[1]。疲劳以及过劳已经日益成为全球性公共健康问题。长期的疲劳会造成学习记忆能力下降和及工作效率低下,影响人们正常生活,甚至可能引发安全生产问题。特别在高强度的军事冲突或非战争军事行动中,疲劳应激损伤严重影响战士身体健康。因此研究疲劳发生发展过程中的相关机制,并开发有效的抗疲劳药物具有非常重要的科学意义和社会意义。
  疲劳发生的病理生理机制复杂,目前尚不明确。现有的观点认为,疲劳的发生是神经系统、免疫系统以及内分泌系统等多因素共同参与的结果[2]。研究表明疲劳发生发展过程中免疫系统异常激活,体内多种炎症因子水平(如白介素-1β,IL-1β等)显著升高,并作用于中枢神经系统,诱导机体产生疲劳样症状[3]。
  炎症小体的研究近年来受到了越来越多的关注。NLRP3炎症小体是机体固有免疫的重要组成部分,它可以通过自身的NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)识别损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)以及病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),进而激活下游的信号转导通路,并诱导机体产生适应性免疫应答[4]。当被激活时,NOD样受体将募集凋亡相关斑点样蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和半胱天冬氨酸蛋白酶前体pro-Caspase-1形成多蛋白复合体,即NLRP3炎症小体。活化的NLRP3炎症小体可以切割pro-Caspase-1生成活化的Caspase-1,活化的Caspase-1可以切割IL-1β及IL-18前体并生成有活性的IL-1β及IL-18,并分泌到胞外,发挥致炎作用。炎症小体的适当活化可以抵抗病原体感染和减轻应激损伤,但是当其活化失控时也能造成炎症效应的放大和器官损伤[5]。
  目前已有研究发现,慢性疲劳综合症(chronic fatigue syndrome,CFS)患者的血清中IL-1β水平显著升高,而IL-1β是NLRP3炎症小体活化后的重要产物,因此推测NLRP3炎症小体可能参与了疲劳的发生发展。但是对于NLRP3炎症小体是否参与疲劳的发生发展,以及涉及的具体机制目前尚无文献报道。因此深入研究NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用及其相关分子机制,对于阐述疲劳的发生机制,以及提出新的疲劳防治策略具有重要意义。
  研究目的:
  本研究拟利用急性疲劳和慢性疲劳两种小鼠模型,检测中枢神经系统中NLRP3炎症小体的激活水平;利用Nlrp3基因敲除(Nlrp3/-)小鼠明确NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用;检测活性氧水平,阐明NLRP3炎性小体激活的活性氧机制;最后应用Ω-3不饱和脂肪酸对上述疲劳模型进行干预,验证NLRP3炎症小体和活性氧在改善和治疗疲劳过程中的作用。
  研究方法:
  本课题首先探索建立了(1)急性疲劳模型:脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)复合强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型;(2)慢性疲劳模型:反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型。选择小鼠的自发活动距离和转棒仪在棒时间作为其疲劳状态的行为学指标,判定疲劳模型是否成功以及小鼠的疲劳程度。
  然后以小鼠中枢神经系统作为研究靶器官,检测NLRP3炎症小体在中枢神经系统中的激活水平。
  再次对Nlrp3-/-小鼠进行相同的疲劳模型建模处理,并检测包括自发活动距离和转棒仪在棒时间在内的行为学指标。同时检测野生型和基因敲除型小鼠脑中活性氧的生成情况,探究NLRP3炎症小体活化的具体机制。
  最后,选用Ω-3不饱和脂肪酸—DHA对反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳进行干预,进一步验证NLRP3炎症小体作为疲劳治疗靶点的价值。
  研究结果:
  1、NLRP3炎症小体参与了LPS复合强迫游泳诱导的小鼠急性疲劳模型
  1.1成功建立小鼠急性疲劳模型,建立的方法是先在小鼠腹腔注射3mg/Kg LPS然后进行强迫游泳20min,小鼠出现了明显疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,说明模型建立成功。
  1.2该疲劳模型小鼠血清IL-1β和IL-6含量的升高,脑中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA和蛋白表达水平升高,免疫荧光结果显示NLRP3炎症小体组装形成并激活。
  1.3与野生型小鼠相比,Nlrp3-/-小鼠在LPS复合强迫游泳诱导下所表现的疲劳行为显著减轻。Nlrp3-/-小鼠在相同的LPS复合强迫游泳诱导下脑组织中Caspase-1酶的激活显著减少,并伴有IL-1β水平的明显降低。
  2、NLRP3炎症小体参与了反复强迫游泳诱导的小鼠慢性疲劳模型
  2.1成功建立小鼠慢性疲劳模型,通过反复强迫游泳,负重每12h游泳10min,连续持续14天,建立了慢性疲劳模型。反复强迫游泳可以诱导野生型小鼠产生明显的疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,与之相比,Nlrp3-/-小鼠的疲劳样行为明显减轻。
  2.2反复强迫游泳建立的慢性疲劳模型,野生型小鼠大脑前额叶皮质脑区的NLRP3炎症小体显著组装并活化,IL-1β水平显著升高。和野生型疲劳小鼠相比,Nlrp3-/-小鼠的疲劳样行为显著减轻,并伴有前额叶皮质脑区和血清中IL-1β的水平显著降低。
  2.3在反复强迫游泳诱导的疲劳下,野生型和Nlrp3-/-小鼠脑中的活性氧水平,血清中丙二醛都显著升高,但在野生型和Nlrp3-/-小鼠之间的差异没有统计学意义。
  3、Ω-3不饱和脂肪酸在反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型中的作用及其可能机制
  3.1Ω-3不饱和脂肪酸可以明显改善反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳样行为,小鼠自发活动距离和转帮仪在棒时间显著延长。
  3.2Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制反复强迫游泳诱导的疲劳小鼠前额叶皮质脑区中NLRP3炎症小体的组装激活、IL-1β的升高以及疲劳小鼠脑中活性氧的生成来改善疲劳状态。
  研究结论:
  本课题发现中枢神经系统NLRP3炎症小体激活导致两种不同模型的疲劳发生;NLRP3-IL-1β通路在疲劳发生过程中起重要作用。Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制NLRP3炎症小体的激活和活性氧的生成,进而缓解小鼠疲劳样行为。
[博士论文] 张华
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:机体天然免疫系统(innate immune system)能够识别和清除感染病原体,从而抵抗病原体感染与损伤。天然免疫系统主要由天然免疫细胞以及相关细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),启动细胞内天然免疫信号转导,产生Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ)和促炎细胞因子,以抵抗病原体感染。
  RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptors,RLRs)属于PRRs中的一类关键受体,在细胞浆中识别RNA病毒,介导抗病毒天然免疫反应,在机体天然免疫应答中发挥着至关重要的作用。RIG-Ⅰ作为RLRs中的最关键的受体分子,可以通过识别RNA病毒或病毒复制中产物,通过接头分子MAVS,活化TBK1-IRF3信号,激发IFN-Ⅰ产生,从而抵抗病毒感染。在RIG-Ⅰ发挥功能的过程中,磷酸化修饰和泛素化修饰以及相关的酶分子发挥了重要的调控作用,影响着RIG-Ⅰ信号的起始、传递和终止等进程,进而维持着机体的免疫平衡。基于我们前期对RIG-Ⅰ信号转导通路的研究,我们通过IP-MS技术鉴定与RIG-Ⅰ相互作用的蛋白质分子及其翻译后修饰类型。通过分析质谱数据,我们发现RIG-Ⅰ的相互作用分子中包括甲基转移酶、乙酰基转移酶、E3泛素连接酶、激酶/磷酸酶、代谢以及RNA修饰相关分子等,小鼠RIG-Ⅰ(mRIG-Ⅰ)的翻译后修饰类型包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化修饰等;其中,许多相互作用分子和翻译后修饰在RIG-Ⅰ信号转导通路中的功能尚未知。我们对质谱数据进行了验证并克隆了mRIG-Ⅰ修饰位点的突变载体,开展了相关功能学研究。
  蛋白精氨酸甲基转移酶是一类在组织细胞中广泛表达的酶分子,其主要包含9个家族分子,介导蛋白精氨酸残基的甲基化修饰,参与调控多种细胞进程,影响肿瘤、炎症、代谢、DNA损伤修复等生命活动过程。随着抗体开发技术和蛋白组学技术的发展,PRMTs和精氨酸甲基化修饰的研究得以广泛开展,但是其在天然免疫,尤其在抗病毒天然免疫中的功能还没有相关报道。
  在质谱鉴定的RIG-Ⅰ的相互作用分子中,我们发现多个PRMTs家族的成员,提示PRMTs可能参与调节天然免疫应答。我们克隆了PRMTs的9个分子,利用报告基因实验对PRMTs影响IFN-β表达的功能进行筛查,发现9个PRMTs分子都能调控IFN-β的表达,而PRMT6是其中抑制IFN-β表达效应最显著的分子。我们还通过构建PRMTs稳定过表达的Raw264.7细胞株,用VSV病毒感染,发现PRMT6稳定过表达可以显著抑制病毒感染诱导的IFN-Ⅰ和IL-6的产生,相应的IRF3活化也显著低于对照。此外,在Raw264.7细胞、NIH3T3细胞和A549细胞中瞬时过表达PRMT6分子,再用病毒刺激,也获得类似的结果。以上结果证实了PRMT6可以负向调节抗病毒天然免疫反应。
  为了检测PRMT6的体内效应,我们构建了Prmt6基因敲除小鼠。首先,我们发现Prmt6缺失并不影响小鼠的正常生长发育和免疫系统的发育。通过VSV病毒感染同窝小鼠,我们发现,Prmt6缺失可以显著提高小鼠的生存率。进一步用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中细胞因子水平,发现Prmt6缺失小鼠血清中的IFN-α、IFN-β和IL-6显著高于对照小鼠,相对应的,Prmt6缺失小鼠的肝脏、脾脏和肺脏中VSV病毒的复制显著低于对照。组织学检测肺部炎性细胞浸润情况也显示Prmt6缺失小鼠的肺部炎性细胞浸润明显低于对照小鼠。这些结果表明了Prmt6缺失可以显著增强小鼠抵抗病毒感染的能力,证实了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能。我们进一步用RNA和DNA病毒分别刺激Prmt6缺失的BMDM细胞,发现VSV病毒和HSV-1病毒刺激均能够诱导Prmt6缺失的BMDM细胞产生更多的IFN-α、IFN-β和IL-6,这与体内实验结果是一致的。我们进一步分析了信号转导通路变化情况,发现Prmt6缺失可以显著增强病毒诱导的RF3的活化,而不影响TBK1的磷酸化以及NF-κB和MAPK信号。这些结果说明了PRMT6通过抑制IRF3活化来抑制IFN-Ⅰ产生,从而抑制抗病毒天然免疫反应。
  体内体外的结果明确了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能,病毒感染是否会引起PRMT6表达水平和细胞定位的改变呢?我们利用Western Blot分析了病毒感染细胞的蛋白变化,发现病毒感染可以显著上调小鼠和人巨噬细胞中PRMT6的蛋白水平,同样,病毒感染也可以引起人肿瘤细胞A549和HepG2中PRMT6的蛋白增加。与此同时,GDS5093、GDS1667和GDS2164中的公共数据也提示病毒感染可以上调PRMT6的表达,而且这种变化可能与病程密切相关。我们利用Western Blot检测了巨噬细胞中PRMT6的胞浆胞核分布情况,发现PRMT6主要分布在细胞浆中,只有很少量的PRMT6分布于细胞核中,而且PRMT6的分布不随病毒感染而改变。这些结果与PRMT6通过调控IRF3磷酸化水平抑制IFN-Ⅰ产生的效应相吻合。
  PRMTs功能的发挥大多依赖其甲基转移酶活性,PRMT6抑制抗病毒天然免疫反应是否依赖其甲基转移酶活性呢?我们根据已有的文献信息,构建了PRMT6的酶活性突变体PRMT6(dead)。通过报告基因实验,我们发现PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、RIG-Ⅰ-2CARD、MAVS、TBK1、IRF3-5D等诱导的IFN-β的表达,而PRMT6(dead)并不能有效地逆转PRMT6的抑制效应。这些结果证实了PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,表现出与常规PRMTs不一样的功能特征。接头分子TRIF、STING、MAVS均可以通过TBK1-IRF3信号激活IFN-Ⅰ的产生,而我们的报告基因结果也证实了PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、MAVS诱导的IFN-β的产生,这说明了PRMT6可能靶向TBK1-IRF3信号。进一步的报告基因实验结果也证实了PRMT6确实可以通过靶向TBK1-IRF3复合体来抑制IRF3活化,从而抑制IFN-β表达。结合前面Prmt6缺失可以增强IRF3磷酸化,但并不影响TBK1活化的结果,我们进一步检测PRMT6是否影响TBK1的激酶活性。通过体外激酶实验,我们发现PRMT6并不影响TBK1的激酶活性。以上结果证实了PRMT6靶向TBK1-IRF3复合体进而抑制IRF3的活化,这一过程不依赖其甲基转移酶活性,也不影响TBK1的激酶活性。
  既然PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,也不影响TBK1活化和TBK1的激酶活性,那么,PRMT6是否可以直接结合TBK1或者IRF3,从而抑制信号的传递呢?通过免疫共沉淀实验,我们发现PRMT6可以直接结合IRF3,而不结合TBK1、IKKε和IRF7。通过检测内源性的蛋白结合情况,发现在静息的小鼠和人的巨噬细胞中,PRMT6可以结合IRF3,而当病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强。在Prmt6缺失的BMDM细胞中,发现Prmt6缺失可以显著促进病毒诱导的TBK1与IRF3的结合,从而增强IRF3的活化。利用HEK293T细胞过表达实验也证实了PRMT6可以结合IRF3,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF3磷酸化。研究结果表明,PRMT6可以结合IRF3,而且,在病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF3的活化,使IFN-Ⅰ产生减少,抑制机体抗病毒天然免疫反应。
  我们进一步根据PRMT6的结构域特征构建了PRMT6的截短体表达载体,通过免疫共沉淀实验,发现PRMT6与IRF3的结合主要依赖其N端结构域,而PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能则主要依赖其AA189-318结构域。这些结果也提示了PRMT6发挥功能可能依赖其N端结构域结合IRF3,进而通过空间位阻效应阻碍TBK1与IRF3的结合,从而抑制IRF3活化和抗病毒天然免疫反应。
  综上,在本研究中,我们鉴定了RIG-Ⅰ的相互作用分子和翻译后修饰类型,揭示了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的效应与机制,将PRMTs与天然免疫联系起来,为PRMTs的生物学研究提供了新的视角,也为病毒感染的干预和治疗提供了潜在靶点和理论依据。同时,我们的研究所揭示的具体机制也可能是病毒逃逸免疫系统攻击的一种策略,在一定程度上增加了我们对病毒逃逸机制的认识。
[硕士论文] 周芬丽
公共卫生 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过分析宿迁市2015-2016年疑似预防接种异常反应(简称AEFI)病例的发生特征,探讨减少或避免AEFI发生的办法及措施,减轻病例遭受的伤害和经济损失;了解AEFI监测系统运转情况,进一步提高当地AEFI网络直报质量。
  方法:
  本研究收集并分析《AEFI信息管理系统》中宿迁市2015-2016年上报的AEFI报告卡和个案数据及《中国免疫规划信息管理系统》中宿迁市同时间段各类疫苗实际接种剂次数,采用描述性流行病学方法进行分析。
  结果:
  1、宿迁市2015-2016年共报告AEFI病例3043例,其中0~6岁组适龄儿童报告2924例,占报告病例总数的88.98%;0岁组儿童报告病例数最多,报告了1280例,占报告病例总数的42.06%;2、性别分布以男性为主,男性病例报告1733例,占报告病例总数的56.95%,男女性别比为1.32∶1,每个年龄组中男性病例报告数均高于女性;3、职业分布以散居儿童和幼托儿童为主,共报告2852例,占报告病例总数的93.73%;AEFI的报告时间分布以天气暖和的6、7和8月份最多,共报告969例,占报告病例总数的31.84%;4、大部分的受种者在接种疫苗后48小时内发生AEFI,报告2774例,占报告病例总数的91.06%,且大部分病例在AEFI发生后48小时内就诊,这部分病例共报告2845例,占报告病例总数的93.49%;其中98.62%的报告病例在就诊后48小时内向预防接种单位进行报告;5、AEFI病例的临床症状以发热、局部红肿和局部硬结为主,其中出现发热症状的病例最多,占报告病例总数的61.85%,且症状较轻微,只有少数病例进行了住院治疗,转归情况均为治愈或好转;6、报告地区分布以人口稠密、文化素质较高的宿城区最多,占报告病例总数的35.39%;7、发生AEFI的疫苗以国家免疫规划疫苗为主,其中报告病例数最多的是百白破疫苗,占报告病例总数的31.94%,而疫苗AEFI发生率最高的是白破疫苗,发生率为613.17/10万;有63.69%的AEFI病例接种途径为肌肉注射;8、AEFI病例分类以一般反应为主,共报告2989例,占报告病例总数的98.23%,异常反应报告53例,占174%,偶合反应报告1例,占0.03%,疫苗质量事故、接种事故和心因性反应在这次研究中没有出现;9、AEFI系统监测指标显示所有病例的及时报告率、及时调查率、个案调查表完整率、AEFI分类率和报告县覆盖率等指标都符合《全国疑似预防接种异常反应监测方案》要求。
  结论:
  本次研究的AEFI病例中,0~6岁组儿童居多,性别分布以男性为主;6、7和8月份报告病例数较多;报告地区中宿城区发生率最高;百白破疫苗报告的病例数最多,白破疫苗的发生率最高;AEFI分类以一般反应为主,主要症状为发热、局部红肿和局部硬结;大部分病例在接种48小时内发生AEFI且能在就诊后48小时内进行报告,AEFI监测系统运行良好,监测敏感性和质量稳步提高。
[硕士论文] 王丽丽
微生物学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin(Ig)-binding proteins,IBPs)是由细菌产生的特异性结合宿主抗体的蛋白,主要包括:金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus protein A,SpA)、链球菌蛋白G(Streptococcal protein G,SpG)和部分大消化链球菌表面蛋白L(Peptostreptococcus magnus protein L,PpL),是细菌重要的致病因子之一。IBPs作为天然的抗体结合分子,已被广泛应用于医学与生物领域,包括抗体纯化、抗体检测和免疫吸附治疗等。新型免疫球蛋白结合分子(Newly evolved lg-binding molecules,NEIBMs)是基于噬菌体展示体外分子进化技术,对IBPs中的各抗体结合域进行重组及突变改造,从而获得新分子结构和结合特性的抗体结合分子。
  SpA具有与IgG相关的医学和生物学领域的应用,包括病原抗体检测、IgG抗体的纯化、免疫沉淀等,这些应用主要依据SpA与抗体IgG Fc(Fc-Fc)高亲和力。SpA除了对IgG Fc的高亲和力之外,对IgG、IgM和IgAFab的VH3区域具有低亲和力,这会导致IgG应用的复杂化。如何消除SpA的VH3结合能力并同时保留其Fc结合能力是蛋白质工程研究的重要挑战之一。本研究选择SpAA结构域中参与VH3结合的29、30位氨基酸以及C结构域中参与VH3结合的36、37位氨基酸进行了随机定点突变,并构建A29,30、C36,37随机突变组合噬菌体展示文库,分别应用未结合抗原和结合抗原的人IgG作诱饵对上述文库进行分子进化筛选,成地获得了具有IgG Fc结合活性并消除了IgM和IgA结合活性的NEIBM AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30。
  本研究分为以下四个部分详细介绍:
  第一部分 应用未结合抗原和结合抗原的人IgG为诱饵分子对A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库和A、C随机组合噬菌体文库进行体外分子进化
  实验室前期已成功构建A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库和A、C随机组合噬菌体文库,A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库的多样性和随机性以及两个文库的库容都满足后期体外分子进化的要求。应用未结合抗原和结合抗原的人IgG为诱饵分子,通过重复的“吸附”—“洗脱”—“扩增”一系列过程,对A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库进行多轮筛选,获得优势组合:AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30。当用未结合抗原的人IgG为诱饵的常规筛选进化到第三代(F3代)时,加入SpA做为竞争蛋白同时进行竞争筛选,获得单克隆直接测序显示与常规筛选相同的优势组合:AL29I30-AV29K30。用未结合抗原的人IgG对未突变的组合文库进行体外进化筛选,获得优势组合A-A。
  第二部分 体外分子进化所得A-A及其突变体的原核表达、纯化
  将优势组合重组序列A-A、AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30分别克隆于原核表达载体pET-32a(+)上构建3种重组的融合蛋白表达载体质粒pET-32a(+)-A-A、pET-32a(+)-AL29I30-AV29K30和pET-32a(+)-AV29N30-AK29V30,转化到大肠杆菌表达菌BL21感受态细胞中,经过IPTG诱导后目的蛋白大量表达,再通过Ni-NTA柱亲和层析纯化获得目的蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳定性分析目的条带大小约为32kDa。
  第三部分 A-A及其突变体的抗体结合特性分析
  以ELISA实验为基础,通过蛋白标记辣根过氧化物酶(HRP)、生物素等手段,检测A-A、AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30与抗体IgG、IgM和IgA结合特性,发现AL29I30-AV29K30、AV29N30-AK29V30与A-A分子比较,保留了IgG的结合,消除了IgM、IgA的结合。同时,将AL29I30-AV29K30、AV29N30-AK29V30和A-A标记HRP,ELISA结果显示,HRP-AV29N30-AK29V30与IgG的结合能力最强,HRP-AL29I30-AV29K30结合能力次之,HRP-A-A与IgG的结合能力最弱。同时应用OCTET、SPR等实验验证了ELISA检测结果。
  第四部分 A-A及其突变体的应用研究
  将HRP-A-A、HRP-AL29I30-AV29K30和HRP-AV29N30-AK29V30作为酶标二抗分子,用ELISA实验比较其对抗-HIV抗体、抗-EV71抗体和抗-CB3抗体的检测效果。对HIV阳性血清的检出率AV29N30-AK29V30最高,在抗-EV71VP1抗体、抗-CB3抗体的检测中,HRP-AV29N30-AK29V30敏感性最好,HRP-AL29I30-AV29K30次之,HRP-A-A最差。将蛋白AL29I30-AV29K30浓缩透析后制成偶联柱,AL29I30-AV29K30偶联柱与SpA偶联柱同时通过亲和层析纯化人血清,AL29I30-AV29K30亲和层析回收纯化IgG,未回收到可检测的IgM和IgA,因此证明了前者的应用优势。
  本研究中,基于噬菌体展示技术的体外分子进化获得了具有保留IgG结合活性且消除IgM和IgA结合活性的NEIBM AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30,并且在IgG纯化和检测中显示出实质性的应用优势。本研究是通过体外分子进化证明功能性蛋白质的一个成功实例,为开发高特异性、高亲和力的免疫球蛋白结合分子奠定了基础,也为SpA抗体结合特性的优化改造提供了一种有效的方法。
[硕士论文] 周庆卿
免疫学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:天然免疫系统及其诱导的炎症反应是机体抵抗病原体入侵的重要手段,机体通过启动天然免疫应答和炎症反应从而有效地预防和清除病原体的感染,但是当炎症反应过度活化或者持续存在时,又会引起器官和组织的损伤。病原体或内源性配体触发的天然免疫应答和炎症反应的发生发展过程中涉及到很多关键基因的表达调控,深入研究其中的机制对预防和控制炎症反应具有重要的意义。表观遗传修饰是近年来研究基因表达调控的热门领域之一,而且越来越多的研究发现表观遗传修饰也参与天然免疫应答和炎症反应的调控,其机制可以是直接作用于某些细胞因子的基因转录,也可以是靶向重要的信号分子,通过激活或调节该分子的基因表达,最终发挥对免疫应答的调控作用。
  组蛋白修饰是一种重要的并且研究较多的表观遗传修饰方式,它最基本的作用是调控基因的表达,在炎症、肿瘤、自身免疫病等许多生理病理过程中发挥着重要的调控作用。甲基化是组蛋白常见的表观修饰形式,研究发现组蛋白甲基化修饰主要是通过调控基因的组蛋白甲基化状态,改变基因的表达水平,进而调控免疫细胞的生长发育和凋亡,参与机体免疫应答反应。组蛋白甲基化修饰是组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶共同参与调节的过程,这两种酶的作用位点主要发生在组蛋白赖氨酸和精氨酸上,近年来逐渐有研究发现许多组蛋白修饰酶在天然免疫应答的调控中发挥了重要作用,比如组蛋白H3K4特异性甲基转移酶MLL和WDR5可以促进细胞因子TNF-α的产生,组蛋白H3K9甲基转移酶Suv39h1和Setdb1与细胞因子IL-2的表达水平有关,以及组蛋白H3K27特异性去甲基化酶JMJD3和UTX可以促进炎症因子的表达。此外,随着越来越多组蛋白修饰酶的功能的深入研究,发现同一种修饰方式发生在不同的基因上可能会对免疫应答及炎症反应产生相反的作用,如组蛋白甲基转移酶Ash11,它能特异性调节基因启动子区组蛋白H3K4的甲基化水平,但因为与上述MLL和WDR5所结合的基因不同,最终发挥了抑制炎症细胞因子表达的作用。因此,探索组蛋白修饰的机制对于深入研究天然免疫应答和炎症反应的调控具有重要意义。
  本课题研究的组蛋白去甲基化酶KDM2B又称Jhdm1b或Fbxl10,定位于细胞核内,是组蛋白H3K4me3和H3K36me2的特异性去甲基化酶。KDM2B可以调控细胞凋亡,抑制细胞的衰老,调控造血干细胞的自我更新、神经管的形成以及胚胎的发育,此外它还参与了肿瘤的发生发展。但是关于KDM2B与天然免疫应答和炎症反应的关系目前尚未报道。
  我们的研究发现KDM2B在小鼠巨噬细胞中表达水平较高,并且在TLR4配体LPS刺激后表达下调。利用siRNA干扰KDM2B的表达,可以显著抑制巨噬细胞中TLR配体诱导的IL-6的产生,但对IFN-β和TNF-α的产生无显著影响。构建了KDM2B基因敲除小鼠,进一步发现KDM2B基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞中TLR配体诱导的IL-6产生显著降低,但是LPS诱导的TNF-α和IFN-β以及病毒VSV和HSV诱导的IFN-β的产生较野生型对照小鼠巨噬细胞无明显差异。小鼠腹腔注射LPS构建内毒素休克模型发现KDM2B缺陷小鼠血清中IL-6水平较对照小鼠显著降低,而TNF-α、IFN-β、IL-1β和IL-12无明显差异,肺部炎症损伤显著减轻。在DSS诱导的小鼠肠炎模型,KDM2B缺陷小鼠体重下降较对照小鼠减少,血清中产生的IL-6水平较低,肠道炎症损伤程度更轻。信号通路研究表明KDM2B缺陷并不影响巨噬细胞中LPS诱导的MAPK、NF-κB和IRF3通路的活化水平。机制研究发现在LPS刺激的巨噬细胞中,KDM2B可以结合到IL-6基因启动子区,但是并不能与TNF-α和IFN-β的基因启动子区结合,而且不影响这三种细胞因子基因启动子区组蛋白H3K4me3和H3K36me2修饰的水平。进一步对LPS刺激前后的巨噬细胞的核蛋白利用抗KDM2B的特异性抗体进行免疫沉淀,将免疫沉淀复合物进行蛋白电泳分离后切割组间的差异条带进行质谱检测分析,发现其中有一个跟染色质重塑相关的蛋白BRG1。BRG1属于进化上高度保守的SWI/SNF染色质重塑复合物的核心催化亚基成员之一,能调控基因的染色质开放程度,从而调节基因的转录表达。免疫沉淀实验进一步证明KDM2B能结合BRG1,而KDM2B缺陷降低IL-6启动子区染色质开放水平。
  总之,我们的研究表明KDM2B选择性促进巨噬细胞中TLR诱导的IL-6的产生,增强免疫炎症反应,其初步机制是KDM2B在核内与染色质重塑复合物的核心亚基BRG1相互作用,通过BRG1对IL-6基因启动子区的染色质进行重塑使其开放程度增加,从而促进了IL-6的转录表达,但尚需进一步深入研究。该研究发现了组蛋白去甲基化酶KDM2B在天然免疫和炎症反应中的新的表观调控功能,可以为临床感染和炎症性疾病的治疗提供新的靶点和方向。
[博士论文] 聂向民
临床检验诊断学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)位于人类第6对染色体短臂6P21.31-21.33,由一组紧密联锁的复等位基因位点组成。其全长3.6Mb~4Mb,约占整个人类基因组3×109bp DNA的0.13%左右。该复合体编码人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA),包含蛋白编码基因位点超过150余个,约占整个人类基因组已知约3.2万个表达基因的0.5%左右。
  MHC是迄今所知人类最复杂、最具多态性的免疫遗传系统,也是人类基因组中已知基因最密集的区域。在人类基因组计划(the Human Genome Project,HGP)开始之前,HLA基因复合体即是整个人类基因组中研究最充分的片段。作为人类基因组计划的重点,MHC成为1999年人类基因组计划中第一个完成全长测序的基因区域。其后,MHC区域基因数据不断获得更新。根据2009年Shiina等进行的统计,在总共3.78Mb的MHC区域内,已确认基因位点更新为253个。包括HLA基因45个,非HLA基因208个。
  MHC作为人类已知最复杂、最具多态性的基因区域,具有高度多态性。这种多态性表现为其主要基因位点含有大量的复等位基因,且等位基因的分布具有明显的种族和地区差异,不同地区、不同人群中各等位基因的频率各不相同。截止2017年,国际免疫遗传学信息系统数据库(IMGT/HLA)已公布HLA等位基因16,755个[12]。其中HLA-Ⅰ类等位基因12351个,包括HLA-A等位基因3913个,HLA-B等位基因4765个,HLA-C等位基因3510个。HLA-Ⅱ类等位基因4404个,包括HLA-D RB1等位基因2058个。HLA的这种高度多态性显示了遗传背景的多态性和复杂性。它是人类在进化过程中抵御不良环境因素的一种适应性表现,使人类具有更大的抵抗入侵病原体的能力,对维持种群的生存与延续具有重要的生物学意义。
  近二十年来,随着分子生物学技术与HLA DNA测序分型技术应用的不断发展与成熟,HLA新等位基因的发现进入快速发展期。随着中华骨髓库(CMDA)的建立与HLA分型数据的增加以及SBT(Sequencing Based Typing)测序分型技术的建立,在中国人群中不断发现新HLA等位基因。
  HLA抗体作为HLA应用研究的重要组成部分,对于HLA临床表型分析及移植排斥监测具有重要意义。HLA抗体早期来源主要为妊娠、输血等同种免疫。杂交瘤单克隆抗体技术建立后,其成为制备HLA抗体的主要来源。
  噬菌体抗体库(phage antibody library)技术又称噬菌体展示抗体文库(phage-display antibody library)技术,是继杂交瘤单克隆抗体技术之后,免疫抗体制备技术发展史上的又一重要技术飞跃。噬菌体抗体库技术是由噬菌体展示技术发展而来,是噬菌体展示技术和抗体库技术相结合而发展出的一项新型抗体制备技术。
  噬菌体抗体库技术从根本上改变了传统杂交瘤单克隆抗体的制备流程,绕过了杂交瘤细胞融合和选择性克隆化等流程,大大缩短了制备周期,增殖周期从数月可缩短至数周,极大地提高了制备效率;其抗体库容量可扩大达到106~109个克隆;并可直接获得抗体的基因序列,并可对其进行进一步基因工程改造。在HLA单克隆抗体应用研究领域,噬菌体展示抗体技术研究尚未见报道。
  我们自2008年起至今已发现确认HLA新等位基因33例,均获得WHO HLA因子命名委员会的正式命名。在论文第一部分,进行了6个新等位基因的鉴定,并对其变异序列的可能来源进行分析,对其编码蛋白空间分子结构的改变进行初步分析。
  在论文第二部分,利用原核表达系统,对4例A*24新等位基因:HLA-A*24∶191、A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257、A*24∶02∶01(作为标准A*24等位基因)以及A*24总变异序列(包含A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257这3个新等位基因的变异序列)编码分子的重链胞外结构域进行原核表达,然后通过噬菌体展示抗体库技术,针对HLA-A*24∶191新等位基因编码的氨基酸变异位点,进行单克隆抗体制备,作为今后对这些新等位基因的分子结构和表达进行进一步的分析和了解的研究工具。
  第一部分HLA新等位基因的发现鉴定及序列分析
  目的:
  发现、鉴定分析新的HLA等位基因序列
  方法:
  1.基因分型:样本HLA-A、B、DRB1位点常规高分辨分型采用HLA PCR-SBT(sequence-based typing)测序分型与基于Luminex液相流式平台的荧光微珠PCR-rSSO(reverse sequence-specific oligonucleotide probe,序列特异性寡核苷酸探针反向杂交)分型方法相结合的方法进行。
  2.基因序列分析:HLA常规高分辨分型异常样本采用单等位基因特异性单链双向测序技术,使用HLAssureTM SE SBT HLA Typing Kit测序试剂,对每个位点上的两条单倍体上的杂合等位基因,分开进行单独正反双向测序。
  3.新等位基因编码蛋白分子空间结构预测分析:使用SWISS-MODEL同源建模、Phyre2及RasMol和RCSB PDB Protein Workshop软件,对新等位基因编码蛋白分子空间结构进行模拟分析。
  结果:
  1.00333号样本采用Luminex液相流式平台rSSO荧光磁珠反向杂交分型复核,结果显示为A*02∶06∶01+A*68∶01∶02,但伴有FP#022、FN#072假反应探针的异常结果。
  该样本SBT测序复核结果显示A位点序列最匹配结果为A*02∶03∶01+A*68∶01∶02,但存在2个碱基差异,即在第2外显子第98位核苷酸为A(A+A)而非W(A+T),第102位核苷酸为Y(C+T)而非W(A+T)。
  单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*02∶03∶01等位基因第2外显子第98位核苷酸发生T->A碱基替代,导致第9位密码子由TTC变为TAC,其编码氨基酸由苯丙氨酸(Phe,F)变为酪氨酸(Tyr,Y);第102位核苷酸发生A->C碱基替代,导致相应的第10位密码子由ACA变为ACC,但其编码氨基酸未发生改变。
  2.01513样本采用rSSO荧光磁珠流式反向杂交分型,结果显示为罕见型DRB1*15∶66+DRB1*14∶05∶01/02,并存在FP#516/517假阳性探针的异常结果。
  SBT测序分型复核结果显示DRB1位点最匹配结果为DRB1*14∶05∶01+DRB1*15∶66,但存在2个碱基差异,即在第2外显子第258位核苷酸为T(T+T)而非Y(T+C),第261位核苷酸为Y(C+T)而非T(T+T),存在2个碱基差异替代。
  单等位基因双向测序鉴定,表明该样本DRB1*15∶66等位基因第2外显子第258位核苷酸碱基发生C->T碱基替代,结果导致相应的第57位密码子GAC→GAT;第261位核苷酸发生T->C碱基替代,结果导致相应的第58位密码子GCT→GCC。但这两个密码子的碱基改变都未造成编码氨基酸改变。
  3.00791号样本SBT测序分型结果显示A*24∶02∶01序列第2外显子第215位核苷酸为R(A+G)而非G(G+G),存在1个碱基差异替代。
  单等位基因双向测序鉴定,表明该样本第2外显子第215位核苷酸碱基发生G->A碱基替代,导致相应的第48位密码子发生CGG→CAG,其编码氨基酸由精氨酸(Arg,R)→谷氨酰胺(Gln,Q)。
  4.00059样本SBT测序分型结果显示A位点序列最匹配结果为A*24∶02∶01+A*33∶03∶01,但在第2外显子第178位核苷酸为Y(C+T)而非T(T+T),存在1个碱基差异替代。
  单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*24∶02∶01等位基因第2外显子第178位核苷酸碱基发生T>C碱基替代,结果导致相应的第36位密码子发生TTC→CTC改变,其编码氨基酸由苯丙氨酸(Phe,F)变为亮氨酸(Leu,L)。
  5.00290样本SBT测序分型结果显示A位点序列最匹配结果为A*24∶198+A*33∶03∶01,但第2外显子第155位核苷酸为W(A+T)而非T(T+T),存在1个碱基差异替代。
  单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*24∶198等位基因上第2外显子第155位核苷酸碱基发生了T->A碱基替代,结果导致相应的第28位密码子由GTG→GAG,其编码氨基酸由缬氨酸(Val,V)变为谷氨酸(Glu,E)。
  6.00550样本Luminex液相流式平台rSSO荧光磁珠反向杂交分型,结果显示为罕见型A*24∶02∶15+A*02∶01∶01,并存在FP#043假阳性探针的异常结果。
  SBT测序分型复核显示A位点序列最匹配结果为A*24∶156+A*02∶01∶01,但第2外显子第256位核苷酸为S(C+G)而非G(G+G),存在1个碱基差异替代。
  单等位基因双向测序鉴定,表明该样本A*24∶156等位基因上第2外显子第256位核苷酸碱基发生了G->C碱基替代,结果导致相应的第62位密码子由GAG→CAG,其编码氨基酸由谷氨酸(Glu,E)变为谷氨酰胺(Gln,Q)。
  以上等位基因序列经IMGT/HLA数据库BLAST检索确认后,递交美国NCBIGenBank数据库,获得注册序列号,然后经EMBL-EBI申报,分别被世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*02∶355(00333样本)、DRB1*15∶06∶02(01513样本)、A*24∶224(00791样本)、A*24∶225(00059号样本)、A*24∶257(00290样本)和A*24∶191(00550号样本)。
  结论
  发现鉴定6例HLA新等位基因,分别被WHO HLA命名委员会命名为HLA-A*02∶355(00333样本)、HLA-DRB1*15∶06∶02(01513样本)、HLA-A*24∶224(00791样本)、HLA-A*24∶225(00059号样本)、HLA-A*24∶257(00290样本)和HLA-A*24∶191(00550号样本)。
  第二部分通过噬菌体展示技术制备新等位基因A*24∶191编码蛋白单克隆抗体
  第一章A*24蛋白分子重链胞外结构域的原核蛋白表达纯化
  目的:对A*24新等位基因重链胞外结构域进行表达纯化,制备原核表达可溶性蛋白。
  方法:
  1.以A*24∶19、A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257新等位基因序列作为模板序列进行蛋白表达。根据新等位基因A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257核苷酸序列变异位置,设计将以上3个新等位基因核苷酸变异汇总为A*24总变异序列(A*24Total Mutation),将A*24∶02∶01作为A*24标准蛋白序列。
  2.基因模板采用重叠延伸PCR法,制备模板基因。使用NcoⅠ、XhoⅠ酶切pET-28a(+)载体。载体连接使用同源重组无缝克隆技术,将目的基因连接入载体进行表达。
  3.转化使用TOP10感受态细胞,将载体转化入TOP10感受态细胞。并进行克隆鉴定。
  4.目的蛋白诱导表达采用Transetta DE3细胞作为表达感受态细胞,对目的蛋白进行表达。
  5.通过超声裂解包涵体,使用Ni-NTA Resin柱纯化法进行可溶性蛋白纯化。
  6.SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白质量。
  结果:
  1.模板重叠延伸PCR鉴定、菌液PCR鉴定结果显示PCR产物大小正确,符合预期标准。
  2.阳性克隆测序结果显示插入基因片段与目的基因序列一致无误。
  3.SDS-PAGE电泳及Western Blot结果显示表达蛋白大小正确,该表达可溶性蛋白可用于下一步单克隆抗体鉴定。
  第二章 HLA-A*24∶191编码蛋白噬菌体展示库单克隆抗体制备
  目的:
  通过噬菌体展示技术制备A*24新等位基因单克隆抗体
  方法:
  1.使用A*24∶191变异序列合成多肽免疫5只小鼠,共计4次,其间隔时间为分别为3/2/2周。免疫完成7天后ELISA检测小鼠血清效价。3天后进行免疫终加强。
  2.终加强免疫完成第2天提取小鼠脾脏RNA,反转录cDNA。
  3.使用25对轻链基因引物及50对重链基因引物,分别扩增轻链及重链基因。
  4.使用ApaLⅠ和AscⅠ内切酶,对轻链基因及pHD载体质粒进行酶切。使用NotⅠ和SiiⅠ内切酶酶切重链基因。
  5.将轻链基因酶切片段与载体质粒连接,脱盐纯化后电转SS320细胞。
  6.测定轻链子库库容并进行测序鉴定,鉴定合格后提取轻链子库质粒。
  7.使用NotⅠ和SfiⅠ内切酶进行酶切轻链子库质粒。然后将已酶切之重链基因连接导入轻链子库。
  8.测定Fab抗体库库容,挑取Fab抗体文库菌落,进行测序验证,对其抗体基因完整性与文库多态性、抗体基因种源及其Germline亚型进行分析。
  9.Fab抗体库经复苏、接种培养、辅助噬菌体侵染、筛选扩培,完成噬菌体展示抗体库营救扩培。
  10.进行噬菌体海选、淘选,营救与扩增,ELISA初筛及确认,阳性克隆抗体诱导表达。
  11.菌液裂解上清与A*24∶191表达蛋白进行免疫印迹法检测。
  结果:
  1.小鼠免疫血清检测结果显示3号小鼠免疫血清效价达到标准。
  2.琼脂糖凝胶电泳显示小鼠RNA提取质量、轻链和重链基因扩增及酶切结果符合要求。
  3.轻链子库测定库容为3.6×106pfu,测序分析显示其抗体基因正确插入率为86%(6/7)。
  4.Fab抗体库测定库容为4.4×107pfu,测序分析显示其抗体基因正确插入率为80%(16/20)。抗体重链序列分析显示其均为鼠源性抗体序列,Germline亚型分析显示其70%(7/10)分布在IGHV1家族,表明抗体基因完整性与文库多态性均应大于80%。
  5.经噬菌体展示抗体库营救、噬菌体海选、ELISA初筛及确认,选择一株单克隆菌液裂解上清与A*24∶191表达蛋白进行免疫印迹法检测,显示所制备该株噬菌体单克隆抗体可与目的蛋白以较高亲和力结合。
[硕士论文] 章元伟
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:人类白细胞抗原(HLA)分子在人体免疫系统中发挥着不可替代的重要作用。HLA分型是研究HLA基因变异的主要方法。HLA分型技术可以应用于器官或干细胞移植,群体遗传学研究,以及自身免疫疾病、传染病、癌症等疾病研究。
  随着高通量测序(NGS)成本的降低和准确度的提高,利用NGS数据对HLA基因分型已成为主流趋势。学术界已开发了众多基于NGS数据的HLA分型方法,然而这些方法都没有针对DRB3/4/5基因进行优化。通过结合序列比对和组装,以及利用测序深度判断拷贝数,DRB3/4/5的分型可以达到很高的准确度。本文按此思路开发了一个新的基于NGS数据的DRB3/4/5基因分型方法,然后通过模拟数据和真实数据验证了该方法的准确性,最后将该方法应用于群体遗传学研究和疾病研究。论文的具体研究内容为:
  1.开发新的基于NGS数据的DRB3/4/5分型方法。新的分型方法依托于型别数据库,将NGS数据比对数据库以后进行单体型组装,在单体型的基础上进行过滤,打分和型别判断,并结合拷贝数判断,从而达到了很高的准确度。依据参考基因组序列生成的模拟NGS数据被首先用来评价新方法的效果,30X测序深度时DRB3/4/5在4位水平均达到100%准确率。另外188个有着Sanger法分型结果的真实NGS数据被用来验证新方法的准确性,在40X测序深度时DRB3/4/5分型准确率为96.56%,98.89%和99.34%。
  2.将新的DRB3/4/5分型方法应用于群体遗传学研究。使用新方法分析千人基因组计划中150个来自5个不同地理区域的个体的低深度全基因组测序(WGS)数据。研究不同人群的DRB3/4/5基因和型别的频率差异,发现非洲人群和任意其他人群的DRB4基因频率都有显著差异。分析DRB1与DRB3/4/5的连锁不平衡,发现与已知的DRB单体型结构一致。
  3.将新的DRB3/4/5分型方法应用于疾病研究。招募100名PLA2R有关的膜性肾病患者,50名PLA2R无关的膜性肾病患者,100名健康对照。对所有样本进行MHC捕获测序,然后用新方法和SOAP-HLA软件处理数据。发现DRB1*15∶01和DRB3*02∶02是PLA2R有关的膜性肾病的两个独立风险型别,DRB3*02∶02是PLA2R无关的膜性肾病的独立风险型别。
[博士论文] 夏龙飞
临床检验诊断学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)是一种非器官特异性自身免疫性疾病,血栓形成是其主要的病理基础和最突出的临床表现,也是APS首要的死因。研究表明,血清中高滴度的抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody,aPL)(尤其是抗β2GPI抗体)在APS血栓形成起着极其关键的作用,但是具体的机制仍不清楚。本课题组前期研究发现,抗β2GPI抗体/β2GPI复合物能够通过刺激核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和激活蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)的活化,从而诱导单核细胞表达组织因子(tissuefactor,TF)和炎症因子,但目前还缺乏足够的体内实验阐述NF-κB和AP-1在aPL/抗β2GPI抗体诱发体内血栓形成中的作用。此外,近期有研究表明,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(the mammaliantarget of rapamycin complex,mTORC)通路在APS血管壁内皮炎症激活导致血管损伤的过程中起着关键作用。因此,本论文旨在前期研究的基础上,分别利用实验性APS(EAPS)小鼠模型和单核细胞(THP-1和人外周血单核细胞)探讨NF-κB/AP-1和mTOR在抗β2GPI自身抗体诱导血栓形成中的作用及其调控的效应分子,为APS血栓形成的防治提供新思路。
  方法:
  (1)建立EAPS小鼠模型,BALB/c小鼠分别于0h和48 h腹腔注射抗β2GPI抗体(500μg/只)或APS病人来源的IgG(IgG-APS)(500μg/只),72h后用于实验。取小鼠腹腔巨噬细胞,超声裂解,收集细胞总蛋白,Western blotting方法检测NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情况,验证anti-β2GPI自身抗体是否能诱导NF-κB和AP-1的活化。
  (2)BALB/c小鼠先用NF-κB抑制剂PDTC(100mg/kg/day)或/和AP-1抑制剂姜黄素(curcumin,Cur)(50mg/kg/day)预处理2h,再进行腹腔注射抗β2GPI抗体(500μg/只),取小鼠腹腔巨噬细胞和胸主动脉,Western blotting方法检测NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情况,观察PDTC和姜黄素对抗β2GPI抗体诱导NF-κB和AP-1活化的影响。
  (3)取EAPS小鼠腹腔巨噬细胞、双侧颈动脉和胸主动脉,运用RT-qPCR和Western blotting方法分别检测TF、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白的表达,Xa生成法检测TF活性,免疫荧光检测腹腔巨噬细胞内TF、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表达,从而进一步分析NF-κB和AP-1活化对抗β2GPI抗体诱导小鼠TF和促炎细胞因子表达的影响。
  (4)采用抗β2GPI抗体(10μg/mL)/β2GPI(100μg/mL)或APS-IgG(250μg/mL)/β2GPI(100μg/mL)复合物处理THP-1细胞或人外周血单核细胞一段时间后,收集细胞总蛋白、RNA及上清液,运用RT-qPCR方法检测TF和IL-8的mRNA的表达,Xa生成法检测TF活性,ELISA方法检测IL-8的表达,Westernblotting方法检测mTOR磷酸化的情况,观察抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI诱导单核细胞表达TF和IL-8及mTOR活化的情况。
  (5)先采用mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin,100nM)预处理THP-1细胞或人外周血单核细胞20h后,再用抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物处理一段时间后,收集细胞总蛋白、RNA及上清液,运用RT-qPCR方法检测TF和IL-8的mRNA的表达,Xa生成法检测TF活性,ELISA方法检测IL-8的表达,Western blotting方法检测mTOR、p38、ERK1/2、JNK和NF-κB p65磷酸化的情况,观察雷帕霉素对抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI诱导单核细胞mTOR、p38、ERK1/2、JNK和NF-κB p65活化的影响。
  (6)THP-1细胞先采用p38抑制剂(SB203580,10μM)、ERK1/2抑制剂(U0126,5μM)、JNK1/2抑制剂(SP600125,90rnM)、NF-κB抑制剂(PDTC,20μM)和TLR4抑制剂(TAK-242,5μM)预处理2h后,再用抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物处理一段时间后,收集细胞总蛋白,Western blotting方法检测mTOR磷酸化情况,观察它们对抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导THP-1细胞mTOR活化的影响。
  结果:
  (1)抗β2GPI抗体和IgG-APS均能显著增加小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平,与对照组NR-IgG比较差异显著(p<0.05)。
  (2)PDTC和姜黄素能分别明显地减弱抗β2GPI抗体诱导小鼠NF-κBp65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平(p<0.05),且二者没有共同的抑制效应。但发现姜黄素能明显降低抗β2GPI抗体诱导小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65磷酸化水平(p<0.05),对主动脉NF-κ B p65磷酸化水平也有微弱地抑制效应但没有统计学意义(p>0.05)。
  (3)PDTC或/和姜黄素均能显著抑制经由抗体β2GPI抗体诱导的小鼠颈动脉腹腔巨噬细胞TF活性的升高、胸主动脉TF、E-selectin、ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白的表达增加、腹腔巨噬细胞TF、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA和蛋白的表达增加(p<0.05),且PDTC显示最强的抑制效应,而二两者联合使用时没有协同效应。
  (4)抗β2GPI抗体/β2GPI和APS-IgG/β2GPI复合物均能显著增加THP-1细胞或人外周血单核细胞TF和IL-8的表达以及mTOR磷酸化水平(p<0.05),且对mTOR磷酸化的影响显示时间依赖性,于刺激45 min(THP-1细胞)和60 min(人外周血单核细胞)时磷酸化水平最强。
  (5)雷帕霉素预处理THP-1和人外周血单核细胞20 h后,抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导的TF和IL-8的表达以及mTOR、p38、ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化水平均能被明显地抑制(p<0.05),而对JNK的磷酸化水平无抑制效应(p>0.05)。
  (6)抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导THP-1细胞mTOR的活化能被p38抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂U0126或TLR4抑制剂TAK-24显著地抑制(p<0.05),而JNK抑制剂SP600125或NF-κB抑制剂PDTC无抑制效应(p>0.05)。
  结论:
  (1)在EAPS模型小鼠体内,NF-κB和c-Jun/AP-1参与介导抗β2GPI抗体诱导小鼠TF、粘附分子(E-selectin、ICAM-1和VCAM-1)和炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达,表明NF-κB和c-Jun/AP-1在aPL诱导的促血栓、促炎症状态中发挥着极其重要的作用。
  (2)体外研究发现,mTOR参与介导了抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导单核细胞TF和IL-8的表达,TLR4、p38和ERK1/2能够调节mTOR的活化,表明mTOR在APS的发病机制起到重要的作用。
  (3) NF-κB、c-Jun/AP-1或mTOR的抑制剂均能够降低抗β2GPI抗体诱导的促血栓和促炎症因子的表达,表明NF-κB、c-Jun/AP-1和mTOR可作为APS血栓形成防治的新靶点。
[博士论文] 吴玉敏
临床检验诊断学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:背景:支气管哮喘是一类由多种免疫细胞参与的慢性炎症性气道疾病,可发生于任何年龄。近年来,越来越多的研究发现,支气管哮喘患者体内存在着一群非T非B的免疫细胞,即固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)。此类细胞不表达任何谱系的标志,但是其具备类似T淋巴细胞的功能。根据与此类细胞相关的转录因子、表面表达的受体以及其活化后分泌的特征性细胞因子,可将ILCs分为三类,包括ILC1s、ILC2s和ILC3s。在健康个体体内,ILCs的量微乎其微,而在病理状态下可被活化而比例增加。支气管哮喘发作时,活化的ILC2s分泌IL-13、IL-5等细胞因子,维持Th2极化状态,参与免疫损伤。在这些促炎细胞因子的作用下,使气道局部呈现气道高反应性,形成典型的哮喘症状。
  RORα,是维甲酸相关的孤核受体家族的成员之一,其在各种生物体的多种组织均有表达。作为ILC2s的特征性转录因子,RORα在ILC2s分化增殖过程中以及功能的发挥方面发挥重要作用。目前的研究发现,当小鼠缺失RORα时,其体内ILC2s的数量减少,并且对于寄生虫的免疫能力减弱。而缺乏ILC2s的小鼠经过继转移ILC2s,则小鼠的ILC2s功能可获重建。
  目的:为了探讨RORα于支气管哮喘发生发展中的作用,为临床哮喘病的治疗寻找新的途径。本研究在建立哮喘小鼠模型的基础上,分析ILC2s在模型鼠的分布,并经构建RORα表达载体研究其对ILC2s的调控作用,探讨用于干预哮喘模型鼠的可能性。旨在为RORα的应用研究奠定理论依据和试验基础。
  材料与方法
  (1)临床病例分析:流式细胞术检测支气管哮喘患者外周血单个核细胞中ILC2s的比例;RT-qPCR方法检测外周血单个核细胞中RORα、T-bet、GATA3、IL-33、IL-25、IL-13、IL-5、IL-4的mRNA表达水平;ELISA法测定血清中的IL-33、IL-13、IL-5的蛋白含量;直线回归法分析RORα的mRNA表达水平与ILC2s活性的相关性、RORα的mRNA表达水平与Th1、Th2细胞相关分子的相关性、ILC2s的特征性细胞因子mRNA表达水平与Th2细胞特征性细胞因子的相关性。
  (2)小鼠哮喘模型的诱导和RORα表达载体的体内干预试验:
  1)构建RORα表达载体:无菌分离小鼠脾脏组织,运用RT-PCR从小鼠脾脏组织的mRNA中克隆出mRORα全长编码区的cDNA,并将该cDNA连接到PMD-18T载体,同时鉴定该载体序列。再定向克隆入腺病毒的穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,并与骨架载体PBHGloxdetalE1,3Cre一同于HEK293内包装,并纯化腺病毒。
  2)小鼠哮喘模型的诱导及RORα表达载体的干预:建立OVA诱导的支气管哮喘模型。利用Ad-RORα干预后。运用H&E染色的方法观察肺组织病理学的变化;流式细胞仪分析模型鼠外周血ILC2s细胞比例;用细胞计数池计数BALF中炎症细胞的浸润情况;ELISA检测血清IL-33、IL-13、IL-5等细胞因子的含量;肺组织和支气管肺泡灌洗液中RORα、IL-33、IL-13、IL-5、IL-4和GATA3等mRNA表达水平用RT-qPCR法测定、肺组织中RORα、ST2蛋白的表达以Western-blot法检测。
  结果:
  (1)支气管哮喘患者外周血中ILC2s的比例相对于正常对照者明显升高,且血清IL-33以及ILC2s的特征性细胞因子IL-13、IL-5的蛋白含量也随之升高;同时,外周血单个核细胞中RORα、IL-33、IL-13、IL-5、IL-4、GATA3的mRNA表达水平也呈升高趋势,而Th1细胞的转录因子T-bet的mRNA则呈降低趋势。相关性分析结果显示,RORα与ILC2s呈正相关,IL-33亦与ILC2s的特征性细胞因子IL-13、IL-5、IL-4呈正相关。
  (2)成功克隆了小鼠RORα基因的全长序列,经测序无误。经定向克隆的方法,成功将RORα的全长基因克隆入pDC316-mCMV-EGFP,经过PCR、酶切分析和测序鉴定均无误。
  (3)腺病毒的包装:成功大量制备了携带小鼠RORα的穿梭载体pDC316-RORα-mCMV-EGFP、骨架载体PBHGloxdetalE1,3Cre,随后将穿梭载体pDC316-RORα-mCMV-EGFP与骨架载体PBHGloxdetalE1,3Cre一同转染状态良好的HEK293细胞,经过纯化后,成功地包装出了高滴度的携带小鼠RORα的腺病毒。
  (4)小鼠哮喘模型的建立:用OVA成功诱导小鼠哮喘动物模型,经模型鼠肺组织H&E染色镜检,可见大量炎症细胞浸润。与OVA组和OVA+Ad-EGFP组相比,Ad-RORα处理的模型鼠,其肺组织中的炎症细胞增多更为明显,且哮喘症状更为明显,出现强烈地抓耳挠腮、抬起前肢、大小便失禁、呼吸急促等哮喘表现。同时,处理组小鼠与未处理的OVA诱模组和Ad-EGFP处理组相比,其支气管肺泡灌洗液中IgE的水平明显增加。
  (5)哮喘模型中ILC2s相关的因子检测:Ad-RORα处理组循环ILC2s明显高于未处理的模型鼠和Ad-EGFP对照组,提示ILC2s参与的哮喘的发病过程,而转录因子RORα发挥了推波助澜的作用。此外,在Ad-RORα处理组,促进ILC2s活化的IL-33,ILC2s的特征性细胞因子IL-13、IL-5和转录因子GATA3,以及Th2细胞因子IL-4等均明显升高。同时,我们亦发现IL-33蛋白升高,升高的IL-33进一步促进ILC2s的增殖活化。
  结论:哮喘患者机体ILC2s数量及其相关分子表达增加,与此同时,上调的RORα与ILC2s比例呈现明显的正相关关系。成功构建了Ad-RORα病毒载体,成功建立了OVA诱导的小鼠哮喘模型,并经体内试验表明了外源性RORα对哮喘发生发展的免疫病理作用。
[硕士论文] 汪舒庆
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:肠道微生物群通过调控营养吸收、抑制病原菌定植及刺激黏膜免疫等方式对宿主健康产生重要影响。作为人及哺乳动物胃肠道的优势菌群,乳酸菌能抑制病原菌对肠道上皮的粘附、预防炎症,因此能有效预防肠道疾病。表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)是一种调控细胞生长、增殖、分化的生长因子,应用于外伤治疗及辅助肠道感染修复中,效果显著。研究表明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,L.casei)能预防肠道疾病感染。实验室前期已构建多种干酪乳杆菌表达质粒,并成功表达异源蛋白。本研究拟构建表达人EGF(hEGF)的重组干酪乳杆菌,研究干酪乳杆菌作为黏膜免疫活菌疫苗传递载体,原位表达特定蛋白的可行性,并对其生物学活性进行了研究。主要结果如下:
  SOE PCR合成Genbank报道的hEGF基因序列,克隆到三种表达载体上:胞内表达载体pELX1;以Spusp45为分泌信号构成的分泌表达载体pELSH;以SlpA蛋白作为信号进行表面展示的干酪乳杆菌表达载体pELWH。获得能够组成型表达hEGF蛋白的重组菌。经Western blot分析,只在重组菌L.casei/pEL WH-hEGF的胞内、细胞表面及培养液上清中检测到SlpA-hEGF融合蛋白,分子量约55 kDa。
  体外培养小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞,以L casei、L.casei/pEL WH为对照,添加L.casei/pELWH-hEGF培养液上清,观察SlpA-hEGF对底物细胞的增殖活性。结果表明SlpA-hEGF能促进细胞增殖,稀释10倍的L.casei/pELWH-hEGF上清的增殖效果与10 ng/mL的hEGF标品效果相同,此外在L.casei和L.casei/pELWH中也观察到了显著的促细胞增殖现象。
  为检测重组菌对小鼠肠道形态结构的影响,选取体重18-22 g清洁级雌性小鼠,每天灌胃重组菌L.casei/pELWH-hEGF全培养液,设计空白对照(CK)、PBS、MRS、干酪乳杆菌全培养液(L..casei)、空载体全培养液(L.casei/pELWH)对照组。结果表明MRS组十二指肠的绒毛高度极显著高于PBS组(P<0.01),L.casei组与MRS组相比极显著提高了小鼠十二指肠绒毛高度(P<0.01),pELWH-hEGF组与L.casei组、pELWH组相比极显著提高了小鼠十二指肠绒毛高度(P<0.01),各处理组空肠高度、回肠高度及十二指肠、空肠、回肠隐窝深度差异在本试验中未达显著水平。
  本研究为干酪乳杆菌成为一种优良的活菌蛋白传递载体提供理论依据及方法。
[硕士论文] 邓兰
内科学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究紫外线照射对成人原代肝细胞活率及膜电位的影响,通过混合淋巴细胞-肝细胞培养,探讨紫外线照射降低成人原代肝细胞的免疫原性的可行性及稳定性。
  方法:收集我院肝胆外科切除肝组织手术标本,诊断为肝脏良性病变(肝血管瘤、肝内胆管结石等),采用灌注法获得肝细胞;将实验肝细胞分为5个组,1个对照组(0 J/m2)及4个不同照射强度组(分别为200、350、550和750J/m2)。紫外灯功率固定,照射强度由照射时间调控,5组照射强度所对应的照射时间分别为0、2、4、6和8分钟。各组分别于处理后培养的第1、3、5天进行相关检测:台盼蓝拒染法和CCK-8法检测细胞活率;荧光显微镜和多功能酶标仪检测细胞膜电位变化;通过混合淋巴细胞-肝细胞培养(MLHC)检测受体T细胞增值情况;收集实验组和处理组的培养上清液,离心后全自动生化分析仪检测白蛋白、LDH的分泌量。
  结果:⑴改良的两步胶原酶灌注获得的肝细胞透亮,呈圆形或球形,胞质均匀,肝细胞总数可达109个以上,活率大于90%。⑵UVB照射新鲜分离的肝细胞,在照射强度相同的条件下,随着照射后培养时间的延长,成人原代肝细胞活率呈现下降趋势。照射后第1天活率最好,随着培养时间的延长,活率下降,到第五天,活率下降1/2;在照射后培养时间相同的情况下,随着照射强度的增加,肝细胞活率呈先上升后降低。照射2min后的肝细胞活率最高,较未照射组高,但差异不明显,活率明显高于4min、6min组,是照射8min组的2倍。⑶不同的UVB照射强度和UVB照射后不同培养时间之间,成人原代肝细胞的膜电位均有明显差异。UVB照射2min组的膜电位在照射后的各个时间点均比UVB照射肝细胞0min、4min、6min、8min组的膜电位高。⑷肝细胞在接受不同强度紫外线照射后,与淋巴细胞混合培养,照射后的肝细胞免疫原性下降,表现为共培养的淋巴细胞增值能力下降。2min组与对照组无明显区别,但明显低于4min、6min、8min组。⑸检测不同照射强度、培养时间的白蛋白、LDH分泌量,接受2min紫外线照射的肝细胞分泌功能最好,随着照射强度的增大和培养时间的延长,肝细胞合成和分泌功能下降。
  结论:混合淋巴细胞-肝细胞培养可以用来检测受体淋巴细胞对供体肝细胞反应的指标,照射2min时共培养的T细胞增值能力最低,提示此时肝细胞的免疫原性最小。
[硕士论文] 姚燚
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:狂犬病毒(RV)和乙型脑炎病毒(JEV)是当前严重危害人畜健康的病原微生物。宿主免疫系统与病毒的相互博弈是病毒入侵机体的第一步,当宿主免疫能力下降时,不仅增加病毒感染机体的可能性也降低了疫苗的免疫原性导致免疫失败。最近的研究发现,作为日常治疗慢性炎症保健品的多不饱和脂肪酸(ω-3),不仅抑制免疫细胞的激活和炎症反应,而且增加病原的感染能力。本课题组发现在ω-3过表达牛肠道内多种菌群比例高于正常牛,也暗示了ω-3对免疫系统有影响。研究发现,在ω-3过表达条件下能够抑制树突状细胞(DCs)的激活和DCs的抗病毒反应,推测ω-3在RV和JEV致病及免疫逃避中扮演重要角色。为证实该设想,通过体外培养DCs,流式细胞术和免疫荧光等技术研究ω-3作用DCs的信号通路,以及ω-3对DCs抗RV和JEV感染功能的影响。并利用小鼠模型分别检测RV和JEV对ω-3过表达小鼠免疫细胞(DCs、T细胞和B细胞)分布及状态影响及ω-3对RV和JEV疫苗免疫效果的影响,再利用类似ω-3的拮抗剂和刺激物处理DCs,检测ω-3是否通过GPR120相关信号通路影响DCs对宿主抗病毒免疫反应的影响。结果表明,FAD3小鼠的脾脏和淋巴结肿组织中,树突状细胞表面CD86表达较正常小鼠降低50%,记忆性T细胞较正常小鼠降低5%,说明ω-3过表达降低了与获得性免疫相关的免疫细胞活化程度;DHA能够完全阻断由JEV和RV感染引起的DCs表面共刺激分子的表达和干扰素的分泌,阻断GPR120受体同时也解除了由DHA引起的DCs抑制作用,说明DHA通过GPR120阻断了RV和JEV引起的DCs激活;GPR120的表达与树突状细胞激活水平呈负相关,高表达GPR120的DCs较低表达GPR120的DCs处于更低的成熟状态,说明GPR120不仅仅通过DHA调节DCs的免疫平衡,GPR120自身也具有调节DCs成熟状态的功能。本项目首次研究了过度服用ω-3导致免疫抑制从而降低宿主免疫系统抵抗病毒感染的能力,为RV和JEV等其他病毒的致病机理研究提供了新思路。
[博士论文] 唐清
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:细菌依赖不同的信号调节系统以响应不断变化的环境,实时调整胞内代谢途径。病原菌的代谢途径更为复杂,还需要高效的信号传导系统来介导细菌与宿主的相互作用,或逃避宿主的免疫系统,建立感染。核苷类第二信分子和生物素都是细菌重要的信号分子,调控着包括中心代谢途径、细胞组成、运动能力、毒力等重要的生理活动。
  (1) c-di-AMP对金黄色葡萄球菌小菌落突变体代谢和感染的调控机制研究
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类重要的条件致病菌,可引发皮肤感染和呼吸道疾病。金黄色葡萄球菌小菌落突变体(S.aureus small colony variant,S.aureus SCV)通常是指甲萘醌、血红素和胸腺嘧啶核苷等营养缺陷型,其生长缓慢,具有耐药性,在固体培养基上形成微小菌落。胸腺嘧啶核苷依赖型小菌落突变体(S.aureus thymidine-dependent SCV,S.aureus TD-SCV)是由于胸腺嘧啶核苷酸合酶ThyA失活突变引起的,必须通过摄取外源的胸腺嘧啶核苷而生长,通常在经过磺胺甲恶唑和甲氧苄啶长期治疗的遗传性囊性纤维化(cystic fibrosis)肺炎病人体内出现,引起严重感染,并造成肺损伤。
  核苷类第二信使环二腺苷酸(c-di-AMP)是细菌特有的核苷类第二信使分子,由二腺苷酸环化酶合成,被特异性的磷酸二酯酶降解,真核生物缺乏合成或降解c-di-AMP的相关蛋白。c-di-AMP参与调控细菌中心代谢、细胞壁合成、渗透压适应以及抗生素抗性等生理活动,并可与宿主细胞内质网接头蛋白STING结合,激活天然免疫反应。
  本研究通过分别敲除S.aureus Newman胸腺嘧啶核苷酸合酶基因thyA和胆色素原合酶编码基因hemB得到了胸腺嘧啶核苷依赖型-SCVΔthyA和血红素依赖型-SCVΔhemB。通过巨噬细胞、小鼠感染实验和Taqman免疫基因芯片分析,发现ΔthyA相对于野生型菌株和SCV对照菌株ΔhemB,在胸腺嘧啶核苷缺乏时,能够产生更高浓度的c-di-AMP,激活依赖于STING蛋白的天然免疫反应。而高浓度的c-di-AMP会导致ΔthyA基因组突变率升高,增强细菌的适应性。本研究很好地解释了TD-SCV能引起高炎症反应,并造成更严重的肺损伤的原因。
  PstA是一个PⅡ家族信号传递蛋白,同时也是c-di-AMP受体蛋白。本研究通过细菌双杂交实验和体外酶活测定发现,PstA在c-di-AMP的存在下能够和胸腺嘧啶核苷酸激酶相互作用,并促进其激酶活性,促进胸腺嘧啶核苷的利用,帮助ΔthyA在缺乏胸腺嘧啶核苷的环境下生存。本研究首次揭示了c-di-AMP通过调控胸腺嘧啶核苷利用而参与中心代谢的机制。
  (2)苏云金芽胞杆菌c-di-GMP核糖开关Be2 RNA的调控机制研究
  苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类杆状、产芽胞的革兰氏阳性细菌,也是昆虫致病菌。B.thuringiensis的生活周期主要分为营养期和芽胞形成期,在芽胞形成期可以产生由杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体,具有广谱杀虫活性。目前,B.thuringiensis制剂目前是世界上使用最广泛的微生物杀虫剂,研究B.thuringiensis生长代谢、生活周期等有很大的应用价值。
  环二鸟苷单磷酸c-di-GMP是广泛分布于细菌中的重要核苷类第二信使分子,通过结合不同的效应蛋白或核糖开关来调控细菌的毒力、细胞周期、生物被膜形成、运动性等多种生理活动。细菌通过二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶来控制胞内c-di-GMP的浓度。核糖开关是位于mRNA非翻译区的一段具有调控功能的sRNA,典型的核糖开关由适体区域和下游的表达平台区域紧密相连而成。
  本研究发现在B.thuringiensis BMB171编码胶原粘附蛋白(Cap) mRNA的5'-非翻译区存在一个c-di-GMP核糖关Bc2 RNA。本研究通过体外转录终止实验,并在c-di-GMP低浓度和高浓度突变株中,通过β-半乳糖苷酶实验、荧光定量PCR实验,揭示了Bc2 RNA表达平台区的终止子结构会强烈地抑制下游基因cap的转录,当结合c-di-GMP后,会引起Bc2 RNA变构,并形成抗终止子结构,解除对cap的转录抑制。敲除Bc2 RNA会导致cap超表达,从而抑制细菌的运动、胞外多糖的分泌和生物被膜的形成,同时促进细菌的沉降并影响细菌对棉铃虫的毒力。本研究首次提出了“抑制-去抑制”模型,并且Bc2 RNA是蜡样芽胞杆菌群中第一个被实验验证功能的c-di-GMP核糖开关。
  (3)转录调控因子BioQ介导的生物素合成调控系统研究
  结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性传染病,可以感染人体的各种器官或组织,但主要侵染肺部。大多数抗结核药物只对生长期的结核分枝杆菌有效,而不能清除潜伏期的结核分枝杆菌,多耐药结核分枝杆菌的出现使得结核病的防控形势变得更加严峻,现有的抗结核药物已经不能满足医疗的需要,迫切需要从结核分枝杆菌鉴定新的靶标,开发出新型药物。
  生物素是所有生物都必须的维生素。它作为羧化酶的辅因子,对分枝杆菌的中心代谢和脂肪酸合成途径非常重要,活动期和潜伏期的结核分枝杆菌都必须依赖自身合成生物素而生存,破坏生物素合成途径会抑制结核分枝杆菌的生长并导致其丧失致病性。哺乳动物不具有生物素合成相关的基因,所以生物素合成途径已经成为新型抗结核药物的靶标。
  本研究以生长迅速、不致病的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)为模式菌株,系统地探究了生物素代谢相关基因的转录调控机制,为分枝杆菌生物素代谢研究奠定了基础。
  经典的生物调节系统依赖双功能酶BirA,一方面作为生物素-蛋白连接酶调控生物素的利用,一方面作为转录调控因子控制生物的合成与转运。分枝杆菌的BirA缺乏转录调控因子的功能,我们在耻垢分枝杆菌中鉴定到了一个TetR家族的转录调控因子BioQ,它补偿了BirA转录调控因子的功能,本研究揭示了以BirA和BioQ协同介导的生物素代谢调节系统。
  BioQ是TetR家族的转录调控因子,本研究通过凝胶阻滞、DNaseⅠ足迹等实验鉴定了BioQ识别的DNA序列为13 bp的保守的回文序列TGAAC-N3-GTTCA;并通过构建bioQ缺失菌株ΔbioQ,利用荧光定量PCR和β-半乳糖苷酶实验探究了BioQ作为转录抑制因子,调节生物素合成相关基因表达的机制。
[硕士论文] 李姝蓉
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:调节性免疫细胞网络是目前移植免疫领域研究热点内容之一,其中调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)是新近发现的一群具有负向调节功能的B细胞,该类细胞可通过多种作用方式从而促进器官移植术后免疫耐受形成,以及维持耐受状态。Bregs的发现及作用机制的研究,为诱导移植耐受策略提供了新方向。但是目前对于Bregs细胞的表型、功能、及调节机制没有深入的认识,尤其在移植免疫中Bregs细胞发挥的作用至今尚未明确。在已有报道的基础上,我们进行了以下研究。
  本研究立了同种异基因小鼠胰岛移植动物模型,按以下方式分组:对照组(n=5);单纯移植1周组(n=5);移植+双抗体1周组(n=5);单纯移植2周组(n=5);移植+双抗体2周组(n=5);长期耐受组(即移植物存活超过90天)(n=4)。流式细胞仪检测移植后受体小鼠脾细胞中CD19+CD5+CD1d+B10细胞和CD19+Tim-1+B细胞比例。结果表示,只有移植+双抗体2周组小鼠体内的B10细胞有明显增加,最高增加至5.9%(P<0.05)。单纯移植2周组、移植+双抗体2周组,以及长期耐受组小鼠体内的CD19+Tim-1+B细胞则均有明显增加(P<0.05)。为进一步明确Bregs是通过与哪些免疫细胞作用而促进耐受形成,同期检测了CD4+CD25+Tregs以及CD4+IFN-γ+Th1细胞和CD4+IL-4+Th2细胞。结果表明,移植+双抗体2周组小鼠体内的CD4+CD25+Tregs和CD4+IL-4+Th2均有显著增加(P<0.05),CD4+IFN-γ+Th1细胞则明显减少(P<0.05)。并且,除Th2细胞外,长期耐受小鼠的各淋巴细胞比例变化趋势都与术后2周数据一致。以上结果提示在抗CD45RB/抗Tim-1联合诱导的小鼠移植耐受过程中,调节性B细胞在耐受的初期及维持过程中都起到了重要作用,其具体机制可能是通过与调节性T细胞,Th1细胞以及Th2细胞的相互作用参与免疫调节。对调节性B细胞的扩增条件进行了探索。结果表明LPS可刺激B10细胞在体外进行增殖,LPS的作用时间(72h)与细胞的增殖成正相关(P<0.05)。
[硕士论文] 林如琴
公共卫生 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  肠出血型大肠埃希菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7为人畜共患病,临床上可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症。目前对EHECO157∶H7感染尚缺乏有效的防治措施,安全有效的疫苗是预防其感染的首选。本研究选择EspA和Tir两个关键性定植功能蛋白候选抗原,同时构建具EspA-Tir-M融合蛋白为抗原的亚单位候选疫苗和以嗜酸乳杆菌为抗原投递系统的活载体候选疫苗菌株,并评价其保护效果。
  方法:
  首先通过重叠延伸PCR方法扩增目的片段EspA-Tir-M,将EspA-Tir-M与原核质粒pET28a(+)连接,构建大肠杆菌原核表达系统,通过诱导蛋白表达和纯化浓缩蛋白EspA-Tir-M。将制备EspA-Tir-M蛋白分别通过滴鼻和皮下注射两种方式免疫小鼠,测定小鼠血清IgG、粪便SIgA,血清中细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平,并进行攻毒实验,观察小鼠的死亡率、排菌量及组织病理切片,对比两种免疫方式的保护效果;其次,再将EspA-Tir-M融合基因与pMG36e质粒连接后电转化至嗜酸乳杆菌感受态,构建表达EspA-Tir-M的重组嗜酸乳杆菌,并进行多重PCR和测序鉴定重组嗜酸乳杆菌,进行SDS-PAGE及Western Blot分析重组嗜酸乳杆菌表达的蛋白情况;并通过体内外实验评价该重组嗜酸乳杆菌的保护效果,体外实验通过竞争、排斥实验和细胞骨架染色,观察重组嗜酸乳杆菌抑制EHEC O157∶H7黏附LoVo细胞及预防A/E损伤形成的效果,体内考察重组嗜酸乳杆菌灌胃免疫小鼠后,诱导小鼠产生特异性抗体和细胞因子的表达水平,以及EHEC O157∶H7攻毒后对小鼠的保护效果。
  结果:
  本实验成功构建EspA-Tir-M原核表达系统,且诱导表达的EspA-Tir-M主要以可溶性形式存在,纯化后蛋白纯度可达90%,将蛋白采取皮下和滴鼻两种免疫方式,结果表明滴鼻免疫比皮下免疫可更好的诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG和SIgA,滴鼻免疫可提高IL-4、IL-10和IFN-γ的表达水平,而皮下免疫只能提高IL-10和IFN-γ的表达水平,此外,滴鼻免疫的保护率高达88.9%,病理切片也显示滴鼻免疫可有效预防EHEC O157∶H7对肠道的损伤,而皮下免疫的保护效果则较差。同时首次成功构建了表达EHEC O157∶H7EspA-Tir-M蛋白的重组嗜酸乳杆菌,且主要以外分泌表达可溶性蛋白;重组嗜酸乳杆菌体外实验可竞争性排斥达60%EHEC O157∶H7黏附LoVo细胞,而预防性排斥高达94%,并且可阻止EHEC O157∶H7对LoVo细胞造成A/E损伤;体内实验表明重组嗜酸乳杆菌可诱导小鼠产生较高水平的IgG和SIgA,提高小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平,对小鼠的保护率达77.8%,并有效缩短粪便排菌量和排菌时间,病理切片显示有效减轻EHEC O157∶H7引起的A/E损伤。
  结论:
  本研究首次构建了预防EHEC O157∶H7的新型双价EspA-Tir-M融合亚单位疫苗和重组嗜酸乳杆菌活载体疫苗,两者均具有良好的免疫效果及保护效果,可作为EHEC O157∶H7的候选疫苗。
[硕士论文] 俞微
固体力学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:艾滋病是一种危害性极大的传染病,如今,随着现代生活节奏的加快,艾滋病的扩散越演越烈。社会对艾滋病的感染、发病机理及其预防、治疗的研究越来越重视,然而,三十多年来,尽管生物学家和医学家从多个角度,在关于人类免疫缺陷病毒(HIV)和受体细胞的相互作用方面,进行了免疫学、微生物学及动力学的深入探索,仍然没有找到能够完全治愈艾滋病的医疗手段,特别是对于HIV感染后期在部分病人身上会发生的R5-X4病毒表现型转换这一现象,至今没有明确的解释。
  HIV一般通过使用趋化因子受体CCR5或CXCR4作为复合受体进入靶细胞。在HIV-1感染的早期,使用CCR5作为复合受体的病毒属于优势种群;而到了后期,使用CXCR4作为复合受体的病毒有可能逐步出现并占据主导地位。为了探索可能导致这一现象发生的因素,我们建立了一个拥有时变参数的五维动力学模型,并在该模型的基础上进行了灵敏度分析。本文逐一分析了每一个因素对R5-X4病毒表现型转换发生的可能性的影响,并得到了超出预期的有趣结果。
  结果显示,在不同的病人身上,对病毒表现型转换起重要影响的因素并没有太大的改变,并且这些因素在疾病发展的全过程中都保持着较大的灵敏度。这些因素主要包括CD4+T细胞和病毒的增殖速率以及病毒的死亡速率。值的一提的是,尽管病人间各个因素影响力的排序是不同的,但各个因素影响力随时间的变化趋势在不同病人间的趋势是相似的。对这一现象的认知为临床抗病毒治疗,如抗艾滋药物的研发和使用、基因治疗方案的确定以及抗艾滋疫苗的研发,提供了一些新的思路和想法。
[硕士论文] 李泽鑫
内科学(内分泌学) 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  烟酸受体GPR109A在很多组织和细胞中都被证明有抗炎活性。发现小鼠胰岛β细胞及MIN6胰岛β细胞株表达烟酸受体GPR109A,并且证明在MIN6细胞上,通过激活GPR109A可以抑制IFN-γ和TNF-α诱导的细胞内NO累积,由此推测GPR109A在β细胞上同样也有抗炎活性。在这些研究基础上,本实验将利用棕榈酸对MIN6细胞进行炎症诱导后,观察 GPR109A的抗炎作用,并进一步探索它的抗炎机制。并在原代小鼠胰岛细胞上初步探讨是否存在着相同的抗炎机制。
  方法:
  培养MIN6细胞,通过RT-PCR及免疫细胞化学染色验证MIN6细胞上存在GPR109A的表达。分别予棕榈酸及棕榈酸+烟酸干预,蛋白免疫印迹法(western blotting)检测INF-γ及GPR109A的表达情况和Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平。为进一步验证GPR109A与Akt/mTOR信号通路的关系,分别予不同浓度的烟酸和3-羟基丁酸干预MIN6细胞,检测细胞内Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平。分离小鼠胰岛,予烟酸和3-羟基丁酸干预,荧光定量PCR分析mTOR、p70S6K的表达水平。
  结果:
  ⑴MIN6细胞表达GPR109A mRNA。⑵MIN6细胞表达GPR109A蛋白。⑶烟酸可部分逆转棕榈酸诱导的MIN6细胞Akt和p70S6K的磷酸化和IFN-γ的表达。⑷烟酸抑制MIN6细胞内Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化。⑸3-羟基丁酸抑制MIN6细胞内Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化。⑹烟酸、3-羟基丁酸可抑制小鼠胰岛细胞mTOR、p70S6KmRNA的表达。
  结论:
  在MIN6细胞上,烟酸受体GPR109A可以通过抑制Akt/mTOR信号通路来抑制棕榈酸诱导的炎症因子表达。
[博士论文] 裴彬
病原生物学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:p62/SQSTM1是参与细胞代谢和应激反应的重要信号传导中心,作为“脚手架”蛋白,p62通过与不同信号分子相互作用,调控细胞自噬、氧化应激和天然免疫。天然免疫是宿主防御外来入侵病原体的第一道防线,宿主通过胚系基因编码的模式识别受体识别病原相关分子模式进而激活下游信号通路,产生多种细胞因子抵抗病原体侵袭。针对RNA病毒,宿主主要利用膜结合的Toll样受体和胞质中的RIG-Ⅰ样受体识别病毒核酸。在RIG-Ⅰ样受体介导的细胞Ⅰ型干扰素免疫应答中,TBK1作为激酶直接催化重要调控因子IRF3磷酸化,诱导Ⅰ型干扰素IFN-β产生发挥抗病毒作用。同时TBK1还催化NF-κB相关蛋白磷酸化,激活转录因子NF-κB,是联系Ⅰ型干扰素信号通路和NF-κB信号通路的关键激酶。以往研究发现p62通过与TRAF6等分子相互作用调控NF-κB的激活,而TRAF6还参与细胞Ⅰ型干扰素的产生。在病毒诱导的天然免疫应答中,关键接头分子MAVS被模式识别受体活化后招募TRAF6,利用TRAF6促进IKKγ的泛素化使之活化进而招募TBK1等分子,激活Ⅰ型干扰素表达。鉴于p62可调控TRAF6的活性影响NF-κB活化以及TBK1作为关键激酶联系着NF-κB信号通路和Ⅰ型干扰素信号通路,p62可能也参与宿主Ⅰ型干扰素免疫应答,然而p62是否影响病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素产生目前尚不清楚。本研究旨在明确p62对RNA病毒诱导IFN-β产生的影响及其作用机制。发现敲减p62可导致RNA病毒感染诱导的细胞IRF3二聚化减弱、ISRE报告质粒表达水平和IFN-βmRNA水平下调,表明干扰p62的表达可影响宿主细胞Ⅰ型干扰素的产生并且通过进一步实验发现p62作用于IRF3上游。通过免疫共沉淀发现p62与TBK1相互作用,而且敲减p62可抑制IRF3的磷酸化。利用体外激酶实验并检测TBK1磷酸化水平,发现敲减p62可导致TBK1Ser172位磷酸化水平下调抑制TBK1激酶活性从而抑制TBK1催化IRF3磷酸化。通过体外磷酸酶实验发现细胞敲减p62导致的TBK1Ser172磷酸化减弱是由磷酸酶PP2A活性增强催化TBK1去磷酸化引起的。此外还发现敲减p62可促进仙台病毒SeV、水疱性口炎病毒VSV和呼吸道合胞病毒RSV的复制。
  综上所述,本研究发现在RNA病毒感染诱导的天然免疫应答中p62通过抑制磷酸酶PP2A对TBK1去磷酸化调控TBK1激酶活性的分子机制,为自噬与天然免疫相互调控提供了新的机制,进一步丰富了对细胞自噬与天然免疫相互联系相互调控共同发挥抗病毒作用的认识,为寻找潜在抗病毒药物靶点提供了新方向。
[硕士论文] 薛梦颖
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:T淋巴细胞是效应细胞,失调能引起多种疾病。研究表明间充质干细胞可以通过调节T淋巴细胞功能,下调不适当的免疫应答,避免机体产生过激的免疫反应。目前,注射外源性的间充质干细胞已经成为治疗系统性红斑狼疮、胶原诱导关节炎等自身免疫疾病的有效手段,但是间充质干细胞发挥免疫调节作用的机制还未得到完全的揭示。
  为了解间充质干细胞对T淋巴细胞的调节功能,本论文首先提取分离出了在来源以及伦理学上更具优势的脐带间充质干细胞(HUCMSCs)、脐带血间充质干细胞(HCBMSCs),分别将其与外周血单核细胞(PBMCs)进行共培养,考察了共培养后T淋巴细胞亚群的变化。研究结果表明,HUCMSCs以及HCBMSCs均可对CD4+以及CD8+T淋巴细胞中不同亚群产生一定的影响,具体趋势是HUCMSCs以及HCBMSCs可上调CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞,下调CD4+CD45RA+CCR7+na(i)ve细胞、CD8+CD45RA+CCR7+na(i)ve细胞、CD4+CD45RA-CCR7+中央记忆型T细胞、CD8+CD45RA-CCR7+中央记忆型T细胞的比例,而对于CD4+CD45RA-CCR7-效应记忆型T细胞以及CD8+CD45RA-CCR7-效应记忆型T细胞有促进作用,并且相关炎症因子的定量结果表明,HUCMSCs与HCBMSCs的免疫调节作用随着时间的延长逐渐减弱。
  嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)是指在体外通过基因重组的方式使T细胞表面表达靶向特定肿瘤的嵌合抗原受体(即CAR),继而回输回病人体内杀伤肿瘤细胞的一种细胞疗法。然而体外制备效率低、体内增殖效率低已经成为制约CAR-T技术发展的重要障碍。前人的研究表明体外制备的CAR-T细胞中na(i)ve细胞以及中央记忆型T细胞的比例与CAR-T细胞的体内扩增效率成正比。以上的研究显示间充质干细胞可以调节T淋巴细胞中不同亚群的比例,因此假设间充质干细胞可以增加CAR-T细胞中na(i)ve细胞以及中央记忆型T细胞的比例。
  为了验证该假设,本论文创造性的将HUCMSCs或HCBMSCs与体外制备的CD19CAR-T细胞进行共培养。实验结果显示,通过共培养,CD19CAR-T细胞中淋巴细胞数目得到了维持并且CD4+、CDS+细胞中na(i)ve细胞以及中央记忆型T细胞比例均有明显的增加,这就意味着在体外制备CD19CAR-T细胞时,将其与HUCMSCs或HCBMSCs进行共培养可能成为解决CD19CAR-T细胞体内增殖效率低这一问题的有效方法。
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