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摘要:揭示超声波介导下质粒DNA转化枯草芽胞杆菌发生的生物学机制,以便于枯草芽胞杆菌基因工程菌株的工业化应用.建立超声波介导质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌的一种方法,采用扫描电镜结合理化分析检测技术研究超声波处理前后细胞的变化.结果显示,一定条件的超声(40~100 W)处理后的质粒DNA可以转化枯草芽胞杆菌,处理后的细胞在电镜下表面凹凸不平,出现褶皱现象;而且胞内蛋白质、磷脂及碱性磷酸酶(AP)大量释放至胞外.结果表明,超声波介导的DNA转化是细胞生理响应与超声波共同作用的结果.
[硕士论文] 魏清伟
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)是生物浸矿应用中最为重要的微生物之一,A.ferrooxidans对多种重金属都具有很高的耐受能力。通过研究其重金属抗性机制,对深入了解微生物细胞维持体内重金属平衡的机理非常重要。
  目前,A.ferrooxidans铜、镉代谢机理的遗传学研究报道还比较少。A.ferrooxidans中许多与金属抗性相关基因的研究大多集中于生物信息学预测,缺乏相应的实验数据支持,因而我们在A.ferrooxidans全基因组注释信息中挑选了三个与金属抗性相关的基因,分析了其氨基酸序列信息,同时分别构建了这些基因的过表达菌株,为探究这些基因的具体生物学功能提供实验数据支持。研究工作主要有以下几个方面:
  1、本实验室从甘肃省兰州市七里河区阿干镇煤矿收集酸性矿坑废水分离纯化得到一株A.ferrooxidans L1,革兰氏阴性菌,短杆状;该菌株以Fe2+为能源物质,且具有较高的硫氧化活性,其生长曲线特征显示延滞期较长,约43h,稳定期约14h;生长70h后进入衰亡期;通过驯化试验,该菌株对不同重金属离子显示出不同的耐受能力:在相同培养条件下,Cu2+、Cd2+对A.ferrooxidans L1生长的抑制作用大小为Cu2+>Cd2+,最高耐受浓度分别是0.04mol/L和0.08mol/L。
  2、运用生物信息学在线分析软件对基因编码的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能结构域、系统发育以及可能参与的代谢通路等进行了预测。推测AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495这三种蛋白均分布在胞外或细胞膜上,参与金属离子的吸附转运等机制。
  3、为探究A.ferrooxidans中AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495的功能特性,以本实验室分离鉴定的A.ferrooxidans L1为材料,采用PCR扩增技术克隆了afe-1948、afe-1862、afe-RS11495基因。将其转化E.coli BL21(DE3),通过SDS-PAGE分析,确定其在大肠杆菌中的最佳表达条件。
  4、为了进一步地了解这三个基因的功能,采用过表达分析的方法考察了其转入受体菌之后的抗性的变化。结果表明:在不同浓度Cu2+、Cd2+胁迫下,E.coli BL21导入目的基因后,相对于对照组,菌体的生物量明显下降,说明其抗性下降,但是其胞内目的蛋白的含量却有所增加,推测是由于导入目的基因后胞内重金属的含量明显上升导致的。
摘要:从NCBI数据库中下载了3种铁氧还蛋白(ACK79261.1,ACK79281.1和ACK80954.1)序列,利用网站在线预测结合软件分析,对其基本理化性质、蛋白修饰、保守结构域、亚细胞定位、二级和三级结构预测和蛋白相互作用网络等方面进行分析和预测.所得数据表明,3种蛋白质均为不稳定的亲水性蛋白质,等电点偏酸性,不含信号肽,均在细胞质中发挥作用;蛋白相互作用分析预测ACK79261.1在核酸代谢过程中发挥重要作用,ACK79281.1主要参与了细胞内的2Fe-2S簇的组装,ACK80954.1对于能量和电子传递必不可少.本研究利用生物信息学预测了铁氧还蛋白结构和功能,为后续研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的电子传递过程以及菌株改良、应用推广提供理论上的依据.
摘要:RND (resistance-nodulation-division)家族转运蛋白广泛分布于革兰氏阴性细菌中,具有催化胞内活性物质(胆酸盐,脂肪酸等)和外排金属离子(Cu+,Ag+)的作用.为探究嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A cidithioba-eillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)RND transporter的功能特性,以本实验室分离鉴定的A.ferrooxidans GB2为材料,采用PCR扩增技术克隆了rnd-1基因.运用生物信息学在线分析软件对该基因编码的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能结构域、系统发育以及可能参与的代谢通路等进行了预测.数据表明:该基因cDNA序列全长1 320 bp,编码439个氨基酸,分子式为C21 00H3330N610O604813,相对分子质量为47.204 kD,为亲水性蛋白;无信号肽,富含延伸链和无规则卷曲结构,三维结构预测表明其符合4KKU结构生物学特点;采用最大似然法构建系统发生树发现RND transporter蛋白在嗜酸氧化亚铁硫杆菌与嗜酸氧化硫硫杆菌中亲缘关系比较近;肽链含有10处磷酸化位点,10处糖基化位点,可能参与细胞质中磷酸化反应,从而对重金属胁迫进行感知和表达.本研究推测该基因在微生物抗重金属过程中有重要的作用.
摘要:以豆渣、苹果渣和葡萄渣为发酵原料,利用酿酒酵母菌和植物乳酸杆菌为发酵菌种,对微生物发酵效果进行比较分析.采用单因素和正交试验方法确定最佳发酵条件为葡萄渣、苹果渣和豆渣配比为2∶3∶5;发酵菌剂组合为酿酒酵母,乳酸杆菌和纤维素酶;发酵时间为72 h,发酵温度为32.5℃,接种量为5%;通过体外消化试验得到粗蛋白的消化率随时间成梯度变化;通过扫描电子显微镜观察,确定酵母菌体蛋白是饲料总蛋白含量提高的主要原因之一;最后对发酵饲料营养价值评定,发酵饲料pH为6.2,粗蛋白质含量11.25%,酸性洗涤纤维素含量为28.43%,中性洗涤纤维素含量为24.68%,达到优质蛋白饲料标准.
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