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摘要:目的 本文旨在鉴定福建省2016年冬季导致病毒性胃肠炎暴发的病原体,并对病原体进行分子特征研究.方法 对疫情暴发地上送的福建省2016年胃肠炎暴发急性病例标本,采用荧光PCR初步判定病原体,常规RT-PCR检测诺如病毒RNA聚合酶和衣壳蛋白基因片段,并进行序列测定和分子特征分析.结果 在3起暴发疫情中18份标本经荧光PCR检测均为诺如病毒核酸阳性,其中15份标本RT-PCR检测判为GⅡ型诺如病毒,9份标本成功测序.分析测序结果,证实引起本轮疫情为诺如病毒新重组株,该重组株有别于本地散发流行及全球暴发流行的优势基因型GⅡ.4.毒株RNA聚合酶核苷酸序列与2016年日本的GⅡ.4悉尼变异株Kawasaki194毒株的同源性最高,达98%,为GⅡ.P16亚型;衣壳蛋白核苷酸序列与2008年比利时的IPH2161-08VG06毒株同源性最高(97.7%~98.8%),为GⅡ.2亚型.结论 这是福建省首次报道诺如病毒重组株GⅡ.P16/ GⅡ.2的检出,并引起病毒性胃肠炎暴发....
摘要:目的 了解福州市急性胃肠炎暴发疫情患者诺如病毒病原学特征及流行特点.方法 收集2015-2017年福州市疑似诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情患者的肛拭子或呕吐物标本,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)筛查诺如病毒,阳性标本应用反转录聚合酶链反应扩增部分VP1区基因并测序,使用诺如病毒基因在线分析工具以及种系进化分析方法了解诺如病毒基因型和亚型的分布.结果 在对21起疫情158份患者标本的核酸检测中,实时荧光RT-PCR法共检出GⅡ型89份(56.33%),GⅠ型9份(5.70%).在随机抽取的有代表性的21份阳性标本中,共获得13份部分VP1区基因序列,其中8份GⅡ.2亚型,2份GⅡ.3亚型,2份GⅡ.17亚型,1份GⅠ.6亚型.结论 2015-2017年福州市引起急性胃肠炎暴发疫情的诺如病毒病原学基因亚型优势毒株为GⅡ.2亚型,且GⅡ.17和GⅡ.2亚型为福州首次发现,其余均为本地流行的型别....
摘要:目的 通过定点监测了解2009-2015年福建省福州市急性腹泻儿童中诺如病毒基因多样性及动态变化趋势.方法 采集2009-2015年福州市儿童医院因急性腹泻入院的5岁以下儿童的粪便标本,应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)筛查诺如病毒阳性标本.应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增完整的VP1区和部分RdRp区并测序,应用在线基因分型工具和种系进化分析方法了解福州市5岁以下儿童中诺如病毒基因型/亚型的分布.结果 在随机抽取的93份标本中,Real-time PCR法检测阳性有91份;共获得其中73份完整VP1区和72份部分RdRp区基因序列.在完整的VP1分型中,GⅡ.4_2006b型43份,GⅡ.4 Syndeny_2012型16份,GⅡ.3型10份,GⅡ.4 NewOrleans_2009型2份,GⅡ.12型l份,GⅡ.7型l份.在部分RdRp区分型中,共发现GⅡ.P4_2006b型43份,GⅡ.Pe型16份,GⅡ.P12型10份,GⅠ.P4型1份,GⅠ.Pa型1份,GⅡ.P21型1份.结论 应用双命名系统分型的方法,发现2009-2015年福州市急性腹泻儿童中诺如病毒具有遗传多样性,其中2009-2012年流行的优势毒株为GⅡ.P4_2006b/GⅡ.4_2006b型,2013-2015年流行的优势毒株为GⅡ.Pe/GⅡ.4 Sydney_2012型.此外,GⅡ.P12/GⅡ.3为福州市持续流行的型别....
摘要:为了探究一例福建省检出的HAstV-5型星状病毒2013/Fuzhou/85毒株基因组分子结构特点,本研究采用PCR分段扩增、测序、拼接的方法,获得2013/Fuzhou/85毒株基因组序列全长6 803bp:5'端和3'端均有85bp非编码区;中间3个开放阅读框:ORF1a长2 802bp(86~2 887nt),编码非结构蛋白丝氨酸蛋白酶;ORF1b长1 548bp(2 827~4 374nt),编码非结构蛋白RNA聚合酶;ORF2长2 352bp(4 367~6 718nt),编码结构蛋白衣壳蛋白前体.目前,GenBank中仅有两株HAstV-5型星状病毒全基因组序列:中国辽宁毒株(JQ403108)和巴西哥亚尼亚毒株(DQ028633),2013/Fuzhou/85毒株和中国辽宁毒株核苷酸相似度最高,达94.4%.对该HAstV-5型星状病毒3个开放阅读框分别构建系统进化树,发现ORF1a与HAstV-1 (JF327666)相似度最高,ORF1b和ORF2与HAstV-5 (JQ403108)相似度最高,提示其有可能存在重组,用Simplot软件进行重组分析,重组位点位于2 741bp,在ORF1a和ORF1b重叠区的上游.本研究中对2013/Fuzhou/85毒株的全基因组测序和重组分析,可以为星状病毒的重组和遗传进化规律研究提供参考....
[硕士论文] 黄业伟
流行病与卫生统计学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:了解2009~2016年福州地区5岁以下急性腹泻住院儿童诺如病毒感染的基因型别并初步建立用于GII基因群诺如病毒检测的捕获ELISA法。
  方法:(1)采用系统抽样的方法随机选取2009~2016年福州市儿童医院以及平潭县医院因急性腹泻入院,经Real-time RT-PCR筛选为诺如病毒核酸阳性的118份5岁以下儿童粪便标本,应用RT-PCR方法扩增完整VP1和部分RdRp区并测序;应用在线基因分型、种系进化以及基因重组分析诺如病毒的基因型别及动态变化。(2)选择一株有代表性的GII.4基因型Sydney_2012变种诺如病毒,利用大肠杆菌原核表达系统,体外表达诺如病毒VP1结构蛋白的P区多肽,包涵体经初步纯化、尿素溶解、PBS透析等进行蛋白纯化和复性,并进一步尝试形成病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)。应用ELISA法检测可溶性重组P蛋白的抗原活性,透射电镜观察VLPs。(3)具有抗原活性的可溶性重组P蛋白免疫6周龄的BALB/c小鼠,经细胞融合,有限稀释法进行亚克隆和间接ELISA筛选,获得抗重组P蛋白的单克隆抗体细胞株;利用上述细胞株,制备鼠单克隆抗体腹水并经Protein G柱纯化;采用改良的过碘酸钠法对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记,利用抗重组P蛋白鼠单克隆抗体,初步建立检测GII基因群诺如病毒的捕获ELISA法;与Real-time RT-PCR比较,评价该方法的灵敏度和特异度;与进口同类商品化试剂比较,评价两种方法的符合率。
  结果:(1)在118份诺如病毒核酸阳性粪便标本中,共获得93份完整VP1和部分RdRp区双基因序列,经测序均为GII基因群。其中GII.P4_GII.4基因型2006b变种41份,GII.Pe_GII.4基因型Sydney_2012变种31份,GII.P12_GII.3基因型13份,GII.P4_GII.4基因型New Orleans2009变种和GII.P17_GII.17基因型各2份,GI.Pa_GII.4基因型2006b变种、GII.P7_GII.7、GII.P7_GII.6和GII.P21_GII.3基因型各1份。(2)GII.4基因型Sydney_2012变种诺如病毒重组P蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经4mol/L尿素溶解、PBS透析复性后,可获得较强抗原活性的可溶性重组P蛋白,并能自组装成直径大小约为10~20nm的病毒样颗粒。(3)成功地获得2株能分泌抗重组P蛋白的鼠单克隆抗体细胞株,分别为212-1和46-2。2株单克隆抗体的效价分别为1:102400(212-1,IgG)和1:16000(46-2,IgM)。以212-1株单克隆抗体为材料初步建立捕获ELISA法,检测32份诺如病毒核酸阳性和30份阴性粪便标本,与Real-time RT-PCR法比较,其灵敏度和特异度分别为50%和100%;与进口商品化同类ELISA相比,两种方法的符合率为79.03%。
  结论:(1)2009~2012年、2013~2016年福州地区5岁以下急性腹泻住院儿童诺如病毒感染分别以GII.P4_GII.4基因型2006b变种、GII.Pe_GII.4基因型Sydney_2012变种为主。(2)成功表达具有抗原活性的GII.4基因型诺如病毒P区重组多肽,初步建立了GII基因群诺如病毒双抗夹心ELISA检测方法,为今后进一步研制质量较高、便于基层现场使用的商业化试剂盒奠定了基础。
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