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[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[硕士论文] 尹剑蓉
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:烟曲霉(Aspergillus fumigatus,Af)是一种机会致病菌,广泛存在于水、土壤、空气、植物等自然界环境中,在有机碎片上生存和生长。目前,烟曲霉已成为最普遍的空气传播真菌病原体,它孢子量丰富,每个分生孢子头生产数以千计的分生孢子,释放到大气中的分生孢子的直径足够小到可达肺泡。环境调查显示,所有人类每天至少会吸入几百个烟曲霉分生孢子。免疫功能正常的人吸入烟曲霉孢子后几乎不会致病,因为肺部先天免疫机制可以有效清除孢子。过敏体质者吸入烟曲霉孢子可触发IgE介导的变态反应从而引起哮喘、变态反应性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎等曲霉病。免疫功能抑制的患者吸入烟曲霉孢子后,易发展为侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA)。侵袭性曲霉病是免疫功能低下患者中最严重的感染性疾病之一,特别是在骨髓移植和实体器官受者中。由于移植数量的增加,血液系统疾病和实体瘤新型加强化疗方案的发展,艾滋病以及免疫抑制剂使用的大大增加,近年来侵袭性曲霉病的发病率急剧升高,同时诊断该病较为困难,真菌病原体检出率不高,此外目前临床上所用的抗真菌药物副作用大,治疗效果不明显,因此很难将患者体内的烟曲霉彻底清除,这导致了侵袭性曲霉病的死亡率极高,可高达50%~95%。因此,研究烟曲霉感染的致病机制,寻找新的相关治疗靶点,以及进一步探究并制定有效的治疗方案刻不容缓,是目前针对烟曲霉感染亟待解决的重要课题。
  机体的抗真菌免疫应答在烟曲霉感染中至关重要,烟曲霉主要侵入机体引起细胞免疫应答,包括先天性免疫应答和适应性免疫应答。先天性免疫应答是机体通过定殖在肺部的巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤细胞的直接吞噬作用来抵御烟曲霉感染的第一道防线,上述细胞亦可分泌并释放一系列细胞因子和趋化因子,从而引起相关机体炎症反应来清除烟曲霉孢子和菌丝。随着烟曲霉感染进一步发展,抗原提呈细胞(Antigen presenting cells,APC)将烟曲霉抗原递呈给CD4+T细胞,继而引发适应性免疫应答。经APC活化后的CD4+T细胞进一步分化为辅助性T细胞(T helper cells)介导体内抗真菌免疫应答,因此Th细胞在烟曲霉感染性疾病中起到尤为关键的作用。Th1细胞主要分泌细胞因子IFN-γ(Interferon-γ),介导机体产生保护性抗真菌免疫应答;Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4(Interleukin-4)和IL-10(Interleukin-10),激活机体产生体液免疫;Th17细胞主要分泌细胞因子IL-17(Interleukin-17),促进中性粒细胞的募集从而对烟曲霉进行有效清除。大量研究证实,Th17细胞介导机体产生抗真菌免疫应答,并且Th17细胞和细胞因子IL-17引起的免疫反应与烟曲霉感染后的机体内应答具有紧密的关系。然而,作为后期新发现加入到Th细胞亚群中的一员,Th17细胞介导机体抵御烟曲霉感染而产生的抗真菌免疫应答的调控机制尚不十分清楚,有待进一步相关研究。
  近年来一系列的研究强调了microRNA(miRNA)的重要性,其相关功能和作用机制不断地在各种疾病中被研究和探讨。miRNA是一组进化上高度保守的内源性非编码小RNA,其长度约18-25个核苷酸,可以通过靶向结合并断裂目的mRNA或抑制目的mRNA的蛋白质翻译的作用,从而在转录后水平上负调控目的基因的表达。众多研究证实了miRNA在免疫细胞的分化发育和调控免疫应答的过程中发挥至关重要的作用。miRNA参与CD4+T细胞发育与分化的调控,如miR-155通过抑制IFNγRα的表达来抑制Th1细胞分化;miR-17~92a簇是有效的Th1细胞分化所必需的,miR-17和miR-19b是重要的特异性miRNA;miR-21通过抑制Spry1的表达来促进Th2细胞分化;miR-29a抑制Th1细胞分化和细胞因子IFN-γ产生等等。已经发现多个miRNA促进Th17细胞分化,如miR-155通过抑制转录因子Ets1促进Th17细胞分化;miR-301通过抑制STAT3信号传导的负调节因子PIAS3参与Th17细胞分化等等。由此可知,miRNA通过调控辅助性T细胞的分化发育和相关细胞因子的分泌生成,可以促进或者抑制机体产生抗感染免疫反应。此外,miRNA在烟曲霉感染的发病机制和机体对烟曲霉感染后引起免疫反应的调节作用研究甚少,鲜有报道。因此,本研究的目的是研究和探讨烟曲霉反应性CD4+T细胞中差异表达的miRNA及其相关靶基因对烟曲霉反应性CD4+T细胞向Th17细胞分化的调控机制。
  第一部分:烟曲霉诱导CD4+T细胞中miR-17-5p的表达上调并向Th17细胞分化
  先采用热灭活的烟曲霉体外刺激正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),培养24小时后磁珠分选出CD4+T细胞即为烟曲霉反应性CD4+T细胞。根据实验室课题组前期的miRNA芯片检测结果,挑选出在烟曲霉反应性CD4+T细胞中表达上调的miR-17-5p进行研究,同时采用qPCR对芯片结果中下调的miR-17-5p进行验证,验证结果与芯片结果保持一致。结果发现:miR-17-5p在烟曲霉反应性CD4+T细胞中的表达增多,约为对照组的1.49倍(P<0.05)。随后采用流式细胞术和qPCR分别检测烟曲霉反应性CD4+T细胞的分化和细胞因子表达的情况。结果发现:经烟曲霉诱导后CD4+T细胞向Th17细胞分化明显增多,并且细胞因子IL-17的表达也明显增多,约为对照组的7.19倍(P<0.05)。
  第二部分:烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p的表达水平对Th17细胞分化的影响
  为了进一步了解烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p的上调是否与Th17细胞分化相关,向PBMC中转染miR-17-5p mimic以及miR-17-5p inhibitor,转染24小时之后再给予热灭活的烟曲霉刺激,培养24小时后磁珠分选出CD4+T细胞。结果发现:烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p的表达水平与Th17细胞分化和IL-17生成呈正相关,转染miR-17-5p mimic促进Th17细胞分化和IL-17生成(P<0.05),而转染miR-17-5p inhibitor抑制Th17细胞分化和IL-17生成(P<0.05)。由此可见烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p具有调控Th17细胞分化的能力。
  第三部分:烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p通过作用于靶基因PTEN促进Th17细胞分化
  首先通过多个靶基因预测网站预测miR-17-5p的靶基因,经分析后选择与Th17细胞分化相关的靶基因PTEN,然后分别通过qPCR、Western Blot和荧光素酶报告基因技术验证miR-17-5p与PTEN mRNA的3'UTR确实存在相互作用关系。为了探讨miR-17-5p调控Th17细胞分化是否是通过作用于靶基因PTEN来实现的,设计并合成PTEN siRNA沉默PTEN的表达。结果发现:转染PTEN siRNA24小时后,烟曲霉反应性CD4+T细胞向Th17细胞分化增多,同时IL-17生成增多(P<0.05)。由此可见烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p是通过作用于靶基因PTEN从而促进Th17细胞分化。
  综上所述,本研究发现烟曲霉可通过诱导CD4+T细胞中miR-17-5p的表达上调,且miR-17-5p可通过作用于靶基因PTEN进一步调控烟曲霉反应性CD4+T细胞向Th17细胞分化以及生成IL-17增多。这种作用机制可能与PTEN参与的PI3K-AKT信号通路相关,故miR-17-5p可能是通过这种调控机制来参与机体的抗真菌免疫应答。
[硕士论文] 王世杰
生物学(微生物学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)为单股正链RNA病毒,是引起人类急、慢性肝炎的重要病原体。HCV感染极易慢性化,其慢性率高达80%。HCV慢性感染是肝硬化、肝癌等严重终末期肝病的重要原因。
  长效干扰素联合利巴韦林曾经是治疗HCV感染的标准方案,其疗效受基因型的影响,且总体不甚理想。近年来上市的新一代直接抗病毒药物(direct antiviral agents,DAAs)(如Ledipasvir和Sofo sbuvir)使丙肝治疗现状发生重大改变,但这些药物费用昂贵,无法在短期内普及使用,副作用以及耐药突变等也有待更长时间的观察。HCV基因组高度变异,这是HCV逃避宿主适应性免疫而高发慢性感染的重要原因。除了变异以外,HCV还进化有其他复杂的免疫逃避机制,尤其是逃避固有免疫应答的机制,促使HCV慢性感染的发生。HCV分子克隆以后的近三十年,丙肝疫苗研究一直受到发达国家的重视,有多种类型的疫苗进入或已经完成了Ⅰ、Ⅱ期临床期试验,但目前没有一种进入Ⅲ期临床试验阶段。HCV的高变异使得疫苗研制举步维艰,另一方面,HCV感染是否足以诱导保护水平的免疫应答也存在争议。
  HCV感染的药物治疗虽然取得了巨大进展,但对于HCV慢性感染和免疫逃避机制的认识还有很多未知,有待进一步深入发掘,阐明这些错综复杂的问题,不仅能为人类控制HCV感染,也能为人类认识其他病毒持续感染的机制提供重要线索。事实上,HCV目前已经被作为研究病毒慢性感染机制的重要模型,在抗HCV药物研发取得巨大进展以后,HCV感染与致病机制依然受到学者的广泛关注,研究热度依然不减。
  我们之前的研究发现HCV感染显著上调Huh7细胞中硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达,且HCV感染高度依赖于TXNIP的表达。本论文在此基础上,对HCV感染诱导TXNIP表达以及TXNIP促进HCV感染的机制进行了探索。
  本研究中,我们开展了以下实验、获得了如下结果:1)进一步观察和证实了HCV感染上调Huh7细胞中TXNIP的表达以及TXNIP分子对HCV感染的重要作用;2)通过RNA干扰技术确认抑制细胞自噬导致Huh7细胞中HCV感染的下调,以及抑制TXNIP的表达明显降低无血清饥饿对细胞自噬的诱导;3)对HCV感染的Huh7细胞进行内质网应激相关标志分子的检测,未观察到HCV感染对内质网应激的诱导;4)HCV感染Huh7细胞能低水平激活IFN-β的转录,外源性IFN-β能剂量依赖性上调Huh7细胞中TXNIP的表达;5)HCV全长RNA和HCV3'-UTR转染Huh7细胞能诱导IFN-β的产生和上调TXNIP的表达;6)Huh7.5.1细胞转染RIG-Ⅰ表达质粒以后,细胞内TXNIP的表达水平升高,且HCV感染能进一步上调TXNIP的表达,而HCV感染对naive Huh7.5.1内的TXNIP表达无上调作用;7)Redd1分子可能与TXNIP协同参与对HCV感染的调控;8)钙离子拮抗剂维拉帕米能通过抑制TXNIP的表达而抑制HCV感染。
  本论文通过上述研究建立了一种HCV慢性感染新机制的作用模型:HCV感染刺激宿主产生低水平干扰素(无论细胞模型中这种作用的高低程度如何,人类和黑猩猩感染HCV在肝组织内普遍检测到干扰素表达的明显上调),干扰素上调TXNIP的表达,TXNIP则通过促发细胞自噬增强HCV的复制。干扰素刺激表达的TXNIP不同于其他干扰素刺激基因表达产物,其作用不是抑制病毒感染,而是相反。基于这一发现,我们证明了一种临床用于治疗高血压的廉价药物维拉帕米通过抑制TXNIP的表达而抑制HCV感染,其用于临床治疗丙型肝炎的前景值得进一步探讨。
[硕士论文] 胡红丽
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:宿主防御新生隐球菌感染是由活化的巨噬细胞、NK细胞和T细胞共同作用完成的。肺泡巨噬细胞和树突状细胞(DC)一般被认为是新生隐球菌感染的一线天然屏障。宿主感染新生隐球菌后,这些DC和巨噬细胞吞食并破坏侵入的隐球菌,向T细胞提呈隐球菌抗原,并产生启动和引导适应性免疫应答的介质(细胞因子和趋化因子)。研究证明,肺脏DC和肺泡巨噬细胞的耗竭导致了感染新生隐球菌的小鼠病情迅速恶化和死亡。因此,肺泡巨噬细胞和树突状细胞在抗新生隐球菌免疫反应中起着重要的作用,并在新生隐球菌感染过程中连接先天免疫系统和适应性免疫系统。IL-17作为Th17型细胞主要代表之一,在细胞外的细菌和真菌感染的清除中起着重要的作用。增加IL-17的产生与减少隐球菌负荷有关,表明IL-17在产生保护性抗隐球菌免疫应答方面也有重要作用。CCL7,也称单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)由于其强大的趋化作用,在许多病理机制中都有涉及。然而,其被IL-17调制,却很少受到关注。在本研究中,我们以小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞为研究对象,证明了在新生隐球菌感染巨噬细胞中IL-17可介导CCL7的诱发。并且,这种效应是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路介导,导致CCL7表达增加。了解CCL7表达的调控可以为新生隐球菌感染免疫潜在治疗靶点的发展提供见解。
  第一部分:隐球菌脑膜炎患者外周血单个核细胞中IL-17表达降低
  本部分将探讨患者外周血单个核细胞中IL-17的表达情况。纳入上海长海医院和长征医院2008年5月~2016年8月患者28例,并且收集同时期健康对照者30例。分别分离其外周血单个核细胞,采用实时定量PCR检测其IL-17表达量。
  结果显示,与健康对照组相比,患者外周血单个核细胞中IL-17mRNA表达水平明显降低。实验室培养RAW264.7细胞至对数生长期,用热灭活新生隐球菌刺激RAW264.7细胞,分别在刺激后的0、4、8、12小时后收集细胞和上清,进行RT-PCR和ELISA检测IL-17在基因和蛋白层面的表达。
  结果表明,热灭活新生隐球菌与巨噬细胞系共培养后,IL-17mRNA和蛋白的表达均呈时间依赖性增高,在12小时达到最高。
  本部分结果提示,IL-17可能通过影响新生隐球菌免疫应答而参与到发病机制中。
  第二部分:巨噬细胞抗隐球菌感染免疫过程中MAPK/CCL7表达升高
  本部分将探讨MAPK代表蛋白/CCL7在巨噬细胞抗新生隐球菌感染免疫中的表达。实验室培养RAW264.7细胞,待呈对数增长后与热灭活新生隐球菌共培养12小时后收集上清,同时设立对照组,采用实时荧光定量PCR及ELISA检测CCL7在基因和蛋白层面的表达水平。并用western blotting检测实验组与对照组分别培养0、8、12小时后巨噬细胞中MAPK的代表蛋白的表达水平。再分别用MAPK的代表蛋白ERK、JNK、p38的抑制剂预处理,检测热灭活隐球菌诱导后巨噬细胞CCL7的表达,结果发现,与对照组相比,热灭活隐球菌诱导后巨噬细胞CCL7表达明显升高(P<0.05),并且巨噬细胞中MAPK代表蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化均增加;ERK、JNK的抑制剂预处理细胞,导致新生隐球菌感染诱导巨噬细胞表达CCL7降低,而p38的抑制剂处理巨噬细胞则没有这种现象。本部分结果提示巨噬细胞感染新生隐球菌后可以通过MAPK中的ERK、JNK信号通路来增强CCL7的产生来增强免疫。
  第三部分:IL-17可通过MAPK信号通路介导巨噬细胞中CCL7的表达上调
  本部分将探讨IL-17对新生隐球菌诱导的巨噬细胞CCL7产生的调控机制。实验室培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,待其呈对数增长趋势时分别以不同浓度的rhIL-17(25,50以及100ng/ml)预处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时。同时设立对照组,对照组为未加入rhIL-17预处理但与新生隐球菌以1∶10的比例共孵育的等体积巨噬细胞,也即加入rhIL-17的浓度为0ng/ml。
  1.不同浓度rhIL-17(0,25,50以及100ng/ml)预处理后,ELISA检测巨噬细胞抗新生隐球菌免疫过程中CCL蛋白的表达水平;用100ng/ml rhIL-17预处理后,并用western blotting分别检测巨噬细胞与新生隐球菌共培养0、8、12小时后ERK、p38、JNK的表达水平。
  2.控制实验因素,即在用rhIL-17刺激之前,分别用各自信号通路的特定抑制剂处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时后,ELISA检测评估CCL7的表达;另一方面,在用rhIL-17刺激巨噬细胞之前,用CCL7阻断抗体处理,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时后,western blotting检测ERK、JNK的表达水平。
  结果发现:1.巨噬细胞在不同浓度的IL-17(对照组0ng/ml,实验组25、50和100ng/ml)中培养12h,CCL7的表达在基因和蛋白层面都随着IL-17的浓度的升高而依次递增,在100ng/ml时最高;而western blotting结果示:用100ng/ml rhIL-17预处理后,巨噬细胞与新生隐球菌共培养后ERK、p38、JNK的磷酸化水平升高。
  2.ERK的抑制剂MEK(U0126,10μm)、JNK的抑制剂JNK(SP600125,10μm)预处理细胞,导致IL-17介导CCL7表达较对照组明显降低,p38的抑制剂p38(SB203580,10μM)却未产生明显影响。而在用rhIL-17刺激之前,用CCL7阻断抗体处理,然后以100ng/ml rhIL-17预处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时后,western blotting检测ERK、JNK的表达水平,结果示,ERK、JNK表达无明显改变。
  本部分结果提示:IL-17可以通过上调MAPK信号通路表达调节新生隐球菌诱导的巨噬细胞CCL7的产生。
[硕士论文] 王万敏
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性支气管肺癌(简称肺癌)是全球最常见的实体恶性肿瘤之一,是全世界每年癌症相关死亡最常见的原因。我国最新数据表明肺癌发生率及死亡率均居恶性肿瘤的首位,其中女性发病率仍处于逐年上升趋势,年平均增长约0.9%。
  作为全球重要的公共医疗问题,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)表面抗原阳性流行率目前约为3.61%,全球统计数据结果显示全球约20亿人曾感染HBV,其中约2.4亿人为慢性HBV感染者。我国作为HBV感染最严重的国家之一,1~59岁普通人群中乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性携带率的最新数据为7.18%。
  据前期研究报道称,恶性肿瘤患者中HBsAg阳性率可达12%。合并HBV感染的肿瘤患者预后较差,认为接受化疗、放疗、靶向药物等相关病因治疗时可引起药物性肝脏损伤,还可能因乙型肝炎病毒再激活(hepatitis B virus reactivation,HBVR)导致病毒复制、机体免疫应答等因素造成进一步肝功能损伤。合并HBV感染可能是恶性肿瘤患者预后不良的独立危险因素。肺癌合并HBV感染的患者在临床上较为常见,HBV感染相关的肺癌患者治疗期间出现肝功能损伤风险的相关研究目前报道较少。
  研究目的:
  分析HBV感染的肺癌患者抗肿瘤治疗过程中肝功能损伤及HBVR的风险,旨在探讨肺癌患者肝功能损伤与HBV感染的相关性及预防性抗病毒治疗的临床的意义,从而为此类患者的个体化综合治疗提供一定的理论依据。
  研究方法:
  收集2015年6月-2017年6月在长海医院住院治疗的HBsAg阳性肺癌患者共61例(HBsAg阳性组),根据有无预防性抗病毒治疗分为预防性抗病毒组29例(干预组),未预防性抗病毒组32例(对照组),收集同期住院未合并HBV感染的肺癌患者61例为(HBsAg阴性组)。干预组在抗肿瘤治疗前1周即开始口服使用抗病毒药物恩替卡韦10mg、拉米夫定100mg,1次/天。对照组抗肿瘤治疗前未进行干预治疗。观察上述患者第1次、第3次、第5次入院时血清肝功能水平及HBsAg阳性组患者乙型肝炎病毒脱氧核糖苷酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV-DNA)水平。
  研究结果:
  1.HB sAg阳性组与阴性组比较:第3次入院时两组患者丙氨酸氨基转移酶、(P=0.048)、总胆红素(P=0.012)、前白蛋白(P=0.01)异常人数存在统计学差异。
  2.HBsAg阳性组中干预组与阴性组比较:第1次住院时丙氨酸氨基转移酶异常人数分别为4/29(13.7%)和2/61(3.3%)(P=0.029);第3次、第5次住院时干预组转氨酶水平大致恢复正常,与阴性组比较无差异。
  3.HBsAg阳性组中对照组与阴性组比较:第1次住院时肝功能异常人数差异无统计学意义(P>0.05);第3次、第5次住院时天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、凝血酶原时间异常人数均明显高于阴性组(P<0.05)。
  4.HBsAg阳性组内干预组与对照组比较:第3次入院时丙氨酸氨基转移酶(P=0.003)、天冬氨酸氨基转移酶(P=0.007)、总胆红素(P=0.024)水平均低于对照组;两组肝功能损伤发生率分别为3.4%和25%,中重度升高者占所有肝损患者的比率分别为0%和75%,两组间统计学差异有显著性(P=0.003)。
  5.HBVR发生率干预组与对照组比较明显减低(9%vs19%)。
  研究结论:
  HBsAg阳性肺癌患者肝功能损伤较HBsAg阴性者升高。预防性抗病毒可降低肝功能异常的风险及HBV再激活发生率,预防性抗病毒治疗存在其必要性。
[博士论文] 彭浩然
微生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)为有包膜的单股正链RNA病毒,是引起人类肝病的重要致病因子。目前全球HCV感染者约1.2到1.7亿,其中发病率以非洲最高,欧美等国家较低。HCV主要经血液传播,引起肝炎、肝脂肪变性、肝硬化以及肝癌等肝脏疾病,并与糖尿病、淋巴瘤等肝外疾病高度相关。慢性感染是HCV感染致病的重要特征,HCV感染者在感染初期大多无明显症状,约80%感染者发展为慢性感染时才表现出肝病临床症状。HCV慢性感染是欧美、日本等发达国家肝硬化、肝癌等终末期肝病的主要致病因素。
  自1989年被发现以来,HCV的分子生物学与感染、致病机制以及药物与疫苗研究受到全球关注,HCV复制子(HCV replicon)与细胞培养来源的HCV(cell culture derived HCV,HCVcc)模型的建立是HCV研究历史上的重要里程碑,成为该研究领域的有力推手。基于HCV细胞感染模型的研究为开发抗HCV药物提供了重要工具,近年来上市的新一代直接抗HCV药物(DAAs)使得丙型肝炎成为可治愈的疾病。彻底消除丙型肝炎仍有赖于有效疫苗的上市应用,丙肝疫苗的研发与艾滋病疫苗存在相似的困境,尽管一系列不同类型的丙肝疫苗处在研发过程中,但是其中部分疫苗已经终止了研发进程。目前没有一种疫苗显示出良好的应用前景。
  由于RNA聚合酶在指导HCV基因组复制过程中乏校对机制,导致HCV基因组的高度异质性,因而HCV在感染者体内以准种或类似株(quasispecies)形式存在。根据基因组的异质性,HCV被分为7个不同基因型,每个基因型又包含数十个不同的亚型。HCV基因组的高度变异是其感染后高发慢性化感染的重要原因之一,也是HCV疫苗研发面临的最大障碍。
  中国属于HCV中等流行区,HCV感染者有3000-4000万人,基因型呈现典型的区域分布特征,以1b和2a型为主,但珠三角和西南地区则以3型和6型更为常见。HCV包膜蛋白由E1、E2两个糖蛋白形成的异源二聚体组成,介导HCV的细胞侵入过程,E1、E2均为高度糖基化的蛋白,其中E2蛋白的功能研究的比较清楚,该蛋白是介导HCV与肝细胞表面多个受体序贯作用,引发细胞膜内吞的主要蛋白。在HCV感染者血清中可检测到针对各基因型的交叉中和抗体,这些抗体主要针对的靶标是E2蛋白。病毒被内吞入胞以后,病毒包膜与内吞小体膜的融合可能由E1蛋白引发,但总体上对E1蛋白的功能还有待进一步深入研究。针对E1蛋白的中和抗体较少有报道。
  目前还不能直接从感染者血清中直接分离、培养HCV,HCVcc是目前在细胞层面研究HCV感染机制的最天然模型,HCVcc入侵宿主细胞的方式、感染特性、病毒的生命周期等方面与感染者血清中的HCV颗粒高度相似。HCVcc颗粒性状与感染者血清中的HCV颗粒均结合有大量的脂蛋白,与脂蛋白的结合一方面有助于病毒颗粒与肝细胞表面的肝素、低密度脂蛋白受体等捕获分子结合从而有助于病毒在肝细胞表面的富集;另一方面,脂蛋白能隐藏HCV包膜蛋白种的中和表位,从而有利于HCV逃避体液免疫应答。被研究者广泛使用的HCVcc均含有2a型JFH-1株的非结构基因,不同型/株结构基因与JFH-1株置换重组可得到感染性高低不同的HCVcc。将转录得到的HCV基因组RNA转染人肝癌细胞系Huh7或Huh7衍生的Huh7.5.1细胞,HCVcc即可产生并释放到细胞培养上清中。在前期实验中发现,以电穿孔方式转染HCV基因组RNA制备的原代J6/JFH1嵌合HCVcc对HCV感染者血清的中和抗体敏感性与连续传代制备的HCVcc有明显差异。基于该现象,本研究探究了HCVcc在连续传代培养过程中包膜蛋白出现的适应性突变对病毒感染特性的影响。另一方面,本研究对一起聚集性HCV感染人群血清样本的病毒中和活性进行检测,并对病毒中和活性与病毒载量之间的相关性进行分析。
  第一部分 HCV包膜蛋白突变对其功能的影响
  HCV包膜蛋白是暴露在病毒颗粒表面的结构蛋白,在病毒的感染和免疫逃逸中发挥重要作用。本研究通过对传代制备的病毒进行深度测序后发现,包膜蛋白中存在F291V、T331S、T444P突变。F291V突变位于E1蛋白中,T331S和T444P突变位于E2蛋白中。于是分别在原型质粒中引入这些突变,并制备相应含这些突变的HCVcc:含F291V、T331S、T444P突变的E41/JFH1株;含T444P突变的D42/JFH1株以及含F291V突变的B43/JFH株,以期研究包膜蛋白突变对病毒功能的影响。
  结果发现包膜蛋白突变使HCVcc滴度上升10-15倍,而且各突变不影响病毒E2蛋白表达及病毒入侵宿主细胞的速率。但突变在增加病毒包装和释放效率的同时,使病毒表面结合的脂蛋白含量增加,病毒滴度增加,密度降低,对SR-BI受体和脂蛋白信号通路的利用度加大。在没有中和抗体筛选和宿主免疫系统的进化压力下,病毒的复制包装释放效率都在不断的提高,病毒朝着高滴度的方向进化。体现了病毒进化上在功能和环境的自然统一。
  第二部分 包膜蛋白突变对HCV抗体中和活性的影响
  用2a型HCV患者血清对E41/JFH1株和J6/JFH1株病毒进行中和实验,结果发现,HCV患者血清能够明显中和E41/JFH1株突变病毒的感染,而较难中和J6/JFH1株病毒感染。APOE抗体在1∶50稀释时能中和76%的E41/JFH1株病毒感染,而对J6/JFH1株感染则只中和55%;用HCV包膜蛋白E2的77-661,3A,5A抗体及HVR1的抗体TW-SHC对E41/JFH1株病毒和J6/JFH1株病毒进行中和实验。结果发现:这些抗体均能有效的中和E41/JFH1突变病毒的感染,中和活性分别70%,75%,65%和60%,而J6/JFH1株则难以被中和。说明这些抗体对E41/JFH1突变株病毒有交叉中和活性,包膜蛋白突变并没有影响病毒的中和表位。
  用77-661,TW-SHC,APOE及CD81抗体对E41/JFH1和J6/JFH1高/低密度病毒进行中和,结果发现77-661抗体,对E41/JFH1和J6/JFH1高/低密度病毒中和效率分别为76%和42%与56%和24%,说明77-661抗体作为包膜蛋白E2的抗体能够更加有效的中和高密度病毒的感染;而TW-SHC抗体对E41/JFH1和J6/JFH高/低密度病毒中和效率分别为65%和10%与86%和29%,说明TW-SHC抗体较难中和高密度J6/JFH1病毒,而对E41/JFH1株低密度病毒中和作用较好;APOE抗体对E41/JFH1和J6/JFH1高/低密度病毒中和效率分别为45%和23%与88%和37%,说明包膜蛋白突变增加了APOE抗体对突变病毒的中和活性。而CD81抗体则对E41/JFH1和J6/JFH1高/低密度病毒中均有较好的中和活性,说明突变不改变病毒对CD81受体的利用,不同密度的颗粒对CD81受体的利用也无明显的差异性。
  包膜蛋白的突变改变了病毒对受体利用及中和抗体活性,这体现了HCV在进化和功能上的统一,病毒以适度降低其感染性为代价,逃避宿主的中和抗体,但却保证了病毒的持续感染,体现了病毒自然选择的特点。同时本研究还鉴定出HCV包膜蛋白中有利于病毒免疫逃逸的氨基酸残基,对研究病毒的进化和免疫逃逸具有重要的意义。
  第三部分 聚集性HCV感染者血清中HCV中和抗体与病毒载量的相关性分析
  本部分实验通过对云南某一地区聚集性HCV感染的血清样本进行分析,发现HCV RNA拷贝大于≥1×106的组别中,ALT和AST的数值呈现了降低的趋势;通过对患者体内中和抗体和HCV E2抗体的研究发现中和抗体不能有效抑制慢性HCV患者体内病毒的复制,中和抗体在慢性化感染中并不起保护作用。
  本研究探究了HCV在家庭成员间传播的风险,并分析感染者肝功能,中和抗体水平与血清中病毒载量的关系。证实慢性HCV患者血清中高滴度的中和抗体并不能对患者起到保护作用。
  结论:本研究通过探究HCV包膜蛋白在传代过程中产生的适应性突变对病毒感染特性、抗体中和活性、受体利用度的影响和一例聚集性HCV感染者血清学特性分析,加深了对HCV包膜蛋白致病机制和病毒免疫逃逸的理解。
[博士论文] 方文捷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  侵袭性酵母感染占所有真菌感染的90%以上,引起包括念珠菌病、隐球菌病和毛孢子菌病在内的多种严重真菌病。一方面,临床对于高发、新发致病酵母感染的流行病学和临床特征缺乏认识。侵袭性酵母感染病原谱的不断变迁,以往不致病或者较少致病的酵母感染病例逐年增多,同时传统高发病的酵母感染逐渐累及新的的基础病群体。比如,念珠菌属的多种非致病菌(如Candida auris,Candida fabianii)近年来逐渐成为致病菌,有些甚至发生了暴发流行,但是其流行病学、临床特征和干预策略的相关研究仍然较为滞后。又如,虽然国际上对于隐球菌脑膜炎的临床研究日益增多,但是目前对于隐球菌病的临床流行病学研究主要集中于HIV阳性人群。临床研究工作者较少从其他免疫状态人群入手,对该类患者的临床特征和诊疗策略进行系统的、分类的分析;由于缺乏临床证据,国际指南暂缺乏对不同免疫状态人群的特异性临床干预策略。据此,本研究的第一、二、三、四、五、六部分旨在填补新发、高发侵袭性真菌感染临床流行病学方面相应的空白。另一方面,由于侵袭性酵母感染病原谱的不断变迁,将微生物鉴定到菌种水平显得愈发重要,故传统诊断技术的局限性日益显现。本研究第七、八、九、十部分利用分子诊断的方法,重点针对以下三个方面开发诊断新技术:1、开发一套诊断策略,可以精准、低成本实现95%以上酵母感染的诊断;2、开发一套针对9个最常见医学相关念珠菌隐匿种的鉴别方法,用于解释90%左右的念珠菌感染;3、针对耳道念珠菌及其近缘种,实现通量高、敏感度高、特异性好、低成本分子诊断方案。
  方法:
  本系列研究第一、二、三、四、五、六部分的临床数据来源于上海长征医院、上海长海医院、伊朗设拉子大学医学科学院及9个国内外医学文献数据库。使用预先设计的表单,使用EPIDATA等软件抽取临床数据。在统计分析上,我们运用卡方检验分析分类变量;多重回归分析用于确定患者预后的独立预测因子;单个率合并分析用于确定全球患病率。
  本系列研究第七、八、九、十部分属于分子诊断体系研发。所用参考菌株来自全球最大的菌种保藏和医学真菌研究中心Westerdijk Fungal Biodiversity Institute,临床菌株来自中国、伊朗,科威特和奥地利多家医院。靶标序列来自本研究所内部数据库以及Genbank。序列分析和引物设计使用Geneious(@)10.1.2软件。体系以参考菌株优化并完成特异性试验后,进一步利用临床菌株体系扩大验证,并同MALDI-TOF MS和一代测序鉴定结果平行比较。
  结果:
  第一部分研究发现:目前全球62.9%的结核/隐球菌共感染病例发表于我国(n=197),56.3%的我国病例发表于2010年之后;99.5%的病例分布于我国季风区。在临床表现上,HIV阳性患者伴发结核/隐球菌共感染的症状比HIV阴性患者更加严重。在诊断方面,几乎所有的结核性脑膜炎合并隐球菌脑膜炎病例均经历误诊或者漏诊(95.2%)。为了解决这一诊断难题,本研究首次提出“联合应用颅内压和脑脊液糖、蛋白、氯”的联合诊断策略,该策略可有效区分结核性脑膜炎单独感染、隐球菌性脑膜炎单独感染以及结核/隐球菌脑膜炎共感染(AUC=0.89),同时不增加患者经济负担。
  第二部分研究发现:在SLE人群中,隐球菌脑膜炎的患病率为0.5%。患者主要以成人女性为主。感染前激素治疗剂量大于30mg/day泼尼松当量同高死亡率相关(OR=9.69(1.54,60.73))。36.8-38.9%患者在隐球菌脑膜炎发病过程中,狼疮活动呈现较低水平,感染发生较为隐匿。该疾病总误诊率为38.2%,死亡率为23.6%。
  第三部分研究发现:在SLE病程中,狼疮脑病发生时间早于隐球菌脑膜炎(p=0.03)。除发热,头痛和颈部僵硬外,大多数临床表现无法区分两个疾病状态(p<0.05)。狼疮脑病患者C反应蛋白值通常正常,而其在隐球菌脑膜炎患者中通常升高(p=0.08)。脑脊液压力和生化检查具有较高的诊断价值(AUC>0.7)。
  第四部分研究发现:Ⅱ型糖尿病隐球菌患病率为0.21%。此类患者平均年龄为56.1岁(95%CI:51.5,60.6),93%的患者年龄大于40岁。感染前62%的患者未经糖尿病管理或血糖控制不良。MLST分型示所有临床菌株属于ST5型,抗真菌药敏试验未发现耐药菌株。69%肺隐球菌病患者经历误诊误治,60%隐球菌脑膜炎患者接受不标准的抗真菌治疗。总体死亡率为33%。
  第五部分研究发现:肾病综合征患者中隐球菌病的患病率为0.3%。从肾病综合征确诊到隐球菌病确诊的中位时间间隔为16个月。46%隐球菌病发生于肾病综合征确诊第一年内。皮肤隐球菌病占所有类型隐球菌病的比例较高(35%)。58%患者经历了误诊误治,误诊病例中90%被初诊为细菌感染。总体死亡率为35%。
  第六部分研究发现:大部分Cyberlindnera fabianii感染病例分布于西欧和波斯湾沿岸。新生儿发病占比较高。中心静脉置管、感染前接受过抗生素治疗、新近接受过外科手术、肿瘤患者以及化疗、激素暴露、透析、低白细胞血症、机械通气和营养不良等可能为其患病的危险因素。Cy.fabianii最常被误诊为Candida utilis,其次为Candida pelliculosa,H.anomala,Pichia jadinii和Candida boidinii。抗真菌药敏试验显示对于氟康唑、伏立康唑、两性霉素b的耐药率分别为16.7%,12.5%,8.3%和12.5%,而对于卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净和氟胞嘧啶,均未见耐药菌株。总体病例死亡率为33.3%(8/24)。本研究进一步研发的多重PCR鉴别诊断体系可以准确鉴别Cy.fabianii及其近缘种,特异性100%,可作为临床API等检测试剂盒的补充。
  第七部分首次报道了一项称为“YEAST PANEL”新型临床致病酵母诊断策略,该诊断方法通过最多三次共21重PCR,鉴定并准确区分念珠菌属、毛孢子菌属、红酵母属、隐球菌属以及白地霉属在内的95%以上酵母感染。体系的优化和首轮验证使用了400株CBS参考菌株,并证实可以在不提去DNA的前提下以单菌落作为模板扩增。进一步通过2次共计800株临床菌的第二轮盲法试验证实,在上述菌株的鉴定上,该技术同MALDI-TOF MS以及ITS/LSU测序具有较为等同的准确性。
  第八部分首次实现无需DNA提取的一步法9重PCR,在单管检测并区分C.albicans,C.dubliniensis,C.africana,C.glabrata,C.nivariensis,C.bracarensis,C.parapsilosis,C.orthopsilosis,和C.metapsilosis。且同系统发育学上关系由近及远的酵母菌、曲霉菌以及人类DNA不存在交叉反应。利用临床菌株同MALDI-TOF MS平行比较发现,本PCR准确鉴别了所有的菌株,而MALDI-TOF无法区分C.albicans和C.africana。
  第九部分建立和验证一种新型多重终点PCR,用于Candida auris,C.haemulonii,C.dubushaemulonii和C.pseudhaemulonii的临床筛查和诊断。使用该检测体系分别在中国和伊朗进行了前瞻性和回顾性临床菌种筛查,研究发现了中国第一株C.pseudhaemulonii临床分离株和伊朗第一株C.haemulonii临床分离株。本研究首次建立了C.auris和C.haemulonii两个菌种的动物模型,以供诊断体系验证。多重PCR对于感染小鼠的血液和组织的总体阳性率分别为28.6%和92.9%。
  第十部分建立和验证一项溶解曲线法四重实时荧光定量PCR,用于Candida auris,C.haemulonii,C.dubushaemulonii和C.pseudhaemulonii的临床筛查和诊断。使用177株真菌验证该体系,发现其特异性为100%,具有高度的可重复性(R2=0.99%),且检测极限值高达10CFU/PCR。以来自科威特的106株被MALDI-TOF MS鉴定为耳道念珠菌的临床菌株进行多技术比较性试验。结果发现,我们的检测体系同以往发表的一项单重探针PCR以及D1/D2测序的结果符合率为100%,且其准确性高于MALDI-TOF MS。
  结论:
  一方面本系列研究阐明高发感染隐球菌病不同免疫状态患者的流行病学、临床特征、影响发病和预后的危险因素等,并在此基础上针对上述诊疗难点,提出鉴别诊断策略。同时首次描述了新发感染C.fabianii的流行病学和临床特征,并提出新型鉴别诊断新策略。
  另一方面本系列研究基于目前致病酵母病原谱的变迁,尤其是针对包括中国在内的发展中国家,成功建立了四项廉价、特异、准确的多重早期诊断技术,并完成初步临床验证。上述体系均有望在临床得以推广应用,作为现有诊断工具的补充或替代技术。
[博士论文] 杨龙
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:白念珠菌作为条件致病菌寄生在健康人体的口腔和小肠粘膜中,当机体免疫力低下时,其可侵入机体引发系统性感染。系统性白念珠菌感染是最常见的院内真菌感染,包括念珠菌血症和深部组织感染。系统性白念珠菌感染患者死亡率较高,即使接受药物治疗,死亡率仍可高达40%。因此,在治疗过程中,改善患者的机体免疫力被认为是增强治疗效果的理想手段。入侵机体后,白念珠菌表面的病原相关分子模式被免疫细胞中表达的模式识别受体识别后激起机体的免疫反应。目前研究已发现多种识别白念珠菌的模式识别受体,如Toll样受体,C型凝集素受体等。白念珠菌表面的β葡聚糖和甘露糖能够分别结合C型凝集素受体Dectin-1和Dectin-2,激活磷脂酶Cγ(PLCγ),产生(1,4,5)-三磷酸肌醇(inositol1,4,5-trisphosphate,InsP3)。InsP3结合InsP3R(InsP3R)引发内质网中钙离子的释放,使胞内钙离子浓度升高。细胞内钙离子调控多种细胞免疫功能,如活性氧的产生,细胞因子分泌和吞噬等。本课题从酵母双杂交实验筛选到SEC5蛋白能够结合InsP3R的碳末端出发,对SEC5与InsP3R的相互作用及其对抗白念珠菌固有免疫的影响进行了研究。
  第一部分,SEC5与InsP3R相互作用。首先通过GST pull down实验和CO-IP实验验证了酵母双杂交实验的筛选结果,从蛋白水平证明SEC5与InsP3R结合。免疫荧光共定位实验发现SEC5与InsP3R主要分布在细胞质中,并在细胞核周围与InsP3R共定位明显。荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)实验证明SEC5与InsP3R共定位区域的空间距离小于10nm,提示SEC5与InsP3R在细胞内直接相互结合。为进一步验证我们的假设,我们对SEC5与InsP3R相互作用的区域进行了深入探索。InsP3R的C末端含有4个α螺旋结构域(H1-H4),分别构建GST-H1/H2/H3/H4融合表达质粒,转化大肠杆菌,表达纯化获得GST-H1/H2/H3/H4融合蛋白beads,并与RAW264.7细胞裂解液进行GST pull down实验,结果发现H1片段能够结合裂解液中的SEC5蛋白。为研究SEC5与InsP3R-H1的结合区域,将SEC5蛋白分为4段(SEC5-1/2/3/4),融合His标签在大肠杆菌中表达。用纯化得到的GST-InsP3R-H1beads与表达有SEC5-1~SEC5-4蛋白片段的大肠杆菌裂解液进行pull down实验,结果发现SEC5-2段和SEC5-4段能够结合InsP3R-H1。综合本部分实验结果表明,SEC5作为一个新的InsP3R相互作用蛋白,直接结合于InsP3R的碳末端。
  第二部分,SEC5-InsP3R相互作用调控InsP3R离子通道活性。首先利用钙离子成像实验检测SEC5-InsP3R相互作用对细胞内钙离子浓度变化的影响,结果发现,在HEK293细胞中,SEC5过表达能够促进卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子浓度的升高,而下调SEC5的表达能够抑制卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子的升高。InsP3R特异性的抑制剂Araguspongin B(ARB)能够抑制SEC5对卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子的升高的促进作用。为了验证SEC5与InsP3R的相互作用对InsP3R介导的钙离子释放的影响,我们设计并合成了能够透过细胞膜,并具有干扰SEC5与InsP3R的相互结合作用的干扰多肽H1-TAT及其对照多肽H1S-TAT。利用CO-IP实验进行验证后,证明HI-TAT能够抑制SEC5与InsP3R的结合。利用钙离子成像实验检测经H1-TAT及对照多肽H1S-TAT处理的细胞,发现H1-TAT能够抑制对照细胞和SEC5过表达细胞中卡巴胆碱引起的胞内钙离子的升高,进一步证明SEC5与InsP3R的相互作用影响InsP3R介导的钙离子释放。为考察SEC5是否直接影响InsP3R的离子通道活性,利用体外表达纯化的SEC5-2多肽片段进行膜片钳电生理实验,检测结果发现,在相同的InsP3浓度刺激条件下,SEC5-2多肽能够增强InsP3R的活性。综合本部分研究结果,说明SEC5与InsP3R相互作用,能够直接调控InsP3R离子通道的活性,并影响细胞内钙离子的升高。
  第三部分,SEC5蛋白与InsP3R相互作用影响小鼠巨噬细胞对白念珠菌的吞噬。首先通过钙离子成像实验发现BMDM细胞吞噬白念珠菌起始阶段细胞内钙离子浓度瞬时升高。而用细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM和InsP3R特异性抑制剂ARB预处理,能够抑制BMDM对白念珠菌的吞噬作用,说明InsP3R介导的胞内钙离子的释放影响巨噬细胞的吞噬作用。为考察SEC5在BMDM吞噬白念珠菌中的功能,利用转染过表达质粒或siRNA的方法改变细胞中SEC5蛋白的表达水平,结果发现在BMDM细胞中过表达SEC5能够显著促进BMDM对白念珠菌的吞噬作用,相反,下调SEC5表达能够抑制BMDM的吞噬功能。免疫荧光实验发现SEC5与InsP3R在吞噬小体上有明显共定位;同时,CO-IP实验结果表明白念珠菌刺激能够促进SEC5与InsP3R的结合。用H1-TAT多肽干扰SEC5与InsP3R的相互作用,能够显著抑制BMDM细胞的吞噬作用。上述研究结果说明SEC5与InsP3R的相互作用影响BMDM细胞对白念珠菌的吞噬作用。
  第四部分,SEC5与InsP3R相互作用调控TBKI-IRF3通路介导的抗白念珠菌天然免疫反应。首先利用白念珠菌刺激BMDM细胞,并用western blot实验检测TBK1的磷酸化激活水平及转录因子IRF3的入核情况,发现白念珠菌刺激能够激活TBK1-IRF3通路,而下调SEC5蛋白表达能够抑制该通路的激活。GST pull down实验发现InsP3R能够与SEC5,TBK1形成复合体,并且白念珠菌刺激促进该复合体的形成。进一步的机理研究发现在SEC5蛋白分子内,SEC5-2片段和SEC5-rbd结构域结合,阻碍SEC5-rbd与TBK1的结合,对SEC5-rbd结构域产生自我抑制。InsP3R的H1段与SEC5-rbd竞争性结合SEC5-2区域。InsP3R的H1段结合SEC5时能够将SEC5-rbd结构域从SEC5-2区域中解离,促进SEC5-rbd与TBK1的结合,导致TBK1的激活。
  综上四部分实验研究结果,我们发现并验证了SEC5为一个未经报道的InsP3R相互作用蛋白,并且能够调控InsP3R离子通道活性,影响InsP3R介导的细胞内钙离子的释放。同时,我们发现SEC5与InsP3R的相互作用影响巨噬细胞对白念珠菌的吞噬,并调控TBK1-IRF3通路介导的抗白念珠菌天然免疫,发现了机体抗白念珠菌免疫反应的一种新的分子调节机制,为临床抗白念珠菌免疫治疗提供了新的理论依据。
[硕士论文] 林文婷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  隐球菌性脑膜炎是预后十分凶险的深部真菌感染,它好发于免疫缺陷人群,若不积极治疗,死亡率高。两性霉素B(简称AMB)是国内外治疗指南中治疗隐球菌性脑膜的首选用药,但因为其副作用多且严重,难以透过血脑屏障,使隐脑治疗效果下降。鞘内给药能提高脑脊液中AMB的浓度,但神经毒性较大,而且需要反复腰穿,难以达到理想的药代动力学水平,对疾病控制不利。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物是一种可注射性智能型水凝胶,生物兼容性良好,在低于体温时是液态,能够包载药物,达到体温时变为凝胶状态,能够缓慢控制释放药物。本实验用PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物来负载AMB,并进行鞘内注射,使AMB在脑脊液中得到缓慢释放,减少给药次数,减轻AMB的毒副作用,解决隐球菌脑膜炎目前的治疗困境。
  方法:
  第一部分,AMB凝胶的获取和相关性质检测。首先合成了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物,用核磁共振和凝胶渗透色谱仪确定该聚合物的分子结构和并对其性能进行表征。用生理盐水将聚合物溶解成不同浓度的聚合物水溶液,测定其凝胶化温度,根据结果选择合适的浓度的聚合物水溶液进行后续研究;用物理载药方法将聚合物AMB负载于聚合物水溶液中(简称AMB凝胶),并对载药前后的聚合物水溶液进行流体力学检测,以判断AMB对该水凝胶是否有影响。
  第二部分,AMB凝胶的体外实验。配制2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶,置于缓释液中,定时更换缓释液,测定AMB凝胶体外缓释度,绘制体外释放曲线,计算累计释放度,用药物缓释曲线中的一阶方程对缓释数据进行拟合。
  第三部分,AMB凝胶的体内实验。在毒理学研究方面,选取健康大鼠为实验对象,将AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶、生理盐水分别进行鞘内注射,每天观察每组大鼠给药后的情况,用Tavlor's评分评估四肢活动能力,记录大鼠死亡或存活情况,在给药后的第7天取做大鼠脊髓做HE染色观察脊髓损伤程度,与以上三个指标比较各组药物对脊髓的神经毒性。在药效学研究方面,建立大鼠隐球菌脑膜炎模型,在建模后的第7天开始用AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶进行鞘内注射,在造模后的第14天和第21天取脑脊液做脑脊液培养计数和乳胶凝集试验,进行治疗效果的评价。
  结果:
  第一部分,通过对三嵌段聚合物的结构和性能表征,结果显示该聚合物分平均分子量为1790-1500-1790,聚合物的结构分布控制非常好,是理想的产物。其液体-凝胶转变相温度为34℃,25wt%聚合物水溶液课用于医用。载药前后聚合物水溶液的流体力学行为不发生变化,说明AMB对该聚合物水溶液没有影响。
  第二部分,体外缓释结果表明AMB凝胶可以缓慢释放AMB长达36天,2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶累积释放度分别为89.0%、77.1%、65.6%,AMB缓释数据符合药物缓释的一阶方程(R2>0.95)。
  第三部分,在毒理学实验中,AMB凝胶组大鼠四肢的Tavlor's评分高于普通AMB(P<0.05),AMB凝胶组大鼠的生存率明显高于普通AMB(P<0.05),HE染色结果显示AMB凝胶的脊髓损伤程度较普通AMB轻,以上结果表明AMB凝胶的神经毒性明显低于普通AMB。在药效学实验中,脑脊液培养结果显示AMB凝胶组大鼠脑脊液中菌体数量低于普通AMB组(P<0.05),乳胶凝集试验结果表明AMB凝胶组脑脊液隐球菌抗原滴度数低于普通AMB组(P<0.05),这都说明AMB凝胶的治疗效果优于普通AMB。
  结论:
  PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物水溶液负载AMB所得到的AMB凝胶较普通AMB有较多优势。它能缓慢释放AMB超过30天,体内的抗菌效果优于普通AMB制剂,此外它还能减轻鞘内注射AMB的神经毒性,减少鞘内给药次数,是比较理想的治疗隐球菌脑膜炎的药物,同时也是一种很好的鞘内缓控给药的手段。隐球菌性脑膜炎作为模式疾病,为其它疾病的鞘内缓控给药提供借鉴意义。
[硕士论文] 张龙严
微生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:据统计,丙型肝炎病毒感染人数全球约1.7亿人,占世界总人口3%。急性HCV感染通常无症状,慢性率高达80%,是肝硬化、肝癌等终末期肝病最常见的原因之一。由于经典治疗方法聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗不良反应多,持续病毒学应答率低,受患者的健康状况和HCV基因型限制等原因,现在指南首选直接抗病毒药(DAAs)索非布韦,达卡他韦以及索非布韦/来地帕韦联合治疗,治愈率可达95%以上,比经典疗法更加有效、安全,耐受性更好,大大降低了肝癌和肝硬化的死亡风险。但HCV的高突变性也使小分子抑制剂的耐药屏障较低,且尚无有效的疫苗问世。
  在HCV感染后宿主细胞可通过激活固有免疫抑制病毒复制,而病毒也通过一系列复杂的机制改变宿主细胞免疫因子与宿主细胞维持相对稳态,导致感染的慢性化。前期利用基因芯片对HCV感染后的Huh7细胞进行表达谱分析和蛋白水平检测显示,HCV感染可以促进Huh7细胞中TXNIP表达水平显著上调。而本研究进一步利用RNA干扰技术也确认了TXNIP对HCV复制及细胞自噬具有重要影响。另外,针对Huh7和Huh7.5.1这两种HCV易感性显著不同的同源细胞株,以往文献认为RIG-Ⅰ突变造成的固有免疫功能缺失是HCV在Huh7.5.1细胞内复制增强的主要原因,但其识别机制仍存在争议,近期有文献报道MDA5也参与识别HCV,而通过分析两种细胞株发现TXNIP差异化表达也是导致Huh7.5.1对HCV易感的重要原因之一。
  为了探究HCV与固有免疫的相互作用机制,寻找HCV挟持宿主因子逃避细胞固有免疫的更多证据,将HCV感染后的Huh7和Huh7.5.1细胞培养上清处理CD81-Huh7细胞,发现上清中存在可溶性因子上调TXNIP表达,通过对HCV感染12h,36h,60h后的Huh7细胞进行转录组测序分析,筛选出显著上调的细胞因子IL-11和TNF-α,随后利用外源性细胞因子处理Huh7细胞,在mRNA水平和蛋白水平检测发现IL-11显著上调Huh7细胞内TXNIP表达,而TNF-α显著抑制TXNIP表达。利用IL-11抑制剂处理Huh7细胞后也观察到TXNIP表达水平和HCV RNA均明显降低。另一方面,通过对比检测Huh7和Huh7.5.1细胞,发现Huh7.5.1细胞IL-11表达量显著高于Huh7细胞。这些结果表明IL-11差异化表达同样是Huh7.5.1细胞对HCV易感的重要因素之一。另外,通过刺激干扰素通路信号分子RIG-Ⅰ和MDA5,推断出Huh7.5.1细胞MDA5信号通路存在不足,同时,刺激Huh7细胞MDA5可以上调TXNIP表达,这为HCV感染逃避细胞固有免疫的策略提供了新的思路。
  鉴于TXNIP在机体正常生理功能和应激条件下均发挥重要作用,而IL-11作为一种可被HCV感染诱导产生的负性免疫调控因子,与HCV复制及逃避固有免疫作用机制的研究在国内外文献中尚未见报道,本研究首次揭示了IL-11在HCV感染中诱导TXNIP高表达的重要作用,初步阐述了其作用机制,并对Huh7和Huh7.5.1两种细胞株差异性支持HCV感染的机制提供了新的线索,也为开发现抗HCV药物新的作用靶点提供了参考。
[博士论文] 吕权真
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着临床上癌症治疗、器官移植中免疫抑制剂的使用以及艾滋病等疾病导致的免疫受损患者的增多,真菌感染的发病率也在不断攀升。院内血源性感染中真菌感染已经上升至第4位。即便在现有的抗真菌药物治疗下,系统性真菌感染导致的死亡率仍高达40%-70%。现有的抗真菌治疗手段有限,而唑类药物作为常用抗真菌药物出现了严重的耐药现象。在经过唑类药物长期治疗的患者中,分离的白念珠菌对唑类药物的耐药率高达40%。因此,阐明唑类药物的耐药机制,寻找新的抗真菌治疗的手段是临床抗真菌感染急需解决的问题。
  白念珠菌对于唑类药物的耐药机制研究已经取得了一些进展,主要是关于唑类合成通路以及外排泵相关基因的突变和高表达导致的耐药问题。阐明白念珠菌对于靶向于麦角甾醇合成的唑类药物的耐药机制,解决唑类耐药问题,需要彻底阐明白念珠菌麦角甾醇合成通路的调控网络。已有的研究表明,白念珠菌甾醇合成通路主要通过转录因子Upc2p调控相关甾醇合成酶的表达。但在酿酒酵母中,甾醇合成的调控不仅局限于转录水平还包括翻译后调控等方式,但这种翻译后调控的方式在白念珠菌中很少有文献报道,仍需要进一步研究。本文选取了与酿酒酵母中调控羟甲基戊二酰乙酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶稳定性的NSG2同源基因ORF19.273基因作为研究对象,研究其对于甾醇合成通路和唑类药物敏感性的影响。首先,通过HIS1-ARG4-LEU2营养筛选策略和融合PCR的方法构建了白念珠菌ORF19.273(NSG2)敲除菌和回复菌。初步考察ORF19.273缺失菌的表型发现,ORF19.273基因对于白念珠菌增殖速率、菌丝和被膜形成并无影响。而通过药物敏感性考察,发现ORF19.273敲除菌对于唑类药物敏感性升高,但对于唑类药物上游的抗真菌药物洛伐他汀、特比萘酚以及下游的抗真菌药物丁苯吗啉敏感性没有差异,对于两性霉素B耐受。对于洛伐他汀药物敏感性无差异提示ORF19.273和酿酒酵母中NSG2基因功能并不完全一致。透射电镜分析结果显示ORF19.273缺失菌细胞膜会出现轻微缺损,而在氟康唑作用下,ORF19.273缺失菌细胞膜损伤更为严重。除此之外,ORF19.273缺失后细胞膜通透性发生变化,对于不能透过细胞膜的碘化丙啶(PI)通透性增加,说明ORF19.273基因缺失后,白念珠菌细胞膜结构和功能均出现损伤。在白念珠菌中,麦角甾醇合成是影响唑类药物敏感性和细胞膜完整性的重要物质。通过气质联用(GC-MS)分析亲本菌和ORF19.273缺失菌以及回复菌中甾醇的百分比发现,ORF19.273敲除后,含有14α-甲基的甾醇obtusifoliol和14α-methylfecosterol在胞内累积,在氟康唑作用后,亲本菌中累积的主要是lanosterol,而ORF19.273缺失菌中累积的主要是含有14α-methylfecosterol、obtusifoliol、eburicol,这说明ORF19.273基因可以调控白念珠菌中各类甾醇的平衡,而在文献报道中,白念珠菌甾醇分布平衡是维持其对于唑类药物耐受的重要机制。因此,认为ORF19.273主要通过降低细胞内含有14α-甲基甾醇的比例维持白念珠菌对于唑类药物的耐受。体内结果与体外研究一致,在小鼠系统性白念珠菌感染模型中,ORF19.273基因缺失菌感染组在氟康唑治疗后,小鼠肾脏荷菌量和死亡率明显低于亲本菌感染组。本部分研究证实ORF19.273基因通过调控obtusifoliol和14α-methylfecosterol的水平,维持白念珠菌细胞膜完整性和白念珠菌对于唑类药物的耐受。
  除了化学药物治疗外,免疫治疗真菌感染领域也研究较为广泛。白念珠菌作为机会性致病真菌,其致病性与机体免疫系统的状态有着密切关系。近几年,文献已经报道了多种有效的抗真菌感染的单克隆抗体、减毒活疫苗以及重组蛋白疫苗,但关于疫苗的作用机制研究还相对较少。通过研究不同疫苗的作用机制和免疫系统清除真菌的关键环节可以为开发新的抗真菌治疗手段提供思路。本研究中发现白念珠菌转录因子FLO8缺失菌作为基因改造的白念珠菌弱毒株可以激活野生型小鼠的免疫保护作用。尾静脉注射flo8△活菌预免后,小鼠对于侵袭性白念珠菌感染、金黄色葡萄球菌感染以及肺部的烟曲霉菌感染和铜绿假单胞菌感染均能产生较好的免疫保护效果。通过长期预免策略,发现flo8△活菌可以刺激机体产生高水平的与白念珠菌结合的抗体,flo8△活菌预免的血清可以增强巨噬细胞对于白念珠菌的调理杀伤能力。在短期预免保护策略中发现flo8△活菌的保护作用不仅仅依赖于抗体,更依赖于其刺激产生的抗炎因子IL-10,IL-10可以降低正常毒力菌株SC5314二次感染时造成的急性炎症损伤,减少单核细胞和中性粒细胞的募集。同时IL-10可以保护胸腺在白念珠菌感染过程中不发生萎缩,通过上调抗凋亡基因BCL-2和BCL-XL的表达抵御白念珠菌感染引起的CD4+CD8+细胞凋亡。通过分析FLO8基因缺失菌细胞壁成分的变化,发现FLO8基因缺失菌表面的甘露聚糖,尤其是血清诱导后的甘露聚糖刺激巨噬细胞产生IL-10的水平升高。小鼠腹腔注射FLO8缺失菌甘露聚糖后,二次感染SC5314时,小鼠肾脏荷菌量降低,生存率升高,这说明FLO8表面的甘露聚糖是FLO8基因缺失菌诱导免疫保护效应的基础。在体外刺激巨噬细胞时,还发现FLO8缺失菌经过血清诱导后,可以特异性刺激巨噬细胞产生NO。标准菌株SC5314则需要在Pam3CSK4协同下刺激巨噬细胞产生NO,说明FLO8缺失后白念珠菌表面刺激NO产生的抗原增多,后来经过分离提取确定是白念珠菌氯仿甲醇提取物中的正丁醇部分能够刺激巨噬细胞产生NO。但体内研究发现,NO并不参与FLO8基因缺失菌诱导的免疫保护效应。综上所述,FLO8基因缺失菌主要通过表面的甘露聚糖刺激CARD9介导的IL-10的生成保护二次感染后小鼠的胸腺并提高小鼠的生存率。这种免疫保护机制可以为后续疫苗的开发以及抗真菌治疗提供新的理论指导。
[硕士论文] 王灵
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:肾综合征出血热是一种自然疫源性疾病,其发病后的主要临床表现为发热、背部疼痛、头痛、低血压、凝血功能紊乱和急性肾损伤,该疾病由汉坦病毒感染引起。肾综合征出血热的具体临床过程可以分为五期,即发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期。在部分病情较重的患者临床表现中,不同的时期可以相互重叠,而在部分病情较轻的患者临床表现中,某些时期则不会表现出来。肾综合征出血热患病人群中以农民占据绝大多数。同时,肾综合征出血热的暴发与流行受到季节的影响,通常在深秋至次年春季时高发。
  中国是肾综合征出血热的高发国家,在中国,肾综合征出血热被归为乙类传染病,并被认为能够对公众卫生健康造成巨大的危害。青岛市是中国境内肾综合征出血热的高发地区,根据青岛市卫生监测数据,自1974年至2015年,青岛市共报道有肾综合征出血热患者14516人,因该病死亡的人数为700人。自2007年起,青岛市疾病预防控制中心便对青岛市内发生的肾综合征出血热疫情进行监控。在疫区,卫生工作者通过患者临床表现和快速诊断试剂诊断肾综合征出血热。自2009年五月起,青岛市给五个农村地区(胶南市、平度市、胶州市、即墨市和莱西市)中的16-60岁人群提供疫苗来控制疫情的发展。因此,针对青岛市当地的肾综合征出血热流行趋势进行研究可以帮助更好的了解当地肾综合征出血热的疾病流行特点,为该疾病的预防和治疗提供指导。
  目的:明确青岛市当地的肾综合征出血热的时间、空间和人群分布特征,了解当地汉坦病毒动物宿主的繁殖规律,评判当地汉坦病毒疫苗接种措施的有效程度,探索青岛市气象因素、动物宿主因素与肾综合征出血热发病之间的相关关系,寻找汉坦病毒传播的新媒介,了解当地汉坦病毒的病毒亚型分类。
  方法:收集2007-2015年青岛市肾综合征出血热发病和死亡资料、2009-2015年青岛市农村地区汉坦病毒疫苗接种资料以及2011-2015年青岛市农村地区动物宿主捕获资料。于2016年在青岛市当地进行流行病学现场调查,收集动物宿主样本和寄生虫样本。提取肾综合征出血热患者血清、动物宿主肺部组织和螨虫等寄生虫内的RNA,对其进行Sanger测序,并将所得序列使用MEGA5.05软件进行分析。
  结果:2007-2015年间青岛市肾综合征出血热共发病1846人,死亡41人,该病的平均发病率为2.45/105。肾综合征出血热发病人群的平均年龄为46.5岁,发病人群中男性占据绝大多数(74.65%),共1378人;在职业分布上,发病人群中大多数为农民(83.37%),共1539人。在地区分布上,青岛市农村地区发病人数最多,共1728人,其次为城乡结合部,共84人,城市地区发病最少,共34人。
  2011-2015年间,青岛市农村地区共捕获动物宿主4081只,动物宿主种类包括黑线姬鼠、褐家鼠、小家鼠、黑家鼠、鼩鼱、仓鼠和黑线仓鼠。在室外捕获的动物宿主主要为黑线姬鼠、褐家鼠和仓鼠,占全部室外捕获动物宿主的73.44%;在室内捕获得动物宿主主要为褐家鼠和小家鼠,占全部室内捕获动物宿主的88.14%。
  2009-2015年间,青岛市农村地区历年的疫苗接种率分别为3.68%、2.73%、1.43%、1.66%、0.02%、2.21%和0.83%。经Cochran-Armitage趋势检验来评估2009-2015年青岛市农村地区疫苗累积接种率和肾综合征出血热发病之间的关系,结果发现青岛市农村地区的疫苗接种情况并未能影响当地肾综合征出血热的发病率。
  通过构建广义相加模型来探索肾综合征出血热与气象因素之间的关系,发现滞后3个月的降雨量与肾综合征出血热的发病率呈正相关。如果滞后3个月的温度在6.0℃到23.7℃之间,温度对肾综合征出血热发病率呈负效应(即该温度区间会减低肾综合征出血热发病风险);如果滞后3个月的温度高于23.7℃或者低于6.0℃,温度对肾综合征出血热发病率呈正效应(即该温度区间会增加肾综合征出血热发病风险)。如果滞后3个月的相对湿度在67.5%到85.7%之间,相对湿度对肾综合征出血热的发病率呈负效应(即该相对湿度区间会减低肾综合征出血热发病风险);如果滞后3个月的相对湿度大于85.7%或者小于67.5%,相对湿度对肾综合征出血热发病率呈正效应(即该相对湿度区间会增加肾综合征出血热发病风险)。考虑到青岛市动物宿主密度和汉坦病毒阳性动物宿主密度与肾综合征出血热患者发病率之间有着密切的关系,因此青岛市当地气象因素对肾综合征出血热流行趋势的作用可能是通过影响当地动物宿主密度和汉坦病毒阳性动物宿主密度来发挥作用的。
  最后,从肾综合征出血热患者、动物宿主肺组织和螨虫体内提取到了汉坦病毒的RNA,通过进化树分析汉坦病毒L片段,发现从螨虫提取的汉坦病毒序列与部分动物宿主体内的汉坦病毒序列相一致。值得注意的是,在青岛市肾综合征出血热患者、动物宿主和寄生虫体内提取到的汉滩病毒在进化树上距离较近,能够独立成簇,而小家鼠和褐家鼠体内提取的汉城病毒也能够独立成簇。
  结论:肾综合征出血热在青岛市农村地区(胶南市、胶州市、平度市、莱西市和即墨市)流行,并且每年在第四季度发病率达到高峰。黑线姬鼠、褐家鼠和小家鼠等啮齿类动物是汉坦病毒在当地的主要动物宿主。通过构建的广义相加模型,可以根据青岛市气象因素来预测肾综合征出血热在当地的发病趋势,同时根据动物宿主与肾综合征出血热发病之间的密切关联,认为气象因素有可能通过影响动物宿主来改变当地肾综合征出血热的流行趋势。此外,本研究还发现革螨和恙螨在汉坦病毒的传播中能够发挥作用,可能是宿主动物-人群传播之间的媒介。
[硕士论文] 邓捷文
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:树突状细胞(dendritic cells,DC)是由Steinman和Cohn在小鼠脾脏中所发现的一种具有树枝状突起的独特形态的细胞。DC是目前已知的最强的抗原提呈细胞,它是特异性免疫应答的触发者,因为它能够刺激初始型T细胞(na(i)ve T cell)活化和增殖,而M(Φ)、B细胞等只能触发已活化的T细胞或记忆性T细胞发生免疫应答。而且也有报道表明,活化的DC细胞能产生释放大量的炎症因子TNF-α和IL-6等。而大量炎性因子的释放促进全身炎症反应综合征的发生发展进一步诱导多器官功能衰竭。故对可调控DC功能的相关分子进行研究具有重要意义。
  同时,细胞凋亡与固有免疫的关系仍是目前研究的热点,凋亡相关分子对固有免疫的调节效应也逐渐被人们所关注。以往研究表明,作为TNFR和TNF家族重要成员的Fas和FasL分子是经典的凋亡诱导信号,但近年来的研究表明,Fas和FasL也可以分别传递信号,发挥不同于凋亡诱导的效应。FasL分子与Fas受体结合后,表达FasL分子的细胞其自身在FasL分子反向信号的作用下发生相应改变。相关的体内和体外实验也证明,FasL分子作为共刺激分子参与胸腺细胞成熟和成熟T细胞活化、增殖的过程,并且FasL分子,作为阳性选择的必需分子能够调节TCR与MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子的亲和力并提高胸腺细胞阳性选择的效能,但其发挥效应的具体机制尚不清楚。树突状细胞表面也表达FasL蛋白,但是FasL反向信号是否在DC中发挥效应仍有待进一步研究。
  之前的实验工作发现,活化性抗Fas抗体Jo-2不能有效诱导树突状细胞的凋亡,反而诱导DC表型和功能的成熟,并分泌释放细胞因子IL-1β和多种趋化因子。为了深入研究FasL反向信号在DC中的非凋亡效应,用Fas-Fc融合蛋白来模拟Fas分子的作用刺激野生型小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC),观察炎症因子的分泌、表型、吞噬能力以及抗原提呈能力的变化。初步实验表明BMDC在Fas-Fc的作用下IL-6和TNF-α分泌增加,且DC表面MHCⅡ和CD86的表达明显上调,CD80和CD40的表达轻微上调,且DC吞噬功能轻度减弱以及抗原提呈能力一定程度上有所提升。为进一步确认该现象,用FasLgld(FasL分子胞外段分子突变致胞外结合Fas功能缺失及胞内无法传递信号)小鼠进一步验证了FasL的反向信号对BMDC的效应,发现FasLgld小鼠来源的BMDC在Fas-Fc的作用下,TNF-α和IL-6的分泌减少,抗原提呈能力降低。为了进一步确认该现象,利用了FasLΔIntra小鼠(FasL分子胞外段能结合并触发Fas信号,但FasL分子胞内段突变不能有效激活下游信号通路),结果基本与FasLgld小鼠相一致。而且进一步研究发现,野生型小鼠来源的BMDC在某些MAPK通路抑制剂和Fas-Fc的共同作用下,TNF-α和IL-6的分泌减少,这说明FasL胞内信号促进DC分泌炎症因子,并且这一效应与MAPK通路相关,Western blot结果也进一步验证了这一现象。由于TNF-α和IL-6的分泌与多种疾病如自身免疫性疾病及感染性疾病相关,因此,研究FasL的反向信号对其分泌的影响及机制,将进一步加深人们对自身免疫疾病及炎症等疾病的发生发展的认识,为寻找这些疾病的治疗方案提供新思路。
  另一方面,知道FasL分子反向信号能诱导炎症因子的大量释放,而炎症因子的大量释放是系统性感染的重要特征。因此,想知道FasL反向信号在系统性感染过程中发挥怎样的效用。建立了真菌系统性感染模型,将一定量的白色念珠菌通过尾静脉分别注入WT、FasLgld、FasLΔIntra小鼠体内,结果发现FasLgld小鼠总体生存率提高,在感染48h后肝、肾真菌负荷量减少;同样地,FasLΔIntra小鼠对真菌感染也不敏感,其生存期明显延长,并且血清中的IL-6和TNF-α的释放显著降低,且感染48h后,FasLΔIntra小鼠肾脏的真菌负荷量显著减少。这一系列结果提示FasL反向信号的活化可能与真菌系统性感染导致的炎症损害及预后相关。已知重要的模式识别受体Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)和C型凝集素型受体(C-type lectin receptors,CLR)在识别细菌和真菌并诱导免疫反应的过程中发挥重要作用,而大量研究表明CLR能够结合大多数真菌细胞壁暴露的β-葡聚糖或甘露糖等配体分子,在抗真菌感染免疫中发挥主要作用。CLR,包括dectin-1,dectin-2,甘露糖受体,DC-SIGN和Mincle等在内能够识别结合真菌的多糖,诱导DC分泌TNFα、IL-1β、IL-6和IL-23以及趋化因子CCL2、CXCL1及CCL3。而之前的实验结果也表明FasL分子突变后的小鼠对于系统性真菌感染不敏感,炎症因子释放减少,这也提示FasL反向信号可能与CLR信号传导通路存在相互影响。为了验证DC的FasL效应在抗真菌感染反应中的作用,进一步研究DC中FasL与CLR的交互作用,通过体外培养WT、FasLΔIntra小鼠来源的BMDC,分别给予2μg/ml的zymd(dectin-1激活剂)、2μg/ml的mannan(dectin-2激活剂)刺激DC24h,结果发现FasLΔIntra来源的BMDCIL-6和TNF-α的分泌量显著降低;同样地,用Fas-Fc刺激WT和CLR缺陷小鼠(dectin-1-/-和dectin-2-/-小鼠)来源的BMDC,结果发现CLR缺陷小鼠IL-6、TNF-α因子分泌减少。这也进一步验证了FasL与CLR存在交互作用,但其分子机制有待进一步研究。
  综上所述,FasL分子反向信号通过多条经典的相关信号通路(如MAPK信号通路等)促进树突状细胞成熟活化并诱导炎症反应。而在急性系统性真菌感染过程中,FasL分子促进机体分泌大量炎症因子,在由败血症诱导的SIRS反应中发挥一定的效应。本研究进一步研究了FasL非凋亡效应及其机制,以期为真菌感染所致败血症的治疗提供新的理论基础。
[硕士论文] 傅维佳
内科学(传染病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:随着HBsAg定量检测技术的发展,临床研究发现HBsAg定量水平在抗病毒治疗过程中有重要的意义。但是HBsAg不仅来源于Dane颗粒(含有完整病毒核酸的感染颗粒),还有更多来源于管状或球形颗粒(非感染性的病毒空壳),所以HBsAg水平与抗病毒治疗并不完全平行,且目前缺乏大样本的临床研究,尚未形成标准化的评价体系。本研究旨在通过回顾性研究,观察核苷(酸)类药物长期治疗的CHB患者其基线HBsAg、HBeAg及HBVDNA定量水平及治疗过程中的动态变化,分析这些指标在CHB患者治疗过程中的临床意义。
  方法:回顾分析从2012年1月至2016年12月期间在第二军医大学附属长海医院感染科就诊及随访的4000例初治慢性乙肝患者,收集相关的临床病例资料,分析指标包括HBsAg、HBeAg、HBVDNA、年龄、性别,共筛选出其中资料齐全的940例样本进行分析。
  结果:1.HBeAg阳性CHB患者(439例)年龄小于HBeAg阴性组(501例),基线HBsAg,HBVDNA定量水平大于HBeAg阴性组。2.HBeAg阳性组中,基线HBsAg与HBeAg,HBVDNA呈正相关,基线HBeAg与HBVDNA呈较弱的正相关。3.HBeAg阴性组中,基线HBsAg与年龄成显著的负相关,与HBVDNA不相关。4.HBeAg阳性组中,经过长期抗病毒治疗,HBsAg,HBeAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到SR。经过4年抗病毒治疗,达到SR者138例,其中ETV组35,LDT组75,LDT+ADV组11,ETV+ADV组9,LAM+ADV组8例。5.HBeAg阴性组中,经过4年抗病毒治疗,全部达到VR,HBsAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。没有发现对疗效有预测价值的因素。
  结论:HBeAg阳性CHB患者,抗病毒治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到血清学应答。HBeAg阴性组中,没有发现对应答有预测价值的因素。
[博士论文] 武军元
预防兽医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是重要的人兽共患传染病,也是严重影响公共卫生安全的病毒性肝炎之一,戊型肝炎的分布特征具有全球性,在澳大利亚、美国和新西兰等环境卫生和经济水平比较发达的国家,戊型肝炎主要呈散发流行,而在亚洲等发展中国家戊型肝炎已经成为严重危害人和多种家畜健康的主要传染病之一。在中国,戊型肝炎依然是影响公共环境卫生安全的主要因素之一,新疆是我们国家人源戊型肝炎流行比较严重的地区,新疆南疆地区曾经暴发过至今为止全世界发病人数最多、经济损失和社会危害最大的一次流行,戊型肝炎已经成为新疆南疆当地不可忽视的公共卫生问题。为此,本研究论文对新疆南疆地区人和部分家畜戊型肝炎的流行现状进行了系统的分子流行病学研究,主要研究成果如下:
  1.新疆南疆地区不同人群戊型肝炎病毒抗体和抗原检测
  从新疆南疆喀什、库尔勒、和田以及阿克苏地区的市民当中随机采集血清样品2980份,血清样品信息记录完整。其中,汉族1328份,维吾尔族1652份,女性1521份,男性1459份,样品主要包括32份屠宰场工人血清、85份家畜及肉品销售人员血清、220份超市服务人员血清,160份餐饮服务人员血清,2483份其他人员血清。依次采用养生堂有限公司万泰药业的IgG、Ag和IgM系列ELISA检测试剂盒,分别对采集的血清样品进行戊型肝炎病毒IgG抗体、Ag(抗原)和IgM抗体检测,以系统了解新疆南疆地区不同人群戊型肝炎的流行状况。结果表明,在HEV-IgG的调查分析中,各检测年龄段人群均有HEV的感染,不同年龄组间IgG阳性率差异具有统计学意义(x2=98.627,df=6,P=0.000),以50-59岁人群的阳性率最高;从血清样本的地域来源分析,库尔勒、阿克苏、喀什以及和田的阳性率依次为:6.81%、8.14%、12.89%和15.38%,不同地域来源样本间阳性率差异具有统计学意义(x2=34.838,df=3,P=0.000);维吾尔族和汉族的阳性率分别为12.53%和7.76%,不同族别之间抗体阳性率差异极显著(p=0.000<0.01);不同从业人群当中,餐饮从业人员、超市从业人员、家畜及肉品接触人员、屠宰场工作人员和其他从业人员的阳性率依次为:2.50%、3.18%、16.47%、31.25%和11.08%,不同职业人群HEV-IgG阳性率差异具有统计学意义(x2=42.498,df=4,P=0.000),其中,从事屠宰行业的屠夫IgG阳性率显著高于其它行业人员的阳性率。在HEV-IgM的检测分析中,仅有7份血清样品呈现阳性,阳性率为0.23%,在HEV-Ag的检测分析中,仅有2份血清样品呈现阳性,阳性率为0.07%。
  2.新疆南疆地区主要经济动物戊型肝炎病毒抗体和抗原检测
  从新疆南疆阿克苏、喀什、库尔勒以及和田地区采集动物血清样品共计7840份,其中,血清来源主要包括:绵羊血清2700份、牛血清1110份、猪血清1660份、马鹿血清410份、犬血清160份、鸡血清1800份。采用万泰公司的戊型肝炎病毒总抗体(Ab)ELISA检测试剂盒以及戊型肝炎病毒抗原(Ag)ELISA检测试剂盒,分别对采集的动物血清样品进行戊型肝炎病毒Ab和Ag检测,以系统了解戊型肝炎在新疆南疆地区主要经济动物中流行的状况。结果表明,在HEV-Ab的检测分析中,猪HEV-Ab阳性率为53.25%(884/1660),不同猪群阳性率差异极显著(P=0.006<0.01),其中,3月龄以上猪的HEV-Ab抗体阳性率(56.00%)高于3月龄以下猪的HEV-Ab抗体阳性率(49.09%);牛HEV-Ab阳性率为7.03%(78/1110),不同年龄组HEV-Ab阳性率差异具有统计学意义(x2=43.106,df=2,P=0.000),其中,4岁以上牛的HEV-Ab抗体阳性率(18.82%)高于2岁以下牛的HEV-Ab抗体阳性率(3.75%);马鹿HEV-Ab阳性率为32.4%(133/410),不同年龄段鹿群HEV-Ab抗体阳性率差异具有统计学意义(x2=166.041,df=2,P=0.000),其中,2-4岁鹿的HEV-Ab抗体阳性率(43.8%)高于2岁以下鹿的HEV-Ab抗体阳性率(9.33%);鸡HEV-Ab阳性率为1.56%(28/1800),其中,喀什、阿克苏、和田以及库尔勒的HEV-Ab抗体阳性率依次为:1.71%、1.50%、1.78%、1.25%,不同地域来源鸡血清样本阳性率差异无统计学意义(x2=0.458,df=3,P=0.928);犬HEV-Ab阳性率为13.13%(21/160),农村饲养犬的HEV-Ab抗体阳性率(25.46%)高于城市家养犬的HEV-Ab抗体阳性率(6.67%),差异极显著(P=0.001<0.01),5岁以上、2-5岁和2岁以下犬的抗体阳性率依次为10.71%、16.84%和5.41%,阳性率差异无统计学意义(x2=3.207,df=2,P=0.201),各品种犬抗体阳性率依次为:25.71%、6.52%、7.90%、0.00%和18.18%,阳性率差异无统计学意义(x2=9.425,df=4,P=0.051),雄性犬的HEV-Ab抗体阳性率(19.77%)显著高于雌性犬的HEV-Ab抗体阳性率(5.41%),差异极显著(P=0.007<0.01);绵羊HEV-Ab阳性率为30.00%(810/2700),各地区绵羊HEV-Ab阳性率差异具有统计学意义(x2=46.113,df=3,P=0.000),其中,喀什地区的HEV-Ab抗体阳性率为37.65%,库尔勒地区的HEV-Ab抗体阳性率为21.67%,差异极显著(P=0.000<0.01)。在HEV-Ag的检测分析中,所有检测样品仅有26份猪血清样品呈现阳性,阳性率为1.57%。
  3.新疆南疆地区戊型肝炎分子流行病学调查
  从新疆南疆地区采集绵羊肝脏300份、胆汁400份、粪便2400份,猪粪便100份,人源HEV-IgM阳性的血清样本7份、人源HEV-Ag阳性的血清样本2份(第2章试验筛选),HEV-Ag阳性的猪血清样本26份(第3章试验筛选)。根据戊型肝炎病毒各基因型ORF2开放阅读框的保守区序列,采用primer premier5.0引物设计软件设计一套套式PCR引物,对上述采集的组织以及血清样品进行RT-nPCR检测,HEV RNA阳性的PCR产物进行克隆,测序。应用核苷酸序列分析软件DNAStar对本研究扩增的序列与戊型肝炎病毒基因Ⅰ-Ⅳ型的代表毒株序列进行同源性比较,应用软件MEGA5的neighbour-joining方法构建检测毒株的系统进化树,分析其遗传演化关系。结果表明,3235份检测样品中15份HEV RNA呈阳性,总阳性率为0.46%,其中,绵羊肝脏样品4份,猪粪便样品11份,15个检测样品序列之间的核苷酸同源性为97.4%-100%,检测样品序列与基因Ⅰ-Ⅳ型HEV的同源性分别为:81.6%-86.3%、84.2%-85.3%、80.0%-85.8%和84.2%-97.9%,系统进化分析显示,检测样品序列集聚形成一个分支,且与国内基因Ⅳ型人源检测株T1和新疆猪源检测株swCH25处于同一分支,属于4d亚型,遗传进化分析提示,4d亚型HEV具有跨物种感染的潜在性,其在新疆南疆地区的人、猪和羊之间可能保持循环感染。
[硕士论文] 李宝珍
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:乙型病毒性肝炎(Viral Hepatitis B,简称乙肝)是由乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染肝细胞导致肝脏炎症病变为主的传染性疾病,是全球和我国重点控制的疾病,是我国最为突出的公共卫生问题之一。我国作为乙肝大国,HBV感染者约9300万,而慢性乙型肝炎病例约2000万,每年因乙肝相关肝病死亡病人估算有30万例。感染者和死亡者数量均占据了全球相应病例的1/3,给社会和家庭带来沉重的负担,降低乙肝发病率和病死率在乙肝防控中尤其重要。
  目前我国乙肝感染状况调查一般为抽样调查。基于社区全体居民查体的乙肝感染状况的调查,与基于抽样调查相比更能真实反映人群乙肝流行状况,对于了解一个地区HBV感染现状,开展相关干预均具有重要意义。HBV新发慢性感染特别是新发慢性感染是评价一个地区乙肝控制的直接指标,而我国常用急性乙肝发病率作为替代指标,且其数据来源于法定传染病报告系统,误报情况较为多见。因此研究HBV新发慢性感染及影响因素对于制定综合防治措施具有指导意义。既往对慢性乙肝感染者临床特征的研究多是以医院为基础的针对乙肝病例的研究,在社区水平上对HBsAg阳性者的临床构成及特征相关研究还很少。全面分析社区水平上HBsAg阳性者的临床构成、特征、转归及乙肝五项指标及其不同组合在人群中流行现状,对于科学制定慢性乙肝感染者管理策略降低乙肝病死率是十分重要的。
  目的:
  1.分析济南市章丘区人群HBsAg流行现状,以及HBsAg阳性人群HBV血清学指标组合的流行状况,为掌握该地区人群中乙肝易感者和传染源的比例和分布情况提供参考;
  2.通过比较两次查体数据获取济南市章丘区社区人群乙肝新发慢性感染率及分布特征,为确定该地区乙肝防治重点人群提供数据支持;
  3.通过HBsAg阳性者随访,对不同临床状态HBsAg阳性者的临床转归及相关因素进行探讨,为科学制定HBV慢性感染者管理政策提供参考。
  方法:
  1.调查方法根据地理位置、经济状况、人员流动性,从济南市章丘区20个镇街中,抽取圣井、官庄、龙山、党家、刁镇、绣惠、枣园7个镇(街道)作为研究现场。通过问卷调查采集个人基本信息和健康体检信息,同时采集查体对象血清进行HBsAg、抗-HBs、抗-HBc等乙肝感染指标检测,区分出HBsAg阳性者与未感染者;HBsAg阳性者进行医学检查,通过问诊、体格检查、腹部B超检查,由专科医生负责根据以上结果进行临床分类并随访,了解转归情况。
  2.分析方法
  (1)使用Excel2010进行人群分布特征、查体调查率、HBsAg阳性率、新发慢性感染率以及HBsAg阳性者临床特征及HBsAg转阴、携带者进展为慢性乙肝、HBeAg血清学转换及再逆转等分布情况分析。
  (2)使用SPSS16.0软件,运用x2检验进行人口构成、HBsAg阳性率在不同镇、年龄、性别等之间的比较;运用Poisson回归模型比较不同年龄组、性别、文化程度、职业、婚姻、医疗费用支付新发慢性感染率的差别;使用Cox回归模型对HBsAg转阴、携带者进展为慢性乙肝、HBeAg血清学转换及再逆转危险因素进行分析。
  [结果]
  1.HBsAg流行情况济南市章丘区HBsAg阳性率为1.92%(95%CI:1.86%~1.98%),男性为2.12%(95%CI:2.02%~2.22%),女性为1.76%(95%CI:1.68%~1.84%),差异有统计学意义;各年龄组中30-39岁组最高,0-9岁组最低,各年龄组阳性率差别有统计学意义。各镇间HBsAg阳性率差别有统计学意义。
  2.HBsAg新发慢性感染情况随访发现616人被HBV感染,计算新发慢性感染率为0.18/100人年。男女两性之间新发慢性感染率差别无统计学意义。
  30岁以下各年龄组新发慢性感染率较低,均低于0.1/100人年,从30~39岁年龄组迅速上升到0.21/100人年,40~49岁年龄组上升到0.23/100人年,50~59岁年龄组上升到0.26/100人年。各镇间的新发慢性感染率间差别有统计学意义。
  3.HBsAg阳性者临床转归及影响因素分析HBsAg阳性人群检出13种乙肝血清学指标组合。完成两次随访的1267例携带者中,91例HBsAg转阴,转阴率为5.55/100人年;多因素Cox回归分析,所有纳入特征不同组间HBsAg转阴的可能性间的差别均无统计学意义。
  1267例乙肝携带者中有47例第二次检查时进展为慢性乙肝,进展率为2.87/100人年。多因素Cox回归分析显示,有酗酒史者进展为慢性乙肝的风险升高。
  209例HBeAg阳性、抗-HBe阴性的感染者在第二次检查时有75例完成了HBeAg血清学转换,总转换率为35.89/100人年。多因素Cox回归分析,所有纳入特征不同组间转换风险比间的差异均无统计学意义。
  931例HBeAg血清学转换后感染者进行第二次医学检查时,96例发生再逆转,总逆转率为8.14/100人年。单因素和多因素Cox回归分析显示,相对于HBVDNA<2000copies/mL者,HBV DNA≥2000copi/mL者逆转的风险比升高。
  结论:
  1.通过实施综合防控措施济南市章丘区HBsAg阳性率有所下降,人群HBsAg阳性率低于全国水平。男性HBsAg阳性率高于女性,年龄以30~39岁组HBsAg阳性率最高。
  2.人群随访发现,济南市章丘区HBV新发慢性感染率为0.18/100人年。影响章丘区人群乙肝病毒新发慢性感染率的因素是地区和年龄。
  3.HBsAg阳性人群检出13种乙肝血清学指标组合;有酗酒史者进展为慢性乙肝的风险升高;HBV DNA≥2000copies/mL者HBeAg血清学转换后再逆转的风险比升高。
  建议:
  1.鉴于30-39岁年龄组HBsAg阳性率最高且新发慢性感染率迅速上升,以及乙肝新发慢性感染的因素是地区和年龄,建议根据不同地区、不同年龄人群的特点制定行之有效的防控策略,有针对性的开展易于群众接受、喜闻乐见的防控知识的宣传,尤其要加大乙肝疫苗普及应用力度,提高人群接种率增强人群自我保护能力。
  2.鉴于HBsAg阳性者随访中,携带者进展为慢性乙肝进展率及HBeAg血清学转换后再逆转率较高,且慢性乙肝抗病毒治疗率较低,建议加强在感染者中进行定期随访重要性的健康教育,提高感染者对随访重要性的认识,及时根据临床转归采取针对性的医学干预措施。推究行之有用的医疗保险支付模式和感染者社区管理模式,提升感染者随访的依从性。
[硕士论文] 王妍
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  隐球菌性脑膜炎是一种中枢神经系统感染性疾病,其发病凶险,治疗困难,死亡率高。该病在国外主要发生在免疫功能低下的患者如HIV感染患者,但在国内,新生隐球菌感染的患者多为没有基础疾病的或无免疫抑制的人群中。细胞自噬是普遍存在于真核细胞中,参与正常细胞生长发育和生理病理过程的生命征象。自噬参与机体的很多病理过程,比如杀灭病原菌,调节免疫甚至杀灭肿瘤细胞。自噬在新生隐球菌感染巨噬细胞时所发挥的作用及其可能诱发的免疫应答情况目前尚无具体报道。故实验旨在通过新生隐球菌诱导小鼠单核巨噬细胞细胞系RAW264.7细胞,来观察自噬在新生隐球菌诱导巨噬细胞时发生的变化,并通过检测相关炎性因子TNF-α、IL-6的表达量,来探究自噬在新生隐球菌诱导RAW264.7细胞中产生及其可能的作用途经,为探讨自噬在新生隐球菌所致中枢神经系统感染中所发挥的作用及可能机制提供一定的参考。
  方法:
  第一部分,新生隐球菌最佳干预浓度检测及验证自噬体的表达。体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,将灭活的新生隐球菌WM148与RAW264.7细胞按照细胞数1∶1、2∶1、4∶1、8∶1培养,设立0h、3h、6h、9h、12h时间点,用CCK-8试剂盒检测RAW264.7细胞的活性。筛选出最适宜浓度后,将细胞进行爬片后进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察自噬的存在。
  第二部分,新生隐球菌诱导自噬的表达规律,将培养的RAW264.7细胞按照细胞数与隐球菌数1∶4的比例共培养,在0h、1h、3h、5h、7h时间点来收集细胞,用细胞流式方法检测各时间点的细胞凋亡,然后提取蛋白及RNA,通过Western blot及qRT-PCR方法分别检测自噬体在各时间点的表达情况。利用自噬体抑制剂(3-MA)抑制自噬后,观察细胞前后凋亡趋势变化。
  第三部分,自噬的表达及相关炎症因子变化情况。体外培养的鼠单核巨噬细胞系Raw264.7细胞,与新生隐球菌1∶4干预,将0h、1h、3h、5h、7h时间点上清液和细胞分别收集到离心管中。采用ELISA方法检测各组上清液中TNF-α、IL-6随着时间的变化,表达水平的变化,加入自噬抑制剂3-MA后,再次检测各时间点TNF-α及IL-6的表达情况。
  结果:
  第一部分,不同浓度新生隐球菌干预巨噬细胞后,巨噬细胞的凋亡率均有度的升高,并且浓度越高、干预的时间越长,细胞凋亡率越高。因此,结合试验所需并查阅相关文献后,采用细胞与隐球菌按照1∶4数量比来干预。通过免疫荧光显色方法可直接观察到自噬的产生。
  第二部分,新生隐球菌诱导后,细胞中自噬体的表达对比对照组(0h)明显升高(P<0.05),且随着干预时间延长,自噬的表达量逐渐升高。1h、3h、5h、7h组较对照组(0h)组逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05),自噬抑制后较抑制前,细胞的增殖减少,表明自噬对维持细胞稳定发挥重要作用。
  第三部分,新生隐球菌诱导RAW264.7细胞后,各组细胞上清液中TNF-α、IL-6的表达较对照组0h组增加,差异有统计学意义(P<0.05),抑制自噬后,各组细胞上清液中的TNF-α、IL-6的表达量较0h组增加但较未抑制时降低,差异有统计学意义(P<0.05)
  结论:
  新生隐球菌的干预可以对巨噬细胞的凋亡产生影响,且干预的浓度与凋亡率呈正相关。新生隐球菌诱导RAW264.7细胞炎性反应后,自噬体会随之表达,自噬表达水平随干预时间延长而逐渐增加,炎性因子TNF-α、IL-6的分泌也随着自噬体的增加或抑制而呈现不同的趋势。表明自噬参与并调控新生隐球菌诱导RAW264.7的炎性反应过程,其详细的作用机制需要进一步深入研究。
[硕士论文] 王玉连
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  白念珠菌是一种条件致病性真菌。近年来,由于广谱抗生素的大量不合理应用、激素的滥用、肿瘤的化学治疗及器官移植后免疫抑制剂的大量应用、免疫功能低下患者不断增多,使真菌感染发生率大大增加,其中白念珠菌感染最常见。氟康唑因其口服吸收效果好,生物利用度高,副作用小,通常作为临床首选治疗白念珠菌感染的药物,但随着氟康唑的大量、频繁使用,真菌耐药发生率逐年上升,导致临床治疗真菌感染的失败。
  本课题组前期药敏实验发现利福喷丁、舍曲林等联合氟康唑时对耐氟康唑白念珠菌可能有协同作用。利福喷丁为利福霉素类抗生素,是治疗结核病的一线用药,抗结核杆菌作用比利福平强,且药物不良反应比利福平小。到目前为止,关于利福喷丁体外抗真菌协同作用的研究较少,因此,开展利福喷丁联合氟康唑体外抗白念珠菌的效应研究,为临床治疗白念珠菌感染探索有效方法。
  方法:
  第一部分:参考M27-A2方案中的微量液基稀释法测定利福喷丁、氟康唑单用及两药合用时对白念珠菌的最低抑菌浓度(MIC);用棋盘式测定利福喷丁联合氟康唑体外抗白念珠菌的效应。通过时间—生长曲线实验、Spot assay实验验证利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用,并摸索后续实验研究所需的药物浓度。
  第二部分:应用透射电镜观察白念珠菌100分别在利福喷丁、氟康唑单药及两药联合作用前后超微结构的变化。
  第三部分:应用流式细胞仪检测白念珠菌100分别在利福喷丁、氟康唑单药及两药联合作用前后细胞周期的变化。
  结果:
  第一部分:利福喷丁单药对实验所选12株白念珠菌均无抗菌活性(MIC80>1024μg/mL)。在氟康唑敏感白念珠菌株中,利福喷丁联合氟康唑后未表现出协同效应(FICI>0.5);在氟康唑耐药白念珠菌中,利福喷丁联合氟康唑后均表现出显著的协同作用(FICI<0.1),本试验所研究的菌株中,利福喷丁对氟康唑体外抗白念珠菌100的增效作用最好,故后续实验选用该菌株作为研究对象。生长曲线显示氟康唑耐药白念珠菌100在4~12h为生长对数期,之后进入生长的稳定期和衰退期。与生长对照组相比,单用药组对氟康唑耐药白念珠菌100生长无明显抑制作用,合药组显示出明显的抑制作用。利福喷丁(125ug/mL)与不同药物浓度的氟康唑(4、16、64ug/mL)联合应用时,对白念珠菌100的抑制作用不随着氟康唑剂量的增加而增强;不同药物浓度的利福喷丁(15.63、31.25、125ug/mL)与氟康唑(4ug/mL)合用时,利福喷丁浓度越高,对氟康唑耐药白念珠菌100的抑制作用越强。
  第二部分:透射电镜结果显示生长对照组的菌体形态规则,细胞结构完整、清晰,呈圆形或椭圆形,细胞壁光滑,胞膜结构连续,清晰可见,胞核及线粒体正常;利福喷丁组细胞形态基本正常,边界清楚,部分细胞见胞核肿胀不规则,未见明显空泡液泡;氟康唑组大多数细胞形态基本正常,部分细胞胞壁电子密度不均匀分布,透明层局灶性增厚,胞膜粗糙,可见肿胀的线粒体,核质相对分明,可见少量空泡、液泡;联合用药组大部分细胞形态不规则,细胞壁的电子透明层厚薄不一,细胞膜与细胞壁分离,层次不清,边界模糊,胞膜严重缺损,线粒体肿胀,核质界限不清,许多大小不等的团块状物质聚集于细胞膜附近,核膜断裂、溶解消失,胞核集聚不规则,凝聚成团。
  第三部分:通过流式细胞术检测药物作用12h、24h对耐氟康唑白念珠菌100细胞周期各期DNA含量变化。作用12h时,空白对照组、利福喷丁组、氟康唑组及合药组在G0/G1期细胞计数百分比分别为:(76.41±1.52)%、(75.48±1.41)%、(72.36±1.01)%、(8.11±0.22)%,S期细胞计数百分比分别为:(5.46±0.73)%、(8.46±0.23)%、(6.86±0.56)%、(12.52±0.54)%,G2/M期细胞计数百分比分别为:(18.14±1.11)%、(16.06±1.37)%、(20.78±1.48)%、(79.37±0.52)%;作用24h时,空白对照组、利福喷丁组、氟康唑组及合药组在G0/G1期细胞计数百分比分别为:(82.36±1.25)%、(70.52±3.11)%、(60.45±1.07)%、(8.11±0.22)%,S期细胞计数百分比分别为:(6.03±0.92)%、(12.15±1.92)%、(15.19±1.23)%、(7.79±1.45)%,G2/M期细胞计数百分比分别为:(11.61±0.86)%、(17.33±1.32)%、(24.36±0.40)%、(86.26±0.94)%,两药合用组比生长对照组及单用药组G0/G1期细胞数显著减少(p<0.01),G2/M期细胞数显著增多(p<0.01),表明联合用药组细胞周期阻滞在G2/M期,通过对12h、24h两个时间点对比发现,药物对白念珠菌100细胞周期的影响大体一致。
  结论:
  利福喷丁单用时无抗白念珠菌活性,但利福喷丁能显著增强氟康唑抗耐氟康唑白念珠菌活性,说明利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌具有增效作用。通过透射电镜观察各组细胞超微结构推测,利福喷丁可能影响RNA或DNA的合成,也可能直接抑制真菌细胞膜上的某种酶的活性,从而发挥其对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用。流式细胞仪检测发现两药合用时可将细胞周期阻滞在G2/M期,抑制真菌细胞的正常分裂增殖。本课题组首次发现利福喷丁对氟康唑体外抗氟康唑耐药白念珠菌具有增效作用,联合用药时抗真菌作用机制比较复杂,本阶段实验初步探索了利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用机制,本课题组将在后续研究中通过检测胞膜甾醇含量、胞内药物含量及相关基因表达等实验进一步探索利福喷丁对氟康唑抗耐药白念珠菌增效作用机制,为耐药白念珠菌感染的临床治疗及新药研发提供新途径。
[硕士论文] 郭雪艳
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒引起的自然疫源性传染病,在我国有着悠久的流行史,且流行地域范围广泛,属于我国重点防控的传染病之一。山东省潍坊市在20世纪80年代发病率曾高达33.29/10万,流行高发年份病死率超过10%,严重危害人民群众身体健康和社会经济发展。本研究利用山东省潍坊市1974~2016年HFRS上报数据,探讨潍坊市HFRS流行规律和分布特征,分析疫情高发地区及其流行特点;以及潍坊市HFRS疫区扩张过程和疫源地类型的转变;研究鼠密度、鼠带毒情况和气象因素对疾病发生的影响,以期及时准确地把握疾病的流行规律,为潍坊市HFRS防控工作提供科学依据。
  方法:
  收集1974~2016年潍坊市HFRS监测资料,分析发病趋势,描述疾病的时空分布特征;收集2005~2016年“传染病报告信息管理系统”报告的HFRS个案数据,分析2005年以来的疫情高发地区的流行特点;收集2013~2016年鼠密度调查资料和2003~2016年宿主动物监测资料,分析潍坊市鼠种构成,计算鼠密度、鼠带毒率、鼠带毒指数,对鼠带毒指数与发病率之间进行相关与回归分析;收集2005~2016年潍坊市高发县市平均温度、降水量、平均相对湿度、平均气压、日照时数等气象因素指标,对气象因素与高发县市区发病率进行相关分析。
  结果:
  1.潍坊市肾综合征出血热自1974年有病例报告以来,根据疾病流行状态可分为5个流行阶段,分别是疫情散发期→第1个暴发流行期→第2个暴发流行期→疫情下降期→第3个小流行期;疫区类型经过了野鼠型疫区→以野鼠型为主家鼠型为辅的混合型疫区→以家鼠型为主野鼠型为辅的混合型疫区→以野鼠型为主家鼠型为辅的混合型疫区的转变;第1个暴发流行期高发地集中在西南向低山丘陵地区的青州、临朐等县市,东北向的昌邑、寒亭也被累及。第2个暴发流行期以中部的昌乐县为中心,疫情分布在西南方向和东北方向。第3个小流行期疫情进一步扩散,市域东南向、西南向、西北向疫情较重,北向次之,市中心疫情较轻。
  2.2005年有HFRS个案记录以来,高发县市主要是临朐县、青州市、诸城市,3地流行特征各异。
  3.2005~2016年疫情遍布潍坊市117个乡镇(街道办事处),诸城市皇华镇、临朐县九山镇、诸城市密州街道办事处、临朐县五井镇、临朐县辛寨镇累计报告病例数居全市前5位。
  4.使用宿主动物监测资料与人间疫情资料做相关与回归分析,发现鼠带毒指数与发病率之间存在正相关,发病率=18.732+4.061×1n鼠带毒指数。
  5.潍坊市气象因素与HFRS发病率广义相加模型分析结果显示,平均气温、平均相对湿度、降水量和日照时数与HFRS发病率之间存在非线性关系。12℃是平均气温与HFRS发病关系的阈值,59%、50mm、220h分别是平均相对湿度、降水量和日照时数的阈值。平均气温和平均相对湿度都在滞后0月即当月时风险最大,降水量和日照时间则是在滞后2月和3月时风险最大。模型预测结果与实际值拟合较好。
  结论:
  1.潍坊市HFRS的流行特征和高发县市都发生了很大的改变,疫区类型也随着时间呈现规律性变化,应及时根据新的流行特征制定相应的防控措施。
  2.相关回归分析,鼠密度和鼠带毒率计算出的鼠带毒指数与发病率高度正相关,控制鼠密度、降低鼠带毒率可控制疾病的发生。
  3.气象因素对HFRS发生流行的影响不同疫区间相关分析结果不一致。用平均气温、平均相对湿度、日照时数、降水量使用广义相加模型预测HFRS发病率,与实际发病率拟合较好,可以将气象资料监测作为HFRS的预测与预警的途径。
[博士论文] 张永法
儿科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  1.观察大黄素在病毒性心肌炎(VMC)小鼠中的疗效;
  2.观察大黄素调控TLR介导的心肌病理损伤的炎症应答作用;
  3.建立CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型,探讨大黄素调控病毒感染引起心肌炎症免疫应答的相关分子机制;
  4.优化VMC的治疗策略,开拓大黄素的临床应用价值。
  研究方法:
  选择90只雄性4-6周龄的BALB/c小鼠,体重均在14-16g之间,按照随机数字表法随机将小鼠分为三组,分别是A组:对照组,B组:模型组,C组:大黄素组,每组30只小鼠。A组:小鼠给予腹腔注射0.1ml不含病毒液的培养液。B组:小鼠腹腔注射0.1ml内含1×102TCID50柯萨奇病毒B3的Eagle's液建立VMC模型,C组:建立VMC模型基础上,大黄素灌胃给药30mg/kg/d,1次/d,连续给药14d;A、B组小鼠给予喂饲等量的蒸馏水,观察小鼠的生存情况,记录实验期间小鼠死亡数目。于实验开始后第7d每组处死5只小鼠,取出心脏测定病毒滴度,将心脏剪碎后研磨,离心取上清液,稀释成不同的浓度,取各种浓度(10-110-2,10-3,10-4,10-5,10-6)的稀释液0.2ml,加入96孔板(Hela细胞),设置4个复孔,观察细胞情况,病变孔:病变细胞>50%,依据Reed-Muench法测定,采用lgTCID50。荧光定量PCR测定CVB3mRNA拷贝数:提取心肌组织中病毒的总RNA,紫外分光光度法测定D260/D280比值(1.8-2.0),扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,重复测定3次,以相对表达量表示。然后分别在第7天、第14天每组抽取小鼠8只,处死解剖,取出心脏,经固定、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片制作、封片、HE染色等步骤制作小鼠心肌病理切片。HE染色观察心肌病理形态学变化,并进行病理积分的计算。方法如下:做好的切片每一张均随机选取5个高倍镜视野,在高倍镜视野下观察并计算视野内坏死区域的面积以及炎性细胞的浸润面积所占整个视野面积的比值。0分:无病变;1分:病变面积<25%;2分:病变面积25%-50%;3分:病变面积51%-75%;4分:病变面积>75%。
  RT-PCR测定心肌组织TLR4mRNA,首先把心肌组织总的RNA提取出来,然后再将总RNA逆转录成cDNA。RT-PCR依据Trizol法操作,定量采用紫外分光光度计,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,重复测定3次,以相对表达量表示:基因灰度值与B-actin灰度值比值。Western-blot法测定心肌炎症因子、TLR4-NF-kB、P38MAPK表达,ELISA检测血清水平炎症因子变化。
  并进行乳鼠心肌细胞的原代培养,取1天龄的新生乳鼠60只,均采取牵拉脊柱法处死,然后固定在泡沫板上;沿小鼠的左肋下缘逐渐将胸腔剪切开,充分暴露胸腔并找到心脏,用剪刀剪断大血管和周围组织,再用镊子将心脏轻轻取出,把心室部分的心脏组织完全剪碎,用不含血清的培养液洗1~2遍之后,转移入50ml离心管中;经胰酶反复消化6次,取沉淀物重悬并在培养瓶中进行培养,培养后再进行传代与冻存。经原代培养新生乳鼠的心肌细胞随机分为了4组,分别是A组:对照组,B组:模型组,C组:大黄素组,D组:LPS+大黄素组。其中,A组不给予病毒液。B组:应用CVB3感染心肌细胞8h。C组:用大黄素100ug/ml预处理心肌细胞2h,再应用CVB3感染心肌细胞8h。D组:预先LPS激活心肌细胞病毒8h,再用大黄素100ug/ml进行阻断2h。检测TLR4、NF-kB及其下游关键因子IkBα及p65的蛋白水平变化。通过Western-blot法测定炎症因子、TLR4-NF-kB与相关分子如p-IkBα、p-p65的表达及TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等因子的浓度。
  研究结果:
  1.与对照组比较,模型组心肌病理积分、心肌组织P38MAPK、TLR4mRNA表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,大黄素组死亡率、病毒滴度、CVB3mRNA拷贝数、心肌病理积分显著降低(P<0.05),心肌组织P38MAPK、TLR4mRNA表达明显下调(P<0.05)。
  2.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的血清浓度在模型组较对照组显著升高,两者有显著的统计学差异(P<0.05);而使用大黄素干预后,大黄素组小鼠血清浓度较模型组有明显的降低,并且比较有统计学差异(P<0.05)。
  3.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的蛋白水平在模型组较对照组显著升高,两者有显著的统计学差异(P<0.05);而使用大黄素干预后,大黄素组小鼠的蛋白水平较模型组有明显的降低,并且比较有统计学差异(P<0.05)。
  4.心肌细胞原代培养,使用病毒感染细胞组别中TLR4、NF-kB蛋白表达显著升高,IkBα及p65的磷酸化水平也有明显上调;而使用大黄素预处理组别中,这些蛋白水平有了明显的下调,差异有统计学意义(P<0.05)。
  5.使用TLR4激动剂LPS对细胞进行处理,发现在LPS+Emodin组,其炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的浓度水平与模型组无统计学差异(P>0.05),而与大黄素组比较,则有明显的升高。
  研究结论:
  1.在VMC的发病进程中,TLR4-NF-κB和TLR4-P38MAPK信号传导途径起关键性作用。
  2.在VMC的发病进程中,炎症反应始终存在,诸多免疫炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等发挥了重要作用。
  3.大黄素有治疗小鼠病毒性心肌炎的作用,其分子机制:(1)大黄素通过下调TLR4、P38MAPK水平来起到保护CVB3感染小鼠心肌的作用;(2)大黄素能够很好的阻断VMC疾病进程中的炎症过程;(3)大黄素能够通过阻滞TLR4-NF-kB信号通路的活化来减少炎症因子和炎性细胞的浸润,从而减轻心肌组织损伤,使疾病得到缓解与改善。
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