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[硕士论文] 麻文青
生物学与分子生物学 石河子大学 2014(学位年度)
摘要:目的:1.采用RQ-TRAP和 TRAP-ELISA法检测不同细胞端粒酶活性,证实 RQ-TRAP法的优越性,
  2.研究比较干细胞样肿瘤细胞与普通肿瘤细胞端粒长度的差异,探讨干细胞样肿瘤细胞中端粒的调节机制,
  3.研究比较干细胞样肿瘤细胞与普通肿瘤细胞端粒酶活性的差异和hTERT基因mRNA及蛋白质表达水平的差异。
  方法:1.采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA两种方法同时检测12(9个肿瘤细胞系和3个正常细胞系)种细胞的端粒酶活性,并比较两种方法的检测结果,2.利用无血清悬浮培养的方法培养富集球状生长的干细胞样肿瘤细胞(sphere forming cells-SFCs),采用流式细胞术检测细胞表面标志物,比较干细胞样肿瘤细胞比例的变化,用RT-PCR方法检测、比较细胞的干性和分化标记物 Oct-4、SOX-2、CK-18的表达状态,3.采用实时荧光定量 PCR(Q-PCR)的方法检测干细胞样肿瘤细胞和正常培养的肿瘤细胞的端粒长度4.采用TRAP-ELISA方法检测干细胞样肿瘤细胞和正常培养的肿瘤细胞的端粒酶活性5.以普通的RT-PCR方法检测干细胞样肿瘤细胞和正常培养的肿瘤细胞hTERT基因的mRNA的表达水平、以Western blot方法检测其蛋白质表达水平。
  结果:1. RQ-TRAP方法能准确特异地检测系列稀释的293T细胞蛋白提取液的端粒酶活性,灵敏度可达8个细胞,扩增效率为99%。阴性对照组则未检测到端粒酶活性。RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA方法结果有相关性(R2=0.7625),
  2.流式细胞术分析结果显示无血清悬浮培养获得较高比例的干细胞样肿瘤细胞,并且比普通肿瘤细胞高表达干细胞转录因子Oct-4、SOX-2,低表达分化因子 CK-18(P<0.05),
  3.通过 Q-PCR方法检测结果分析,人乳腺癌干细胞样肿瘤细胞(MCF7-SFCs)端粒长度(1.201±0.05212)长于人乳腺癌 MCF7细胞(1.019±0.1005),人宫颈癌干细胞样肿瘤细胞(HeLa-SFCs)的端粒长度(1.602±0.1355)长于人宫颈癌 Hela细胞(1.024±0.0977),经 t检验分析p>0.05,乳腺癌干细胞样肿瘤细胞和宫颈癌干细胞样肿瘤细胞与肿瘤细胞间端粒长度的差异无统计学意义,
  4.采用TRAP-ELISA法检测端粒酶活性结果显示:人乳腺癌 MCF7细胞系、人宫颈癌 Hela细胞系、人乳腺癌干细胞样肿瘤细胞(MCF7-SFCs)和人宫颈癌干细胞样肿瘤细胞(HeLa-SFCs)端粒酶活性均阳性。干细胞样肿瘤细胞的相对端粒酶活性(RTA)明显低于普通肿瘤细胞,经 t检验分析p<0.05,差异有统计学意义。
  5.干细胞样肿瘤细胞(MCF7-SFCs和 Hela-SFCs细胞)hTERT mRNA表达低于普通肿瘤细胞(MCF7细胞和Hela细胞),经t检验分析P<0.05,差异有统计学意义;干细胞样肿瘤细胞的hTERT基因蛋白质表达水平均低于普通肿瘤细胞表达水平。
  结论:1.RQ-TRAP方法检测端粒酶可行,比 TRAP-ELISA方法成本低、时间短,且支持高通量,是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。2.在 MCF7细胞系和Hela细胞系中干细胞样肿瘤细胞的端粒长度长于普通肿瘤细胞但是端粒酶活性和hTERT表达均低于普通肿瘤细胞。
摘要:目的:采用实时定量端粒重复序列扩增法(RQ-TRAP法)检测不同细胞端粒酶活性。方法用RQ-TRAP和TRAP-ELISA两种方法同时检测12种细胞的端粒酶活性,并比较两种方法的检测结果。结果 RQ-TRAP方法能准确特异地检测系列稀释的293T细胞蛋白提取液的端粒酶活性,灵敏度可达8个细胞,扩增效率为98.92%。阴性对照组则未检测到端粒酶活性。RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA方法结果有较强相关性(r2=0.7625)。两种方法检测肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。结论 RQ-TRAP方法检测端粒酶可行,比TRAP-ELISA方法成本低、时间短,且支持高通量,是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。...
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