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[博士论文] 龚红建
生物学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:p53家族在个体发育、肿瘤抑制与发生、细胞周期调控、细胞凋亡等方面有非常重要的作用。p53家族成员(p53、p63和p73蛋白)之间有较高的序列相似性,在DNA结合域上p73与p53蛋白有63%的相似度,p63与p53蛋白有60%的相似度,这也暗示着这三种蛋白能够结合至相同的DNA序列来转录激活同一靶基因,已有研究证明p53家族蛋白都能参与调控某些基因。著名抑癌因子p53蛋白在DNA损伤下被激活且聚集在核内转录调控相关基因,抑制细胞周期或促进细胞凋亡等从而维持基因组的稳定性。但现有研究已经证明p53却抑制DNA双链断裂修复(DSB),似乎与其抑癌功能相悖。近年来已证明p53基因可编码多种异构体,它们可以协同或拮抗p53调节下游信号通路,但对其功能和生物学意义的研究才刚刚开始。p53异构体斑马鱼Δ113p53以及其在人细胞中的同源蛋白Δ133p53缺失全部的转录激活域和部分的DNA结合结构域,保留全部的多聚体结构域,它是p53的靶基因,能特异地拮抗p53介导的细胞凋亡。有意思的是它仅被γ-射线照射激活,不被UV和热激激活,那么Δ113p53/Δ133p53是否在DNA双链断裂中起着重要的作用呢?
  本论文第一部分工作从以下两个方面探讨了这个科学问题,具体结果如下:
  1)发现Δ113p53/Δ133p53促进NHEJ、HR和SSA三种DNA DSB修复途径。首先我们观察到Δ113p53/Δ133p53只能被DNA双链断裂损伤胁迫诱导表达,然后在斑马鱼和人类细胞系中,采用NHEJ、HR和SSA三种修复分析系统,发现Δ113p53/Δ133p53对此三种修复方式都起着促进作用,并不依赖于全长p53。此种促进作用是通过提高DSB修复关键基因Lig4、Rad51以及Rad52的表达来进行的。
  2)p73协同Δ133p53促进DNA DSB修复。Δ133p53蛋白缺失转录激活结构域,却能转录激活Lig4、Rad51和Rad52的表达而不依赖于p53,那么这又是怎样发生的呢?已知p53家族之间都具有类似的寡聚化结构域,不同的异构体可能形成异源多聚体。所以我们检测在DNA DSB下p53其它家族成员的激活表达,发现p73蛋白也可以被DNA双链断裂胁迫激活,且与Δ133p53表达时期一致。进一步研究发现Δ133p53促进DNADSB修复是依赖于p73,在DNA DSB胁迫下,敲低p73会增加DNA损伤积累以及加速细胞衰老。免疫共沉淀显示它们在体内可以形成蛋白复合物。染色质免疫共沉淀揭示Δ133p53促进p73结合到修复相关基因Lig4、Rad51、Rad52基因启动子处,进而激活它们的表达,促进DNA双链断裂修复。我们首次发现了Δ133p53和p73基因在DNA双链断裂修复的作用,同时也解开了全长p53抑制DNA DSB修复的困惑。
  本论文第二部分工作是斑马鱼1号染色体22种基因敲除。CRISPR-Cas9技术的发展极大降低了大规模开展斑马鱼基因敲除的成本。为创建中国自己的斑马鱼突变体库,使国内斑马鱼同行广泛受益,同时提升中国斑马鱼领域科学家的国际影响力和话语权,中国科学家组成了大规模敲除斑马鱼1号染色体基因的联盟。在斑马鱼一号染色体整基因敲除计划中,利用CRISPR-Cas9技术,成功构建了22个基因敲除突变体。这些材料最终都会免费通过国家斑马鱼资源中心向国内外学术界公开。通过对于这些基因的逐个敲除,我们可以进一步破解这些基因的功能,从而建立各种发育与疾病模型,最终希望通过这些模型研究与人类相关的发育和疾病研究等。
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