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[硕士论文] 鲍诗源
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:本研究根据实验室转录组数据库利用PCR技术克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)转化生长因子-β激活激酶1(LcTAK1)和TAK1结合蛋白1(LcTAB1)、TAK1结合蛋白2(LcTAB2)的cDNA序列,对其氨基酸序列及蛋白结构进行了预测和分析。研究了它们在大黄鱼各组织中的表达情况;检测了经病原相关分子模式(PAMP)刺激后,TAK1和TAB1、TAB2基因在大黄鱼肾细胞系(LCK)中转录水平的时空表达谱;并对三个基因进行亚细胞定位分析。此外,本研究还构建了它们的过表达重组载体,将TAK1与其结合蛋白TAB1/TAB2分别或共转染人胚胎肾细胞系293T(HEK293T),检测不同PAMPs刺激后对NF-κB的激活及下游细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α),白细胞介素(IL)IL-6、IL-1β、IL-8和Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)等基因转录水平表达的调控。主要结果如下:
  (1)LcTAK1与其结合蛋白TAB1、TAB2的克隆、表达分析及定位
  LcTAK1基因ORF为1725bp,编码574个氨基酸(aa),预测分子量(Mw)64.2kDa,理论等电点(pI)6.69;包括一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(S_TKc),属于保守的TAK1家族。LcTAK1遍布于大黄鱼多个组织,其中在脑和脾脏中表达量较高,肌肉中表达量最低;亚细胞定位表明其主要存在于细胞质;LPS、flagellin和poly I:C刺激可诱导LCK细胞系中LcTAK1转录水平显著上调(p<0.05)。
  LcTAB1基因ORF为1521bp,编码506aa,预测Mw54.6kDa,理论pI5.35;包括一个PP2Cc结构域和一个TAB1家族保守的C末端基序(PYVDFSQFYLLWGSDH),属于保守的TAB1家族。LcTAB1遍布于大黄鱼多个组织,其中脑和脾脏中表达量较高,肌肉中表达最少;亚细胞定位表明LcTAB1主要在细胞浆中表达;LPS和poly I:C刺激后LCK细胞系中LcTAB1表达量显著增加(p<0.05)。
  LcTAB2基因ORF为2271bp,编码756aa,预测Mw为81.7kDa,理论pI8.26;包括一个N末端CUE结构域和一个ZnF_RBZ结构域,属于保守的TAB2家族。LcTAB2在多个组织中都有表达,其中在血、脑和脾脏中表达量较高,在肝脏中表达量最低;主要定位于细胞质;在LCK细胞系中LPS、flagellin和poly I:C刺激可诱导LcTAB2的显著上调(p<0.05)。
  (2)LcTAK1与LcTAB1对NF-κB及下游免疫反应的激活
  LcTAK1或LcTAB1单独过表达均不能激活NF-κB启动子转录,但LcTAK1与LcTAB1共同过表达可以显著激活NF-κB活性,并诱导HEK293T细胞中IL-8表达量增加(p<0.01)。LPS刺激可以增强LcTAK1和LcTAB1共同过表达对NF-κB启动子的激活(p<0.05),进而诱导细胞因子TNF-α,IL-6和IL-8的表达(p<0.01)。在LcTAK1和LcTAB1共同过表达细胞中,poly I:C刺激也能增强NF-κB启动子的活性,但不能诱导TNF-α,IL-6和IL-8转录。以上结果显示LcTAK1和LcTAB1的相互作用可能在NF-κB活化中起关键作用,并且在鱼类抗细菌和抗病毒免疫防御中发挥不同的功能。
  (3)LcTAK1与LcTAB2对NF-κB及下游免疫反应的激活
  LcTAB2单独过表达可激活NF-κB和大黄鱼炎症细胞因子TNF-α、IL-1β启动子活性(p<0.05)。LcTAK1单独过表达可激活大黄鱼NF-κB-P65、TNF-α、IL-1β和干扰素IFNⅠ的启动子活性(p<0.05);其中大黄鱼TNF-α启动子活性与HEK293T细胞中TNF-α转录表达的结果不同,表明不同物种的TAK1在NF-κB信号通路中可能发挥不同的激酶功能。而LcTAK1与LcTAB2共同过表达会显著抑制NF-κB及其亚基P65、TNF-α、IL-1β和IFNⅠ的启动子活性(p<0.05);表明TAK1与TAB2的相互作用参与了NF-κB介导的炎症反应及抗病毒免疫应答,并且LcTAB2可能对LcTAK1存在负调控作用。
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