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摘要:随着经济的飞速发展,全球每年对聚酰胺、聚氨酯等多聚物产品的需求量呈现逐年增长的趋势.1,5-戊二胺是合成聚酰胺等多聚物的重要单体,生物法合成1,5-戊二胺是一种具有潜在竞争力的绿色环保、资源可持续利用的方法.本文将从代谢途径中的关键酶,大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌以及甲醇芽孢杆菌中戊二胺代谢途径工程改造的最新研究进展4个方面进行综述,并对其前景进行展望....
摘要:随着我国电网建设的完善,电网网络结构呈现出错综复杂的状态,电力发生故障时,线路与线路之间的相互倒供成为常态.如何科学快速的实施选择,如何选择最优的电力路径,成为摆在各级电力调度员面前的一道难题.本文笔者结合多年工作实践,就城区配网负荷转移辅助决策系统的研制这一课题展开研讨,为进一步增强电力倒供的科学性,旨在给相关专业人士提供参考....
摘要:为了能使变电站运行数据有效可靠的传输,正确并快速处理好通信中断故障是相当关键的.在本文中,笔者针对贵港地区电网的实际情况,提出了变电站远动通信中断故障诊断方法和快速处理的解决方案,以供参考....
[硕士论文] 高震
微生物学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,PanD EC4.1.1.11)是微生物泛酸(由泛解酸和β-丙氨酸组成)生物合成途径中的关键酶,由panD基因编码,以丙酮酰基为催化活性中心,具有严格的底物特异性,可以催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸的合成途径只存在于微生物和植物细胞中,因此以L-天冬氨酸α-脱羧酶为靶点设计的抗真菌、抗细菌药物和除草剂对动物或人类无害。
  β-丙氨酸可用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品,用途非常广泛。目前国内β-丙氨酸主要采用化学合成法,存在成本高、生产条件对环境不友好等缺点,开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。但目前筛选到的产酶菌株产酶量较低、酶活性低,难以规模化生产和广泛应用。
  本研究通过传统纯培养技术,从亚热带海洋土壤沉积物样品中初步分离筛选到八十株具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的菌株,经纸层析复筛后选择其中4株酶活力较高的菌株进行菌种鉴定。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16S rRNA序列比对分析和系统发育分析,鉴定出这四株菌中有两株属于不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、一株属于普罗维登斯菌属(Providencia spp.)、一株属于发光细菌属(Photobacterium spp.)。
  以普罗维登斯菌株为研究对象,根据GenBank数据库中已有的普罗维登斯菌属天冬氨酸脱羧酶基因(panD)序列设计引物,PCR扩增获得L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(panDP)。以pET-30a(+)为载体、Escherichia coli DH5α为宿主细胞,构建了重组菌。生物信息学分析结果表明panDP基因包含一个长为381bp的ORF,编码一个由126个氨基酸组成的多肽,分子量预测为13.92kDa。panDP基因在核苷酸水平上与Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的aspartate1-decarboxylase precursor基因(GenBank登录号:FM162591.1)的一致性为81%;与Photorhabdus temperata subsp.thracensis strain DSM15199的aspartate decarboxylase基因(GenBank登录号:CP011104.1)的一致性为77%;在氨基酸水平上,PanDP与来自Providencia rettgeri的L-天冬氨酸α-脱羧酶(GenBank登录号:WP036958294.1)具有98%的一致性,但尚未发现其功能特征研究的相关报道。
  将构建好的重组质粒pET-30a-panDP转入表达宿主E.coli(DE3)plysS中,构建重组表达菌株。诱导表达的最佳条件为:以终浓度10g/L的α-乳糖为诱导剂,30℃诱导10h。镍柱纯化蛋白进行酶学性质分析,结果表明:在以L-天冬氨酸为底物时,PanDP的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,在最适反应条件下,金属离子的终浓度为5mM时,Ca2+、Al3+、Fe3+对酶具有促进作用,其中Al3+的促进作用最高,可达到140%。而Na+、Ba2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用,Na+的抑制作用比较微弱,Mn2+、Mg2+、Cu2+的抑制作用比较明显。该酶在低温条件下,比较稳定,超过55℃后,随着时间的延长,稳定性变差,但该酶在80℃下,保存1h,仍具有40%的酶活。当pH值为8.0时,该酶稳定性最好,在pH值为5.0到9.5的范围内,仍保持40%以上的酶活力,在pH值为7.5到8.5的范围内,保持60%左右的酶活力;Km为0.01602mmol/L,Vmax为1.6861μmol/min,kcat值为0.28s-1。
  对panDP基因进行定点突变,获得了四个突变体,分别为K9A,K9D,S25E,S25K;纯化这四个突变体蛋白,进行酶学性质研究,与野生重组酶PanDP相比,这四个突变体酶活性均丧失,由此可知氨基酸残基位点的第9位和第25位均与酶的活性相关。
  本研究完成了Providencia sp.GZ1和Acinetobacter sp.GZ8野生型菌株的鉴定,panDP基因的高效表达和功能分析;PanDP酶的最适反应温度较高,达到60℃,在80℃下仍保留较高的酶活,较高的酶反应温度使其在工业生产中有一定的应用价值和参考价值。
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