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[硕士论文] 马天宇
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:分娩启动是一个复杂的生理过程,影响因素有很多,包括机体内部环境和外界环境两方面。外界因素包括摄入食物、不当的机械运动等;内在调节主要包括激素、免疫炎症以及细胞凋亡等。目前关于分娩启动过程具体分子机制的研究鲜有报道。在本实验室大白猪分娩前后胎盘组织转录本测序中筛选出GPX1差异表达基因,有研究表明GPX1可以缓解氧化应激反应,GPX1缺乏会导致非正常分娩。本试验旨在探究谷胱甘肽过氧化物酶GPX1在分娩启动的进程中的作用。
  为了探究GPX1是否在分娩启动中发挥作用,我们在怀孕15.5天孕鼠腹腔注射LPS构建小鼠早产模型,检测胎膜中ROS水平、氧化标志基因HSP90、炎症因子TNFα、IL1β以及分娩相关基因COX2的表达变化。在WISH细胞中分别转染干涉片段si-GPX1和超表达质粒,检测分娩相关基因HSP90、COX2、Caspase3、IL1β以及NFκB。为了判断GPX1发挥作用的通路,采用NFκB通路抑制剂CAPE处理WISH细胞,通过细胞免疫荧光检测NFκB以及COX2的表达变化。通过ELISA检测清平猪有无分娩征兆的羊水中PGE2的浓度。在WISH细胞中转染重组质粒pCMV-GPX124小时和48小时后,分别检测细胞上清液中的PGE2浓度。最后,通过PGE2处理WISH细胞,检测对GPX1、NFκB和COX2的影响。试验主要研究结果如下:
  1)小鼠早产模型中实验组小鼠胎膜ROS水平显著增强,氧化应激标志基因HSP90表达水平显著高于对照组,同时炎症因子TNFα、IL1β和COX2呈现高表达,蛋白结果表现一致。表明分娩启动时,氧化应激水平加剧,并出现炎症反应。在三类抗氧化标志基因GPX1、Catalase和SOD2中,实验组与对照组相比,表达水平分别是1.80、1.27和1.18倍。其中GPX1相对变化最剧烈,推断GPX1作为主要抗氧化基因。
  2)在长妊娠期及短妊娠期清平猪种中,有分娩征兆组羊水中PGE2浓度均显著高于无分娩征兆组,结果表明PGE2对分娩启动发挥重要作用。高水平GPX1可以降低HSP90的水平,表明GPX1可以降低氧化应激反应,同时激活NFκB通路上调COX2的表达,在24以及48小时后,PGE2水平均显著上升。低水平GPX1使HSP90水平升高,氧化应激水平加剧,上调炎症因子IL1β水平。GPX1从激素水平以及免疫炎症两方面参与妊娠以及分娩启动的调节。
  3)PGE2处理WISH细胞后,对GPX1产生促进作用,对NFκB以及COX2有负反馈抑制作用。这种机制可以防止PGE2水平通过NFκB通路进一步升高,避免PGE2高峰提前引发早产。GPX1的稳定表达是正常妊娠分娩的必要条件。
[硕士论文] 张世阳
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究鞭毛内转运蛋白172(Intraflagellartransportprotein172,IFT172)在小鼠生精细胞中的功能以及精子鞭毛形成过程和生育能力中的作用。
  方法:1、将成年的Ift172flox/flox雌性小鼠与Stra8-iCre雄性小鼠杂交,建立的Ift172生精细胞条件敲除小鼠为实验组小鼠,以野生型小鼠为对照。2、用10对六周以上的Ift172条件敲除雄鼠或野生型雄鼠分别与成年的野生型雌鼠交配两个月以上,评估其生育力及繁殖能力。3、收集附睾精子,精子计数,检测精子活力,光镜下观察精子形态。4、收集小鼠睾丸和附睾进行HE染色,观察精子发生过程的各个阶段。5、透射电镜(TEM)观察两组小鼠精子的超微结构。6、蛋白印迹(WesternBlot)检测IFT25、IFT27、IFT81、AKAP4、ODF2、SPAG16L等相关蛋白的表达水平。7、分离小鼠睾丸生精细胞,免疫荧光染色染色检测IFT172的定位以及Ift172条件敲除小鼠体内IFT172敲除水平,并观察精子中纤维鞘蛋白AKAP4和外周致密纤维蛋白ODF2的定位。
  结果:Ift172floJflox;Stra8-iCre条件敲除小鼠都能够生长至成年。1、与正常的小鼠相比较,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的睾丸重量/体重比例没有明显差别。其中有六成的成年雄性纯合子小鼠是不育的。2、组织学检测显示,与野生型小鼠相比,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的精子形成阶段发生异常。3、Ift172被敲除后,小鼠附睾中仅残存少量发育完全的精子,大部分精子出现精子尾卷曲。且精子数目比野生型小鼠减少了10倍左右,精子活力较野生型小鼠有明显降低。4、与野生型小鼠相比,在Ift172条件敲除小鼠的睾丸内,其他的几种IFT家族B复合物的成员IFT20、IFT25、IFT27和IFT81以及IFT家族A复合物中的IFT140的表达水平没有明显的变化。此外,轴丝蛋白SPAG16L的表达量也没有明显变化。但是外周致密纤维结构蛋白ODF2以及线粒体鞘蛋白AKAP4的表达量显著下降。5、免疫荧光染色结果显示,在野生型小鼠中IFT172定位在生精细胞中定位在长形精子细胞的精子领处,而AKAP4和ODF2在Ift172条件敲除小鼠精子中的定位与野生型小鼠相比没有明显改变。
  结论:IFT172在生精细胞中表达量减少导致小鼠精子数目、活力以及生育能力下降,IFT172是一个对于雄性小鼠的生育能力以及精子发生所必需的蛋白,它很可能参与精子发生过程中特殊的结构蛋白的运输和组装。
[硕士论文] 镇景开
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48kD转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。
  方法:(1)用Consite方法分析人SPA G16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织cDNA为模版,构建含有SPA G16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/pGL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pcDNA3和S-SOX5/pTarget)以及抑制其表达的siRNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/pGL3转染至BEAS-2B细胞,以pGL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pcDNA3转染至BEAS-2B细胞,以pcDNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L mRNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pcDNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPA G16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。
  结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48kDa的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16LmRNA的水平。SOX5RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。ChIP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPA G16L的表达。
  结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPA G16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。
[硕士论文] 尹晓燕
化工过程机械 山东大学 2017(学位年度)
摘要:马蹄蝙蝠有一个积极的超声波声纳系统,允许动物在结构丰富的自然环境中导航和捕捉猎物。这种生物声纳系统的组件包含一个不寻常的动态系统,在实现动物的优良的感官性能中起着关键性作用。马蹄蝙蝠生物声纳采用精心设计的挡板形状来对传出和传入的超声波进行衍射,超声从被鼻叶包围的鼻孔发出然后被大外耳接收。当超声衍射发生时,鼻叶和耳朵就被驱动。在发射端,两鼻叶即前叶和鞍,已被证明是与超声发射同步运动。在接收侧,外耳已显示在约100毫秒内发生高达20%的相对于耳朵总长度的形变。由于这些形变的产生,传入和传出超声的衍射变成了一个动态的过程。动态的衍射过程导致类似的动态装置特性,如果这种额外的动态维度被发现在本质上提高了感官信息的编码,那么马蹄蝙蝠生物声纳可以作为一个动态的过程应用于传感技术。本文将会介绍目前已知的关于蝙蝠生物声纳的动态效果,同时将会对生物声纳和类似工程的感官系统如声纳和雷达进行对比。
  蝙蝠种群中的马蹄蝠(Rhinolophidae)和相关的旧大陆鼻叶蝠(Hipposideridae)都显示出将明显的耳朵动作作为其生物体行为的一部分。在当前的工作中,通过耳朵上标记点的三维重建来定量分析这些耳朵运动。在两种物种中观察到的耳朵运动都分为两类:在“刚性旋转”运动中,耳朵的几何形状保持不变,仅仅改变在空间中的旋转方向。在“柔性运动”中,耳朵的几何形状发生变化,这在标记点之间的距离变化中是明显的。线性判别分析结果表明,两种类型的运动可以在分析的数据集中没有任何重叠的情况下分离。因此,来自两个物种的蝙蝠有两种独立类型的耳朵运动,它们之间显然没有过渡。两种不同运动在动物生物体行为中的作用仍有待确定。
  已知蝙蝠通过多普勒频移补偿机制来进行捕猎和追踪,本文将通过实验的方法来探究快速耳朵运动能否对回声产生较大的多普勒频移值,从而激发蝙蝠启动其多普勒频移补偿机制。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 许铁龙
动物学 贵州师范大学 2017(学位年度)
摘要:本研究至2016年12月止共对贵州省包括毕节市、大方县、盘州市、威宁彝族回族苗族自治县、纳雍县、水城县、兴义市、道真仡佬族苗族自治县、务川仡佬族苗族自治县、绥阳县、赤水市、习水县、金沙县、遵义县、凤冈县、兴仁县、惠水县、关岭布依族苗族自治县、开阳县、修文县、安顺市、长顺县、清镇市、贵阳市花溪区、贵阳市乌当区、贵定县、织金县、息烽县、龙里县、平坝县、黔西县、余庆县、荔波县、榕江县、从江县、三都水族自治县、独山县、丹寨县、江口县、印江土家族苗族自治县、松桃苗族自治县、施秉县、黎平县、雷山县、凯里市、沿河土家族自治县、思南县、安龙县、贞丰县、望谟县、罗甸县在内的共计51个县、市、区进行了野外翼手目动物标本采集,采集翼手目动物标本共计2036号,结合文献记录,现贵州省共有翼手目动物7科18属59种。与《贵州兽类志》相比增加19种。其中,中国特有种8种。经过实地调查,贵州省分布最为广泛的大蹄蝠Hipposiderideros armiger,其在贵州省的分布地共计47个县市。在贵州高原山区省的5个动物地理亚省中均有分布的翼手目物种分别为:托氏菊头蝠Rhinolophusthomasi、菲菊头蝠Rhinolophus pusillus、皮氏菊头蝠Rhinolophuspearsonii、贵州菊头蝠Rhinolophusrex、云南菊头蝠Rhinolophusyunanensis、大蹄蝠Hipposiderosarmiger、黄大蹄蝠Hipposiderospratti、三叶蹄蝠Aselliscusstoliczkanus、西南鼠耳蝠Myotisaltarium、中华鼠耳蝠Myotischinensis、中华山蝠Nyctalusplancyi、南蝠Iaio、印度伏翼Pipistrelluscoromandra、东亚伏翼Pipistrellus abramus,共计14种。五个动物地理亚省之中,翼手目种类最多的是黔东南低山丘陵盆地亚省,共计48种,占贵州省总数59种的81.4%;另黔西高原中山亚省共有翼手目动物31种,占贵州省总数59种的52.54%;黔北中山峡谷亚省的翼手目种类为31种,占贵州省总数59种的52.54%;黔中山原丘陵亚省的翼手目共计38种,占贵州省总数59种的64.41%;黔南低山河谷亚省的翼手目种类共计33种,占贵州省总数59种的55.93%。贵州省翼手目分布型以东洋型为主要类型,为27种,南中国型13种排列第二,云贵高原及附近山地型6种,东亚季风区型4种,旧大陆热带-亚热带型3种,古北型2种,东北型、岛屿型、喜马拉雅-横断山区分布型各1种,不易归类的分布型1种(由于其分布比较广泛,不能视为某一类),即大耳黄蝠Nycticeiusemarginatus。
[硕士论文] 赵焕乐
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:机场及其周边鸟类种类调查及其多样性研究对于新建机场开展鸟击防范工作具有重要意义。2015年1-12月,采用样线法和固定半径样点法对内蒙古扎兰屯成吉思汗机场及其周边8km范围内的区域进行鸟类多样性调查。调查结果如下:
  (1)调查期间共记录到鸟类有15目31科82种。
  (2)扎兰屯成吉思汗机场围界内麻雀、喜鹊、家燕、白鹊钨为主要鸟类。鸟类四季活动的共同高峰期为早晨6点到8点,其中春季4点到6点的鸟类种类最高,为6种,夏季的6点到8点鸟类数量最多,为363只。
  (3)根据对鸟类的群落结构分析:机场围界内春季的鸟类多样性指数(0.740)和均匀度指数(0.819)最高;冬季的优势度(0.683)最高;夏季的平均密度(2.826ind· hm-2)最高。机场围界外:夏季湿地的多样性指数最高,为1.576;冬季的草地均匀度指数最高,为0.902;冬季的居民区优势度最高,为2.113;春季的湿地平均密度最高,为28.600 ind·hm-2。
  (4)本文在前人研究的基础上综合鸟类的体积、数量、出现次数、飞行高度、与机场的距离、出现的样带数以及是否集群7个因子对鸟类的危险值重新赋值并计算得出危险值。严重危险鸟类有普通鸬鹚Phalacrocorax carbo、麻雀、赤麻鸭Tadorna ferruginea等14种。
  根据调查结果提出不同季节,不同区域以及不同鸟种的针对性防范措施以及机场管理对策,为今后的扎兰屯机场鸟击防范工作提供重要的科学依据。
[硕士论文] 王晨
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:FHL2(Four and a half LIM domains protein2)是FHL蛋白家族成员之一,可作为转录因子共结合因子,参与细胞增殖、迁移、凋亡、信号转导和基因转录等诸多过程。目前,基于FHL2的研究主要集中在心脏、骨骼和癌症中,对生殖发育方面的研究较少。研究表明,FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,可通过结合NR5A1,调控抑制素α基因的转录,提示FHL2对生殖具有重要调控作用,但调控作用及作用机制尚不清楚。因此,本实验以昆明小鼠卵巢颗粒细胞(mGCs)为模型,研究FHL2对小鼠颗粒细胞的调控作用及作用机制,旨在为阐明哺乳动物卵泡发育调控机制提供理论基础。主要研究结果如下:
  (1) FHL2在小鼠卵巢中的时空表达与定位规律:收集新生小鼠(1-6天)及3周和10周的小鼠卵巢,免疫组化实验结果表明,FHL2的表达量随着卵泡组装和原始卵泡池的形成逐渐升高,在颗粒细胞和卵母细胞中均有表达;Western Blot检测结果显示,出生后1天、4天和7天小鼠卵巢FHL2表达量逐渐上升;
  (2) FHL2在颗粒细胞细胞核和细胞质中表达:Western Blot和免疫荧光方法证明,FHL2在mGCs细胞核和细胞质中均有表达,定位与细胞所处的分裂周期有关;
  (3) FHL2促进小鼠颗粒细胞的增殖:体外培养小鼠颗粒细胞,分别转染FHL2小干扰RNA或过表达质粒,CCK-8、细胞计数,流式细胞分析方法结果表明,敲低FHL2后,细胞活力显著降低,S期细胞比例显著降低,细胞凋亡显著增加;过表达FHL2,则可以显著促进小鼠颗粒细胞生长,提高细胞活力,抑制细胞凋亡;
  (4) FHL2通过结合转录因子AP-1和NF-κB调控EGF和EGFR转录:转染FHL2 siRNA后,敲低组EGF和EGFR的mRNA表达量和蛋白表达量显著降低,而超表达FHL2则显著提高EGF和EGFR的表达量;进一步利用Co-IP和CHIP方法证明,FHL2分别结合转录因子AP-1和NF-κB,在转录水平上调控EGF和EGFR的表达;
  (5) EGF对小鼠颗粒细胞生长的调控依赖于FHL2表达量:EGF(20 ng/mL)可显著促进mGCs增殖、提高细胞活力,提高S期细胞比例;敲低FHL2后,EGF对颗粒细胞的促增殖作用受到抑制,提示EGF对小鼠颗粒细胞的调控依赖于FHL2表达量;此外,EGF处理可诱导颗粒细胞EGF和EGFR的表达量显著上升;敲低FHL2后再用EGF处理,EGF对其自身和其受体的诱导作用被显著抑制;
  (6) EGF可促进FHL2表达,尤其是诱导细胞核内FHL2表达量上调:上述实验说明,EGF通路可能与FHL2存在互作,为进一步验证该假设,利用EGF处理小鼠卵巢颗粒细胞,结果表明,EGF(20 ng/mL)处理可诱导mGCs FHL2表达;而分别添加EGFR抑制剂(AG1478)、MEK抑制剂(UO126)和PI3K抑制剂(LY294002)则可以阻断EGF对FHL2表达的调控,说明EGF可通过结合EGFR,激活MEK和PI3K信号通路,参与小鼠颗粒细胞FHL2的表达调控;免疫荧光检测结果显示,EGF可诱导颗粒细胞核内FHL2表达量显著上调;Western Blot结果进一步表明,随EGF处理时间的增加,FHL2在核内表达的表达量逐渐增加,呈时间依赖模式。
  在本研究中,发现FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,并参与颗粒细胞的生长调控。EGF与EGFR在细胞膜上结合,激活MEK和PI3K信号通路,调控FHL2表达,并促进FHL2在细胞核内聚集,而核内FHL2可作为转录因子共激活子,通过结合转录因子AP-1和NF-κB,促进EGF和EGFR的表达,从而形成EGF/EGFR/FHL2自分泌通路,调控颗粒细胞的生长与增殖。研究结果阐明了FHL2对颗粒细胞生长的调控作用及作用机制,有助于我们更好的理解哺乳动物生殖发育调控网络,并为提高家畜繁殖力新技术研发提供科学依据。
[硕士论文] 林志灯
海洋生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:长链多不饱和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFA)一般指的是双键数≥3且碳链长度≥20的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)。其中具有重要生理功能的LC-PUFA主要有二十二碳六酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(ARA),它们都是生物体正常生长发育所必需的脂肪酸。一般认为,海蟹不具有将亚油酸和α-亚麻酸转化为LC-PUFA的能力。因此,DHA和EPA等LC-PUFA被认为是海蟹的必需脂肪酸。近年来,本课题组在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)脂肪需求以及植物油替代鱼油方面开展了相关研究。研究结果发现,在饲喂紫苏籽油和红花油的青蟹的肌肉中,脂肪酸20:4n-6和20:5n-3的含量有轻微的提高。据此结果,我们推测青蟹自身可能具有合成LC-PUFA的能力。为验证我们的推测,本研究对青蟹合成LC-PUFA的关键酶基因进行了克隆,并对基因的组织表达和营养调节进行了研究。主要结果如下:
  1.采用RT-PCR和RACE-PCR方法,从青蟹中克隆到一个脂肪酸去饱和酶基因(GenBank登录号:KU975033),命名为Δ6 Fad-like。该基因的cDNA序列全长为1973bp,包含201bp的5’非翻译区,443bp的3’非翻译区以及1329bp的开放阅读框,共编码442个氨基酸。氨基酸序列与其它已克隆的甲壳类Δ6脂肪酸去饱和酶具有53%~80%的相似性,且具有典型的脂肪酸去饱和酶的结构特征。RT-qPCR结果显示:Δ6 Fad-like基因主要在肝胰腺中表达,而在其它组织中的表达量相对较低。养殖试验结果表明,随着大豆油替代鱼油比例的升高,Δ6 Fad-like基因在肝胰腺中的表达显著上调,说明了大豆油能促进该基因的表达。
  2.克隆到一个碳链延长酶4基因(GenBank登录号:KX454537),命名为Elovl4-like。该基因的cDNA序列全长为1119bp,包含58bp的5’非翻译区,44bp的3’非翻译区以及1017bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸。氨基酸序列与已克隆的其它物种的延长酶4具有42%~47%相似性,且具有典型的延长酶的结构特征。RT-qPCR结果显示:Elovl4-like基因主要在肝胰腺中表达,而在其它组织中的表达量相对较低。养殖试验结果表明,随着大豆油替代鱼油比例的升高,Elovl4-like基因在肝胰腺中的表达显著上调,说明了大豆油能促进该基因表达。
  3.克隆到一个碳链延长酶基因,命名为Elovlm,又因该基因有两个亚型,故又分别命名为Elovlm1和Elovlm2。Elovlm1和Elovlm2 cDNA序列全长均为1529bp,包含75bp的3’非翻译区,389bp的5’非翻译区以及1065bp的开放阅读框,共编码354个氨基酸。RT-qPCR结果显示:Elovlm基因主要在胃中表达,而在其它组织中的表达量相对较低。养殖试验结果表明,随着大豆油替代鱼油比例的升高,Elovlm基因在胃中的表达显著上调,但对肝胰腺中的Elovlm基因的表达影响不显著。
  综上所述,本研究从青蟹中克隆到三个LC-PUFA合成关键酶基因,即Δ6 Fad-like、Elovl4-like和Elovlm。这些基因在肝胰腺和胃等组织中的表达水平较高,说明这些组织可能是青蟹LC-PUFA合成的主要部位。饲料中的大豆油能够显著提高青蟹LC-PUFA合成关键酶基因的表达水平。该研究结果对于丰富甲壳类营养学,特别是分子营养学内容等具有较重要的理论意义和学术价值,为进一步研究甲壳类LC-PUFA合成的分子机制提供了基础。
[硕士论文] 陈晓乾
凝聚态物理 山东建筑大学 2017(学位年度)
摘要:蝙蝠作为唯一具有真正飞行能力的哺乳动物,它的翼是由前肢在进化过程中演变而来的,翼膜将前肢、身体和尾巴连接成一个整体。蝙蝠的飞行过程离不开翼膜,翼膜能够为蝙蝠的飞行提供升力。马铁菊头蝠属于小蝙蝠亚目中的菊头蝠科,在低速飞行过程中具有很强的机动性。本文通过对马铁菊头蝠模型翼膜所受升力的实验测量,对数据进行拟合,得到翼膜的升力系数,探究马铁菊头蝠翼膜的空气动力学特性。
  研究工作主要包括以下三个方面:
  (1)获取蝙蝠样本三维数字结构
  首先捕捉蝙蝠样本,对其形态学结构进行测量和拍照。然后将蝙蝠罹体样本进行一系列地处理,处理过程包括固定蝙蝠的形状、重塑蝙蝠体型、喷显像剂和贴标记点。然后使用三维光学扫描系统对蝙蝠样本进行表面扫描,通过计算机的自行处理得到原始表面结构的三维数字模型,利用图形处理软件处理原始三维数字模型,得到完整结构和无翼膜结构的模型,通过三维打印技术得到蝙蝠的实物模型。
  (2)蝙蝠模型的风洞实验
  对实物模型进行风洞实验,实验仰角范围为0°~20°,每次以1°的变化量增加,风洞的风速控制在0m/s~6/s的范围内,风速变化值为0.5m/s。记录风洞实验的数据,
  (3)数据的处理及分析
  根据空气动力学的相关理论,得到实验中蝙蝠翼膜受到升力,从而得到升力系数。由于实验测量的数据量较大,无法直接从数据中得出蝙蝠翼型的气动特性,因此需要整理数据并进行数据拟合,将升力与升力系数、风速之间以图表的形式表示出来。然后分别分析升力与风速、迎角的关系,升力系数与迎角的关系,分析得出数据中存在的一般规律,根据现有物理理探讨论蝙蝠具有的气动特性与进行。
  通过分析数据,得到的结论有:
  (1)在平稳非拍翼状态下,马铁菊头蝠翼膜所受升力随迎角和风速的变化而变化。在相同迎角情况下,升力随风速的增加而增加,变化趋势由缓慢逐渐增加变为线性增加。在相同风速条件下,实验中的飞行最佳迎角为12°,此时升力为最大,超过该迎角之后的升力缓慢下降。
  (2)升力系数随迎角的变化同样发生改变,升力系数在小角度时与迎角的关系近似线性关系,同样在迎角为12°时,升力系数值最大,之后随着迎角的增加,升力系数缓慢降低。在相同迎角的条件下,1m/s时的升力系数最大,而其它风速时的的升力系数主要集中在1~1.9之间。
  (3)马铁菊头蝠是一种主要以丛林中的昆虫为食的蝙蝠,在低速飞行时,他能够灵敏的躲避障碍物完成捕食过程,该特点说明在此条件下,其具有很强的机动性,该现象与其升力系数在低速时较高的情况相符合。
[硕士论文] 张丽娟
细胞生物学 安徽师范大学 2017(学位年度)
摘要:蛙科动物(Ranidae)是两栖动物无尾目(Anura)下新蛙亚目(Neobatrachia)中一个物种数量繁多的大科。对于蛙科的系统关系存在争议,蛙科内属的关系也未得到很好的解决。这是因为大部分研究采取的分子遗传标记数据较少,所以系统发生关系差异明显。本研究测得了花臭蛙(Odorrana schmackeri)的线粒体基因组全序列后,联合NCBI网站发布的现有的蛙科动物的线粒体全序列构建系统发生树,以期为蛙科的系统发生关系提供更多证据。
  本研究根据Oligo7.0软件设计出能扩增出花臭蛙(Odorrana schmackeri)线粒体全序列的17对引物,然后采用PCR及LA-PCR方法扩增序列并进行测序。得出花臭蛙线粒体基因组全序列长为18610bp,包含36个基因,分别为2个rRNAs基因、13个蛋白编码基因、21个tRNAs(缺少tRNA-His),还有一个控制区外加几个非编码空隙。通过跟石川臭蛙控制区对比,花臭蛙控制区终止相关序列区(TAS)的序列为:TATACTATGTATAATCATCATTAATCTATATAGTT;保守区(CSB):三个短的序列框CSB-1 (TAAATGAATGCTCGAATGACATA),CSB-2 (TACCCCCCCCCTTTACCCCC),CSB-3 (CCTTAAAACCCCCCCCGA);没有识别到中央保守区(CD)。在花臭蛙控制区5'和3'两端分别找出长为468 bp、195 bp的两个串联重复序列VNTRs1和VNTRs2,5'端的VNTRs1为62 bp,重复6次:5'-ATATAGATATAGGTACTATATCATACTATGTATAATCACCATTAATCTATATGGTTACATTC-3',而在3'端发现了15 bp长的重复13次的VNTRs2:5'-TAGATATACCTATAA-3'。花臭蛙线粒体基因排列方式跟新蛙亚目的基本一致,除了花臭蛙的线粒体基因组中缺失tRNA His,推测tRNA His在线粒体中的消失是直接丢失或是转移到了细胞核中。
  本文选择了15个属共70种蛙科动物,外加蟾蜍科的两种蟾蜍隐耳蟾蜍(Bufo cryptotympanicus)和史氏蟾蜍(Bufo stejnegeri)作外群,构建了基于线粒体全序列的系统发生树。结果显示:系统发生树高度支持将文中选取的70种蛙类动物分为两个进化枝:分支A和分支B。分支A包括倭蛙属、棘蛙属、大头蛙属、虎纹蛙属(Hoplobatrachus)、陆蛙属(Fejervarya)和水栖蛙属(Euphlyctis)6个属。分支B由湍蛙属(Amolops)、侧褶蛙属(Pelophylax)、拇棘蛙属(Babina)、臭蛙属(Odorrana)、蛙属(Rana)、腺蛙属(Glandirana)、水蛙属(Hylarana)七个属组成。所以分支A和分支B分别代表叉舌蛙亚科和蛙亚科。另外,跟大部分研究结果不同的是,圆舌浮蛙(Occidozyga martensii)聚到了叉舌蛙亚科和蛙亚科之外。从系统发生关系看,支持将叉舌蛙亚科和蛙亚科两个亚科升级为两个科:叉舌蛙科和蛙科。
  新蛙亚目有区别于典型脊椎动物的特定线粒体基因排列方式,但新蛙亚目中常常发生线粒体基因重排现象。在选取的物种中,重排的方式主要有:控制区下游的LTPF基因簇、NDII和COI之间的WANCY基因簇、tRNA His和ND5的易位及tRNA Met和控制区CR的复制等。线粒体基因重排跟系统发生树分类基本一致。进化枝B中虎纹蛙属和六趾蛙都复制了另一个CR,并且ND5基因位移到了复制的CR区下游,从而拥有两个控制区;而在系统发生树中,虎纹蛙属和六趾蛙聚合在一起,说明基因重排能反映出系统关系。所以在系统发生关系研究中,可以将线粒体基因的重排作为探究系统发生的一个有力的分子标记。
[硕士论文] 宋如昕
动物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:为了研究低温胁迫对中华鳖(Pelodiscus sinensis)早期炎性因子IL6肠道表达的影响,本论文首先细致划分了中华鳖的肠道。采用形态学观察、组织切片的方式研究了中华鳖的九段肠道。使用已经在哺乳动物和鱼类的肠道中报道的9个基因,从功能上区分中华鳖肠道各区段。其次,为研究肠道部分的免疫功能,聚焦于免疫因子il6,在克隆了中华鳖il6的cDNA全长后,从启动子、基因结构、共线性关系、相似性分析、系统发育和蛋白结构等方面对其进行生物信息学分析;采用 qPCR手段进行了组织表达模式分析。最后,为了探究il6免疫功能,利用免疫刺激剂(LPS、Con A和PolyI:C)在体外刺激脾脏原代细胞的实验;为了探究低温胁迫对il6的影响,我们采用两个温度(25℃,15℃)、两种细菌(革兰氏阴性与阳性菌)体内攻毒的方式从5个时间点(6h,12h,24h,72h和7d)来检测il6在肠道以及脾脏中的表达变化情况。
  实验结果如下:
  1.传统手段与分子生物学方法相结合对中华鳖肠道的划分
  根据标记分子在各区段的表达情况,对比形态学、组织学观察分析得到,从S1到 S3(从肠道起始占总长度的29.9%的位置,29.9%)的区域相当于哺乳动物十二指肠,而S4(40.2%)到S5(65.4%)、S8(92.7%)与 S9分别相当于哺乳动物回肠和大肠。而对于S6(81.3%)和S7(87.3%),其功能多样,并且取决于功能基因。它们可能是小肠和大肠之间的过渡区或者属于大肠部分。
  2.中华鳖il6的克隆及组织表达模式分析
  启动子分析显示,il6的启动子含有保守的转录因子结合位点。il6 cDNA全长为2069bp,开放阅读框长度为663bp,而il6ns cDNA全长为2194bp,开放阅读框长度为615bp,两者差异仅限于信号肽位置(il6编码信号肽的序列中插入了一段125bp的序列导致il6ns不编码信号肽)。中华鳖il6与鸟类、哺乳类相比均有保守的共线性关系,且相似性一致性较高。中华鳖il6与哺乳类、鱼类的基因结构类似,而中华鳖il6ns与鸟类的基因结构相似。蛋白二级结构主要包括α-螺旋、延伸链、无规则卷曲、β-转角。三级结构包含IL-6/G-CSF/MGF家族特征序列(C–X(9)–C–X(6)–G–L–X(2)–Y–X(3)–L),序列末端还具有aataaa加尾信号等。系统进化分析显示,与鸟类首先聚类,其次是哺乳类,最后是鱼类。同时,以人 IL6蛋白为模型构建了中华鳖 IL6蛋白的3D结构模型。组织表达模式分析结果则显示,两个il6在体内的分布差异较大。
  3.低温胁迫对中华鳖肠道免疫因子il6 mRNA表达的影响
  il6/il6ns两个转录本在金黄色葡萄球菌或嗜水气单胞菌胁迫后,表达量随时间推移整体均呈现先升后降的趋势,且 il6的表达受低温胁迫的影响表现出“应答延迟”和“表达增强”的现象。此外还发现,在受到细菌入侵后,il6的mRNA表达量对细菌的应答反应要强于 il6ns的。体外实验表明,脾脏细胞在 PolyI: C的刺激下6h il6/il6ns表达极显著上调(P<0.01),在24h和48h表达量迅速回落。但是,在Con A和LPS的刺激下,两个基因在各个时刻均没有显著性变化。
  综合以上研究结果得出如下结论:
  1.通过检测中华鳖中一些与哺乳类以及斑马鱼同源的标记分子,可以得到一个与传统形态学及组织学不同的、更为精确的中华鳖肠道划分结果。
  2.克隆得到了两个中华鳖的il6的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。弥补了爬行类il6研究的空白,证实了两个基因在组织内的分布情况不同。
  3.低温胁迫会对中华鳖il6应对细菌的免疫应答造成影响。且发现il6的两个转录本在胁迫后的表达模式不同。提示它们在体内有不同的功能。
[硕士论文] 史一然
生态学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:城市化建设改变了鸟类的栖息地结构,增加了人类对鸟类的干扰程度,极大地影响鸟类的群落结构,因此研究城市化建设对鸟类群落的影响对于城市建设和鸟类保护都具有非常重要的作用。扬州地处亚热带和温带气候过渡区,有丰富的湿地生态环境,是许多鸟类繁殖或者迁徙中转的最佳场所。本论文采用直接观察法和图片样本收集法对扬州市区的鸟类种类进行调查,分析城市化建设过程对鸟类群落结构的影响;在扬州市区选择城市居民区、城市公园和临近城市的乡镇3种典型区域,调查不同区域内的鸟类种类和数量及其各类环境因子,分析环境因子与鸟类群落组成的关系,探讨城市建设过程中影响鸟类群落的主要因素,为扬州市的城市化建设和鸟类保护提供资料。实验结果如下:
  1)扬州地区现记录鸟类140种,分别隶属于53科14目。其中雀形目物种75种(53.57%),非雀形目65种(46.43%);留鸟49种(35.00%),夏候鸟35种(25.00%),冬候鸟29种(20.71%),旅鸟27种(19.29%);鸣禽75种(53.57%),涉禽26种(18.57%),游禽20种(14.29%),攀禽10种(7.14%),猛禽5种(3.57%),陆禽4种(2.86%)。
  2)本次调查结果与1980年鸟类调查数据进行比较,历史上出现过、但本次调查未记录的消失鸟类共计50种,历史上未出现过、但本次调查发现的新增鸟类共计51种。其中,新增鸟类物种中雀形目23种,非雀形目28种;消失鸟类物种中雀形目13种,非雀形目37种。新增鸟类物种中夏候鸟13种,冬候鸟7种,留鸟17种,旅鸟14种;消失鸟类物种中夏候鸟11种,冬候鸟16种,留鸟4种,旅鸟19种。新增鸟类物种中鸣禽23种,涉禽13种,游禽9种,攀禽4种,猛禽2种;消失鸟类物种中游禽14种,鸣禽13种,猛禽11种,攀禽6种,涉禽5种,陆禽1种。鸮形目和夜鹰目无新增物种,鹳形目和鸻形目的新增物种数较多。旅鸟的物种组成变化较大,消失物种种类较多;冬候鸟消失物种较多但新增物种较少,夏候鸟部分物种消失但数量与新增夏候鸟物种数基本一致,留鸟的消失种类少且新增种类多,其中鸣禽种类最多且新增物种数最多,猛禽消失物种数占该分类比重较大,涉禽新增物种数大于消失物种数,除鸣禽和涉禽外,其他生活型鸟类消失物种数均大于新增物种数。
  3)居民区鸟类群落的多样性指数、均匀度指数和优势度指数均与城市公园和乡镇存在极显著差异,但城市公园和乡镇的多样性指数、均匀度指数、优势度指数之间均无显著差异。城市公园为城市生存鸟类和本地留鸟提供栖息环境,而乡镇为迁徙性候鸟提供更丰富的栖息地环境。
  4)鸟类的群落的特征参数与环境因子的相关性分别表明,样区面积、样线面积、样方距市中心距离和噪音指数在三种生境类型中均存在显著性差异。居民区中的树冠层高度、树冠层密度、灌木层密度、草本层密度和建筑指数均与城市公园和村镇生境有显著性差异,但这些因子在城市公园和村镇生境之间均无显著性差异。人为干扰在居民区和城市公园之间无显著性差异,但与乡镇生境存在显著性差异。群落特征参数与环境因子的多元线性回归分析表明,多样性指数、均匀度指数和丰富度均与样区面积、样线面积、树冠层密度、灌木层密度、草本层密度、距市中心距离有正相关关系,与人为干扰和建筑指数有负相关关系;优势度指数与样线面积、树冠层密度、灌木层密度、草本层密度有正相关关系,与建筑指数有负相关关系;个体数与样线面积、树冠层高度、树冠层密度有正相关关系,与建筑指数有负相关关系。
  5)鸟类群落特征参数与样区面积存在显著的相关性,多元线性回归分析表明,样区面积越大,鸟类群落的多样性指数、均匀度指数和丰富度(物种数)越高,符合岛屿地理学假定的预测。
  以上结果说明,扬州市区现有鸟类140种,近三十年来鸟类群落在雁形目、隼形目、鸻形目、鹳形目物种中有较大变化;城市公园和乡镇具有较高的生物多样性,城市公园为更多本地留鸟提供了丰富的食物资源和栖息环境,乡镇生境为迁徙性候鸟提供了生存空间;植被是影响鸟类生物多样性的主要原因,保证乔木-灌木-草本层次的连续性和丰富度有助于提高鸟类的生物多样性。
[硕士论文] 李运强
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:达里诺尔湖是我国北方干旱区的重要湿地,也是我国中西部地区众多水鸟的繁殖地、迁徙途中停歇地。2016年4月至2016年10月,对保护区6种典型生境中不同季节鸟类的种类组成、种群数量及群落结构进行了系统调查,并根据历年调查数据分析其种类组成年际动态变化,研究结果如下:
  调查期间记录到120种鸟类,属于15目,35科,其中留鸟15种,候鸟105种。国家级重点保护鸟类20种,其中一级保护鸟类3种,二级保护鸟类17种。鸟类组成以非雀形目为主,有14目23科,88种。古北界鸟类最多,繁殖鸟类以北方型为主,同时反映出各成分相互渗透的过渡性特征。
  河口湿地生境食物丰富,是各种游禽、涉禽的优质觅食场所,春季、夏季和秋季鸟类数量都很多,尤其是秋季,大量南迁雁鸭类陆续抵达后,河口湿地鸟类数量明显多于其他生境。
  春季鸟类种类最多,密度最小;秋季鸟类密度最大,种类最少。鸻形目鸟类有33种,是种类最多的类群,其次为雁形目,有22种,鸻形目和雁形目候鸟的迁徙活动对保护区鸟类群落变化影响很大。
  1983年至1985年调查记录107种鸟类,隶属于15目,32科;1999年至2001年调查记录鸟类78种,隶属于12目,30科;2012年至2016年调查记录193种鸟类,隶属于17目,40科。2013年出版的《达里诺尔野鸟》收录鸟类296种,隶属于18目,48科。
  在过去的30多年,保护区繁殖鸟类区系成分出现明显变化,高地型、季风区型种类扩散至保护区,并出现了南中国型、喜马拉雅-横断山型成分;雁形目繁殖鸟种类稳定,鸻形目繁殖鸟种类增多。鸻鹬类的增多与达里诺尔湖湖面退缩,浅水沼泽面积增加相关,是鸟类对达里诺尔湖生境变化的响应。
[博士论文] 曹婧
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物中,卵泡闭锁是卵泡发育过程中一个复杂且不可避免的退化过程,受到激素、生长因子等多种因素的调控,而颗粒细胞在卵泡的发育中扮演至关重要的角色,其凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因。Aurora B(丝氨酸/苏氨酸激酶)作为染色体乘客蛋白的一员,参与调控染色体的排列、纺锤体的组装以及胞质分裂等有丝分裂过程。此外,SUMO修饰参与蛋白质互作、信号转导、核质运输、转录调控以及调节基因组稳定性等方面,虽已有文献报道Aurora B可以被SUMO修饰,但是对于Aurora B及其SUMO修饰对卵泡发育的影响方面,仍然是个未解之谜。因此,本课题将以小鼠卵泡及其颗粒细胞为研究模型,主要研究Aurora B及其SUMO修饰对卵泡及其颗粒细胞发育的影响,初步探索可能存在的调控机制。本实验分为两个部分,具体内容和结果如下:
  实验一:Aurora B对小鼠卵泡及其颗粒细胞发育的影响研究
  1、AuroraB在卵泡及颗粒细胞中的定位与表达模式。获取不同发育阶段卵泡及颗粒细胞,检测Aurora B的定位及表达。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核,当胞质分裂时,位于围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的发育,Aurora B在各级卵泡和颗粒细胞中的表达水平上升,在有腔期达到最大;
  2、Aurora B影响卵泡的发育。体外分离获得次级卵泡,添加Aurora B抑制剂培养,观察记录卵泡的生长情况。研究结果显示,抑制AuroraB活性后,卵泡生长速度成下降,闭锁率增加,卵泡的发育受到抑制;
  3、Aurora B影响颗粒细胞的生长。选取有腔期颗粒细胞(pre-GCs),进行抑制剂培养,检测细胞周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,抑制Aurora B后,G0/G1期细胞比例显著增加、S期细胞比例显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻;
  4、初步探索Aurora B调控颗粒细胞生长的分子机制。选取pre-GCs进行抑制剂培养,检测调控细胞增殖与凋亡相关基因和蛋白水平。研究结果显示,Aurora B参与调控p38MAPK与Fas/FasL信号通路,下调G1期向S期转化的细胞周期蛋白CDK4、增殖相关蛋白PCNA以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,上调细胞死亡蛋白Fas、凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表达量,最终参与颗粒细胞的生长调控。
  实验二:Aurora B的SUMO修饰验证及其对卵泡颗粒细胞的影响
  1、SUMO修饰验证。成功构建几种真核表达质粒,选取pre-GCs体外分离培养,利用免疫共沉淀法检测SUMO修饰。研究结果显示,在颗粒细胞中,Aurora B可以被SUMO2修饰,Lys207为主要的SUMO2修饰位点;
  2、SUMO2修饰影响Aurora B的生物功能。体外分离培养pre-GCs,首先利用免疫细胞化学法检测Aurora B的定位分布。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核内,而Aurora BK207R主要定位在细胞核,部分定位在细胞质中;其次利用Westernblot法检测Aurora B的蛋白稳定性。研究结果显示,SUMO2可以在一定范围内促进Aurora B的蛋白表达水平。表明,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的定位与蛋白稳定性;
  3、SUM02修饰影响颗粒细胞的生长。体外分离培养pre-GCs,分别转染对照组(HA)、正常组(HA-Aurora B)和突变组(HA-Aurora BK207R),检测细胞的周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,突变组G0/G1期细胞比例显著增加、S期和G2/M期细胞比例均显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻。
  综上,本研究发现在小鼠卵泡中,Aurora B定位于颗粒细胞核,胞质分裂时,转定位至中间体和围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的成熟,Aurora B在卵泡和颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,在有腔期达到最大。抑制Aurora B后卵泡生长受阻、凋亡增加,并通过p38MAPK和Fas/FasL信号通路,下调CDK4、PCNA和Bcl-2的水平,上调caspase-8、caspase-3水平,影响颗粒细胞生长。此外,发现AuroraB可以被SUMO2修饰,Lys207为主要修饰位点,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的亚细胞定位和稳定性,影响颗粒细胞的生长。本研究结果将为卵泡的发育和闭锁提供一定的理论依据,同时也为更好的治疗卵巢疾病奠定基础。
[博士论文] 黄纯杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:随着社会进步,人类生殖障碍已成为全世界令人堪忧的医学和社会学难题。其中一个重要因素就是由各种已知或未知原因导致的女性卵子数量和/或质量恶化。恶化的卵子往往无法完成减数分裂或在减数分裂过程中染色体更易发生异常分离产生非整倍体配子,进而导致女性不孕、流产和新生儿先天缺陷。因此,从分子水平阐明调控卵子减数分裂和胚胎发育的机制对于提高和改善人类生殖能力具有重要的医学和社会学意义。SENP7是一种去SUMO化蛋白酶,作用于多聚SUMO链的剪切,从而维持SUMO化修饰的动态平衡。体细胞中,SENP7参与调控染色质稳态和DNA损伤修复。然而,SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的作用仍有待研究。本研究以小鼠为模型,通过敲低卵子和早期胚胎中内源性SENP7的表达以研究其在哺乳动物卵子成熟和早期胚胎发育过程中的作用及其分子机制。主要研究结果如下:
  (1)敲低GⅤ期(减数第一次分裂前期)卵子内SENP7的表达后卵子减数分裂进程受到明显抑制。表现为卵子恢复减数分裂(GVBD)和第一极体排放(PBE)受阻,导致成熟卵子的产生显著减少;
  (2)敲低SENP7表达后,组蛋白H3K9和H3K27表观修饰状态的改变(乙酰化上调和三甲基化下调),以及Cdc14B/C表达水平上调伴随着的CyclinB1和CyclinB2降解导致卵子恢复减数分裂受阻以及卵子内纺锤体组装异常;
  (3)y-tubulin定位紊乱以及泛素化修饰介导的γ-tubulin表达量下调也直接引起SENP7缺失型卵子内纺锤体组装异常;
  (4)纺锤体组装异常使恢复减数分裂的SENP7缺失型卵子后续发育受阻;同时持续活化的纺锤体组装检验点将这些卵子的发育进程阻滞在MⅠ期之前,导致这些卵子无法进入AⅠ期,进而无法排出第一极体;
  (5)敲低受精卵内SENP7表达后,胚胎发育同样出现明显缺陷。表现为胚胎卵裂受阻,大部分胚胎甚至无法发育到2细胞时期,导致囊胚发育率趋于零水平。同时,伴随着时间的延长,胚胎会发生凋亡;
  (6) SENP7缺失型胚胎内组蛋白H3K9和H3K27表观修饰的紊乱(乙酰化水平上调和三甲基化水平下调)以及DNA5hmC修饰水平的下调导致DNA损伤位点邻近的染色质无法维持DNA修复所需的理想空间结构;HP1α在常染色质上的分布导致DNA修复蛋白Rad51C的表达量下调;胚胎有丝分裂过程中纺锤体组装同样出现异常。这些因素共同导致缺失母源性SENP7的胚胎无法修复其基因组中存在的DNA损伤,因而胚胎发育出现缺陷甚至胚胎发生凋亡;
  综上,本研究揭示了母源性SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的关键作用及其分子机制。另外,本研究将SUMO化修饰与染色质上的其他修饰在生殖生物学的一些事件中联系起来,有助于认识生殖发育过程中蛋白质水平的复杂调控网络,为提高动物繁殖和人类生殖健康提供重要理论依据。
[硕士论文] 孙士涛
设施园艺学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:近年来随着设施园艺产业的发展,土壤盐渍化问题日趋严重,制约了我国设施蔬菜产业的发展,黄瓜是设施蔬菜栽培生产中主栽的蔬菜作物,耐盐性较弱。课题组前期研究表明采用耐盐性强的南瓜砧木嫁接黄瓜能提高耐盐性,脱落酸(ABA)在盐胁迫响应中有重要作用,关于嫁接黄瓜耐盐性中ABA作用机制尚不明晰。嫁接植株作为一种复合体,砧木与接穗如何进行信号交流仍有待进一步研究。本研究以黄瓜(Cucumis sativus L),南瓜(Cucurbita Moschata Duch)为材料,采用黄瓜自根(Cs)、南瓜自根(Cm)、南瓜砧木嫁接黄瓜(Cs-Cm)、黄瓜自嫁(Cs-Cs)植株,从表观形态、光合、气孔开闭、脱落酸(ABA)对气孔调控、气孔对ABA敏感性等方面研究了盐胁迫下ABA在提高嫁接黄瓜耐盐性中信号调控作用,主要结论如下:
  1.南瓜砧木嫁接黄瓜在盐胁迫下较自嫁黄瓜能快速关闭气孔。以Cs-Cs和Cs-Cm,测定了南瓜砧木嫁接黄瓜、自嫁黄瓜在0和75 mM NaCl处理下气孔开闭、光合参数、ABA含量以及H2O2含量变化情况。研究发现,早期NaCl处理下(0 h-6h),两种材料叶片ABA含量逐渐升高,而且南瓜砧木嫁接黄瓜较自嫁黄瓜能够快速、彻底关闭气孔,降低植株蒸腾速率,因此减少了叶片水分散失,缓解了盐胁迫下叶片萎蔫。
  2.南瓜自根材料在盐胁迫下较黄瓜自根材料能快速关闭气孔。研究了黄瓜自根和南瓜自根在0和75 mM NaCl胁迫下气孔导度、蒸腾速率、ABA含量和H2O2含量变化情况。结果表明,早期盐胁迫处理下(0h-6h),两种材料叶片ABA含量逐渐升高,而且与黄瓜自根材料相比,南瓜自根材料气孔关闭更快速和彻底。
  3.盐胁迫下根系产生的ABA可能通过木质部转运到地上部叶片中调控气孔关闭。通过分析盐胁迫下嫁接黄瓜和自根材料根系和叶片ABA含量及ABA相关基因表达情况,发现盐胁迫下嫁接黄瓜和自根材料叶片ABA含量均显著高于根系,然而植株根系ABA合成、转运相关基因显著上调,而且采用ABA抑制剂(50μM Fluridone)预处理叶片对植株叶片气孔导度、蒸腾速率无明显影响,而使用ABA抑制剂预处理根系显著降低了地上部叶片ABA含量,引起叶片气孔导度和蒸腾速率升高,表明盐胁迫下叶片ABA可能更多来源于根系。
  4.ABA和H2O2在嫁接黄瓜气孔快速关闭过程中起到重要作用。通过ABA抑制剂(50μM Fluridone)和H2O2抑制剂(100 mM DPI)预处理Cs-Cm植株和Cs-Cs植株根系和叶片,检测了75 mM NaCl胁迫下两种材料叶片气孔导度、蒸腾速率、ABA含量的变化。研究发现,ABA抑制剂和H2O2抑制剂预处理植株根系时,显著降低了两种材料叶片ABA积累,引起叶片气孔导度和蒸腾速率升高,表明ABA和H2O2参与了盐胁迫诱导嫁接黄瓜气孔快速关闭过程。采用外源ABA(20μM)预喷施Cs-Cm植株和Cs-Cs植株叶片,实验结果表明,外源ABA预喷施处理,降低了盐胁迫下嫁接黄瓜叶片气孔导度和蒸腾速率,缓解了植株叶片萎蔫情况。
  5.南瓜砧木提高了嫁接黄瓜叶片气孔对ABA敏感性。以南瓜自根、黄瓜自嫁和南瓜砧木嫁接黄瓜植株为材料,在不同浓度ABA(0μM、10μM、20μM、50μM、100μM)处理下,检测了三种材料离体叶片气孔关闭情况。结果表明,南瓜砧木提高了嫁接黄瓜叶片气孔对ABA的敏感性。
  6.等渗PEG胁迫下南瓜砧木嫁接黄瓜较自嫁黄瓜更彻底关闭气孔,缓解植株萎蔫,表现出与盐胁迫处理一致性。通过分析盐胁迫和等渗的PEG溶液胁迫处理下嫁接黄瓜的响应,研究还发现,相比于盐胁迫处理,在相同时间点渗透胁迫下两种材料气孔导度和蒸腾速率略高于盐处理,表现出与盐胁迫处理的差异性。
  综合上述研究结论,NaCl胁迫下南瓜砧木嫁接黄瓜较自嫁黄瓜提高了叶片气孔对ABA敏感性,引起气孔快速关闭,降低蒸腾作用,减少水分散失,缓解了植株萎蔫,增强了嫁接黄瓜盐胁迫适应性,ABA和H2O2在盐胁迫下叶片气孔关闭的响应中发挥了重要作用。
[博士论文] 胡俊
水生生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:动物肠道黏膜表面时时都暴露于复杂和动态的微生物群落之中,因此,肠黏膜层的主要功能之一是作为抵抗驻留在肠腔中的大量细菌的屏障。然而,研究者往往只关注到了黏膜层上皮细胞以及他们之间的紧密连接结构,却常常遗忘和忽视了一个重要的防御系统,那就是粘液层,这一层就是微生物-宿主互作、相互影响的最初接触面。微生物与宿主肠道共同进化形成相互有效的适应机制,并且在不同肠道区域呈现出不同的特点。研究宿主肠道、粘液蛋白以及微生物互作过程中的特点以及关系,对更好的理解微生物与宿主互作提供了基础,为水产动物肠道健康研究以及发掘新的益生菌都具有重要意义。本论文首先通过蛋白质组学、转录组学以及16S测序技术分别对模式动物斑马鱼的肠道粘液、肠道本身、肠道粘液粘附菌群按照斑马鱼肠道自然折叠分段进行了全面透彻的研究,发掘鱼类肠道不同区域的功能、与肠道健康相关的蛋白、基因以及粘附菌群分布差异及特点,揭示肠道粘附微生物稳态对于肠道以及宿主健康的重要性。最后尝试以经济养殖鱼类代表罗非鱼为例说明实际生产养殖中肠道粘附菌群作为肠道健康评价指标的实际应用以及评价意义。主要结论如下:
  1.通过对正常养殖斑马鱼肠道从前至后自然分为三段的顺序进行粘液染色,发现斑马鱼肠道粘液在不同区域的厚度不一致,但是都只有一层,按照中肠、前肠、后肠的顺序逐渐降低。通过蛋白质组学技术鉴定筛选差异蛋白,中肠与前肠比较有353个,后肠与前肠比较有329个,但是后肠与中肠的比较只有201个,说明前肠差异蛋白的数目最多;随后进行功能富集分析发现,不同肠道区域的显著差异蛋白根据功能多涉及到营养代谢通路,表明主要差异蛋白与营养相关。最后经过筛选获得具有不同黏膜屏障功能的蛋白分布,发现在不同肠道区域分别与机械屏障、化学屏障、免疫屏障以及微生物屏障相关的粘蛋白分布特点,揭示不同肠道区域粘液采用不同的屏障策略。
  2.转录组学技术比较正常养殖斑马鱼前中后肠差异表达基因,后肠相对于前肠以及中肠具有更大的差异,无论是显著性上调还是下调的基因都在后肠数量上显著高于前肠与中肠,说明在表达模式上后肠的差异性。通路富集分析后,在前肠与中肠之间的显著差异基因一共被注释到8个具有显著差异的通路,在后肠与前肠以及后肠与中肠之间的比较分别具有23个和24个显著差异的通路,其中18个是共同的通路,这也更加说明了后肠的功能差异性。经过筛选与肠道健康相关的基因,我们发现与肠道免疫进程以及肠道上皮发育相关的基因多分布于后肠,前肠相对较少,最少的是中肠,说明肠道在不同区域的免疫调节功能以及细胞屏障功能的差异。但是具有调节粘液分泌以及肠上皮分化的基因gata5在中肠最丰富,与肠道粘液的厚度存在很大的相关性,暗示这一基因在肠道中与粘液屏障的正向关系。
  3.16S测序技术比较正常养殖斑马鱼前中后肠粘液粘附菌群特点。从整体结构上来看,斑马鱼前中后肠的粘液粘附菌群存在明显的差异,前肠与后肠具有更加相似的结构。不同部位主要以变形菌门(Proteobacteria)为主,随后是梭杆菌门(Fusobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),相对比例存在显著性不同。在属水平上,除去“unknown”的部分,鲸杆菌属(Cetobacterium)和邻单胞菌属(Plesiomonas)占有主要地位,其中鲸杆菌属(Cetobacterium)在前中后肠的不同部位体现出显著性的丰度差异,在中肠的相对丰度最大,达到31.35±1.21%,前肠以及后肠分别为8.67±0.50%和13.14±3.43%。链球菌属(Streptococcus)和乳球菌属(Lactococcus)在前肠丰度最高沿着肠道延伸往后逐渐下降,在中后肠无差异;假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella)在前中肠相对丰度无差异,在后肠显著降低。结合中肠粘液最厚、中肠鲸杆菌属(Cetobacterium)丰度最高的特点以及以往研究,我们认为鲸杆菌属具有更好的鱼类定植能力,是鱼类微生物屏障功能的重要组成部分。以此也说明在评价肠道以及宿主自身健康上粘附菌群不可被忽视以及与内容物菌群混为一团,而应该被单独提出来作为健康评估指标。
  4.将粘附菌群作为一个鱼类健康指标,结合其他肠道健康相关检测手段,对水产养殖行业在鱼类饲料中植物性蛋白替代鱼粉后添加植酸酶的效果进行评价。1,000 U/kg饲料植酸酶的添加明显改善了粘附菌群多样性:变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和栖热菌门(Thermus)的相对丰度得到提升;从属水平来看,梭菌属(Clostridium sp.)和栖热菌属(Thermus sp.)的相对丰度都受到微生物植酸酶的显著升高调控。伴随着的变化是促进了磷的利用率,升高肠道微绒毛密度的同时降低微绒毛长度;肠道应激因子Hsp70以及炎症因子Tnf-α和Tgf-β的水平都被显著性升高,显示出由于微生物植酸酶的添加诱导了更高的肠道应激和炎症状态。因此本研究认为粘附菌群优化,一定程度能够改善肠道以及宿主福利,但是饮食的直接作用可能会高于菌群优化带来的益处。从本研究可以看出粘附菌群的改变需要得到重视,在评估鱼类健康上,可以从一个新的角度进行说明,但是关于肠道健康与粘附菌群的关系需要更多的深入研究。
[硕士论文] 杨峰
水产学、水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:在目前集约化水产养殖模式下,草鱼(Ctenopharyngodon idella)作为我国产量最大的经济鱼类,在实际养殖过程中,特别容易出现肝脏脂肪过度蓄积进而导致脂质代谢紊乱等症状,免疫力也下降,严重者则表现为脂肪肝。因此,如何提高鱼类肝脏对脂肪利用能力及肝脂质蓄积调控的研究已显得非常迫切和必要。近年来,关于microRNA(miRNA)的研究越来越深入。研究显示miRNA参与陆上动物的胆固醇、甘油三酯和脂肪酸代谢等,因而在脂质代谢调控中发挥重要作用。目前,有关miRNA调控鱼类脂质代谢的研究还不深入,相关机理还不明晰。本研究主要以草鱼和草鱼肝细胞系(L8824)为实验材料,采用基因克隆、基因过表达及干扰、qRT-PCR、酶活性测定及腹腔注射等营养学、生物化学、分子生物学和细胞生物学相关技术与方法,在活体与细胞水平上较系统地研究了miR-33/122调控草鱼肝脏脂质代谢的作用及初步机理。研究结果为丰富鱼类脂质代谢调控机理提供了基础资料,为防治鱼类营养性脂肪肝等代谢性疾病及提高机体免疫力提供了思路及理论基础,进而为促进鱼类健康生长提供了科学依据。
  本研究主要内容包括:⑴采用RT-PCR技术,克隆了miR-33的前体序列,并进行了同源性比对和组织分布规律分析。结果显示,miR-33的前体长度为65bp,和其它物种的同源性较高;构建系统进化发育树也显示草鱼miR-33和鱼类miR-33的进化关系最近;组织分布规律显示在脑、眼睛、肝脏、肌肉和肠道中表达量较高,而在肾脏、脾脏、心脏和脂肪中的表达量较低。⑵采用miR-33 mimic(miR-33模拟物)转染草鱼肝细胞L8824的方法,开展了miR-33的功能研究。实验设置三个组,空白对照组、阴性对照组和miR-33 mimic转染组,处理24h后收集细胞。采用油红O染色提取法检测了L8824细胞中甘油三酯(TG)含量,qRT-PCR技术检测了与脂质代谢相关基因的mRNA表达水平。结果显示,相对于空白对照组和阴性对照组,miR-33 mimic转染细胞24h使miR-33超表达后,显著增加了细胞中TG含量(P<0.05),且和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著增加(P<0.05)。为进一步验证miR-33在肝脂质代谢中的功能,本研究亦在活体水平上进行了腹腔注射miR-33 antagomir(miR-33拮抗剂)实验。实验共设置三个组,空白对照组,注射0.65%生理盐水组和注射miR-33 antagomir组(12.5 nmol/尾.次)。实验采用连续注射的方法,即在每天上午9:00注射1次,连续注射3天。在实验进行的第4天上午9:00进行取样。实验采用全自动生化分析仪对草鱼血清相关生化指标进行了分析,qRT-PCR技术对脂质代谢和免疫相关基因转录水平进行了检测。结果显示,注射miR-33 antagomir组比空白对照组和生理盐水组血液中的总胆固醇和甘油三酯含量显著减少(P<0.05);进一步在基因转录水平的研究发现,和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著降低(P<0.05);和免疫有关的促炎因子(TNFα,IL-1β,IL-6和NF-κB)水平降低(P<0.05),而抗炎因子(TGF-β1和IL-10)的表达量升高(P<0.05)。以上结果表明miR-33通过调节脂代谢相关基因和免疫相关因子等的表达在草鱼肝脏脂肪代谢紊乱引起的脂肪肝(炎)过程中发挥重要作用。这一工作也是国际上对鱼类miR-33调节脂质代谢机制的首次阐述。⑶采用和miR-33实验相同的方法,本节实验首先获得了miR-122前体基因序列。结果显示,miR-122前体序列长度为99bp。和其它物种的同源性较高,说明miR-122具有很高的保守性;系统进化关系分析也显示草鱼miR-122和斑马鱼miR-122的进化关系最近;而组织分布规律则说明miR-122仅在草鱼肝脏中特异性高表达,而在其它组织中尚未检测到其表达。采用在肝细胞L8824中转染miR-122agomir(miR-122激动剂)方法来研究miR-122的功能。实验分组、实验时间及实验方法等都和miR-33的实验相同。结果显示,和空白对照组及阴性对照组相比,转染miR-122激动剂后,miR-122在L8824细胞中的相对含量明显增加(P<0.05),TG含量显著升高(P<0.05),表明超表达miR-122后促进了脂肪的合成。进一步检测发现,与脂质合成有关mRNA的表达水平也显著增加(FAS,ACC,PPARγ);为进一步研究miR-122的功能,本节研究在活体水平也开展了腹腔注射实验。分组及注射时间和miR-33的实验相同,只是注射剂量变为了5 nmol。结果显示,注射miR-122激动剂后,草鱼肝脏中miR-122的含量明显增加(P<0.05);进一步在基因表达水平的研究显示,注射miR-122 agomirs后,PPARγ,SREBP-1c,ACC,FAS和H-FABP等和脂质合成有关mRNA的表达量显著升高(P<0.05),说明miR-122促进脂肪合成的作用是通过调节脂肪合成基因进行的;检测免疫有关基因的转录水平发现,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的相对表达量出现显著地升高(P<0.05),而抗炎因子IL-10和TGF-β1的相对丰度则明显降低(P<0.05),表明miR-122在促进肝脏脂肪过量增加的基础上可能进一步降低了其免疫力。⑷开展了GSPE对肝脏脂质代谢及miR-33/122影响的实验。在细胞水平研究GSPE对肝脏脂质代谢调控的作用及对相关基因和miR-33/122表达的影响;在活体水平上进一步验证GSPE的上述作用。在细胞水平上,首先利用不同浓度的油酸构建草鱼脂肪肝细胞模型。然后设置两个实验组,即添加GSPE组和未添加GSPE组。取样的时间设置为0h、1h和3h。实验结束后检测细胞中脂肪含量的变化、miR-33/122的表达水平以及脂质代谢合成相关基因的mRNA水平。在活体水平上,一共分三组,即空白对照组,灌喂生理盐水组和灌喂GSPE组(250mg/Kg),分别在0h、1h和3h取样。检测血清生理生化指标、miR-33和miR-122的表达变化、脂质代谢和免疫相关基因mRNA表达水平的变化。结果显示,添加GSPE后不论在活体还是细胞水平TG含量都显著降低(P<0.05),miR-33和miR-122的表达水平也都受到抑制(P<0.05);检测脂代谢相关基因的表达水平发现,灌喂GSPE1h时,脂肪分解相关的基因(CPT-1,ATGL及PPARα)表达量显著升高(P<0.05),而脂合成及转运相关的基因PPARγ及H-FABP表达则显著降低(P<0.05);当灌喂GSPE3h时,更多脂肪合成基因的表达受到抑制(SREBP-1c,PPARγ,ACC,FAS和H-FABP);对免疫相关基因mRNA表达的检测发现,在脂肪肝细胞中添加GSPE1h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-κB的表达量都显著下降(P<0.05),而抑炎因子IL-10和TGF-β1的表达显著上升(P<0.05),表明GSPE能够通过调节脂肪肝细胞相关免疫基因的表达而提高机体免疫力的作用,且这种作用是快速和短暂的,因为在添加GSPE3h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-κ3以及抑制炎症因子的表达水平都发生了反转。而在活体水平上,GSPE在灌喂1h时除显著降低促炎因子IL-1β外,对免疫相关的其他基因没有显著性影响;而在灌喂3h时,则显著降低了促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的转录水平(P<0.05),而抑制炎症的因子IL-10显著上升(P<0.05),表明GSPE在活体水平需要较长的时间才能发挥作用,也可能是因为机体内慢性代偿反应的缘故。结果表明, GSPE能改善鱼类的肝脂肪代谢紊乱症状,这可能和GSPE能抑制miR-33和miR-122的表达进而调节一系列脂代谢和免疫相关基因有关。研究结果为在生产实践中改善饲料配方进而预防脂肪肝(炎)等代谢性疾病提供了理论基础。
[硕士论文] 司马应许
生物学、动物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:日本三角涡虫(Dugesia japonica)隶属扁形动物门(Platyhelminthes),涡虫纲(Turbellaria),在动物系统演化中占有重要地位,并且具有极强的再生能力。目前,虽然已克隆大量与涡虫再生相关的基因,但其具体的再生机制及相关基因的功能仍不清楚。
  本文从日本三角涡虫转录组数据库中筛选出再生过程中持续上调表达但表达量较低的热休克蛋白70和90家族的Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因。利用整体原位杂交、RNA干扰和Real time-PCR等分子生物学技术对四基因的时空表达模式和功能进行分析,结果如下:
  (1)通过Real time-PCR技术对切割损伤、离子液体暴露、冷应激和热应激环境下日本三角涡虫体内四基因的表达量进行分析,结果显示:在应激条件下,四基因的表达量均明显上调,并且随着切割损伤时间的延长、离子液体浓度的升高,四基因的表达量逐渐上升。
  (2)日本三角涡虫Djhsp70e基因的cDNA长度为1982bp,5'端有180bp非编码区,3'端有38bp的非翻译区,其中包含一个长度为1764bp的最大开放阅读框(ORF),编码一个由587个氨基酸构成的蛋白质,含有两个热休克蛋白70家族所特有的标签序列。原位杂交结果显示:在整体中,该基因在除脑及咽部以外的身体各部分广泛表达,身体两侧和肠支处杂交信号较强;再生个体的芽基部位有较强的杂交信号。RNA干扰该基因后,整体涡虫出现严重头部溶解且不能再生,而头再生尾片段也出现严重的溶解现象。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后,Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
  (3)日本三角涡虫Djhsp90a基因cDNA长为3212bp,包括5'端1039bp的非编码区和3'端22bp的非编码区,其中包含一个长度为2151bp的ORF,编码一个由716个氨基酸构成的蛋白质。其中包含6个热休克蛋白90家族所特有的序列标签。原位杂交结果显示:在整体涡虫中杂交信号主要分布在除脑及咽以外的大部分实质组织中;在再生个体中的芽基部位有较强杂交信号。RNA干扰该基因后,整体涡虫出现明显的头部溶解现象并伴有身体持续性皱缩;头再生尾片段再生被抑制;尾再生头片段与对照比没有明显变化。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后,Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
  (4)日本三角涡虫Djhsp90b基因的cDNA长度为2636bp,5'端有94bp的非编码区和3'端有132bp非编码区,含有2409bp的最大开放阅读框,编码一个由802个氨基酸构成的蛋白质。该基因所推导的氨基酸序列含有5个HSP90家族所特有的标签序列。整体原位杂交结果显示:该基因在整体涡虫实质组织中广泛表达且身体两侧有较强的杂交信号;再生个体的芽基部位杂交信号较强。RNA干扰该基因后,整体涡虫身体出现明显的皱缩;头再生尾和尾再生头片段再生速度缓慢。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后,Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
  (5)日本三角涡虫中Djhsp90c基因的cDNA长为2573bp,其中包含一个长度为2394bp的最大开放阅读框,编码一个由797bp氨基酸编码的蛋白质,5'端有114bp的非编码区,3'端有65bp的非编码区。包含6个HSP90家族基因所特有的标签序列。原位杂交结果显示:该基因在整体涡虫中杂交信号主要分布在身体两侧及尾部;再生片段芽基部位有较强的杂交信号。RNA干扰该基因后,整体涡虫口部两侧出现膨胀现象;头再生尾和尾再生头片段再生受到抑制。Realtime-PCR结果表明干扰该基因后,Djpiwi-1、Djpiwi-b和Djh2b基因的表达量显著下调。
  以上结果表明:涡虫体内Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因在应激条件均具有细胞保护作用;四基因通过调控干细胞维持涡虫体内组织平衡,并在再生过程中起重要作用。除此之外,Djhsp90c基因通过调节Djpiwi-b和Djh2b基因调节涡虫体内干细胞的增殖和分化,是涡虫再生过程中重要的调节因子。
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