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[硕士论文] 魏亚庆
生物工程 华中科技大学 2015(学位年度)
摘要:热休克转录因子(HSFs)或称为热休克因子,广泛存在于真核生物细胞中,是在功能和结构上同源性很高的一种转录因子。当细胞遭受热休克或其他环境压力时,HSFs激活热休克蛋白(HSPs)的表达,从而维持细胞内稳态,帮助细胞存活。HSFs家族有四个成员,其中 HSF1在哺乳动物中非常保守,是调控热休克蛋白表达的主要因子。HSF1直接参与了许多生理过程的调节,例如:生长发育、细胞凋亡、细胞分化、炎症以及肿瘤发生等。
  研究表明,在HSF1敲除的小鼠的晶状体上皮细胞中,HSF1与HSF4可竞争性地结合于靶基因的启动子,共同调控晶状体的发育,提示HSF1在晶状体发育过程中扮演着极其重要的作用。另外 HSF1敲低的斑马鱼模型表明 HSF1可能通过激活HSP70而调控晶状体的发育。斑马鱼胚胎透明,在眼睛发育初期即可对其进行观察,相对于小鼠更适合研究眼睛早期的发育。目前尚无HSF1敲除的斑马鱼模型的报道,因此有必要构建HSF1敲除的斑马鱼模型。
  TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)技术是一种新的基因敲除技术。它利用TALE(Transcription activator-like effector)家族的蛋白结构单元特异性识别DNA靶序列之间的能力和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割靶序列,造成DNA双链断裂,诱发DNA修复机制,从而有很高几率诱导靶序列产生突变。
  本论文中,首先应用半定量RT-PCR技术检测了HSF1在斑马鱼中体内的时空表达。发现在斑马鱼胚胎发育过程中,HSF1在6hr时达到最高峰,48hr降至低谷,72hr后 HSF1的表达量有所上升,但仍低于胚胎发育早期,表明该基因存在母源性表达。HSF1在成年斑马鱼各组织中普遍表达,在眼、卵巢、精巢中高表达,而在心脏、脾等组织中的表达比较低,这提示HSF1可能在多种组织器官中具有生理功能,在眼、卵巢和精巢等组织中发挥重要作用。
  应用TALEN技术进一步构建了HSF1缺陷的斑马鱼模型。通过TALEN在线软件设计选择HSF1外显子一的TALEN靶位点后,采用Golden Gate的方法成功构建出了TALEN表达质粒。应用RNA体外转录的方法合成TALEN的mRNA,将其注射到一细胞期的斑马鱼受精卵中。应用PCR-RFLP的方法检测TALEN效果,表明获得了F0嵌合突变体。通过F0和野生型斑马鱼杂交,成功获得了三种类型的F1代斑马鱼,分别是:c.90_98delGGATCCGGA(p.Glu30_Pro32del),c.78_81delGACG(p.Trp26Cysfs*10)和c.91delG(p.Asp31Ilefs*6)。
  本论文应用TALEN技术,首次在斑马鱼中敲除hsf1基因,得到三种HSF1缺陷的斑马鱼模型,为以后研究HSF1的功能,特别是在斑马鱼眼睛发育过程中的作用,及其具体的分子机制奠定了坚实的基础。
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