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[硕士论文] 王文静
内科学(风湿免疫学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:成人斯蒂尔病(AOSD)是一种可累及多个系统的自身免疫性炎症性疾病,发病率较低,较难诊断。它主要表现为反复发作的高热(≥39℃)、关节炎或关节痛、一过性红色皮疹及白细胞和铁蛋白显著增高。AOSD合并巨噬细胞活化综合征(MAS)是风湿免疫科的危急重症,是临床诊治的难点。目前AOSD的治疗可选择非甾体抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素、缓解病情抗风湿药物(DMARDs)、生物制剂及免疫球蛋白等。以往学者将AOSD分为系统型和多关节炎型,但这种分型并不能有效区分临床表型并进一步指导临床策略。近来根据AOSD的转归,有学者提出了三种疾病模式:①单循环型:一次典型发作后经治疗可达到长期缓解,预后良好;②多循环型:疾病反复复发,但复发症状较首发症状轻微,逐渐达到完全缓解;③慢性关节炎型:疾病活动及关节症状持续存在,严重时可出现关节破坏。研究不同疾病模式AOSD临床特征的差异,探索AOSD疾病模式的分类方法,以及合并MAS可能的风险因素,对于早期诊断和治疗方案选择具有重要的意义,但目前我国尚无此类研究。
  目的:
  分析不同疾病模式的AOSD的临床特点,研究各模式分类诊断的合适指标及临界值,并探索AOSD合并MAS的可能风险因素,为优化临床诊治提供资料和依据。
  方法:
  本研究为回顾性研究。研究纳入2001年1月至2016年12月海军军医大学附属长海医院确诊成人斯蒂尔病的全部患者的病例资料(共162例),其中10例并发MAS。成人斯蒂尔病的诊断依据Yamaguchi标准。收集以下数据:1)人口学信息:发病年龄、性别、确诊时间;2)临床表现:最高体温、发热时长、有无皮疹、关节痛/关节炎及部位、有无肌痛、咽喉痛、淋巴结病、肝肿大、脾肿大、胸膜炎、心包炎等;3)实验室检查:血常规、肝肾功能、血脂、电解质、C反应蛋白、红细胞沉降率、炎症因子、免疫球蛋白、铁蛋白、凝血功能、降钙素原等;4)治疗情况:确诊前后用药情况。由高年资医师根据患者的预后转归情况,将病例分为单循环型、多循环型和慢性关节炎型3组。采用单因素和多因素方差分析和非参数检验的方法比较不同疾病模式下临床特征的差异性,利用受试者运算特征(ROC)曲线探索不同疾病模式分类诊断的合适指标及临界值,并利用二元logistics回归模型,分析AOSD合并MAS可能的风险因素。
  结果:
  本回顾性研究纳入2001年1月1日至2016年12月31日海军军医大学附属长海医院住院部162名AOSD患者,其中单循环型98例,多循环型57例,慢性关节炎型7例。男女比例为1∶2.24,发病年龄平均值(40.3±14.9)岁,确诊时间中位数为4(2,8)周;最高体温和发热时长的中位数分别为39.7(39.0,40.0)℃和4(3,8)周;WBC计数的为中位数为14.4×109/L(11.0×109/L,19.7×109/L),中性粒细胞百分比的中位数为83.2%(78.5%,89.4%);ALT、AST、ALP、球蛋白、LDH和纤维蛋白原的中位数分别为44.5(20.0,100.3)U/L、43.0(23.8,85.5)U/L、91.0(68.8,134.8)U/L、32.3(29.0,37.0)g/L、410.0(266.8,531.3)U/L和5.7(4.6,6.5)g/L;IgG和CRP的中位数分别为14.0(12.2,17.0)g/L和83.6(31.9,128.0)mg/L;ESR、C3、C4的均值分别为(74.1±33.4)mm/H、(1.3±0.4)g/L和(0.3±0.1)g/L;铁蛋白大于2000ug/L的比例为64.8%,RF阳性的比例占6.8%,ANA阳性的比例占9.9%。
  单因素分析发现,三种疾病模式在确诊时间、最高体温、发热时长、体重下降、关节肿痛的发生率、谷氨酸氨基转移酶升高和类风湿因子阳性上率有显著差异,而多因素分析发现三种疾病模式在在确诊时间、发热时长、肌痛和皮疹的分布上有显著差异,P值均小于0.05。单循环型和多循环型AOSD患者使用抗生素的比例显著高于慢性关节炎型,三种疾病模式的患者确诊后不同治疗药物的比例没有显著差异。
  利用受试者运算特征(ROC)曲线计算曲线下面积(AUC),发现对于三种疾病模式较好的诊断指标为分别为ALT/IgM、铁蛋白×ESR和IgG,当患者ALT/IgM大于81.25U/g时,诊断为单循环型AOSD的可能性较大;当患者铁蛋白×ESR大于1.05×105时,诊断为多循环型AOSD的可能性较大。
  采用二元Logistics回归分析,发现多循环型AOSD、肝脏肿大及纤维蛋白原降低可能是AOSD合并MAS的风险因素。
  结论:
  单循环型、多循环型和慢性关节炎型三种疾病模式的AOSD患者在确诊时间、发热时长等临床特征上具有显著差异,ALT/IgM、和铁蛋白×ESR可能有助于区分AOSD疾病模式,多循环型AOSD、肝脏肿大及纤维蛋白原降低提示AOSD患者可能有合并MAS的风险。
[博士论文] 邹玉明
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性、自身免疫性疾病,以滑膜过度增殖和炎症细胞浸润为特点,导致关节的慢性炎症以及继发软骨和骨的侵蚀。类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)是炎性滑膜的重要组成部分,是类风湿关节炎发病过程中相关病理损伤的关键参与者。
  传统的改变病情抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs),如甲氨蝶呤,病人的长期使用会产生耐药性,在一部分病人的应用过程中逐渐失去效果。近年来生物制剂的大力发展和应用极大革新了RA的治疗,临床上常常将生物制剂与DMARDs联合应用于RA患者,更好的控制和缓解了病情。尽管生物制剂改善了对传统DMARDs不敏感病人的治疗,但是生物制剂价格昂贵、需要胃肠外给药、增加感染和癌症的风险是其缺点。因此继续发展和筛选治疗RA的临床新药物具有重要意义。
  苦参碱是从一类传统中草药苦参等植物中提取出的生物活性碱,它有一系列的药理学活性,如有抗肿瘤、抗炎与免疫调节、抗病毒、抗纤维化、抗寄生虫、心血管保护、抗骨质疏松等。但是目前为止,苦参碱还没有发展为应用于临床的药物,这与其给药剂量大,药物活性低有关。在苦参碱结构基础上研发的苦参碱衍生物MASM[(6aS,10S,11aR,11bR,11cS)210-Methylamino-dodecahydro-3a,7a-diaza-benzo(de)anthracene-8-thione]表现出比苦参碱更好的药理学活性。已有文献报道苦参碱衍生物MASM具有抗炎、免疫调节、抗肝纤维化、放射保护等作用,但是还没有研究评估其对RA的治疗是否具有治疗作用。本研究从行膝关节置换的RA病人身上获取炎性滑膜组织,体外分离培养获取人源性原代RA-FLSs,在体外建立RA细胞模型,以及建立胶原诱导的小鼠关节炎模型,通过体外和体内实验评估苦参碱衍生物MASM对RA治疗的潜在药用价值。
  方法:
  1.胶原酶消化法体外分离培养出入源性原代RA-FLSs,并在传代培养的第三代对细胞进行流式鉴定;
  2.用CCK8实验探究苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs体外增殖的影响;
  3.实时荧光定量RCR实验探究苦参碱衍生物MASM对IL-1β激活的RA-FLSs炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8以及基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3、MMP-13基因表达的影响;
  4.AnnexinⅤ-FITC/PI双染后用流式细胞仪检测MASM对RA-FLSs细胞凋亡的影响;
  5.用苦参碱衍生物MASM预处理后,IL-1β激活RA-FLSs细胞48小时后:JC-1染色,流式细胞仪检测RA-FLSs细胞线粒体膜电位的下降;提取蛋白(cytochrome c提取胞浆蛋白检测),Western blot检测凋亡的线粒体通路相关蛋白Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved caspase9、pro-caspase3、cleaved caspase3、Cleaved PARP;Caspase3活性试剂盒检测RA-FLSs细胞中capsase3活性;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光及westemblot检测RA-FLSs自噬相关标记物p62、Beclin-1、LC3的表达变化;
  7.利用自噬抑制剂CQ抑制自噬后,观察苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡诱导作用的影响;
  8.苦参碱衍生物MASM预处理后,继续用IL-1β激活RA-FLSs,蛋白收样后Western blot检测磷酸化Akt及总Akt蛋白表达水平;
  9.MAPKs和NF-κB信号通路与RA发病密切相关。用苦参碱衍生物MASM预处理RA-FLSs后,IL-1β短时间处理激活RA-FLSs中MAPKs和NF-κB信号通路。总蛋白抽提后,Western blot检测MAPKs信号通路中的磷酸化Erk1/2、磷酸化JNK、磷酸化p38以及相应总蛋白的表达水平;核蛋白抽提试剂盒分离胞浆蛋白和核蛋白,分别检测核蛋白中NF-κB/p65入核水平以及胞浆蛋白中IκBα的表达变化;将DBA/1小鼠分为正常组、阳性CIA对照组、低剂量(苦参碱衍生物MASM10mg/kg组)和高剂量组(苦参碱衍生物MASM30mg/kg组)。
  10.用Ⅱ型胶原诱导小鼠建立RA动物模型——胶原诱导的关节炎模型。实验组灌胃给药,对照组给生理盐水1次/天;关节炎炎症指数评分对关节红肿的临床表现进行评分,诱导28天后每两天统计一次;
  11.收集小鼠组织样本,固定、脱钙、切片后HE染色观察小鼠足踝部关节组织病理改变,并对滑膜炎症进行评分;
  12.收集小鼠组织样本,固定后行Micro-CT扫描,三维重建后观察小鼠足爪部整体骨损伤并进行评分;
  13.眼眶取血,室温凝固后离心收集血清,ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;
  14.切片样本进行TNF-α免疫组化染色,观察各组间关节局部TNF-α表达水平。
  结果:
  1.胶原酶消化培养法从可以从滑膜组织中培养出RA-FLSs,经过细胞换液和传代可以获得细胞成分较为均一、形态类似成纤维细胞的细胞成分。经CD90标定后流式鉴定,CD90阳性细胞>90%,表明获取细胞大部分为RA-FLSs,可以用于后续实验;
  2.CCK8实验表明苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs的增殖,且体现出剂量和时间依赖性;
  3.IL-1β可以激活RA-FLSs,诱导其炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8)以及MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-13)的表达明显升高,苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs上述炎症因子和MMPs的表达,且随着给药浓度的升高,抑制作用增强;
  4.MASM预处理1小时后,IL-1β继续刺激RA-FLSs48小时,流式细胞仪检测AnnexinⅤ-FITC/PI双染,结果显示5~20μM苦参碱衍生物MASM可以明显诱导RA-FLSs细胞凋亡,呈剂量依赖性;
  5.Jc-1染色后流式检测RA-FLSs线粒体膜电位的下降,随着MASM浓度的增加,线粒体膜电位的下降呈递增趋势;Western-blot检测凋亡的线粒体途径相关蛋白,结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降、促凋亡蛋白Bax的表达升高、胞浆内细胞色素c蛋白水平升高、下游的cleaved caspase9表达升高,pro-caspase3表达下降而cleaved caspase3表达升高,凋亡标志物Cleaved PARP的表达升高,且所有蛋白的表达水平均与苦参碱衍生物MASM的给药剂量相关;可以明显提高caspase3的活性,且呈剂量依赖性,与蛋白表达结果相符;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光结果显示苦参碱衍生物MASM可诱导RA-FLSs中LC3的点状聚集;Western blot检测自噬相关蛋白标志物p62、Beclin-1、LC3的结果显示,5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以导致p62的表达下降,而Beclin-1、LC3B-Ⅱ的表达升高;
  7.用CQ阻断细胞自噬后,苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡促进作用得到进一步加强;
  8.Western blot检测相应处理后RA-FLSs细胞内磷酸化Akt和Akt总蛋白表达结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理可以抑制Akt的磷酸化,但是对Akt总蛋白的表达影响不大;
  9.Western blot检测MAPKs和NF-κB信号通路蛋白结果显示,IL-1β2ng/ml处理30分钟可以激活RA-FLSs,明显诱导Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,5~20μM苦参碱衍生物MASM可以抑制Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,且在20μM时抑制作用最明显,但对Erk1/2、JNK和p38总蛋白的表达影响不大;IL-1β2ng/ml处理RA-FLSs30mins可以明显减小胞浆中IκBα的表达水平,诱导NF-κB/p65入核,而5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以剂量依赖性扭转这一趋势。
  结论:
  苦参碱衍生物MASM可以抑制RA发病过程中的关键细胞RA-FLSs炎症因子以及MMPs的表达,抑制RA-FLSs细胞增殖,通过线粒体途径促进RA-FLSs凋亡,并且可以明显上调RA-FLSs中细胞自噬的水平。此外,通过自噬抑制剂CQ抑制RA-FLSs中的细胞自噬,可以进一步增强苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs凋亡诱导作用。此外,苦参碱衍生物MASM可以明显抑制RA-FLSs中与RA发病密切相关的MAPKs以及NF-κB信号通路的信号转导。在体内实验部分发现,苦参碱衍生物MASM可以缓解CIA小鼠动物模型中的关节局部和全身的炎症水平以及关节的组织破坏。综上所述,苦参碱衍生物MASM是治疗RA的潜在药物,具有进一步研发的价值。联合应用苦参碱衍生物MASM以及自噬抑制剂CQ或HCQ,有可能进一步增强其对RA的治疗效果,但仍需进一步研究进行评估。
[博士论文] 俞旭华
航海与潜水医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:减压病(decompression sickness,DCS)是威胁潜水等高气压作业和航空航天等活动安全的关键医学问题,快速减压过程和减压后惰性气体过饱和生成的气泡是引起DCS发病的根本原因。传统观点认为,气泡的机械作用,如栓塞作用、剪切力作用、机械压迫作用是导致DCS形成的根本原因。随着研究的深入,越来越多的证据表明气泡作为外源性物质可触发体内一系列生化及炎症反应,如血小板聚集、白细胞激活、细胞因子释放等,诱发血管内凝血及炎症反应,导致血栓形成,组织缺血水肿,炎细胞渗出,这可能在DCS的发生和发展中发挥更为重要的作用。
  微粒(microparticles,MPs)是细胞在激活或凋亡早期以出芽方式分泌的直径约0.1~1μm不规则囊性小泡。MPs表面可携带母细胞表面抗原,其内容物含有浓集细胞因子、信号蛋白、mRNA和microRNA。作为细胞间生物信号和信息传递的载体,MPs可将其胞内成分转移至靶细胞,介导靶细胞活化、表型修饰、及功能调节。内皮细胞来源的MPs,即内皮微粒(endothelial microparticles,EMPs)不仅是内皮损伤的重要指标,在介导内皮功能障碍中同样发挥显著的致病作用。EMPs在血管炎症、血管舒缩功能、血管生成等方面发挥多重作用。诸多生理及病理因素均可激活或损伤内皮细胞,导致EMPs的产生与释放。Madden等研究发现,潜水员完成潜水作业返回水面后,循环中EMPs数量显著增加,提示血管内皮功能损伤。Thom等通过一系列人体试验发现,潜水员经不同方案潜水后,循环MPs数量和多普勒超声检测的血管内气泡信号强度呈正相关;小鼠经模拟潜水后快速减压,循环血液中各亚型MPs的数量均显著增加,并通过激活血小板和中性粒细胞增加血管内白细胞粘附,进一步加重DCS血管炎性损伤,甚至可导致DCS中枢神经系统损伤。如提前给予MPs消融剂聚乙二醇,则可显著降低DCS所致血管炎性损伤。上述研究结果表明MPs可能在DCS血管炎性损伤中发挥重要的致病作用。
  本课题组前期研究发现,大鼠模拟潜水后快速减压,循环内EMPs显著增加,同时伴有脑、骨骼肌和大网膜中中性粒细胞显著滞留现象,提示广泛的血管炎症反应;如在潜水前给予内皮保护剂辛伐他汀后,可显著降低DCS发病率,减轻肺组织炎性损伤,同时循环内EMPs数量增幅显著下降,各组织器官中性粒细胞滞留程度显著下降。因此,我们推测在DCS的发病过程中,气泡通过直接触碰或改变血液层流剪切力,导致血管内皮细胞被激活或损伤,产生和释放EMPs并进一步诱发血管炎症损伤级联放大效应。
  为观察DCS气泡诱导的EMPs在血管炎性损伤中的确切效应,我们通过自制的微气泡生成装置模拟DCS气泡对内皮细胞的刺激作用,检测气泡刺激后培养液中EMPs生成数量的情况,判断血管内皮损伤的程度;在细胞及动物水平分别观察气泡刺激诱导的EMPs对血管内皮的损伤效应(第一部分)。在明确气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放并进一步对内皮细胞产生损伤效应后,本课题组进一步探索气泡诱导EMPs产生的分子机制,寻找其中的关键信号分子,从而为DCS的防治寻找新方法与新思路(第二部分)。此外,针对DCS致病的根本原因——气泡,寻找促进气体交换、减少气泡生成的方法,为DCS的防治寻找新的的非加压治疗手段。
  第一部分:气泡诱导的内皮微粒对内皮细胞的作用研究
  研究目的与方法:本研究以原代培养的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)为研究对象,通过自制的气泡发生装置,将气泡与PMVECs接触30 min后,继续培养6h,后收集培养液。4℃,10000 g×30min离心,去除细胞碎片,收集上清;4℃,100000 g×60min离心,弃去上清。1×PBS重悬,流式细胞法检测EMPs的数量。在明确气泡刺激诱导EMPs产生与分泌的效应后,将气泡诱导的EMPs与正常PMVECs共孵育或经尾静脉注射入大鼠体内,在体与离体条件下分别观察内皮损伤相关指标的变化情况。此外,将EMPs与含氟表面活性剂FSN-100共孵育,观察FSN-100对EMPs的消融作用。
  研究结果:本课题组成功分离与培养出纯度大于95%的大鼠PMVECs并用于后续实验。流式结果显示气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放,将气泡诱导的EMPs与正常PMVECs共孵育后,内皮细胞活性显著下降(存活率下降,凋亡率上升)。内皮细胞产生与分泌细胞间粘附分子(ICAM-1)和血管内皮粘附分子(VCAM-1)显著增加,内皮细胞内活性氧(ROS)产生增加、一氧化氮合成(NO)减少,细胞间紧密连接下降,内皮通透性增加。在体实验中,大鼠循环内皮损伤指标可溶性血栓调节蛋白(s-TM)及粘附分子ICAM-1和VCAM-1含量显著增高,提示内皮广泛而严重的损伤。FSN-100可显著减轻气泡诱导的EMPs对内皮的不良效应。
  研究结论:气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放且气泡诱导的EMPs可进一步促进血管功能障碍及炎性损伤。
  第二部分:气泡诱导内皮微粒产生的机制研究
  研究目的与方法:本研究以人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial ceils,HUVECs)为研究对象,气泡诱导EMPs产生的方法同“第一部分”。应用荧光探针或流式细胞术的方法检测气泡刺激后胞内Ca2+浓度的变化并利用Ca2+通道阻滞剂LaCl3(100μM)观察胞内Ca2+对气泡诱导EMPs产生的影响。此外,流式法检测气泡刺激后胞膜翻转酶Flippase活性的变化及磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外露的情况,并进一步分析Ca2+是否在其中发挥作用;利用荧光显微镜观察骨架蛋白F-actin在胞膜共定位情况并进一步分析Ca2+是否在其中发挥调控作用。Western blot法分别检测诱导骨架蛋白重构的重要信号分子——细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2),肌球蛋白轻链(MLC)激活情况并进一步利用相应的分子抑制剂明确其在诱导EMPs释放中的确切作用。
  研究结果:内皮细胞经气泡刺激后,内皮细胞内Ca2+浓度显著增高,且气泡诱导EMPs的数量与胞内Ca+浓度具有明显的正相关性(r=0.687,P<0.05)。气泡刺激内皮细胞后,p-ERK1/2,p-MLC水平明显上升(P<0.05,P<0.05),细胞膜骨架蛋白共定位显著减少、骨架蛋白重构增加(P<0.05)。应用ROCK抑制剂Y27632后,p-MLC水平被显著抑制,骨架蛋白重构减少,同时气泡诱导EMPs释放的数量显著降低(P<0.05)。气泡刺激后,内皮细胞翻转酶Flippase活性明显下降,胞膜PS外露显著增加。应用Ca2+通道阻滞剂后可显著减轻上述效应中除ERK1/2被激活之外的所有作用。
  研究结论:气泡刺激血管内皮后通过触发胞内Ca2+增加激活Rho/ROCK通路并引起细胞膜骨架蛋白共定位减少、骨架蛋白重构,同时抑制翻转酶Flippase活性导致PS外露增加,促进EMPs的产生与释放。
  第三部分:肺表面活性物质对大鼠减压病的保护作用研究
  研究目的与方法:实验前12h给予大鼠雾化吸入10 mg肺表面活性物质(Surfactant)或生理盐水(Saline),然后建立DCS模型(空气模拟潜水:60m水深,90 min高压暴露,3min匀速减至常压)。观察大鼠DCS发病并探测血管内气泡生成情况,检测大鼠内皮炎症及氧化损伤相关指标。
  研究结果:雾化吸入Surfactant可显著降低大鼠DCS发病率及死亡率(75.0% vs.46.4%,P<0.01;28.6% vs.14.3%,P<0.01),DCS发病潜伏期和生存期明显延长(P<0.05)。血管内气泡生成量显著下降(P<0.01)。大鼠全身性炎症及肺内炎症指标(白介素1β和白介素6)较Saline组明显降低(P<0.01),内皮损伤相关指标(肺W/D,肺泡灌洗液蛋白,E-选择素,ICAM-1,EMPs)较Saline组明显降低(P<0.05),氧化与抗氧化(GSH/GSSG)失衡显著改善(P<0.01)。
  研究结论:雾化吸入Surfactant可通过抑制肺内炎症反应、改善肺功能、促进惰性气体排出明显减少血管内气泡生成;辅以抗氧化及保护内皮作用预防大鼠DCS的发生。
[博士论文] 刘德芳
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性风湿免疫疾病,主要表现为反复的滑膜炎,导致多关节肿痛、变形、活动受限,往往演变成残疾,是致残率最高的关节疾病,严重影响了生活质量,是一种终身性疾病。目前RA的具体病因尚不明确。本课题根据湿性重浊粘滞,久湿形成毒,湿毒郁久化热致瘀,阻滞经脉筋肉,结合西方病因学说“体液论”,提出“湿毒入络”可能导致RA的病因学理论。湿毒入络,体液的流动或迁移可能刺激水通道蛋白(AQPs)的异常表达;RA的活动期炎性渗出,滑膜充血水肿,也可能伴随水的异常代谢。已有报道,AQPs在RA的发展过程中发挥着一定的作用,可介导其病理变化过程中的细胞迁移。另外,临床上尚无根治RA的办法,大多只停留在对症治疗,缺乏对因治疗。本课题针对RA的病因病机“湿毒入络”,拟方三黄一龙汤(SYD)联合甲氨蝶呤(MTX)治疗RA湿热痹阻证,从临床和动物实验两方面对RA发病机制和三黄一龙汤或联合MTX的作用机理进行了研究。
  方法:
  本课题的第一部分以RA湿热痹阻证患者的外周血和滑膜液作为研究对象,从细胞因子、AQPs及JAK-STAT通路的信号因子等的表达及调控方面进行了初步研究,主要采用ELISA法检测相关指标。第二部分复制出RA湿毒入络动物模型,以大鼠的外周血、骨关节、肺、脾、肾脏等作为研究对象,从炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK-STAT通路的信号因子及关节病理组织学的变化及调控进行了深入研究,采用了ELISA法、RT-PCR法及病理组织学等检测方法。
  结果:
  一、RA湿热痹阻证患者炎性因子、AQPs及JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿热痹阻证患者炎性因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者活动期关节肿胀指数、压痛指数以及ESR、CRP、DAS28明显升高;采用SYD联合MTX治疗,其关节肿胀指数、压痛指数及ESR、CRP、DAS28能较快较好地改善。(2)RA湿热痹阻证患者外周血TNF-α、IFN-γ较健康对照组显著升高,滑膜液TNF-α、IFN-γ较外周血明显升高。(3)采用SYD联合MTX治疗后TNF-α、IFN-γ显著下降。
  2、RA湿热痹阻证患者AQPs的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者外周血和滑膜液中AQP1、AQP2和AQP3的表达水平较健康者明显降低。(2)外周血中AQP1、AQP2、AQP3表达略高于滑膜液,以AQP1表达最多,AQP3次之,AQP2表达最少。(3)SYD联合MTX可以使RA湿热痹阻证患者低表达的AQP1、AQP2和AQP3上调。
  3、RA湿热痹阻证患者JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1、SOCS-3的表达水平较健康者都降低,其中STAT1表达高于STAT3,PIAS1表达高于PIAS3,SOCS-1与SOCS-3表达相当。(2)RA外周血中STAT1、PIAS1、PIAS3、SOCS-1的表达高于滑膜液,而外周血中STAT3、SOCS-3与滑膜液中基本相当。(3)经SYD联合MTX治疗,RA湿热痹阻证患者外周血STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1都下调,SOCS-3无明显变化。
  二、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATPase、JAK-STAT通路信号因子及关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠显示血小板数、中性粒细胞比率和单核细胞比率较正常组明显升高,淋巴细胞比率较正常组明显降低。SYD及SYD联合MTX能较好地降低中性粒细胞和单核细胞比率,上调淋巴细胞比率。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中IL-6和TNF-α表达水平较正常组都明显降低;骨关节中IL-6和TNF-α表达较正常组都明显升高。SYD及SYD联合MTX都能使外周血低下的IL-6和TNF-α上调,使骨关节中升高的IL-6和TNF-α下调。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血中VEGF表达较正常组无差异,而其骨关节中VEGF表达较正常组明显增多。SYD及SYD联合MTX均能使骨关节中增多的VEGF减少。(4)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组无差异;而其炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组明显减少。SYD联合MTX可促进炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的表达。
  2、RA湿毒入络模型大鼠AQPs、Na+,K+-ATP酶的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3表达较正常组均明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中以AQP2表达最高,其次是AQP3;骨关节中以AQP3表达水平最高,其次是AQP2。(3)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中AQP1mRNA的含量较正常组明显减少,其肾组织AQP1mRNA的含量较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性较正常组明显减退。(5)SYD及SYD联合MTX都能较好地促进RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3的表达,SYD联合MTX还能显著地增强肺组织AQP1mRNA的表达。(6)SYD及SYD联合MTX能显著地提高RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性。
  3、RA湿毒入络模型大鼠JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3表达较正常组明显降低;骨关节中JAK1、JAK3表达较正常组明显升高;JAK2表达较正常组明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中JAK3mRNA的含量较正常组无差异;肾组织中JAK3mRNA的含量较正常组明显增多。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中STAT1表达较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠外周血中STAT3表达较正常组明显降低;骨关节中STAT3表达较正常组无差异。(5)SYD及SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3及骨关节中JAK2的表达上调。(6)SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠骨关节中升高的JAK1、JAK3表达下调。(7)SYD及SYD联合MTX能上调外周血STAT3的表达。(8)SYD及SYD联合MTX能抑制肾组织中JAK3mRNA的表达。
  4、RA湿毒入络模型大鼠关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络证模型大鼠关节组织病理学表现为巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。(2)SYD联合MTX能抑制RA湿毒入络模型大鼠关节纤维组织的增生和淋巴细胞的浸润。
  结论:
  本研究证实了湿毒入络是RA的基本病机。湿毒入络诱导RA发病与AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK等密切相关,表现出外周血、骨关节及肺脾肾脏等组织器官中AQP的亚型AQP1、AQP2、AQP3及AQP1mRNA表达减少,Na+,K+-ATP酶活性减退,骨关节促炎性细胞因子IL-6、TNF-α和血管内皮生长因子(VEGF)产生增多,软组织TGF-β1mRNA减少,信号因子JAK1、JAK3及JAK3mRNA异常表达,关节巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。印证了肺主通调水道、脾主运化功能参与了RA湿毒入络的发生发展过程。证明了三黄一龙汤及三黄一龙汤联合MTX能较好地降低RA的关节肿胀、压痛指数,降低ESR、CRP、DAS28等炎症指标,抑制外周血和骨关节炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和血管内皮生长因子(VEGF)产生,促进TGF-β1mRNA分泌,增强外周血和骨关节AQP1、AQP2、AQP3及肺脏AQP1mRNA的表达,提高脾脏Na+,K+-ATP酶的活性,调控信号因子JAK1、JAK2、JAK3及STAT3等的表达。可作用于多组织器官,多靶点进行调节,增强组织细胞的代谢,缓解关节滑膜炎症,抑制滑膜组织血管新生。这为临床推广应用提供了理论依据。
[博士论文] 童文文
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病。疾病特征包括起止点炎、渐进发展的骶髂关节炎以及脊柱关节强直。该病好发于青壮年男性并且发病率较高,由于缺乏典型的早期症状和明确的早期生物标记物,AS通常在第一次临床症状出现后的8-10年时间才能得到明确的诊断。晚期患者脊柱的骨性强直及髋关节的骨性融合将导致患者完全丧失生活和工作的能力,对家庭和社会产生极大负担。脊柱及关节部分的骨化作为AS主要病理特征,目前关于它的发生、发展机制也尚不清楚。因此寻找AS的早期诊断标志物以及探索骨化发生的生物学机制一直是AS研究的热点。
  自身抗体是多种自身免疫性疾病的免疫标记物,可作为早期诊断,疾病活动度的观测,治疗预后评估等的标志物。由于缺乏类风湿因子,强直性脊柱炎一直被认为是血清阴性脊柱关节病,血清抗体较少被考虑作为生物标记物进行研究。然而,近年来越来越多的证据表明B细胞和相应的体液免疫反应可能通过抗原提呈,抗体产生等方式参与AS的发病过程。因此,本课题试图通过蛋白芯片在AS血液样本中筛选到合适的可以作为AS早期诊断的标志物,并研究自身抗体相应的抗原蛋白在疾病发生发展中的作用及机制,从而为强直性脊柱炎寻找合适的标志物及可能的治疗靶点。
  目的:
  第一部分:筛选强直性脊柱炎患者血浆内的自身抗体并扩大样本验证Kaiso蛋白自身抗体在强直性脊柱炎血浆内的表达情况。
  第二部分:探究Kaiso分子在体内外实验中对成骨分化进程的影响。
  第三部分:探索Kaiso分子调节成骨分化进程的具体机制。
  方法:
  第一部分:(1)HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎患者及正常人血浆:经过芯片封闭,芯片杂交,芯片检测,数据提取与分析等步骤筛选出强直性脊柱炎患者血浆内特异性的自身抗体。(2)血浆自身抗体表达水平的验证:基于Meso Scale Discovery(MSD)技术,利用夹心法,即将重组蛋白包被在板底,然后加入含有待测抗体的血浆样本或阳性对照抗体进行孵育,再加入带有sulfo标签的抗待测抗体的二抗,最终利用电化学发光原理检测,从而得出不同血浆样本中的抗体表达水平。
  第二部分:(1)Kaiso分子过表达、敲减稳转细胞株的建立:通过病毒载体的构建,慢病毒包装,慢病毒感染细胞及嘌呤霉素筛选等实验步骤完成慢病毒感染稳转细胞株的构建。荧光定量PCR及蛋白免疫印迹实验验证过表达及敲减效率。(2)成骨分化的诱导及检测:在培养基中添加50μg/ml抗坏血酸,10mMβ-甘油磷酸钠,50ng/ml BMP2重组蛋白进行成骨诱导。在不同时间点使用PCR技术检测骨化相关分子的变化、使用BCIP/NBT法进行染色检测碱性磷酸酶的表达情况、使用碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性、使用茜素红S染色法观察钙结节形成,从而评价不同细胞株成骨分化能力。(3)裸鼠体内异位成骨实验:将Kaiso过表达、敲减及相应对照的稳转株细胞株接种到β-TCP材料支架上,细胞-材料复合物植入裸鼠肌肉内部模拟活体环境,最后通过μCT扫描骨密度值及HE染色观察材料上细胞的成骨情况来评价不同稳转细胞株的成骨能力。
  第三部分:(1)RNA测序了解Kaiso过表达及敲减后基因表达的变化情况:通过提取RNA,RNA质量检测,建立cDNA文库,上机检测,测序结果分析等步骤检测Kaiso过表达及敲减后差异表达的基因。并进一步进行GO、KEGG分析探究差异基因富集到的生物过程及信号通路。(2)使用PI3K-Akt信号通路抑制剂并加入成骨诱导液进行诱导,探究该信号通路是否参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)Kaiso分子结合的目的基因预测及验证:根据生物信息学分析预测转录因子Kaiso可能结合的目的基因,ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验验证Kaiso与Itga10启动子区域的结合及对Itga10的表达调控。(4)Itga10敲减实验进一步验证Itga10与PI3K-Akt信号通路及成骨分化的关系。
  结果:
  第一部分:(1)通过HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎及正常人血浆,结果在强直性脊柱炎病人血浆中特异性筛选出MYLK,ASAP,SUGT1,BCL7A,EIF2C1,KAISO,IGHG17等蛋白自身抗体。(2)扩大相应样本量利用MSD技术对其中感兴趣的Kaiso蛋白抗体进行验证,结果显示早期AS患者体内Kaiso抗体表达水平显著高于正常人,晚期AS患者血浆内表达水平与正常人无显著差异。
  第二部分:(1)通过慢病毒感染技术成功构建Kaiso基因过表达和敲减MC3T3-E1稳转细胞株。使用成骨诱导液分别对Kaiso过表达及敲减稳转细胞株进行成骨诱导,结果发现骨化相关分子、碱性磷酸酶的表达量及活性、钙结节形成等反映成骨分化能力的指标在Kaiso过表达后被显著抑制,而在Kaiso敲减后明显增强。(2)裸鼠体内异位成骨实验证实Kaiso过表达稳转细胞株体内成骨能力低于对照,而Kaiso敲减稳转细胞株体内成骨能力与对照组相比显著增强。
  第三部分:(1)对RNA测序所得的差异基因进行GO分析发现,Kaiso过表达后下调的基因和Kaiso敲减后上调的基因均能够富集到骨化相关生物过程。KEGG分析发现PI3K-Akt信号通路在Kaiso过表达时被抑制,Kaiso敲减时被激活。其中Itga10的表达变化与PI3K-Akt信号通路变化一致。(2)PI3K-Akt信号通路抑制剂证实该通路参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验发现Kaiso可以通过结合存在于Itga10启动子区域的特异序列从而抑制Itga10的表达。(4)Itga10敲减实验证实Itga10的表达与PI3K-Akt信号通路成正相关,敲减Itga10能够抑制细胞的成骨分化。裸鼠体内异位成骨实验进一步证实敲减Itga10对细胞成骨分化的抑制作用。
  结论:
  本课题通过三个部分的研究揭示了Kaiso蛋白的自身抗体在早期强直性脊柱炎患者血浆内高表达,进一步探究Kaiso分子与骨化这一强直性脊柱炎病理过程的关系,结果显示Kaiso分子可通过结合Itga10来调控PI3K-Akt信号通路从而抑制成骨分化过程。这为强直性脊柱炎的早期诊断及骨化的干预治疗提供了一个新的可能。
[硕士论文] 张蕾
护理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  老年人慢性病患病率较高,影响其生活质量和心理健康。既往研究发现,患者患病后可体验到益处发现。目前关于老年慢性病患者益处发现的研究较少,且缺乏科学的测量工具。因此,本研究拟在认知适应理论、应激作用过程模型的指导下,对中国老年慢性病患者益处发现的现状进行调查,探索益处发现的影响因素,为日后制定干预方案提供依据,以期提高患者益处发现水平,促进患者身心健康。
  方法:
  本研究基于文献回顾、质性研究、量性研究等研究方法,研究内容分为以下三个部分:
  第一部分:老年慢性病患者益处发现体验的质性研究。研究者在文献回顾的基础上制定了访谈提纲初稿,并经过专家修改和调整,对老年慢性病患者进行质性访谈,析出患者患病后的益处发现体验。
  第二部分:老年慢性病患者益处发现问卷的研制。结合理论研究、文献回顾及质性访谈析出结果,形成问卷初稿,并进行专家咨询。对问卷进行初步修订后,实施预调查,采用项目分析、探索性因子分析、内部一致性系数、重测信度对问卷进行信效度检验。
  第三部分:老年慢性病患者益处发现及影响因素的现状调查。采用方便抽样法,以前期形成的调查问卷为工具,对上海市两所三级甲等医院的320名老年慢性病患者实施问卷调查。采用描述性统计分析探究老年慢性病患者益处发现现状,采用非参数检验、多元回归分析对益处发现的影响因素进行研究。
  结果:
  老年慢性病患者在应对疾病过程中,可体验到益处发现。表现为灵性增长、欣赏生活和生命、优先权的积极改变、领悟社会支持、新的可能性、个人成长、利他行为、健康行为改变。
  结合理论研究、文献回顾及质性访谈析出结果,编制老年慢性病患者益处发现问卷。问卷信效度检验结果显示,各条目内容效度指数为0.818~1,问卷总体内容效度指数为0.91,问卷内容效度良好。探索性因子分析结果显示,问卷由6个维度构成,量表因子累计方差贡献率为66.86%,各条目维度归属基本与原理论设想一致,仅1个条目维度归属不一致。问卷内部一致性Cronbach'a系数为0.924,重测信度为0.902,问卷信效度良好。
  对320名老年慢性病患者的调查结果显示,患者益处发现得分较高,总分为78.76±16.72,疾病感知、面对应对、回避应对、屈服应对、家庭内支持、家庭外支持、乐观倾向得分分别为42.69±10.20、20.46±2.32、17.78±2.34、12.44±2.09、24.46±3.89、41.96±9.50、13.02±1.66。通过非参数检验、Spearson相关分析筛选变量,析出老年慢性病患者益处发现影响因素,包括:①社会人口学因素中的文化程度、退休前职业;②回避应对、屈服应对;③家庭内支持,家庭外支持。将有统计学意义(P<0.05)的影响因素纳入多因素分析,结果显示回避应对、家庭外支持、家庭内支持进入益处发现的logistic回归方程,共同解释了总变异的22.4%。采用回避应对、领悟到更多家庭内支持和家庭外支持的患者益处发现水平高。
  结论:
  老年慢性病患者在应对疾病过程中,可体验到益处发现。自行研制的问卷信效度良好,可用于老年慢性病患者益处发现相关研究。患者益处发现得分较高,其受屈服应对、家庭内支持、家庭外支持的影响。研究提示医务人员和患者家属在今后对老年慢性病患者益处发现的干预中应引导患者适当采取屈服应对的策略,接受患病的事实,调整心态,增加患者的社会支持,以期促进患者体验到更多益处发现。
[硕士论文] 王晔炜
特种医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:减压病是潜水和高气压医学领域的一个核心问题。航天员出舱、潜水员出水、加压舱减压等活动都应当遵循一定的减压规则,以预防这一疾病。减压算法,是运用了生理学、物理学原理构建的数学模型。这类模型能够模拟惰性气体在人体内的运动,并通过人为设置的一定规则计算出相应的减压方案,指导安全减压。
  最早的减压算法是Haldane于1908年所创立的5类理论组织算法。减压算法诞生至今,在发展中不断革新理论,创新方法,产生了许多更加科学和高效的新算法。而当前中国所使用的空气和氦氧潜水减压表理论基础还停留在Haldane的算法上。学习吸收新型减压理论和减压算法的优点,能够进一步地提升安全与效率。这就需要从源头算法出发,学习和借鉴当前主流减压算法,以此为基础对算法进行优化,进而计算适应潜水实践需求的新型减压方案。
  本研究以减压算法的计算步骤为线索,对当前主流减压算法中的ZH-L16,可变通透性模型和Thalmann算法进行了深入的解析,并根据其特点,进行了吸收融合。
  首先,本研究对惰性气体运动过程的模拟计算过程进行了解析,研究了生理性惰性气体动力学指数式方程与线性-指数式方程的计算过程与特点。再结合生理性惰性气体脱饱和速率慢于饱和速率的这一特点,进行了简化与优化。通过增加不对称半饱和比这一参数,模拟了生理性惰性气体运动的不对称性。同时,将呼吸商对吸入气中生理性惰性气体分压的影响考虑在内,使计算更加精确。
  其次,本研究论证了平行理论组织这一算法基础框架的合理性与其背后所蕴含的生理学原理,确定了平行理论组织对于新型算法的适用性。同时,分析比对了几种不同减压算法的平行理论组织分布特点,总结出了平行理论组织半饱和时间设定和分布的规律,并运用这一规律,确定了11类理论组织及其半饱和时间。
  接着,在解析ZH-L16、可变通透性模型和Thalmann算法减压上限计算过程的基础上,本研究将计算减压上限的方式归纳总结为比例法、线性法与差值法。在吸纳线性法与差值法各自的特点后进行了融合,形成了非线性法的减压上限计算过程。使差值法的减少气泡产生与比例法的浅深度停留充分这两个特点相互结合,产生了新型减压算法ANL。
  ANL算法参考了ZH-L16A的基本参数,沿用了平行理论组织这一概念,将理论组织的类别数设定为11类,使用不对称饱和-脱饱和过程对生理性惰性气体的张力计算过程进行模拟,并综合线性法与差值法的特点,应用非线性法对减压上限的计算进行了优化。
  为了对优化后算法进行评估,本研究以试验算法为目的,自主开发了减压算法试验平台软件,并将其用于后续的算法运算与优化环节。对于潜水电脑表可以使用的实时减压算法,本研究也以生理性惰性气体运动的实时计算为线索,初步进行了分析和设计,使未来的潜水电脑表研制工作具有了一定的理论基础。
  最后,通过分析比较几种现有减压表的减压规则,本研究从站间距、上升下潜速率、气体切换和停留时间这几个方面确定了ANL算法减压规则。并运用减压算法试验平台软件,产生了基于ANL算法的空气与氦氧潜水减压方案,将其中的部分减压方案与现有空气和氦氧常规潜水减压表中的方案进行了比较。结果表明,对于不同类型的潜水,通过对半饱和时间比根据一定规则进行修正,ANL算法可以计算出类似于现行减压表的减压方案。初步论证了其理论层面的安全性和可行性,该新型算法具有潜在的实用价值。
[硕士论文] 奂剑波
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:海难或海战时落水人员浸泡于海水中,发生海水浸泡性体温过低症的概率较大。马岛海战中,阿根廷“贝尔格拉诺将军号”巡洋舰遭英潜艇鱼雷攻击后迅速沉没,舰员落水和失踪达320人,大多数舰员落水后因低温海水浸泡而死亡[1]。目前对海水浸泡体温过低症致伤机制与救治的认识尚不完全清楚,即使采用及时的救治措施,重症低温伤员救治成功率仍然低于50%[2,3]。由于海上搜救伤员的难度较大,如处于战争时期,落水人员的救治通常需要等待较长时间[4]。在20℃以上海水中,落水人员的生存时间明显延长。既往体温过低症动物模型通常在短时间内致伤,并不能很好反映长时程海水浸泡导致的慢性体温过低症的病理生理改变。
  及时恰当的复温是海水浸泡性体温过低症早期救治的关键措施。既往国内外研究大多关注急性重度体温过低症伤员的主动体内复温措施,如CRRT或者ECMO等[4]。体表复温由于其可能产生“复温性休克”或者“后降效应”等在救治实践中应用尚存在争议[7,8]。而在长时程海水浸泡导致的慢性体温过低症的救治中,如果伤员的意识清醒,海战环境下,无高级的复温设备,无专业的医务人员时,紧急采用温水浴复温等体表复温对海水浸泡性体温过低症伤员进行救治的利与弊难以把握,与被动复温相比对机体的影响仍不清楚。另外,海水浸泡性体温过低症肺损伤相关并发症发生率最高,其死亡率高达66.7%[9],如不正确及时处理可能对体温过低症最终救治成功率产生影响。血清酶学指标改变如肝功、肾功、心肌酶等可反映机体重要脏器的病理生理状态,体温过低症时其变化也较大。观察复温措施对于肺脏病理损伤和重要血清酶学的影响可一定程度上评估该复温方法的有效性。
  为了对长时程海水浸泡导致的体温过低症的病理生理改变有更深刻的认识,并为后续研究打下基础,建立了长时程海水浸泡导致的体温过低症SD大鼠模型,并对其进行重要脏器病理学改变进行横断面的观察研究,发现该模型中肺脏是重要的低温致伤靶器官,并发现了低温性胸水,且血清酶学改变明显。在此基础上采用温水浴和被动复温两种不同方法对大鼠进行复温,比较复温前后体温过低症大鼠肺脏损伤程度及血清酶学等指标的变化,以此初步评价温水浴复温在紧急状态下对长时程海水浸泡性体温过低症复温的效果。
  第一部分:长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型的建立
  目的:建立长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型。
  方法:成年雄性SD大鼠20只,随机均分为正常对照组和低温实验组,每组10只。正常对照组不做处理,低温实验组采用自制大鼠水浴固定器在20℃人工海水中浸泡24h,观察大鼠生命体征变化,实验结束后检测各部位体温,常见血液学指标及重要脏器病理学改变。
  结果:低温实验组大鼠低温海水浸泡过程中,心率、呼吸、意识等与正常对照组相比明显下降,浸泡结束后核心温度接近20℃。血液学指标明显异常,病理学提示重要脏器均出现不同程度损伤。肺脏病理损伤较为严重,出现肺泡结构破坏、肺泡及间质出血、炎性细胞浸润等改变。
  结论:长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型建立成功,肺脏为重要的损伤靶器官,可用于后续相关研究。
  第二部分:温水浴复温对长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠肺损伤及血清酶学的影响
  目的:比较温水浴复温与被动复温,长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠复温前后肺脏病理及血清酶学变化,初步评估温水浴复温在长时程海水浸泡体温过低症救治中的效果。
  方法:100只雄性SD大鼠随机均分为正常对照组(不做任何处理),低温实验组(20℃海水浸泡24h),被动复温组1、2、3、4(20℃海水浸泡24h+被动复温,分别在复温后0h、3h、6h、12h处死),温水浴复温组1、2、3、4(20℃海水浸泡24h+温水浴复温,分别在复温后0h、3h、6h、12h处死),每组10只。主要检测肺脏病理学及血清肝功、肾功、心肌酶等指标改变。
  结果:温水浴复温与被动复温对长时程海水浸泡体温过低症大鼠肺损伤及血液学异常均有恢复作用。与被动复温组相比,温水浴复温组大鼠在复温后6h、12h,肺脏病理损伤恢复更好,P<0.05;在复温后6h实际碳酸氢盐恢复更好,P<0.05;在复温后0h肝功能指标升高更少,复温后3h、6h恢复更好,P<0.05;在复温后0h肾功能指标升高更少,复温后3h、6h、12h恢复更好,P<0.05;在复温后0h心肌酶指标升高更少,复温后3h、6h恢复更好,P<0.05。
  结论:与被动复温相比,温水浴复温对长时程海水浸泡体温过低症大鼠肺损伤及血液学异常的修复作用更明显。温水浴复温在海战中长时程海水浸泡导致的体温过低症伤员的紧急复温中效果优于被动复温。
[博士论文] 吴贤敏
耳鼻咽喉科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的听力损失
  目的:利用C57小鼠腹腔注射顺铂制造药物性听力损失模型,用顺铂联合大蒜素腹腔注射来探讨大蒜素在体内对顺铂诱导的听力损失是否具有保护作用。
  方法:体内实验所用C57小鼠性别匹配,年龄在7-8周,体重17-23g。小鼠被随机分为三组,每组30只;第1组,0.9%生理盐水注射为对照组;第2组,顺铂注射;第3组,顺铂+大蒜素注射。第1组小鼠给予连续七天腹腔注射0.9%生理盐水(0.6毫升/100克)。第2组小鼠给予连续七天腹腔注射顺铂(3毫克/公斤)。第3组小鼠在顺铂注射前一天腹腔注射大蒜素(18.2毫克/公斤),在接下来的连续七天先腹腔注射大蒜素,2小时之后再腹腔注射顺铂(3毫克/公斤),用药前和用药后检测三组小鼠的听性脑干反应(ABR),TUNEL凋亡试剂盒检测三组小鼠耳蜗外毛细胞、支持细胞和螺旋神经节神经元的凋亡情况。对三组小鼠耳蜗中剩余的外毛细胞和螺旋神经节神经元进行计数,用透射电镜观察外毛细胞和螺旋神经节神经元中线粒体情况,用Western blot检测三组耳蜗组织中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表达情况,免疫荧光检测三组小鼠耳蜗外毛细胞中P53的表达和螺旋神经节神经元中细胞色素-C、cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表达情况,检测三组小鼠耳蜗组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。
  结果:ABR结果表明,C57小鼠单独腹腔注射顺铂组表现出听觉脑干反应的阈值增加,而大蒜素+顺铂组小鼠的听觉功能的大部分频率受到保护。顺铂引起耳蜗外毛细胞及底转、中转的螺旋神经节神经元计数减少,大蒜素能保护顺铂引起的耳蜗外毛细胞及耳蜗中转的螺旋神经节神经元损伤。TUNEL检测结果显示:顺铂引起耳蜗外毛细胞、支持细胞及耳蜗底转和中转螺旋神经节神经元凋亡,大蒜素能明显地减少顺铂诱导的凋亡情况。透射电镜结果显示:大蒜素能显著地降少顺铂诱导的螺旋神经节神经元中线粒体的损伤。Western blot结果显示:顺铂增加耳蜗组织中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表达,降低Bcl-2的表达;大蒜素能显著地降低耳蜗组织中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表达,增加Bcl-2的表达。免疫荧光结果显示:顺铂诱导螺旋神经节神经元中细胞色素C的释放、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表达增强,诱导外毛细胞、支持细胞中P53的表达增强,大蒜素能显著地减少螺旋神经节神经元中细胞色素C的释放,cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表达,减少耳蜗中转、底转外毛细胞中P-53的表达及耳蜗中转支持细胞中P53的表达。此外,大蒜素能降低耳蜗组织中丙二醛水平,升高耳蜗组织中超氧化物歧化酶的水平。
  结论:大蒜素可有效地预防顺铂诱导的听力损失,其中大蒜素通过线粒体途径保护顺铂诱导的螺旋神经节神经元的凋亡,通过p53途径来保护耳蜗外毛细胞和支持细胞的凋亡。同时大蒜素通过抗氧化作用保护顺铂诱导的耳蜗损伤。
  第二部分 大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的前庭毒性
  目的:本研究的目的是探讨大蒜素对顺铂诱导的小鼠前庭功能障碍的保护,并探讨大蒜素对顺铂诱导的耳前庭毒性的保护作用机理。
  方法:本实验所用C57小鼠性别匹配,年龄在7-8周,体重17-23 g。小鼠被随机分为三组,每组10只;第1组,0.9%生理盐水注射为对照组;第2组,顺铂注射;第3组,顺铂+大蒜素注射。第1组小鼠给予连续七天腹腔注射0.9%生理盐水(0.6毫升/100克)。第2组小鼠给予连续七天腹腔注射顺铂(3毫克/公斤)。第3组小鼠在顺铂注射前一天腹腔注射大蒜素(18.2毫克/公斤),在接下来的连续七天先腹腔注射大蒜素,2小时之后再腹腔注射顺铂(3毫克/公斤),用药前后都用游泳实验来观察小鼠的泳姿情况。游泳测试设备为盛有温水的矩形水箱,长70厘米,宽40厘米,深10厘米,小鼠被放置在水箱的中心和身体与水箱的长轴平行,放手,观察小鼠自由游泳的姿势。小鼠以稳定的姿势游泳,头露出水面,评分为3分。小鼠头露出水面,游泳姿势不稳,评分为2分。小鼠的头部不能向上或不能露出水面,评分为0分,这只小鼠必须立即从水中被救出,以免被淹死。每组随机抽取5只小鼠进行游泳试验,每只小鼠进行3次试验,每次1分钟,每次间隔10分钟。交替试验,防止过度疲劳影响试验结果。计算游泳得分平均数进行统计分析。测试是在室温下进行的。用免疫荧光方法观察三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞纤毛束的外观和密度。用TUNEL试剂盒检测三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞的凋亡情况。用免疫荧光方法检测三组中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞层和血管层细胞质中cleaved-caspase-3的表达情况及荧光密度,用免疫荧光方法检测三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞层和血管层细胞核中AIF的表达情况及AIF核转移率。
  结果:游泳实验结果表明,C57小鼠单独腹腔注射顺铂组表现出前庭功能受损,而大蒜素+顺铂组中大蒜素能显著地保护小鼠的前庭功能。注射顺铂7天后,顺铂组的椭圆囊、球囊和壶腹毛细胞的纤毛束数量明显减少,纤毛束分布不均和外观不正常,然而,顺铂+大蒜素组椭圆囊、球囊和壶腹毛细胞的纤毛束保存较好、外观正常和高密度分布。TUNEL检测凋亡情况:对照组没有发现TUNEL染色,在顺铂组的前庭神经节神经元、间质细胞、椭圆囊、球囊、壶腹中毛细胞和支持细胞中发现了TUNEL阳性染色。然而,在顺铂+大蒜素治疗组的前庭神经节神经元、毛细胞和支持细胞中都没有发现TUNEL染色,只有一些间质细胞被TUNEL染色标记。免疫荧光检测cleaved-caspase-3结果:在对照组中,没有发现cleaved-caspase-3染色。在顺铂治疗组中前庭毛细胞层和血管层细胞的细胞质中发现cleaved-caspase-3阳性染色。在顺铂+大蒜素组中,前庭毛细胞和血管层细胞的细胞质中cleaved-caspase-3的表达明显减少。在顺铂组的前庭毛细胞层和血管层细胞cleaved-caspase-3的荧光密度明显高于对照组,而在顺铂+大蒜素组,大蒜素显著地降低了前庭毛细胞层和血管层细胞cleaved-caspase-3的荧光密度。免疫荧光检测AIF的表达情况:在对照组中,AIF在前庭毛细胞层和血管层细胞质中分布,在细胞核内没有分布。经过7天的顺铂治疗,在前庭毛细胞层和血管层细胞的核区域内发现了强烈的AIF荧光。前庭毛细胞层和血管层细胞中AIF核转移率在顺铂组明显高于对照组;在顺铂+大蒜素组,大蒜素显著地降低毛细胞层AIF核转移率,但是大蒜素没有显著地降低血管层细胞AIF核转移率。
  结论:腹腔注射顺铂的小鼠,在游泳测试中表现出前庭功能障碍,这结果表明小鼠的前庭受损。然而,在大蒜素预处理组,大蒜素可以明显地阻止了这些损伤。大蒜素显著地减少顺铂诱导的椭圆囊、球囊、壶腹的毛细胞层和血管层细胞中cleaved-caspase-3的表达,也减少了椭圆囊、球囊、壶腹的毛细胞层中AIF的核转位。这些结果表明,大蒜素通过有效地抑制caspase依赖和非caspase依赖的凋亡途径来保护顺铂诱导的前庭功能障碍。因此,大蒜素可能有助于防止顺铂诱导的前庭毒性。
[博士论文] 李海
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景:百草枯(PQ)为一种速效触杀灭生型季胺盐类除草剂,其化学名为1-1'-二甲基-4-4联吡啶阳离子盐。我国既是百草枯的生产大国,又是百草枯的消费大国。随着百草枯的广泛使用,百草枯中毒患者也日益增多。百草枯脂溶性强,易于人体吸收,且在血液中基本不与血浆蛋白结合,故进入人体后可迅速分布于肺、肝、肾和肌肉等组织器官中。其中肺组织既是百草枯在人体的主要蓄积器官,也是百草枯致人体损伤的主要靶器官。在百草枯中毒早期可发生急性肺损伤,到了中晚期则以肺纤维化为主要表现,典型百草枯中毒患者的肺也被称为“百草枯”肺。近几十年来,国内外学者对百草枯的发病机制进行了大量研究,也取得一些进展,但对于百草枯中毒的具体发病机制仍未完全阐明,故百草枯中毒,尤其是中重度中毒患者死亡率极高,临床尚无特效解毒药及救治方法。因此有必要进一步研究百草枯中毒的发病机制,尤其是在分子与基因水平的研究,为百草枯中毒的治疗带来突破性进展。
  20世纪90年代,有学者在对果蝇的研究中发现一种新的信号通路即Hippo信号通路,目前已证实该通路参与了细胞增殖、分化和凋亡,在肿瘤的发生过程中起着重要作用。随着对Hippo通路研究的深入,人们发现该通路与人类的其他疾病如主动脉瘤、组织纤维化、病毒性肝炎等的发生密切相关。近年来研究发现Hippo信号通路和TGF-β1信号通路在调节结缔组织生长因子(CTGF)的表达方面存在着交互作用,而TGF-β1已被认为是百草枯中毒中引起肺纤维化的关键因子。因此,Hippo信号通路可能在百草枯中毒致肺纤维化的发病过程中起着重要作用。在本研究中我们首次通过观察百草枯染毒大鼠肺组织内MST、Yap、TGF-β1及Smads等细胞因子的变化情况,了解Hippo信号通路在百草枯中毒致肺纤维化中的作用,为深入开展百草枯中毒发病机制的研究开辟新的思路。
  中药红花是一种具有活血化瘀作用的常用药物,自汉代以来广泛应用于临床。红花黄色素为红花的提取物,其中85%以上为羟基红花黄色素A(HSYA),临床上常用于各种缺血性心脑血管疾病的治疗,其安全性及有效性已得到证实。近年来随着研究的深入,人们发现红花黄色素还具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗纤维化等多种药理作用。已有实验证实红花黄色素能抑制博来霉素诱导的小鼠及大鼠肺纤维化,同时在临床上使用红花黄色素治疗IPF也取得了一定的效果。目前临床上对百草枯患者主要以大剂量糖皮质激素作为基本的抗炎及抗纤维化治疗手段,不仅效果尚不理想,而且副作用较大,因此发现新的且副作用较小的治疗药物具有重要意义。本研究中我使用红花黄色素及TGF-β1抑制剂SB431542干预百草枯染毒大鼠,通过观察其肺组织病理学与部分蛋白分子表达水平的变化为百草枯中毒的临床治疗研究探索新的方向,提供一定的理论基础。
  目的:
  1、建立急性大鼠百草枯中毒肺纤维化模型,研究Hippo信号通路在其发病机制中的作用;2、从Hippo信号通路角度出发探索红花黄色素及TGF-β1抑制剂SB431542治疗百草枯肺纤维化的分子机制,为药物的临床使用提供理论基础。
  方法:
  选取成年(6周)雄性Wister大鼠255只,随机分为6组,其中空白对照组、SY对照组及SB对照组各35只,染毒组、SY干预组及SB干预组各50只。染毒组、SY干预组及SB干预组以50mg/kg给予体积分数为20%的百草枯原液加生理盐水稀释至1ml灌胃;空白对照组、SY对照组及SB对照组与其等量生理盐水灌胃。SY干预组给予红花黄色素50mg/kg,SB干预组给予SB431542100μg/kg,每日腹腔注射,其余各组给予等量生理盐水每日腹腔注射,连续给药四周。各实验组于实验开始后3、7、14、21、28天各处死6只大鼠。留取大鼠血液ELISA法检测血清TGF-β1浓度。留取大鼠肺组织分别使用荧光实时定量PCR检测肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF mRNA的表达;免疫荧光检测肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白的表达及定位;Western-blotting检测肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白的表达。留取大鼠肺组织病理切片行HE及Masson染色后,光学显微镜下观察组织病理改变,并进行病理学评分。留取大鼠肺组织透射电镜观察组织超微结构的变化情况。计算各实验组不同时间点生存率,用Kaplan-Meier方法比较各组生存率。
  结果:
  1.血清TGF-β1水平
  染毒组大鼠血清TGF-β1浓度自3天开始进行性升高,14天达到高峰,其后缓慢下降,28天仍高于对照组。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但TGF-β1升高程度较染毒组低,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组TGF-β1浓度变化无统计学差异(p>0.05)。
  2.肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白表达情况
  (1)MST染毒组MST的表达3天开始下降,7天下降到最低值,其后缓慢升高,至28天仍低于对照组。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但其下降幅度要低于染毒组,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组MST的表达各组间及时间点无明显变化(p>0.05)。MST蛋白主要表达定位于肺组织细胞胞浆中,仅在处于最强表达时细胞核中出现极少量表达。
  (2)TGF-β1和Smad3染毒组TGF-β1和Smad3的表达3天开始进行性升高,14天达到高峰,其后缓慢下降,28天仍处于较高水平。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但其升高程度较染毒组低,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组TGF-β1和Smad3的表达各组间及时间点无明显变化(p>0.05)。TGF-β1蛋白表达定位于肺组织细胞胞浆中; Smad3在各对照组主要表达定位于肺组织细胞胞浆中,染毒后Smad3表达部位由胞浆转移至胞核。
  (3) Yap和CTGF染毒组Yap和CTGF的表达自3天起进行性升高,28天达到最高峰。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但其升高程度较染毒组低,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组Yap和CTGF的表达各组间及时间点无明显变化(p>0.05)。Yap在各对照组主要表达定位于肺组织细胞胞浆中,染毒后Yap表达部位由胞浆转移至胞核;CTGF蛋白表达定位于肺组织细胞胞浆中。
  3.病理学变化
  (1)光镜观察空白对照组、SY对照组及SB对照组各时间点肺组织结构清晰完整,未见明显异常。染毒组早期表现为急性肺泡炎,肺组织充血水肿,炎性细胞浸润,基本无纤维化表现。随时间炎症表现逐渐加重,14天达到高峰,并开始出现纤维化表现。21至28天肺组织炎症表现逐渐减轻,但纤维化持续进展加重。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同病理学变化趋势,但炎症及纤维化表现较染毒组减轻。
  (2)病理学评分空白对照组、SY对照组及SB对照组各时间点肺组织病理学评分无统计学差异(p>0.05)。染毒组、SY干预组及SB干预组各时间点肺组织病理学评分均明显高于空白对照组(p<0.05)。染毒组各时间点肺组织病理学评分高于SY干预组及SB干预组(p<0.05)。
  (3)电镜观察空白对照组、SY对照组及SB对照组各时间点肺组织超微结构基本正常,未见明显损伤。染毒组早期表现为Ⅰ、Ⅱ肺泡上皮细胞变性,线粒体肿胀,染色质边集等细胞损伤表现,晚期出现成纤维细胞增殖及胶原纤维过度增生等纤维化表现。SY干预组和SB干预组各时间点与染毒组有类似超微结构改变,但细胞损伤及组织纤维化程度较轻。
  4.各实验组生存率比较
  空白对照组、SY对照组及SB对照组大鼠生存率无统计学差异(p>0.05)。空白对照组大鼠生存率明显高于染毒组、SY干预组及SB干预组(p<0.05)。SY干预组及SB干预组大鼠生存率高于染毒组(p<0.05)。
  结论:
  1.急性百草枯中毒时Hippo信号通路可通过MST-Yap途径被激活,并通过参与TGF-β1/Smad信号通路对CTGF表达调控促进大鼠肺纤维化的发生。
  2.红花黄色素及TGF-β1抑制剂SB431542能通过干预Hippo信号通路部分减轻急性百草枯中毒大鼠肺纤维化程度。
  3.急性百草枯中毒时,机体可能还存在不依赖于TGF-β1信号通路的其他途径参与大鼠肺纤维化的发生。
[博士论文] 赵志勇
中西医结合临床 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:导师马玉琛教授研读《内经》、《伤寒论》、《金匮要略》、《脾胃论》、《老子》等古代经典著作,提出“痰毒合生顽痹”、“无毒不足治痹”,“气为生长之主”,“阳为火热之源”,“病为三维之体”,“道为医养之宗”等学术思想。依此为主导,总结出“中医三维辨证施治”诊疗体系,和“痰毒并治”、“扶正重阳”、“祛邪护阳”等治法,用以治疗内科、尤其风湿、消化系统常见和一些难治性疾病,及其并发症等,取得了良好效果。本课题秉承马玉琛教授以上观点,总结出系统性红斑狼疮类似于阴阳毒,又属于痹病。临床治疗系统性红斑狼疮时,在升麻鳖甲汤的基础上,根据痹病的病性、病位临证加减,进行中医药治疗,并进行了前瞻性临床对照研究。
  目的:评价升麻鳖甲加减方治疗系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus SLE)的临床疗效,探明该方药治疗本病的作用特点。
  方法:本研究为随机对照试验,纳入94例SLE患者,随机分为治疗组和对照组,两组均给予激素及硫酸羟氯喹口服,治疗组在此基础上加用中药治疗,疗程12周。分别在治疗4周、治疗12周采用系统性红斑狼疮病情活动性指数(SLEDAI)标准及中医证候疗效评价标准,观察治疗前后患者系统性红斑狼疮病情活动指数(SLEDAI)、激素积分、中医证候积分、实验室等指标进行疗效评价。
  结果:两组患者治疗12周后综合疗效,治疗组总有效率为90.9%,对照组总有效率为81.3%,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者分别治疗4周、12周后,SLEDIA积分、中医证候积分均出现明显差异,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗12周后治疗组中医证候疗效为90.9%,对照组为74.4%,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者在治疗8周、12周后激素积分开始出现明显差异,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组和对照组患者治疗12周后各实验室指标较治疗前均有明显差异,差异有明显统计学意义(P<0.01);两组患者经治疗后除WBC、ESR、CRP治疗组各指标改善均优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组治疗后治疗组不良反应发生比例低于对照组。
  结论:在升麻鳖甲方的基础上,按痹病对SLE进行中医药治疗,可以有效缓解SLE患者临床症状,疗效确切,适合临床应用。
[硕士论文] 余昕
中西医结合基础 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种具有多种临床表现的人类自身免疫性疾病。在大多数情况下,涉及的重要器官包括脑,心脏,关节,皮肤和肾脏。SLE的发病机制复杂,现有研究表明免疫功能紊乱是其发病的主要原因之一。人参是一味传统中药,具有补气固脱,健脾益肺,宁心益智,养血生津的作用,人参皂甙(Ginsenoside,GS)作为人参根中提取的主要活性成分,现代药理已证实GS具有增强免疫的作用,故GS对自身免疫已经过度活跃者是否会加重病情,GS能否用于自身免疫性疾病的治疗,一直是医学界争论的焦点。在我单位的前期研究中,采用随机对照双盲的前瞻性临床试验证实:GS可以增强强的松治疗SLE的总有效率,更迅速地缓解SLE的病情活动、降低系统性红斑狼疮病情活动度(SLEDAI)评分,有利于激素的顺利撤减。为了进一步研究人参皂甙对SLE患者的免疫系统作用,设计了本实验。在本研究中,选择前期研究较充分、中药人参中含量较高的四种人参皂苷单体:人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1),人参皂苷Rh1(Ginsenoside Rh1),人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)和人参皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3),探讨其对SLE的体液免疫调节的影响和作用机制。
  研究目的:
  通过体外实验研究GS单体对SLE体液免疫调节的影响,探讨GS对B细胞增殖、凋亡及其对B细胞分泌的IgG和IgM的调控作用,以及对B细胞相关因子及其亚群分布的影响。
  研究方法:
  1.人外周血单核细胞悬液制备:取健康成人外周血全血细胞,经离心分层,用移液器取淋巴细胞层,再用PBS清洗三次,加入1mL的RMPI-1640培养基重悬细胞,以获得单核细胞悬液(PBMC)。
  2.CD19+B细胞分选:利用CD19磁珠抗体标记PBMC,将标记后的PBMC置于分选柱(LS柱)中,再将LS柱置于分选器的磁场中,将细胞悬液过柱并收集被标记细胞。
  3.细胞培养:筛选出的CD19+B细胞加入采用含10%的胎牛血清,1%双抗液(青链霉素混合液)的RPMI-1640培养液,置于37℃,5%CO2的培养箱中进行培养。
  4.BrdU法检测不同浓度(0.1、1、10mg/L)Rb1,Rh1,Rg1,Rg3+1μg/ml LPS干预对B细胞增殖的影响,并同LPS刺激培养下的B细胞进行比较。
  5.ELISA法检测不同浓度(0.1、1、10mg/L)Rb1,Rh1,Rg1,Rg3+1μg/ml LPS干预对B细胞分泌IgG和IgM的影响,并同在LPS刺激培养下的B细胞的IgG与IgM分泌量进行比较。
  6.Western-Blot法检测在10mg/L的Rb1,Rh1,Rg1,Rg3+1μg/ml LPS干预对B细胞凋亡相关因子Fas/FasL和caspase-3的表达,并同LPS刺激培养下的B细胞进行比较。
  7.RT-PCR法检测在10mg/L的Rb1,Rh1,Rg1,Rg3+1μg/ml LPS干预下B细胞相关因子的基因BAFF及BLyS及其受体及β2M的表达。
  8.流式细胞术检测在10mg/L的Rb1,Rh1,Rg1,Rg3+1μg/ml LPS干预下B细胞亚群CD19+CD27+CD32+的比例。
  研究结果:
  1.经过磁性分离分选后的CD19+B细胞纯度与分选前(17.3%)相比较大提升,为98.4%(P<0.05)。
  2.BrdU法结果显示,与空白组相比,LPS组B细胞增殖率升高(P<0.05);与LPS组相比,四种人参皂苷单体均具有抑制B细胞增殖的作用(P<0.05),并且抑制作用呈剂量依赖性。
  3.ELISA法结果显示,与空白组相比,B细胞分泌IgG和IgM增加(P<0.05);与LPS组相比,四种人参皂苷单体均具有抑制B细胞分泌IgG和IgM的作用(P<0.05),并且抑制作用呈剂量依赖性。
  4.Western-Blot法结果显示,与空白组相比,LPS组的B细胞相关凋亡蛋白Fas/FasL和凋亡激活蛋白caspase-3的表达降低;与LPS组相比,四种人参皂苷单体均能够增加Fas/FasL和caspase-3的表达。
  5.RT-PCR法结果显示,与空白组相比,LPS组的B淋巴细胞刺激因子(BLyS)及其受体BCMA,TACI和B细胞激活因子(BAFF)及其受体BAFF-R和β2-微球蛋白(β2M)的mRNA表达水平均上调(P<0.05);与LPS组相比,四种人参皂苷单体均能够下调BLyS及BAFF及其受体及β2M的mRNA表达水平(P<0.05)。
  6.流式细胞术结果显示,LPS组CD27+B细胞的比例增加(P<0.05),CD19+B细胞的比例减少(P<0.05),FcγRIIB(CD32)的表达水平降低(P<0.05);与LPS组相比,Rb1,Rh1和Rg3均能够增加CD19+B细胞的比例(P<0.05),降低CD27+B细胞的比例(P<0.05),并且能增加FcγRIIB的表达水平(P<0.05)。
  研究结论:
  四种人参皂苷单体可以通过抑制B细胞增殖,减少B细胞分泌物IgG和IgM的分泌,提升B细胞凋亡相关蛋白和抑制B细胞相关因子的表达,以及调控B细胞亚群分布来下调LPS诱导下的系统性红斑狼疮模型的体液免疫,其中Rh1抑制体液免疫的效果最为明显。
[博士论文] 刘欣
内科学(风湿免疫学) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病,以侵蚀性关节炎为特征,最终导致关节畸形而致残。全球大约有1%的人群受类风湿关节炎疾病的困扰,其中女性发病率远高于男性。尽管各类固有免疫和适应性免疫细胞共同参与类风湿关节炎的致病机制,但是从人类和动物的各项研究中可以发现CD4+T细胞是RA治病机制的核心部分。
  表观遗传学是调节细胞生理机制的一个新的研究领域。microRNAs(miRNAs)作为一种表观遗传的修饰,参与了细胞增殖、凋亡、分化,能量代谢及免疫调节等一系列重要的生理及病理过程,在多种疾病的发病机制中扮演重要角色。miRNAs是一类内源性,长21-25个核苷酸序列的非编码RNA,能够引发mRNA裂解和抑制其转录翻译,从而进行转录后调控。
  miR-181a是一类调控T细胞敏感性的关键分子。miR-181a通过T细胞的抗原受体可以影响成熟T细胞的活化阈值。Goronzy教授通过研究发现,年龄是影响miR-181a表达的一个重要因素,随着年龄的增加,miR-181a的表达减少,使得TCR信号受刺激后,影响初始的ERK信号传导,抑制T细胞活化。最近一项体外实验表明miR-181a是调节炎症反应的关键因子,在炎症刺激下表达明显增多。在类风湿关节炎患者的各类细胞中都有异常表达的miRNAs,可参与调控类风湿关节炎致病机制的特定通路。然而miR-181a在类风湿关节炎中的表达趋势以及在疾病中的作用机制仍不清楚。
  本课题首先评估类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞及其亚群的T细胞过度活化的表型;然后,进一步鉴定调控T细胞过度活化的miRNA与其靶基因的作用机制;最后通过体外实验研究miR-181a调控T细胞活化的治病机制。这些研究可以揭示类风湿关节炎T细胞过度活化的新的分子机制,为寻求治疗类风湿关节炎提供思路。
  第一章 类风湿关节炎患者外周血中CD4+T细胞及其亚群的功能研究
  目的:
  研究类风湿关节炎患者CD4+T细胞及其亚群的活化功能。
  方法:
  1.密度梯度离心法分离33例RA和28例健康对照的外周血单个核细胞,MACS磁珠分选出CD4+T细胞。
  2.流式细胞术检测钙内流情况。
  3.表面染色检测表面活化标志物CD25和D69的表达。
  4.BD Phosflow检测LCK、ZAP70和ERK蛋白磷酸化水平。
  结果:
  1.同健康对照组相比,RA患者的CD4+T细胞和na(i)ve CD4+T细胞中均观察到明显升高的钙离子内流,分别P<0.001,P<0.01;同时发现钙离子内流的水平与疾病活动度密切相关,但与年龄无关;在记忆性CD4+T细胞中两组之间钙流水平无统计学差异。
  2.RA患者的CD4+T细胞及其亚群的CD25和CD69的表达均明显高于健康对照组。
  3.RA患者的CD4+T细胞和na(i)ve CD4+T细胞的LCK、ZAP70和ERK蛋白磷酸化水平均高于健康对照组;在记忆性CD4+T细胞中,除了LCK,ZAP70和ERK的表达无统计学差异。
  结论:
  类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞的钙离子内流水平明显升高,与疾病活动度紧密相关。CD4+T细胞的TCR信号通路处于过度活化状态,如CD25和CD69的高表达,ERK、ZAP70、LCK磷酸化水平的增高。同时类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞具有很强的钙离子信号和ZAP70、ERK的磷酸化水平明显增高,而在记忆性CD4+T细胞中未出现明显的差异表达,说明na(i)ve CD4+T细胞在T细胞活化中起到更为重要作用,所以在接下来的实验中将na(i)ve CD4+T细胞作为研究对象。
  第二章 类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞miR-181a表达及其下游调控关系的建立
  目的:
  分析调控类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞过度活化的miRNA表达,确定miR-181a/DUSP6调控关系的建立。
  方法:
  1.密度梯度离心法分离18例RA和18例健康对照外周血单个核细胞,MACS磁珠分选出na(i)ve CD4+T细胞。
  2.提取na(i)ve CD4+T细胞中的总RNA和总蛋白。
  3.Real-time PCR检测miR-181a表达及DUSP6和PTPN22mRNA表达水平。
  4.Western Blot检测DUSP6蛋白表达水平。
  5.miR-181a mimic和inhibitor及其相应的阴性对照转染类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞48h后,通过Real-time PCR和Western Blot验证DUSP6mRNA和蛋白水平的表达。
  6.双荧光素酶报告基因验证DUSP6是miR-181a的靶基因。
  结果:
  1.根据Targetscan数据库,初步考虑miR-181a是非常适合研究且可行性很高的调控DUSP6和PTPN22表达,进而控制T细胞活化通路的miRNA。
  2.与健康对照组相比,类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞miR-181a表达明显多于对照组,P<0.001;与疾病活动度呈正相关,r=0.59,P<0.01。
  3.类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞DUSP6的mRNA表达水平明显降低,P<0.05,但是PTPN22mRNA表达水平在疾病组和对照组间无明显差异。WesternBlot也表明类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞DUSP6蛋白表达也明显少于健康对照组,P<0.05。
  4.与转染miR-181a mimic阴性对照相比,过表达miR-181a能降低DUSP6基因表达,但统计学无差异;显著下调蛋白表达,P<0.001;同转染miR-181a inhibitor阴性对照相比,抑制miR-181a表达使DUSP6mRNA和蛋白水平表达均增多,P<0.01。
  5.通过构建DUSP6的3'UTR荧光素酶报告载体发现,与对照相比,共转miR-181a mimic及含DUSP6的3'UTR荧光素酶报告载体的细胞中荧光素酶的活动显著下降,将结合位点突变后,荧光素酶活性提高,提示miR-181a通过直接结合DUSP6的3'UTR发挥作用。
  结论:
  miR-181a的高表达促进类风湿关节炎疾病的发生发展和miR-181a对DUSP6表达的抑制导致的TCR信号通路过度活化密不可分,说明miR-181a/DUSP6调控关系在类风湿关节炎的发病机制中起到重要作用。
  第三章 miR-181a/DUSP6调控关系对类风湿关节炎na(i)ve CD4+T细胞功能的影响
  目的:
  探索miR-181a/DUSP6调控关系对类风湿关节炎na(i)ve CD4+T细胞功能的影响。
  方法:
  1.密度梯度离心法分离12例活动性RA和12例健康对照的外周血单个核细胞,MACS磁珠分选出na(i)ve CD4+T细胞。
  2.miR-181a inhibitor或阴性对照转染至类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞。
  3.Real-time PCR检测miR-181a表达,检测转染效率。
  4.流式细胞仪检测钙离子内流水平。
  5.流式细胞仪检测细胞因子分泌情况。
  6.流式细胞仪检测na(i)ve CD4+T细胞分化。
  结果:
  1.类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞转染miR-181a inhibitor和阴性对照,48小时后收细胞,提取细胞总RNA,进行RT-PCR,评估转染效率,结果发现miR-181a表达下降,转染成功,进行下面实验。
  2.与转染miR-181a inhibitor阴性对照相比,抑制miR-181a表达能明显减少钙离子内流。
  3.同健康对照组相比,类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞中IL1α,IL6,TNF-α和IFN-γ表达明显高于健康对照组,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05。但在IL-2和IL-10的表达上,两组之间均无明显统计学差异。同转染miR-181a inhibitor阴性对照相比,下调miR-181a表达能明显减少IL1α,IL6和TNF-α的表达,分别P<0.01,P<0.05,P<0.01,对IFN-γ的表达无明显影响。
  4.与转染miR-181a inhibitor阴性对照相比,抑制miR-181a表达能阻止类风湿关节炎患者na(i)ve CD4+T细胞向Th1细胞分化,P<0.01,促进了向Th2细胞分化,但无统计学差异。
  结论:
  在类风湿关节炎na(i)ve CD4+T细胞中,抑制miR-181a表达导致DUSP6的表达上调,从而抑制ERK信号通路,进而使钙离子内流减少,影响T细胞活化,促炎因子分泌减少,抑制自身免疫反应。这些研究揭示了类风湿关节炎T细胞过度活化的新的分子机制,为寻求治疗类风湿关节炎提供思路。
[硕士论文] 孙政
内科学(内分泌与代谢病) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  甲状腺相关性眼病(Thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是一种与甲状腺相关的器官自身免疫性疾病,以眼睑的挛缩、眼框内脂肪组织增生、眼外肌增粗、视神经压迫为特征性表现。TAO患者的眼眶局部症状严重影响患者的生活,同时更有导致失明的风险。根据2016年EUGOGO指南,推荐静脉注射甲基强的松龙(intravenous methylprednisolone,IVMP)作为中重度活动性TAO患者的一线治疗方案。大量临床实践证实IVMP治疗具有良好的疗效,但在临床工作中对于糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)累积剂量的选择仍存在争议;另外IVMP治疗过程中引起的不良反应备受关注,其中以肝功能损伤、糖代谢紊乱、电解质丢失等较为常见;关于IVMP治疗TAO患者引起的糖代谢紊乱,既往的报道并未涉及血糖与GCs累积剂量之间的关系,同时也未涉及引起血糖升高的机制,GCs引起血糖升高的相关危险因素也鲜有报道。
  本研究将对中重度TAO患者使用IVMP治疗后在不同GCs累积剂量下患者的疗效及产生的不良反应进行探讨,并研究分析TAO患者在不同GCs累积剂量下血糖的水平情况,探讨IVMP治疗后TAO患者血糖升高的可能机制及相关危险因素。
  研究方法:
  利用回顾性研究的方法,对使用IVMP治疗的中重度TAO患者按照GCs累积剂量分成三组:A组56例(GCs累积剂量≦4.5g)、B组47例(4.5g<GCs累积剂量≦7.5g)、C组68例(GCs累积剂量>7.5g);进一步根据GCs累积剂量将C组分成三组:低剂量组(GCs累积剂量≦4.5g,n=68)、中剂量组(4.5g<GCs累积剂量≦7.5g,n=68)、高剂量组(GCs累积剂量>7.5g,n=68)。研究在不同GCs累积剂量下IVMP治疗的疗效并观察不良反应发生情况。依据行OGTT试验的22例病例,分析使用IVMP治疗后TAO患者在不同GCs累积剂量下糖代谢变化,计算胰岛β细胞功能评价指标,胰岛素抵抗评价指标,研究IVMP治疗后血糖升高的可能机制,最后分析引起血糖升高的相关危险因素。
  研究结果:
  (1)IVMP治疗前,A、B、C组三组间比较,年龄、性别、FT3、FT4、TSH、NOSPEC评级、畏光流泪例数、复视例数、异物感例数、TSHR-Ab、TG-Ab、TPO-Ab等无显著差异(P>0.05);CAS评分分别为2.3±1.0、2.7±1.2、2.8±1.0,有显著差异(P<0.05)。
  (2)随GCs累积剂量增加,A、B、C组TAO患者CAS评分下降程度逐次升高(分别为0.2±0.7、1.0±0.8、1.3±0.8),三组间比较有统计学意义(P<0.05);A、B、C组CAS评分下降患者的例数比例分别为19.6%、76.6%、86.8%,三组间比较有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组CAS评分下降程度分别为0.3±0.6、0.7±0.8、1.3±0.8,三组间两两比较有显著差异(P<0.05);低、中、高剂量组CAS评分下降患者的例数比例分别为23.5%、57.4%、86.8%,三组间两两比较有显著差异(P<0.05)。
  (3)随GCs累积剂量增加,A、B、C组患者畏光流泪、异物感、复视症状缓解的例数比例逐次升高,三组间具有显著差异(P<0.05)。低、中、高剂量组畏光流泪、异物感、复视症状缓解的例数比例随GCs累积剂量增加,其中畏光流泪缓解的例数比例高剂量组与低剂量组比较有显著差异(63.2%vs82.3%,P<0.05)。
  (4)随GCs累积剂量增加,A、B、C组双眼外肌总直径减小的程度、双眼外肌总直径减小的患者例数比例逐次升高,但三组间无显著差异(P>0.05)。低、中、高剂量组双眼外肌总直径减小的程度分别为-0.1±5.0、0.6±4.5、0.5±5.1,三组间无显著差异(P>0.05);低、中、高剂量组双眼外肌总直径减小的患者例数比例随GCs累积剂量增加逐次增加(分别为40.4%、51.1%、55.3%),三组间无显著差异(P>0.05)。
  (5)随GCs累积剂量增加,A、B、C组NOSPECS评级下降的程度、NOSPECS下降的患者例数比例逐次升高,但三组间有显著差异(P<0.05)。随GCs累积剂量增加,低、中、高剂量组NOSPECS评级下降的程度分别为0.2±5.0、0.3±0.6、0.4±0.6,三组间两两比较无显著差异(P>0.05);低、中、高剂量组NOSPECS下降的患者例数比例随GCs累积剂量增加逐次增加(分别23.5%、29.4%、32.4%),但三组间两两比较无显著差异(P>0.05)。
  (6)随GCs累积剂量增加,A、B、C组甲状腺相关抗体(TPO-Ab、TG-Ab、TSHR-Ab)由异常转变为正常的患者例数比例逐次升高,其中TSHR-Ab由异常转变为正常的患者例数比例分别为7.3%、12.8%、33.8%。随GCs累积剂量增加,低、中、高组甲状腺相关抗体(TPO-Ab、TG-Ab、TSHR-Ab)由异常转变为正常的患者例数比例逐次升高,其中TSHR-Ab由异常转变为正常的患者例数比例分别为4.4%、19.1%、33.8%。
  (7)171例TAO患者IVMP治疗前,双眼眼外肌总直径与CAS评分显著相关(r=0.330,p<0.05),与NOSPECS评级显著相关(r=0.229,p<0.05),而与TSHR-Ab无显著相关性(r=0.184,p>0.05)。IVMP治疗后,C组双眼外肌总直径下降的程度与CAS评分显著相关(r=0.335,p<0.05)。
  (8)IVMP治疗后,C组AST显著高于A组(23.4±9.1vs19.1±5.6,P<0.05),ALT无明显差异(23.7±16.6vs22.3±12.3,P>0.05);B组AST、ALT与A组比较无显著差异(21.5±7.7vs19.1±5.6,23.8±15.2vs22.3±12.3,P均>0.05);A、B、C组AST、ALT升高均<100U/L,发生肝损的的比例分别为3.6%、8.4%、7.4%。低、中、高剂量组发生肝损的的比例分别为4.4%、5.9%、7.4%。
  (9)IVMP治疗后,A、B、C组发生低钙血症的病例比例分别为16.1%、40.4%、30.9%,其中B组与A组比较低钙血症的病例比例显著增加(40.4%vs16.1%,P<0.05)。低钾血症发病率三组分别为3.6%、10.6%、7.4%,三组间两两比较均无统计学差异(P>0.05)。低、中、高剂量组发生低钙血症的病例比例分别为29.4%、25.0%、30.9%,三组两两比较无显著差异(P>0.05);低、中、高剂量组发生低钾血症的病例比例分别为11.8%、17.6%、7.4%,三组两两比较无显著差异(P>0.05);
  (10)IVMP治疗后,A、B、C组肾功能不全的发病率分别为14.5%、6.4%、2.9%;其中C组与A组比较,肾功能不全发病率明显下降(2.9%vs14.5%,P<0.05)。低、中、高剂量组肾功能不全的发病率分别为1.5%、2.9%、2.9%。
  (11)IVMP治疗后,体重增加大于等于5Kg的例数比例A、B、C组分别为10.7%、8.7%、11.8%,低、中、高剂量组分别为4.4%、4.4%、7.4%。
  (12)IVMP治疗后,A、B、C三组发生高血压例数比例分别为8.9%、4.3%、8.8%,低、中、高剂量三组发生高血压例数比例分别为4.4%、7.4%、8.8%。
  (13)IVMP治疗后,A、B、C三组糖代谢异常发生率分别为5.4%、13.1%、2.9%,低、中、高剂量三组糖代谢异常发生率分别为5.9%、7.3%、2.9%。
  (14)22例行OGTT试验的TAO患者中,6例(27.27%)患者使用IVMP治疗后出现糖调节受损,糖调节受损的发病率与GCs累积剂量无关(r=-0.296,P=0.181)。
  (15)HBG组与NBG组比较,CISI、OGSI降低(P<0.05);HOMA-IR、QUICKI、HOMR-β、IGI、DI、AUCC-P/AUCG无显著差异(P>0.05);DI0、DI120、DI180等指标均显著降低(P<0.05)。
  研究结论:
  (1)IVMP治疗中重度TAO患者,中、高剂量GCs(GCs累积剂量>4.5g)较低剂量GCs(GCs累积剂量≤4.5g)有效,但会增加发生不良反应的风险。(2)高剂量GCs(GCs累积剂量>7.5g)与中剂量GCs(4.5g<GCs累积剂量≤7.5g)比较,不良反应发生率未显著增加,提示对于中剂量GCs难以控制的中重度TAO患者在密切监测不良反应的情况下可以选择高剂量激素治疗。(3)TAO患者使用IVMP治疗后引起血糖的升高的原因主要可能是胰岛β细胞储备功能不足。
[博士论文] 夏振娜
卫生毒理学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  热射病(Heatstroke,HS),是一种由高体温诱导的、由热细胞毒作用、弥漫性血管内凝血和系统性炎症反应共同导致的一种多器官功能障碍性疾病,发病急,累及器官多,目前临床上尚缺乏特异性的防治药物。研究发现,热射病与脓毒症的病理生理机制极其相似,肠道屏障损伤可导致内毒素血症的发生,内毒素入血后可促进炎症因子的产生,介导系统性炎症反应,加重多器官损伤,在疾病进程中发挥重要作用。基于此,肠道被认为是热射病等多种危重症的“发动器官”。
  右美托咪啶(Dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性旺2肾上腺素受体(Alpha2-adrenergic receptor,α2-AR)激动剂,副作用小,具有无呼吸抑制、稳定血流动力学、抑制应激反应等特点,已广泛应用于危重症或围手术期患者的镇静或麻醉等。据报道,DEX在临床应用过程中表现出显著的抗炎和器官保护作用,如降低危重症患者的炎性细胞因子水平,缓解患者的肝脏、肾脏、肺脏和肠道损伤等。诸多研究已表明,DEX对脓毒症有较好的治疗作用,可降低患者的系统性炎症水平,减轻脏器损伤,提高生存率,因此提出了DEX对病理生理机制与脓毒症极其类似的热射病也可能有治疗作用的假设。近期研究发现,DEX可通过α2A-AR调节Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)及其相关信号通路的活化,介导抗炎、抗凋亡等作用,对肠道起保护作用;且有数据显示,DEX的受体α2A-AR亚型在胃肠道高表达。基于此,推测DEX可能通过靶向肠道,减轻肠道屏障损伤,抑制内毒素血症,进而对热射病所致的系统性炎症反应和多器官损伤起保护作用。
  研究目的:
  本课题主要研究DEX对热射病小鼠系统性炎症反应和多器官损伤的保护作用,并基于肠道屏障从以下几个方面研究其保护作用机制:(1)从肠道屏障的通透性、肠上皮细胞间的紧密连接蛋白、肠细胞超微结构等方面研究DEX对肠道屏障功能的影响;(2)从TLR4及其下游的核因子Kappa B(Nuclear FactorκB,NF-κB)通路、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein3,NLRP3)炎症小体和凋亡等角度研究DEX对小鼠肠道的抗炎和抗凋亡作用机制;(3)利用α2A-AR的拮抗剂BRL-44408进行干预,以验证DEX对热射病小鼠的保护作用是否与α2A-AR有关。
  研究方法:
  第一部分热射病小鼠模型的建立
  热射病小鼠模型的建立:利用高温环境模拟舱建立成年雄性C57BL/6小鼠的热射病模型,温度为40±1℃,湿度为55±5%,待小鼠肛温升至42.7℃(公认的热射病发生的标志)时取出,室温恢复。
  分别于热射病发生后2小时、6小时和24小时麻醉解剖小鼠,检测不同处理组的血清肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和IL-1β的水平,以确定最佳取样时间,用于后续研究。
  小鼠经麻醉解剖后,检测肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)和碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP),肾功能指标血清尿素(Bloodurea,BU)和肌酸酐(Creatinine,CREA),并通过检测血浆内毒素水平评价肠道损伤程度。取小鼠的主要器官如肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和肠道(回肠部分)等进行组织病理学检查,评价热射病小鼠的主要脏器损伤情况。
  第二部分右美托咪啶对热射病小鼠的保护作用研究
  DEX对热射病小鼠保护作用的量效关系研究:根据文献资料和预实验,分别设5μg/kg、10μg/kg和25μg/kg三个剂量组,根据体表面积进行等效剂量换算,分别相当于临床人用剂量的约0.5倍、1倍和2.5倍。以热射病发生后的炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β为检测指标,以确定最佳剂量水平,用于后续研究。
  DEX对热射病小鼠多脏器损伤的保护作用研究:检测肝功能指标、肾功能指标和肠道损伤指标;并对小鼠的主要脏器做病理组织学检查。
  DEX对热射病小鼠肠道屏障的保护作用研究:通过FD4实验和D-乳酸水平的检测评价小鼠肠道的通透性。并通过Western-blot(WB)和免疫组织化学手段分析肠道组织的紧密连接蛋白occludin和闭锁小带蛋白(Zonula occludens1,ZO-1)的表达。最后,利用电镜检查技术对小鼠肠道细胞的超微结构进行检查。
  第三部分右美托咪啶对热射病小鼠肠道的保护机制研究
  肠道TLR4相关炎症信号通路的研究:首先,WB检测小鼠肠道组织的α2A-AR和TLR4蛋白表达水平。其次,对NF-κB信号通路相关蛋白p65亚基、磷酸化κB抑制因子α(Inhibitor ofκBα,IκBα)、磷酸化p65的表达水平进行检测;并通过免疫荧光实验观察NF-κB p65的细胞核转移情况。然后,WB检测肠道组织的NLRP3、接头蛋白ASC和caspase-1的活化成分p10的表达水平;并用免疫荧光技术分析NLRP3与IL-1β的表达情况。最后用qPCR手段检测小鼠肠道炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平。
  肠道细胞凋亡水平的检查:通过WB手段分析肠道凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平;通过TUNEL免疫荧光实验分析肠道细胞的凋亡水平。
  最后,给予α2A-AR拮抗剂BRL-44408干预,分别检测肠道α2A-AR和TLR4的蛋白表达水平;肠道和血清的炎症因子水平;并对小鼠的主要脏器做病理组织学检查。
  研究结果:
  一、热射病小鼠模型的建立
  肛温变化趋势:将10只小鼠置于温度为40±1℃、湿度为55±5%的环境中处理218.0±19.9分钟后,小鼠肛温可达到42.7℃(热射病发生的指标),伴随出现躁动、皮毛潮湿、唾液分泌增加等症状,部分小鼠出现抽搐、精神萎靡甚至浅昏迷等症状。移出高温舱后,小鼠的肛温迅速降低,80min~180min内降至30.5±0.9℃,之后缓慢上升,约6小时后,肛温升至36.9±0.8℃,小鼠状态基本恢复至对照组小鼠(n=5)的水平。
  血清炎症因子检测:热射病发生后2小时,小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高不明显;热射病发生后6小时,小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高明显,与对照组有统计学差异(n=8,P<0.05);热射病发生后24小时,小鼠血清炎症因子水平基本回落至对照组的水平。因此,后续均以热射病发生后6小时为取样时间点进行实验。
  多器官损伤的检查:热射病小鼠肝脏主要表现为肝细胞肿胀、透明或水样变性,伴随肝功能指标ALT、AST和ALP的明显升高;肾脏的皮质区域出现典型的透明管型变性,伴随肾功能指标BU和CREA的明显升高;肺脏则出现明显的间质充血或血栓,偶见肺泡充血;脾脏的白髓区域出现明显的巨噬细胞吞噬的细胞碎片形成的“星空现象”;肠道表现为明显的中央乳糜管膨胀,固有粘膜层结构紊乱,伴随血浆内毒素水平的升高(n=8)。
  经过多次重复实验,发现在本实验条件下,小鼠发生热射病及其恢复过程中的温度变化曲线比较稳定,且热射病发生后6小时,小鼠的血清炎症因子水平升高明显,伴随出现肝脏、肾脏、脾脏、肺脏和肠道等多个器官的病理损伤,提示热射病小鼠模型建立成功。
  二、右美托咪啶对热射病小鼠的保护作用研究
  DEX的抗炎作用:DEX(5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg)可剂量依赖地降低热射病小鼠的血清TNF-α和IL-6、IL-1β水平,且以25μg/kg剂量水平时的抗炎效果最为显著,与HS组相比均有统计学差异(n=8,P<0.05),因此,后续均以此剂量进行研究。
  DEX的多器官保护作用:25μg/kg的DEX可降低热射病小鼠的血清ALT、AST和ALP水平(n=6~8,P<0.05或0.01),并缓解其肝细胞肿胀、透明或水样变性等病理改变;DEX小鼠的血清BU和CREA水平低于HS组(P<0.05或0.01),其肾脏皮质区域的透明管型变性被改善;DEX对热射病小鼠肺脏间质充血或血栓、脾脏巨噬细胞吞噬细胞碎片形成的“星空现象”等均有明显的缓解作用;DEX还可减轻热射病小鼠肠道的中央乳糜管膨胀,固有粘膜层结构紊乱等病理改变,并降低血浆内毒素水平。
  DEX抑制肠道通透性的增加:FD4实验结果显示,DEX降低了热射病小鼠的血浆FD4水平,与HS组有统计学差异。同时,对肠道屏障功能的另一标志物D-乳酸进行检测,发现DEX可以显著降低热射病小鼠血浆D-乳酸水平的升高(n=8,P<0.05)。
  DEX提高肠道紧密连接蛋白的表达:DEX处理组小鼠肠道的紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达水平高于HS小鼠(n=6~8,P<0.05)。
  DEX保护肠道细胞超微结构:热射病小鼠的回肠组织出现如下症状:肠道上皮细胞的微绒毛变短、脱落或被破坏;肠道上皮细胞间的紧密连接变得松散、空泡化或裂开,导致细胞间出现不规则的间隙;细胞线粒体内部出现肿胀、空泡化等特征,线粒体嵴模糊不清,线粒体外膜膨胀。DEX处理组小鼠除了呈现轻微的线粒体肿胀和空泡化等特征外,其微绒毛、紧密连接等结构基本恢复至对照组小鼠的水平。
  以上结果表明,DEX可通过提高肠道紧密连接蛋白的表达、维持肠道细胞超微结构的完整性,减轻热射病小鼠的肠道屏障损伤,因此本课题重点基于肠道屏障研究DEX对热射病小鼠的保护作用机制。
  三、右美托咪啶对热射病小鼠肠道的保护机制研究
  DEX对肠道α2A-AR和TLR4表达水平的影响:DEX可提高热射病小鼠肠道的α2A-AR表达水平,下调TLR4的表达水平(n=6~8,P<0.05或P<0.001)。
  DEX抑制NF-κB信号通路:各组小鼠肠道的NF-κB p65的表达水平未发生明显改变,而DEX降低了磷酸化IκBα和磷酸化NF-κB p65的水平,与HS组比有统计学差异(n=6~8)。免疫荧光结果显示,DEX降低了热射病小鼠的NF-κB p65的核转移水平。
  DEX抑制NLRP3炎症小体信号通路:DEX明显降低了热射病小鼠肠道的NLRP3、ASC和caspase-1p10表达水平,与HS组比有统计学差异;且DEX降低了热射病小鼠肠道的NLRP3与IL-1β的荧光水平(n=6~8)。
  DEX降低肠道炎症因子水平:DEX可降低小鼠肠道TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平,与HS组相比均有统计学差异(n=6~8)。
  DEX抑制肠道细胞凋亡:DEX提高了抗凋亡蛋白Bax的表达,下调了促凋亡蛋白Bcl-2的表达;同时,DEX明显降低了热射病小鼠肠道的TUNEL阳性细胞的比例(n=6~8)。
  DEX的作用与α2A-AR有关:α2A-AR拮抗剂BRL-44408可部分逆转DEX对热射病小鼠肠道α2A-AR和TLR4表达水平的影响,上调肠道组织局部和血清中的炎症因子水平,并部分抵消DEX对热射病小鼠多器官病理组织损伤的保护作用(n=6~8)。
  以上结果显示,DEX对热射病小鼠发挥肠道保护作用的机制有两个方面:一方面,降低肠道TLR4的表达,下调其下游的NF-κB和NLRP3信号的活化,进而降低热射病小鼠肠道局部的炎症反应水平;另一方面,DEX以一种Bax/Bcl-2依赖的方式下调了热射病小鼠的肠道细胞凋亡水平。另外,DEX对热射病小鼠的作用与α2A-AR有关。
  研究结论:
  1、在温度为40±1℃、湿度为55±5%的条件下可成功诱导成年雄性C57BL/6小鼠的热射病模型,其肛温可达42.7℃。热射病发生后6小时,小鼠出现明显的系统性炎症反应,伴随出现肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和肠道等多器官损伤。
  2、DEX可减轻热射病小鼠的系统性炎症反应和多器官损伤。
  3、DEX可提高热射病小鼠肠道的紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达,维持其超微结构的完整性,保护其屏障功能,从而下调血浆内毒素水平。
  4、DEX对热射病小鼠发挥肠道保护作用的机制:DEX可上调肠道α2A-AR的表达,降低TLR4的表达,从而下调TLR4下游的NF-κB和NLRP3炎症小体信号通路的活化水平,抑制热射病小鼠肠道的炎症反应;同时,DEX可下调热射病小鼠肠道细胞的凋亡水平,且该作用与其对Bax和Bcl-2的调节作用有关。
[硕士论文] 张宏伟
营养与食品卫生学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  当人体暴露于异常加速度环境,会出现眩晕、头痛、出冷汗、恶心、呕吐、持续性疲劳等症状,统称为晕动症或晕动病(motion sickness)。其主要包括晕船、晕机、晕车以及视觉诱发的晕动症。虽然晕动症的发生机制至今没有完全阐明,但已有证据表明,机体暴露于异常加速度环境所引起的应激反应、植物神经系统功能异常是促使晕动病发生发展的重要原因。不少研究证实,现有的多种抗晕动症药物,如东莨菪碱等,可以缓解恶心、呕吐等晕动症的主要症状,但对植物神经系统功能异常以及持续性疲劳没有缓解作用。已知,疲劳是影响作业能力的主要和直接原因,疲劳引起的作业能力下降往往与安全事故发生有直接的联系。因此,阐明加速度暴露引发疲劳的特点及其机制,研制加速度暴露人员作业能力维护措施是航海医学,尤其是军事航海医学领域研究者关注的重点。
  近年来的研究证实,代谢组学是一种帮助分析各种原因引起的机体代谢产物变化的有效工具。通过检测、分析血液代谢产物的变化可以为人们了解多种疾病发病机制及其防治措施研究提供的线索。综上所述,认为,有必要进行加速度暴露后机体代谢产物变化的检测,分析加速度暴露致脑体功能变化可能的原因,为加速度暴露人员作业能力维护措施研制提供线索。
  目的:
  本实验在调查分析加速度暴露人员疲劳特点的基础上,采用代谢组学方法,了解加速度暴引发疲劳的可能原因,并在此基础上通过动物实验观察血清丙酮酸升高在脑体功能下降中的作用及其可能机制,为加速度暴露人员作业能力维护措施研制提供线索。
  方法:
  一、人群试验
  (一)舰员晕船和疲劳关系调查
  1.舰员疲劳状态调查
  采用日本产业卫生学会疲劳研究会的《疲劳自觉症状调查表》对舰员六级海况暴露4h后的疲劳状况及其特点进行调查、分析。
  2.舰员晕船程度评价
  采用Graybiel《晕船程度评价量表》调查舰员晕船严重程度。
  (二)加速度暴露对受试者血清代谢产物和激素水平影响
  1.加速度暴露前后血清代谢产物检测
  通过GC-TOF/MS分析加速度暴露前后受试者血清代谢产物含量的变化。
  2.加速度暴露前后血清激素含量检测
  通过放免法检测血清胰岛素、胰高血糖素和糖皮质激素含量。ELISA法检测血清肾上腺素含量。
  二、动物实验
  (一)加速度暴露装置与方法
  雄性SD大鼠(250-300g)。据体重随机分为对照组和加速度暴露组。于每日18:00-21:00将实验组大鼠放入按Crampton等报道仿制的加速度暴露装置内,加速度暴露2小时。
  (二)晕反应指数评分标准
  晕反应指数评分标准:计数粪便颗粒数,每粒粪便计1分;有排尿则计为1.2分否则不得分;若有轻度立毛反应计为0.6分,重度计为1.2分,否则不得分;有震颤反应计1.2分否则不得分。晕反应指数为各项得分的总和。
  (三)大鼠脑体功能指标相关指标检测
  1.旷场实验(OPT)
  通过旷场实验检大鼠运动总距离(cm)来评价大鼠脑体功能。
  2.Morris水迷宫实验(MWM)
  通过Morris水迷宫检测大鼠的找平台时间(s),来评价大鼠的认知功能。
  3.负重游泳实验(LST)
  通过负重游泳实中大鼠游泳至力竭时间(min),来评价大鼠的体力功能。
  大鼠行为学实验检测时间都在每天的19:00-22:00
  (四)血清激素,血糖,丙酮酸和β-羟基丁酸含量的检测
  大鼠血清胰岛素、胰高血糖素和皮质醇含量的检测使用放射免疫法。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠血清肾上腺素、去甲肾上素及血清β-羟基丁酸含量。使用罗氏血糖仪测血糖。通过试剂盒检测血清丙酮酸含量。
  (五)海马、前额皮层、肝脏和肌肉中ATP含量和PDH活性检测
  通过试剂盒检测大鼠组织中ATP含量和PDH活性。
  (六)统计方法
  作图和统计分析均使用GraphPad Prism6.0.2。实验数据用((X)±SEM)表示,统计方法使用两独立样本t-检验和one-way ANVOA(LSD)。相关性分析采用spearman相关分析。检验水准为α=0.05。
  结果:
  一、人群试验
  (一)航海作业人员晕船后疲劳特点分析
  六级海况暴露4小时,60.9%乘员发生晕动症,94.3%乘员发生疲劳。进一步分析不同程度体力疲劳和精神疲劳所占百分比:体力疲劳0分占10.3%,1-13分占58.6%,13-26分占20.7%,26-39分占10.4%,而精神疲劳0分占14.9%,1-13分占52.9%,13-26分占20.7%,26-39分占11.5%。表明,异常加速度暴露后,疲劳的发生率大于晕船的发生率,并具有脑体疲劳并存的特点。
  (二)加速度暴露对受试者血清代谢产物的影响
  加速度暴露后60名受试者血清发生明显变化的代谢产物共有35种,其中变化1-2倍的29种,变化两倍以上的有6种,而丙酮酸浓度变化幅度最大,与暴露前比血清丙酮酸含量升高4倍。
  (三)加速度暴露对受试者血清激素浓度的影响
  加速度暴露后60名受试者血清胰岛素含量平均下降28.8%,肾上腺素、胰高血糖素和糖皮质激素含量分别平均升高50.2%,15.3%和37.8%。
  二、动物实验
  (一)加速度暴露对大鼠脑体功能相关指标影响
  加速度暴露后,大鼠旷场活动总距离缩短38.1%,水迷宫找到平台时间延长88.3%,负重游泳致力竭时间下降21.2%。
  (二)加速度暴露对大鼠血清代谢产物及其相关激素含量的影响
  加速度暴露后大鼠血清有25种代谢产物含量发生变化,与人群检测结果一样,血清丙酮酸浓度升高幅度最大,上升了3.2倍。加速度暴露后大鼠血清胰岛素含量下降33.7%,而胰高血糖素、皮质醇、肾上腺素和去甲肾上腺含量分别升高34.3%、190.6%、113.4%和28.9%。
  (三)丙酮酸升高在加速度暴露脑体功能相关指标变化中的作用探讨
  1.腹腔注射丙酮酸后大鼠脑体功能相关指标明显变化
  注射丙酮酸导致大鼠血清丙酮酸浓度升高3.9倍,其出现明显的脑体功能指标变化。其中,旷场活动总距离缩短79.2%、Morris水迷宫找平台时间延长113.7%和负重游泳时间下降23.0%。
  2.外源性胰岛素抑制加速度暴露血清丙酮酸升高并明显缓解大鼠脑体功能相关指标的变化幅度
  与单纯暴露组相比,暴露前给予胰岛素组大鼠加速度暴露后体内胰岛素浓度升高343%,血清丙酮酸浓度下降29.5%,旷场活动总距离增加49.2%,Morris水迷宫找平台时间缩短46.6%,负重游泳时间延长11.2%。
  3.内源性胰岛素分泌增加抑制加速度暴露大鼠血清丙酮酸升高并明显缓解脑体功能相关指标的变化幅度
  与单纯加速度暴露组,暴露前灌胃CPL(葡萄糖、麦芽糖、酪氨酸、亮氨酸)组大鼠加速度暴露后血清胰岛素水平增加241.3%。CPL组大鼠加速度暴露后血清丙酮酸含量下降87.2%,旷场活动总距离延长69.7%,水迷宫找平台时间下降47.0%,负重游泳时间延长22.0%。暴露前灌胃东莨菪碱组大鼠的上述指标与单纯加速度暴露组相比没有显著差异。
  (四)加速度暴露血清丙酮酸浓度升高影响脑体功能的机制探讨
  1.各种干预措施组与单纯加速度暴露组大鼠加速度暴露后血清丙酮酸及海马、前额皮层、肌肉和肝脏组织ATP浓度和PDH酶活性比较
  与对照组比,单纯加速度暴露后大鼠血清丙酮酸明显升高,同时海马、前额皮层、肌肉和肝脏组织中PDH酶活性和ATP浓度分别下降33.8%和56.0%、25.0%和48.5%、31.6%和41.2%、38.6%和48.3%。而与单纯加速度暴露组比,胰岛素组和灌胃CPL组大鼠血清丙酮酸水平明显降低,同时海马、前额皮层、肌肉和肝脏组织中PDH酶活性分别升高46.3%和63.4%、28.9%和49.7%、25.5%和23.2%、51.8%和46.4%;ATP浓度分别升高81.7%和74.0%、77.2%和105.9%、87.5%和36.5%、63.1%和54.2%。
  2.腹腔注射丙酮酸后大鼠血清丙酮酸升高同时伴有海马、前额皮层、肌肉和肝脏组织中ATP浓度和PDH酶活性下降
  注射丙酮酸后大鼠血清丙酮酸明显升高。与对照组比,海马、前额皮层、肝脏和肌肉组织细胞中ATP浓度和PDH酶活性分别下降45.4%和23.1%、31.3%和42.1%、28.6%和21.2%、46.8%和13.2%。
  结论:
  异常加速度暴露可导致机体发生以脑体疲劳并存为特点的疲劳。人群试验和动物实验均发现,加速度暴露可引起血清丙酮酸大幅升高,动物实验证实血清丙酮酸升高在加速度暴露致脑体功能下降中起重要作用。而抑制相关组织细胞丙酮酸脱氢酶活性和ATP合成,影响能量代谢可能是丙酮酸升高引起脑体功能下降的原因之一。
[硕士论文] 王洁
微生物与生化药学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征的自身免疫性疾病,其发生发展与遗传、环境因素密切相关。研究表明类风湿性关节炎的严重程度受炎性介质的影响较大,主要的炎性介质有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)以及白细胞介素-1(IL-1)等,其中TNF-α在RA的发病机制中起着非常重要的作用。当前,在类风湿性关节炎临床治疗中,针对TNF-α的药物如阿达木单抗,英夫利昔单抗等取得了很好的临床效果,不仅能够改善症状,还能够抑制关节的破坏。然而,这类抗TNF-α单抗药物因完全封闭了TNF-α的生物学功能,导致机体的免疫自稳、免疫监视功能受到影响,给患者带来了易发生结核病感染、产生新的自身免疫疾病甚至诱发肿瘤的风险。
  TNF-α在机体内的过量表达及TNF-α/TNFRs信号通路的异常激活与类风湿关节炎等自身免疫性疾病的发生发展有着密切关系。随着对RA发病机制的研究深入,当前更多的研究是把治疗的靶点转向TNFRs。然而,相对于TNF-α单抗等生物制剂,TNFRs的小分子拮抗剂的基础和应用研究进展缓慢。从抗炎角度来说,TNFR1主要传递促炎、凋亡信号,通过选择性地阻断TNFR1传递的信号通路来封闭TNF-α的生物学功能,已成为该类药物研发的热点。目前尚无一种具有高度选择性的TNFR1拮抗药物上市应用于临床。
  本课题组在前期工作的研究中,以TNF-α为靶点,生物淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库,获得了一条具有抗炎活性的海蛇蛇毒活性肽(Hydrostatin-SN1,22AA),以该活性肽Hydrostatin-SN1为前导肽,结构优化获得了一条抗炎活性肽(Hydrostatin-SN10,10AA),表面等离子共振技术(SPR)、微量热泳动技术(MST)结果表明,Hydrostatin-SN10能与TNFR1直接相互作用,且发现只与TNFR1结合,而不与TNFR2、TNF-α结合,靶点明确,具有选择性,并能够竞争性抑制TNFR1-TNF-α的相互作用,能够有效抑制TNF-α激活的细胞内NF-κB及MAPKs信号通路。本研究在类风湿性关节炎动物模型(CIA小鼠)上评价Hydrostatin-SN10及其PEG2000修饰后的PEG-SN10的体内抗炎效应,这将为研发Hydrostatin-SN10成为具有自主知识产权的、靶点明确的海洋生物来源新型选择性TNF-α受体抑制剂多肽药物奠定基础。
  研究目的:
  通过建立胶原诱导的类风湿性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,研究Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的体内抗炎效应,为研发新型选择性TNF-α受体抑制剂多肽药物奠定基础。
  研究方法:
  1、类风湿性关节炎模型的建立:于第0天取牛Ⅱ型胶原(4mg/ml)与等体积完全弗氏佐剂CFA(4mg/ml)涡旋混合,至滴于水上不分散为较好,实验组小鼠尾根部皮内注射100μl/只。第21天后加强免疫,取牛Ⅱ型胶原(4mg/ml)与等体积不完全弗氏佐剂IFA(4mg/ml)涡旋混合至滴于水上不分散为较好,小鼠尾根部皮内注射100μl/只。第29天观察造模成功,均分为正常组,模型组,Hydrostatin-SN10组,PEG-SN10组及英夫利昔单抗组(阳性对照组),当天开始腹腔注射给药,模型组及正常组腹腔注射PBS,Hydrostatin-SN10组腹腔注射Hydrostatin-SN10(1600μg/kg),PEG-SN10组腹腔注射PEG-SN10(1600μg/kg),英夫利昔单抗组腹腔注射英夫利昔单抗(4mg/kg),每日一次,连续给药24天,第53天处死小鼠。
  2、每天观察小鼠活动情况及毛发情况,每隔3天测定小鼠脚掌厚度并对脚掌进行关节炎指数评分,评价Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。
  3、ELISA试剂盒测定小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及炎症因子IL-17的表达量,运用流式检测试剂盒测定血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10的表达量,从炎症因子表达水平观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。
  4、运用Micro-CT扫描观察小鼠后肢关节形态改变及骨质破坏程度,数据分析骨小梁的骨参数变化情况,从骨质破坏角度观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。
  5、采用流式测定脾脏中Treg细胞、辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞2(Th2)、辅助性T细胞17(Th17)的表达情况,从免疫学角度观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。
  6、HE染色观察小鼠后肢关节损伤,滑膜炎及炎性细胞浸润等情况,免疫组化测定踝关节中TNF-α表达量及抗酒石酸磷酸酶染色观察破骨细胞的变化情况,从关节病理切片观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。
  研究结果:
  1、正常小鼠精神状态良好,活动正常,毛色光亮而无脱毛现象;模型组小鼠加强免疫后,关节肿胀逐渐明显,精神状态欠佳,活动受到明显影响,无法正常活动,毛色无光泽且有脱毛现象;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组小鼠精神活动、毛色光泽、关节肿胀程度均较模型组明显减轻。Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能有效降低CIA小鼠的足爪肿胀程度及关节炎指数。
  2、血清中炎症因子测定结果表明:模型组小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17,TNF-α,IL-6,IFN-γ的含量显著高于正常组;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组可显著降低CIA小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17、TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量,且能显著提高抑炎因子IL-10的表达水平。
  3、脾脏中Th细胞的测定结果表明:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组中Foxp3及IL-4的表达量均显著提高,而IL-17及IFN-γ的表达量显著降低。即Hydrostatin-SN10及PEG-SN10可能是通过调节Treg/Th17及Th1/Th2的变化发挥抗炎作用,从而抑制类风湿性关节炎的发生发展。
  4、小鼠后肢Micro-CT检查结果显示:正常组关节面光滑,关节结构清晰可见;模型组关节面粗糙,骨质破坏严重;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,骨质破坏程度明显减轻;小鼠骨小梁Micro-CT结果显示:正常组骨小梁结构完整;而模型组骨质破坏严重,有明显空洞;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,骨质破坏程度明显减轻;骨小梁的参数测定结果显示:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组骨密度(BMD)、骨体积/组织体积(BV/TV)、骨面积/组织体积(BS/TV)、小梁的数量(Th.N)、小梁厚度(Tb.Th)等参数显著上调,骨表面积/骨体积(BS/BV)、骨小梁的模式因子(Tb.pf)、小梁的分离度(Tb.sp)等参数显著下调。这些结果表明Hydrostatin-SN10及PEG-SN10具有显著的抗炎效应。
  5、HE染色结果表明:正常组小鼠关节腔结构完整,未见软骨损伤,关节及滑膜组织中未见明显炎症细胞浸润;模型组可见关节结构破坏严重,丧失正常的关节结构,小鼠关节间隙消失,滑膜增生及软骨损伤严重,且可见严重的炎性细胞浸润;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,可见关节结构完整,炎性细胞浸润明显减轻,关节损伤显著减弱。
  6、免疫组化结果表明:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组关节中TNF-α的表达量显著降低,抗炎效应显著。
  7、抗酒石酸磷酸酶染色结果表明:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,抗酒石酸磷酸酶显著降低,即Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能够减少破骨细胞的数量,从而减少对骨组织的侵蚀。
  研究结论:
  本研究结果表明Hydrostatin-SN10及PEG-SN10在类风湿性关节炎动物模型(CIA小鼠)中具有显著的体内抗炎效应。
[博士论文] 张倜
内科学(风湿病) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性自身免疫性疾病,其特点是自身免疫耐受机制失衡,免疫功能紊乱,机体产生大量针对细胞核、细胞浆和细胞表面成分的自身抗体。SLE患者的免疫功能失衡包括自身反应性T细胞的产生及高反应性的B细胞产生自身抗体。SLE患者的T细胞可以给B细胞提供过度的帮助,但可惜的是,不能对于外界抗原的侵袭给予足够的抵御。在细胞因子水平,T细胞无法产生足够的细胞因子IL-2,同时产生过多的IL-17与IL-10。同时存在各种亚型的T细胞,包括Th17细胞浸润在肾脏组织中,造成病理破坏,所以进一步研究各种亚型T细胞的异常功能,以及在SLE患者中的作用,对于进一步探索SLE的发病机制是很有帮助的。
  CD28是T细胞表面的共刺激分子,对T细胞的活化、增殖起着重要的作用。既往研究表明,长期的自身抗原、外界抗原刺激T细胞,会导致共刺激分子CD28的丢失,从而导致CD4+CD28-T细胞的数量不断聚集。而CD4+CD28-T细胞的表型及功能,与正常的CD4+CD28+T细胞相比较,同样也会发生巨大的变化,比如获得了毒性杀伤性作用,更多的IFN gamma的分泌,NK细胞表面分子的表达以及趋化因子的表达异常。在一些炎性疾病如类风湿关节炎,多发性硬化,急性心肌梗死中,CD4+CD28-T细胞的数量与正常人相比较是增加的,并且发现这群细胞在一些炎性疾病存在组织浸润性。考虑到SLE患者体内发生着剧烈的体液免疫和细胞免疫,均需要CD4+T细胞的协同作用,可能会加剧了CD28分子的丢失,以及CD4+CD28-T细胞具有强大的破坏作用,是否会在SLE疾病进程中发挥作用,是进一步值得研究与思考的。
  IL-15是一种细胞因子,IL-15R包含三个亚基单位α,β,γ,通过跨膜传递的方式传递信号,也就是IL-15首先与IL-15Rα形成复合体,把信号传递给表达IL-15Rβγ的细胞,包括CD8+T细胞,NK细胞。IL-15的主要功能是给效应杀伤性T细胞提供共刺激信号,并促进组织浸润的杀伤性T细胞的功能,进一步加强组织破坏性。而CD4+CD28-T细胞具备NK细胞表面分子,细胞杀伤性功能,以及组织浸润性等特征。因此本研究将针对IL-15对于CD4+CD28-T细胞的数量及功能,以及参与SLE免疫病理损伤的可能机制进行探讨。为解决以上提出的问题,本实验分为两部分:
  第一部分 CD4+CD28-T细胞在SLE中表型功能变化及组织浸润性
  目的:观察SLE患者与正常人群外周血CD4+CD28-T细胞的比例以及表型变化,分析该群细胞在SLE免疫病理损伤中的作用和意义。
  方法:采用流式细胞术检测44名SLE患者、22名正常对照人群的外周血中CD4+CD28-T细胞的比例以及SLE患者、正常对照人群患者CD4+CD28-T细胞的NK细胞受体表达水平,趋化因子、粘附分子表达水平与对应的CD4+CD28+T细胞对比;采用免疫荧光的方法检测SLE患者肾脏活检标本和对照组正常人肾脏中CD4+CD28-T细胞的浸润情况。
  结果:SLE患者外周血中的CD4+CD28-T细胞的比例显著高于正常对照组,并且SLE患者及正常对照组CD4+CD28-T细胞表达NK细胞受体水平、粘附分子水平、趋化因子、凝集素,明显高于对应的CD4+CD28+T细胞,但是SLE患者与正常对照人群的CD4+CD28-T细胞分子表达水平没有差异。另外,在肾小管间质中可见CD4+CD28-T细胞大量浸润,而在正常对照的肾脏标本中,未见CD4+CD28-T细胞浸润。
  结论:在SLE患者外周血中CD4+CD28-T细胞的比例升高。并且这些细胞与CD4+CD28-T细胞相比较,具有更高的NK细胞受体分子、粘附分子、趋化因子、凝集素分子表达量水平,提示CD4+CD28-T细胞具备杀伤性功能及迁徙能力。另外通过免疫荧光证实,证实CD4+CD28-T细胞在狼疮肾炎中大量浸润,提示其介导了狼疮肾炎免疫病理损伤过程。
  第二部分 IL-15促进CD4+CD28-T细胞在SLE中免疫损伤功能
  目的:探索IL-15在SLE患者肾脏的表达情况,对CD4+CD28-T细胞的功能影响,以及促进SLE肾脏免疫损伤的机制。
  方法:采用免疫荧光的方法检测SLE患者肾脏活检标本和对照组正常人肾脏中表达IL-15的巨噬细胞的浸润情况。流式细胞术检测不同浓度IL-15对于SLE患者、正常对照人群的外周血中CD4+CD28-T细胞的功能影响;以及IL-15预处理CD4+CD28+T细胞与CD4+CD28-T细胞后,共培养肾小球上皮细胞,观察促进凋亡效能。
  结果:通过免疫荧光证实,分泌IL-15的巨噬细胞在狼疮肾炎中大量浸润,提示IL-15介导了狼疮肾炎免疫病理损伤过程。并且体外实验证实,IL-15可以促进CD4+CD28-T细胞的增殖、杀伤表型、干扰素分泌以及趋化能力。最后,细胞共培养证实CD4+CD28-T细胞可诱导更多的肾小球上皮细胞的凋亡损伤。
  结论:IL-15可以促进CD4+CD28-T细胞的多种功能,从而介导SLE免疫损伤,是一种新型的免疫损伤机制。并且阻断IL-15-IL-15Rα相互作用,从而抑制CD4+CD28-T细胞的功能,可能是SLE治疗中的潜在靶点。
[博士论文] 宋玲莉
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文从以下几方面进行论述:
  第一部分 Hegdghog信号通路在百草枯肺纤维化大鼠模型中的表达情况
  目的:百草枯中毒主要引起以肺损伤为主的多系统功能损害,以肺纤维化最常见,死亡率极高,但其肺损伤及肺纤维化的具体机制未完全明确。
  方法:不同剂量的百草枯原液(体积分数20%,剂量10、50、100mg/kg)分别灌胃6-8周Wister雄性大鼠,以造模口服百草枯中毒致肺纤维化,试验随机分组,分为正常对照组(n=30),百草枯染毒组(n=90,剂量10、50、100mg/kg,n=30×3),观察染毒大鼠第1、3、7、14、21、28天六个时间段的一般情况(精神、摄食、毛色、活动、体重等),从而确定百草枯诱导肺纤维化的造模用药剂量(该用药剂量称为染毒组,PQ组)。蒸馏水灌胃正常对照组,将染毒组(PQ,n=30)和正常对照组(Cont,n=30),于第1、3、7、14、21、28天六个时间段分别处死各组大鼠,并收集大鼠血清标本监测两组大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的血清学指标。
  结果:1.Cont组大鼠平均体重随着喂养时间的延长稳步增加,PQ组大鼠染毒后体重早期(3-7天)增加极慢,3天、7天及14天时与Cont组比,差别有统计学意义(P<0.05),染毒21天时体重明显增加,21天、28天,差别无统计学意义(P>0.05)。
  2.20%百草枯原液配比剂量50mg/kg灌胃大鼠可模拟口服百草枯中毒的肺纤维化过程,大致经过肺泡充血水肿、急性肺泡炎、肺纤维化,确定该浓度为造模浓度。
  3.PQ组Hyp含量(单位:μmol/L)随时间推移有所升高。
  4.HE染色显示Cont组大鼠肺组织结构正常,PQ组大鼠肺组织按时间顺序呈现由肺泡炎至纤维化的动态改变:早期(1-7天)表现为严重的肺泡炎性渗出,大量的炎性细胞浸润,与Cont组比,肺泡炎评分差异有统计学意义(P<0.05);Masson结果示Cont组结构正常;PQ组(3-7天)早期少量胶原纤维分布,中后期(14-21天)可见支气管管壁与肺泡间隔呈纤维性增厚,大量不规则排列胶原纤维,与Cont组比,肺纤维化评分差异有统计学意义(P<0.05)。
  5.免疫荧光及组化显示PQ组肺组织ERK、TGF-β1、Smad3、Gli1的表达均明显增高;RT-PCR和Western-blot显示,PQ组肺组织的Gli1、Shh、ERK、TGF-β1、Smad3等蛋白的表达均高于Cont组,且PQ组肺组织中的Gli1、Shh在21天达高峰,TGF-β1、Smad3、ERK在14天达高峰,与Cont组比,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:1.20%百草枯原液配比剂量50mg/kg灌胃Wister雄性大鼠可以成功模拟口服百草枯致肺纤维化的过程,肺部病变主要表现为早期的肺泡炎和晚期的纤维化。
  2.Hh信号通路在正常大鼠肺组织中处于抑制状态,百草枯染毒后被异常激活,且随着肺纤维化的进展,Hh信号通路的活化程度增加,因此Hh信号通路的异常激活可能与百草枯肺纤维化有一定的联系。
  关键词:百草枯;肺纤维化;Hedgehog信号转导通路
  第二部分 环巴胺及Gant61在百草枯诱导肺纤维化大鼠中的治疗作用
  目的:本试验以Hedgehog信号通路为切入点,以Hedgehog信号通路的关键环节为研究靶点,探讨Cyclopamine及Gant61是否有减轻百草枯诱导的大鼠肺纤维化程度,并明确其机制是否与抑制Hh信号通路而实现,同时探索Hh信号通路与TGF-β1介导的ERK及Smad信号通路之间的联系。
  方法:6-8周Wister雄性大鼠随机分为正常对照组(Cont,n=30)、百草枯染毒组(PQ,n=30)、Cyclopamine干预组(Cyc,n=30)、Gant61干预组(Gant,n=30)、SB431542干预组(SB,n=30)。50mg/kg百草枯灌胃Cyc、Gant、SB各干预组,分别给予Cyclopamine(5mg/kg/d)、Gant61(200μg/kg/d)和SB431542(100μg/kg/d)腹腔注射,于第1、3、7、14、21、28天分别处死5只大鼠,收集各组大鼠血清以检测各组大鼠的SOD、MDA、GSH血清学指标;测定肺组织羟脯氨酸(Hyp)水平;HE染色和Masson染色评分,评估不同时间段各组大鼠肺泡炎及纤维化病变的程度;免疫组化、免疫荧光、RT-PCR和Western-blot等技术分析大鼠肺组织Hh通路中转录因子Gli1、Shh和其他信号因子TGF-β1、ERK、Smad3等的表达。
  结果:1.Cont组、PQ组及各干预组大鼠初始平均体重无差异,PQ染毒后早期(3-7天)大鼠体重增长极慢,各干预组体重增加缓慢,第7天各干预组大鼠体重较PQ组有统计学意义(P<0.05);各干预组21天时体重与Cont组及PQ组差距减小,差异无统计学意义(P>0.05)。
  2.各干预组的MDA在早期升高不明显,上升程较PQ组度低,1天时SB组及Cyc组,3天时Cyc组及Gant组,与PQ组比差别有一定的统计学意义(P<0.05);各干预组的SOD、GSH含量在染毒早期明显下降,第3天、7天二者含量与PQ组比,差别具有统计学意义(P<0.05),下降持续时间也比PQ组短,在染毒后期(21天-28天)各指标与Cont组比无明显差别(P>0.05)。
  3.各干预组大鼠肺组织中Hyp呈类似于PQ组的变化趋势,给予药物干预后大鼠肺组织Hyp水平升高时间延后。3天时,各干预组与Cont组Hyp的浓度的差异无统计学意义(P>0.05);7天、14天、28天,Hyp含量差别有统计学意义(P<0.05)。各干预组肺组织Hyp水平均不同程度降低,与PQ组比,Hyp含量3天、7天差别无统计学意义(P>0.05);14天、28天差别有统计学意义(P<0.05)。
  4.各干预组病理HE及Masson染色改变类似于PQ组的变化规律,呈现由肺泡炎到肺纤维化的动态改变,但炎症和纤维化评分较PQ组轻;与PQ组比,各干预组肺泡炎及肺纤维化均有不同程度改善,SB组3天、7天,Cyc组1天、3天、7天,Gant组在3天、7天及14天时,肺泡炎评分较PQ组比有统计学意义(P<0.05),各干预组14天、21天及28天肺纤维化评分较PQ组有统计学意义(P<0.05)。
  5.免疫荧光、免疫组化、RT-PCR及Western-blot方法显示Gli1、TGF-β1、ERK、Smad3、Shh在各干预组中的表达规律同PQ组,但是表达量有一定程度的下降。染毒7天时,各干预组Gli1的表达开始增高,21天达高峰,较PQ组有所降低,在7天、14天、21天、28天相对Cont组和PQ组的表达倍数均有统计学意义(P<0.05)。染毒7天时,SB组、Cyc组、Gant组的TGF-β1、Smad3、ERK表达开始增高,14天达高峰,21天开始回降,各干预组表达较PQ组也有所降低。
  结论:1.Cyclopamine和Gant61通过抑制Hh信号通路而延缓和改善百草枯肺纤维化的发生和发展,SB431542可以抑制TGF-β1介导的ERK/Smad信号通路而延缓和改善百草枯肺纤维化的进展。
  2.PQ中毒后期Hyp含量升高,干预治疗后升高的时间延后,程度减轻,提不Cyclopamine、Gant61、SB431542可以有效抑制肺组织中胶原纤维的增殖以及细胞外基质的沉积,起到较好的抗肺纤维化作用。
  3.Cyclopamine和Gant61调控的Hedgehog信号,与TGF-β1介导的ERK/Smad信号通路在百草枯肺纤维化发展过程可能存在一定的交互作用。PQ染毒后肺内Hedghog信号通路、TGF-β1信号通路被激活,而Cyclopamine、Gant61和SB431542抑制了PQ的这种作用。
  第三部分 口服百草枯致肺损伤中的自噬现象
  目的:自噬(autophagy),细胞内“自己吃自己”的现象,即self-eating,正常细胞极少发生自噬,自噬存在保守性和可诱导特性,自噬在百草枯诱发的肺损伤中所起作用是正面还是负面的尚未完全阐明,值得研究。
  方法:Wister大鼠分为正常对照组(Cont,n=30)、染毒组(PQ,n=30),每组分6各亚组,每亚组5只大鼠,在1、3、7、14、21、28天通过透射电镜分别观察百草枯染毒后肺组织的的自噬现象,应用Western-blot监测Beclin-1和LC3的表达。
  结果:1.Cont组的肺组织超微结构正常。与Cont组比,PQ组电镜结果示:第7天自噬前体和初级溶酶体出现;第14天自噬前体、自噬体均可见;第21天细胞中大量的自噬体、自噬溶酶体出现;第28天自噬溶酶体膨胀及空泡化。
  2.PQ组LC3、Beclin-1的表达在各时间均升高(P<0.05),随时间有动态变化:染毒后开始升高,与Cont组比,14天达高峰(P<0.05),28天有所下降,但仍高于Cont组的基础表达。
  结论:细胞自噬参与百草枯致大鼠肺损伤过程,并可以诱发大鼠肺组织纤维化程度的加重,在百草枯肺纤维化的发生及发展中发挥一定的作用。
[博士论文] 李爱
内科学(血液病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 间充质干细胞治疗2型糖尿病的临床研究
  研究目的:
  研究静脉输注间充质干细胞治疗2型糖尿病患者的安全性及有效性。为了找到一种治疗2型糖尿病的安全有效的治疗方法。
  研究方法:
  本临床试验在提交我院伦理委员会审批通过后,向捐献者详细说明本临床试验的目的、意义,捐献者充分理解并同意后,签署知情同意书,在无菌条件下留取健康产妇的脐带组织,剥离华通氏胶,并剪碎,经过培养及消化处理后,获得原代脐带间充质干细胞,继续在体外培养并扩增间充质干细胞,获得足量的间充质干细胞。这些细胞经过免疫表型鉴定、形态学鉴定、多向分化能力的鉴定和内毒素及病原微生物检测后,以确定培养出了可应用于临床治疗的符合GMP标准的脐带组织来源的间充质干细胞。
  本研究选取了2009年7月-2012年10月18例在我院住院治疗的2型糖尿病患者,签署间充质干细胞输注治疗知情同意书后,给予静脉输注脐带间充质干细胞,每名患者输注2-3次,每次间隔2周,详细记录治疗前、治疗后第1、第3、第6个月患者的空腹血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白、C肽和T细胞亚群等指标变化,并记录出现的不良反应。总结试验数据,并做统计学分析。
  研究结果:
  1.由脐带成功分离、培养及扩增出脐带间充质干细胞,经过免疫表型鉴定、形态学鉴定、多向分化潜能的鉴定和内毒素及病原微生物检测后确定培育出的脐带间充质干细胞符合GMP规范,可应用于临床治疗。
  2.应用脐带间充质干细胞输注治疗的2型糖尿患者,按照疗效评价标准,分为治疗有效组和治疗无效组两组,二者在临床基础特征方面无显著性差异(p>0.05)。治疗有效组患者的空腹血糖和餐后血糖均明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);在治疗有效组中血浆C肽水平及调节性T细胞有升高的趋势,但无显著性差异(p>0.05)。在脐带间充质干细胞输注过程中前及输注后,仅有4例患者(4/18,占22.2%)有轻度发热反应,未发现其他明显不良反应。脐带间充质干细胞输注治疗后随访观察了6个月,18例患者均感觉身体的一般情况较前明显改善,生活质量得到了提高。
  研究结论:
  脐带间充质干细胞治疗2型糖尿病是安全的,未发现严重不良反应。对部分患者,MSC能有效降低空腹血糖和餐后血糖,其作用机制可能与促进Treg的生成,抑制异常免疫系统对胰岛β细胞损伤和提高外周组织对胰岛素的敏感性有关。该研究为临床上进一步应用UMSC治疗2型糖尿病奠定了实践基础。
  第二部分 间充质干细胞治疗强直性脊柱炎的临床研究
  研究目的:
  研究静脉输注间充质干细胞治疗强直性脊柱炎患者的安全性和有效性。为了找到一种治疗强直性脊柱炎的安全有效的治疗方法。
  研究方法:
  本临床试验在提交我院伦理委员会审批通过后,向捐献者详细说明本临床试验的目的、意义,捐献者充分理解并同意后,签署知情同意书,在无菌条件下留取健康产妇的脐带组织,剥离华通氏胶,并剪碎,经过培养及消化处理后,获得原代脐带间充质干细胞,继续在体外培养并扩增间充质干细胞,获得足量的间充质干细胞。这些细胞经过免疫表型鉴定、形态学鉴定、多向分化能力的鉴定和内毒素及病原微生物检测后,以确定培养出了可应用于临床治疗的符合GMP标准的脐带组织来源的间充质干细胞。
  本研究入组了2009年7月-2012年10月5例在我院治疗的强直性脊柱炎患者。签署间充质干细胞输注治疗知情同意书后,给予静脉输注间充质干细胞,每次输注细胞数为1IU/10Kg(1IU=1×107个间充质干细胞),平均输注1-2次,每次间隔3个月。根据疗效评价标准,比较治疗前、治疗后第1、3、6月患者的各项指标变化,包括:体格检查、BASDAI、BASFI、BASMI评分;C反应蛋白、血沉、尿常规、血常规、肝肾功能检测;影像学等检测,并详细记录不良反应。
  研究结果:
  1.本研究5例患者输注UMSC后有3例(60%)出现发热,体温在38.5-39℃之间,所有发热患者体温在2-6小时内降至正常范围。
  2.患者治疗前、后疗效对比:所有患者治疗后较治疗前BASDAI、BASMI评分下降了,BASFI评分升高了;3例患者的血沉降低了,1例患者的C反应蛋白明显下降;所有患者的症状较前好转,并维持稳定。
  研究结论:
  脐带间充质干细胞治疗强直性脊柱炎是安全、有效的,在输注过程中及输注后未发现严重的并发症及不良反应,患者耐受性良好。能有效降低炎性指标,改善患者脊柱和关节的功能并提高生活质量。该研究为临床上进一步应用UMSC治疗强直性脊柱炎奠定了实践基础。
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