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[硕士论文] 黄一锋
生物工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:S-腺苷蛋氨酸(SAM)参与生物体细胞内转甲基、转硫基和聚胺合成等多种重要的反应,它在治疗肝病、抑郁症和关节炎等疾病中起着重要的作用,目前市场需求量巨大。生物体能直接利用L-甲硫氨酸合成SAM,但不能直接利用D-甲硫氨酸,势必造成了D-甲硫氨酸的浪费。本文对酿酒酵母模式菌株BY4741进行改造,实现在BY4741细胞内D-甲硫氨酸的积累,并将D-甲硫氨酸转化为L-甲硫氨酸,最终提高BY4741胞内SAM的产量。
  运用标记回收的基因敲除技术在BY4741中敲除hpa3,发现敲除hpa3有利于D-甲硫氨酸在BY4741中的积累。利用多片段重组技术将ENO2启动子、D-氨基酸氧化酶、ENO2终止子、TEF2启动子、L-苯丙氨酸脱氢酶、TEF2终止子以及多拷贝质粒p426的骨架重组成一个新质粒pR426,转入迸BY4741(△hpa3)中,通过蛋白电泳及粗酶液反应证明改造菌成功表达D-氨基酸氧化酶和L-苯丙氨酸脱氢酶,并且菌体表达的两个酶均有酶活。将改造菌株进行摇瓶发酵培养考察其生产SAM的能力,结果显示相比于出发菌,改造菌株的SAM产量提高了18.3%,最大SAM胞含量提高了31.2%。
  利用CRISPR/Cas9系统对BY4741中的hpa3和erg6基因进行编辑,研究BY4741中CRISPR/Cas9系统的工作效率。为以后利用CRISPR/Cas9系统调控酿酒酵母中SAM的代谢网络提供方法依据。
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