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[硕士论文] 魏莹莹
动物学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:在女性生殖健康中,与年龄相关的卵巢功能衰退以及多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)和卵巢早衰(premature ovarian insufficiency,POI)等卵巢相关疾病呈现越来越高的发病趋势。但是,对人类女性卵巢自然衰老的研究因为取样困难及道德等方面的限制而难以进行。猪和人在生理学,解剖学和生物化学等方面具有一定的相似性,因此猪可以作为研究卵巢衰老及相关疾病的动物模型。在整个卵巢发育的过程中,常常将初潮期和绝经期作为卵巢行使生殖功能的开端和结束,为此,本实验选取了与女性初潮期和绝经期相对应的母猪的青春期和生殖衰竭期即180日龄和8岁作为卵巢衰老过程中的两个关键时间点,以雅南母猪卵巢为实验材料,分别进行了全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)和全转录组测序(RNA-seq)。主要结果如下:
  1.构建了全基因组甲基化图谱,比对后发现甲基化修饰发生在CpG,CHH和CHG的胞嘧啶上,在基因上甲基化修饰主要发生于基因的CDS区,并在转录起始位点和转录终止位点呈现一个急剧的下降。而整体甲基化水平在两个时间点中并无明显变化,且甲基化水平和染色体长度呈负相关(Pearson's r=-0.636,P=1.844×10-9),和GC含量(Pearson's r=0.903,P<2.2×10-16)、基因数量(Pearson's r=0.398,P<2.2×10-16)、CpG岛比率(Pearson's r=0.792,P<2.2×10-16)和重复区密度(Pearson's r=0.126,P<2.2×10-16)均呈现正相关。
  2.在两个时间点母猪卵巢内鉴定到422个差异甲基化区域(P<0.05),其中303个甲基化区域表现出上调,119个甲基化区域表现出下调,揭示在卵巢的发育过程中DNA甲基化修饰的动态变化。有146个和12个差异甲基化区域分别存在于基因的CDS区和启动子区域,这些差异甲基化区域关联的基因功能主要富集于凋亡代谢通路、胚胎发育和免疫系统的调节等。而更多的DMR位于CDS区域则提示我们这一部分差异表达区域可能具有一定的功能,通过对DMR和该区域所在基因的mRNA表达进行相关性分析,发现甲基化水平和基因的表达具有显著的负相关(r=-0.179,P=5.72×10-7)。
  3.通过RNA-seq分别鉴定出了20,357个mRNAs、1,196个miRNAs、4,879个lncRNAs和7,600个circRNAs。经过差异表达分析,最终显著差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA数量分别为2243个,95个,248个和116个。这些差异表达的转录本相关基因富集于病毒反应、蛋白结合、细胞凋亡以及包括排卵、受精、怀孕和胚胎发育的生殖能力相关等功能。
  4.通过对DNA甲基化和几种RNA进行联合分析发现,在卵巢组织的两个时间点,基因组分别有8,845个(34.9%)和9,663个(38.2%)的基因同时表达出mRNA和miRNA且处于甲基化状态,除此之外,表达的或甲基化的基因均是相对减少,而基因未表达且未甲基化的基因数量约为600;同样的情况也出现在miRNA,lncRNA和DNA甲基化的联合分析中,分别有16.7%(1,354)和18.1%(1,465)的基因同时表达出lncRNA和miRNA且处于甲基化状态。这个结果表明大部分的基因均呈现出DNA甲基化和转录表达的协同调控,并且这种调控方式在衰老期会更优先出现。为了更深刻的揭示这种协同调控,对差异甲基化区域及几种RNA相关的基因进行GO功能对比,发现它们在凋亡过程、受精、怀孕和胚胎发育等卵巢功能方面出现交叉。
  5.基于竞争性内源RNA(ceRNA)理论,我们用显著差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA构建了以miRNA应答元件为桥梁的几种RNA互作网络,具体包括4个miRNA(miR-125b,miR-504,miR-92b-5P,miR-9),4个基因(FADD,EGFL7,PER2,CELSR1),3个lncRNA(MSTRG62621,MSTRG114143,MSTRG167556)和2个circRNA(circ000675,circ13607)。并对这个网络通过皮尔逊相关系数进行了共表达分析,揭示了受FADD、MSTRG.114143和miR-92b-5p调控的RNA网络,以及PER2和miR-92b-5p之间互相调控的两种方式分别为CELSR1,PER2和circ13607对miR-125b和miR-92b-5p.的竞争。尽管miR-92b-5p和PER2没有对应的miRNA应答元件,但其共表达的关系暗示了也许存在另外的调控因子及RNA内部更复杂的关系。
  本研究通过WGBS,RNA-seq和相关性分析等方法对青春期及生殖衰竭期的母猪卵巢从基因组水平和转录组水平对DNA甲基化和四种RNA进行了联合分析,构建了基于ceRNA理论和共表达的调控网络,同时也揭示了DNA与转录组及RNA之间相互调控和协同调控机制。研究结果将为进一步了解及研究卵巢衰老及其分子机制提供基础。
[专利] 发明专利 CN201710812077.2
四川农业大学 2017-11-17
摘要:本发明提供一种发酵型炭基生物有机肥及其制作方法,涉及生物有机肥制作技术领域。所述炭基生物有机肥的主要成分和质量份为生物质炭10~18份、鱼粉3~8份、骨粉3~8份、米糠5~9份、蛭石8~12份、普通有机肥25~35份、腐殖土60~80份、以质量比1:1混合的EM菌和生防促生菌0.5~1份。所述方法包括以下步骤:(1)菌剂准备和预处理,(2)炭基生物有机肥的制作。本发明的目的在于制造一种炭基生物有机肥,即以生物质炭、功能微生物、有机肥和有机物质,包含米糠、骨粉、鱼粉或饼肥等为主要原料,利用固态好氧浅层发酵技术,来制备具有功能微生物数量大、活性高、土壤适应性强和土壤肥力提升有效的新型肥料。
[专利] 发明专利 CN201510256445.0
四川农业大学 2015-09-23
摘要:本发明公开了一种草莓和双孢蘑菇互生栽培的方法,包括按双孢蘑菇栽培料配方备料,经前发酵和后发酵,得蘑菇培养料;夏季草莓大棚土壤中施入糠麸、扣棚、覆透明膜,利用发酵热和太阳能对土壤消毒,做垄,取出垄底土经消毒制作蘑菇覆土;夏秋季营养钵育苗,促进花芽分化和新根发生;秋季在高垄内蘑菇栽培铺料、播种、覆土,待菌丝在培养料和覆土层中生长良好,将草莓营养钵苗植入;草莓大棚促成栽培管理,调温湿度、盖棚、覆地膜,防止或唤醒草莓休眠,蜜蜂授粉,蘑菇子实体诱导与发育;适时采收。本发明保障了草莓和蘑菇高效优质生产,提高了种植效率和效益;实现了秸秆和畜禽粪便的高值化,实现了农业的高效可持续发展。
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