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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶.在热带药用海洋生物芋螺的毒液中,富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要.研究上样量、水化方式与时间、除盐步骤、聚焦电压和时间、平衡时间、凝胶电泳方法和染色方法等方面,优化并建立了较为理想的芋螺毒液蛋白样品双向电泳的实验条件与方法; 通过双向电泳和MALDI-TOF-MS质谱分析技术,从海南产桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)毒液蛋白中成功分离鉴定出PDI等9种蛋白; 通过双向电泳和PDQuest软件分析了并比较了三种不同大小桶形芋螺毒液总蛋白的差异性,并质谱鉴定出5个明显的差异蛋白点.研究建立了桶形芋螺毒液蛋白双向电泳分析及质谱鉴定的技术方法,为后续大量分离纯化出天然的芋螺PDI酶以及利用蛋白质组学技术方法深入研究芋螺毒液特征提供了重要的基础.
摘要:通过比较丝线、羊肠线2种不同材料和不同结扎道数对大鼠CCI疼痛模型痛阈值的影响,优化筛选出更易在实验过程中普及的技术方法.将42只SD雄性大鼠随机分成7组,包括结扎丝线4道、3道与2道3个组;结扎羊肠线4道、3道与2道3个组和1个假手术组,每组6只大鼠.铬制羊肠线和丝线分别结扎大鼠左侧坐骨神经2道、3道、4道;假手术组只暴露左侧坐骨神经,不进行结扎处理.建模成功后测量各组大鼠的机械性缩足反应阈值(MWT),发现丝线3道、4道组和羊肠线2道、3道、4道组与假手术组和自身基础的MWT有极显著差异(P<0.01);假手术对照组、丝线2道组与各组自身基础的MWT之间没有差异(P>0.05),结扎手术前后的MWT之间差异显著,结扎后第7天、14天和21天的MWT之间没有差异.羊肠线3组之间没有显著性差异(P>0.05).由此可得出结论:羊肠线2道、3道、4道组,以及丝线3道、4道组均能产生稳定的神经痛,根据MWT的数值大小和是否出现自噬现象可认为,以羊肠线结扎2道组最好,不但MWT的数值小,且操作简便又节省时间,可作为大鼠CCI建模的首选方法.
摘要:芋螺毒素GeXIVAWT是来自食虫将军芋螺(Conus generalis Lonnaeus)毒管中,具有两对二硫键的28肽.通过化学合成这种芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化.利用简单快速的重组表达来生产富含二硫键的芋螺毒素有可能成为有效的新途径.通过对芋螺毒素GeXIVAWT的基因进行密码子优化,人工合成引物来构建表达载体pET22b(+)/pelB-GeXIVAWT.融合了信号肽的重组芋螺毒素以包涵体的形式在大肠杆菌中获得了高效表达.利用低浓度尿素洗涤和超滤管进行纯化无组氨酸标签的重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT,再利用稀释复性的方法将无活性的包涵体转变成具有活性的重组芋螺毒素.复性后的重组蛋白采用反相高效液相色谱进一步纯化后进行了质谱鉴定.活性实验表明重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT具有抑制昆虫细胞Sf-9的生长,为研究芋螺毒素作为生物杀虫剂奠定基础.
摘要:细胞电活动是生命现象的基本特征之一,而离子通道是其结构和功能的基础.因此,研究离子通道作用机制具有重大的理论和现实意义.许多神经系统和心血管疾病,如多发性硬化症、癫痫、脑溢血、神经痛、Brugada综合征(BrS)、进行性心脏传导缺陷(PCCD)和原发性心室纤颤(IVF)等,都与钠离子通道氨基酸序列和结构发生的改变有关.该文对钠离子通道的研究进展进行综述.
摘要:随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率.另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白.昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统.利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白.以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍.
摘要:目的:优化重组芋螺毒素K41 (CTX-K41)的表达条件.方法:以不同接种比例、不同浓度IPTG、不同诱导时间、不同诱导温度、不同培养基pH值对含有pCTX-K41的E coli工程菌进行诱导表达,用Tricine-SDS-PAGE对表达产物进行分析.结果接种比例为1∶200,诱导时间为4h,IPTG.浓度为0.4mmol·L-1,诱导温度为30℃时,培养基pH值为5.0时CTX-K41的表达量最高.结论:已成功优化了重组蛋白CTX-K41的表达条件.
摘要:海洋生物毒素以其毒性强,结构新颖,药理作用特殊,易合成等特点成为药理学和神经科学的有力工具和新药开发的新来源.本文根据海洋生物毒素的化学结构特征将其大致分为3类:即多肽类毒素,聚醚类毒素,生物碱类毒素等,并对其进行了综述,同时对海洋生物毒素的应用前景进行了展望.
摘要:目的:优化PCR条件,建立能特异扩增出α-芋螺毒素基因片段的最理想PCR条件.方法:根据α-芋螺毒素基因保守的信号肽或内含子序列和非翻译区保守核苷酸序列设计了多组特异引物,并对引物浓度和退火温度等影响因素进行优化.结果:根据α-芋螺毒素基因保守的内含子序列为引物、引物浓度为0.1 μmol/L、退火温度为50℃时,能特异的扩增出α-芋螺毒素基因片段,分子量大约分别为180bp和300bp.结论:采用优化的PCR条件,能筛选出克隆新型的α--芋螺毒素基因片段的最理想引物,为α-芋螺毒素的化学合成、活性研究和应用提供基础.
摘要:随着PCR反应技术的不断改进和完善,它们在现代科学研究、生产和生活检测中的应用也越来越广,并且极大程度上促进了基因工程和蛋白质工程的快速发展.就PCR技术在芋螺毒素、海蛇毒素、海葵毒素及水母毒素等海洋生物多肽毒素基因克隆研究中的应用作简要介绍.
摘要:旨在比较5种毕赤酵母基因组DNA的提取法,以便获得简便高效的提取高质量酵母基因组DNA的优化方法.分别使用蜗牛酶破壁法,超声波破碎法,液氮研磨法,Lyticase破壁法,试剂盒法提取毕赤酵母基因组DNA,然后进行DNA电泳检测以及紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度.结果显示,5种方法均能提取出酵母基因组DNA,而酶法所提取的酵母基因组DNA质量最好.由此证实,蜗牛酶法成本低、效果好,是理想的提取高质量酵母基因组DNA的方法,完全满足后续试验要求.
摘要:随着基因重组技术的快速发展,基因工程产品的利用越来越广泛,但其分离纯化的成本约占总成本的60%~70%.因此,探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要.简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系,着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况.
摘要:芋螺毒素和微生物的次生代谢产物与植物的生物碱一样,具有生物多样性的特点.芋螺毒素特有的二硫键骨架和化学修饰后特异的空间结构,使其具有特异的稳定性和药理学活性.对芋螺毒素基因的分析和新型基因的克隆筛选,是深入研究各种受体、离子通道及其亚型,进而在克隆表达的靶受体上设计和筛选高效新药的前提.芋螺毒素基因资源的研究在芋螺毒素新基因及其编码产物毒素肽的发现与利用方面发挥了重要作用.现时该领域的新进展进行论述.
摘要:芋螺毒素生物活性强,对药物作用靶点的选择性高,在治疗神经性疼痛等疾病方面具有很好的开发前景.然而天然芋螺毒素容易受到体内蛋白酶的水解.将其进行环化,可增加它们在人体内的稳定性,从而具有口服活性.本文以α-芋螺毒素Vc1.1和MII环化后的稳定性与活性变化、环化的合成方法为例,对芋螺毒素的环化研究进展进行综述,说明环化的芋螺毒素将有可能在治疗神经性疼痛等疾病中扮演一个重要的角色.
摘要:利用RNA 5'末端移动反转录(switching mechanism at 5'end RNA transcription,SMART)技术构建及鉴定疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库,克隆新型芋螺毒素基因.提取疣缟芋螺毒管总RNA,用RT-PC反转录成单链cDNA(single-stranded cDNA,ss-cDNA),长距离PCR(long-distance PCR,LD-PCR)扩增合成双链cDNA(double-stranded cDNA,ds-cDNA),依次用蛋白酶K和SfiⅠ酶进行酶切孵育,用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离.得到的ds-cDNA与λTripIE×2噬菌体载体体外连接并体外包装,感染大肠杆菌E.coli XL1-blue,测定原始文库滴度和重组率.进行文库扩增,测定扩增文库滴度.用PCR鉴定插入cDNA片段的大小,构建的疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体原始文库滴度为1.47×106pfu/mL,重组率为90.72%,扩增文库的滴度为4.07×108 pfu/mL,插入cDNA片段为200~1200 bp.利用SMART技术成功构建了疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库并克隆出新型芋螺毒素基因,为芋螺毒素基因的筛选和鉴定奠定了基础.
摘要:目的 建立毕赤酵母的高效电转化方法,为利用毕赤酵母重组表达海洋药物功能基因提供方法基础.方法 采用电穿孔的方法把外源DNA转化进毕赤酵母基因组中.通过对毕赤酵母生长状态,电击条件等影响因素进行探索.结果 当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、电压为1.5kV、质粒浓度为0.15g·L-1和0.2cm电转化杯时,转化效率达到最大值,为每微克质粒DNA 36个转化子.经抽样PCR鉴定所得到的转化子均为阳性克隆.结论 通过对电转化各种条件的优化,获得了高效电转化技术方法.
[硕士论文] 高炳淼
水产养殖(海洋生物技术) 海南大学 2009(学位年度)
摘要:芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTX)是近年来国际上的研究热点。CTXs是肉食性软体动物芋螺(Conus)分泌出来的能特异性作用于体内各种离子通道及神经受体的生物活性多肽化合物,通常是山10~46个氨基酸残基组成,具有分子量小、结构多样、富含半胱氨酸、作用靶点广泛、功能专一、组织特异性强等特点。目前发现的芋螺毒素超家族主要有A-,T-,O-,M-,P-,I-和S-超家族等,它们既可以作为体内一些具有重要生理功能靶点的探针和“解密器”,也可被直接开发成为药物或作为新药的先导化合物,因此对芋螺毒素的深入研究有着重要的理论和实际意义。
   本实验室从海南产勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)中克隆到了一个新的芋螺毒素基因K411。K411编码产生的成熟肽是由28个氨基酸组成的小肽,含有五个半胱氨酸,具有能阻断乙酰胆碱受体的生物活性。人工合成该肽成本高、毒性大、氧化折叠后的异构体产物异常复杂,难以纯化,且得率很低。若采用基因工程方法直接真核分泌表达出具有天然构象的活性肽,则会大大降低成本且无须再考虑氧化折叠以及二硫键配对问题。由于毕赤酵母表达系统是目前较完善的高效异源蛋白表达系统,具有高分泌表达、高稳定整合、易于高密度发酵和产物的下游纯化较易等优点。所以本实验采用该系统对芋螺毒素基因K411进行高效表达研究具有非常重要的意义。
   本研究利用PCR方法从芋螺毒素K411的前体基因中,亚克隆出带有K411本身信号肽序列的、适合与毕赤酵母表达载体连接的目的基因;同时利用化学法合成K411成熟肽基因,分别构建含有芋螺毒素K411本身信号肽和毕赤酵母信号肽序列的目的基因两类酵母表达载体。已经成功构建了K411基因的5个酵母表达载体,分别为B-K4112,B.K4113,αA-K4145,αA-K4167,αA-K4189。将构建好的表达载体线性化后电转化毕赤酵母菌,经Zeocin抗生素筛选和PCR鉴定后获得了高拷贝重组子,并利用甲醇进行了诱导表达研究。初步探索了诱导表达的条件,结果表明,最佳诱导表达时间为72h,培养基选择MGY/MM比BMGY/BMMY诱导表达效果好。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,在6Kd左右出现一条明显的目的蛋白带。由此可知,K411基因已在毕赤酵母中获得成功表达,有待于下一步分离纯化。利用基因工程方法获得芋螺毒素将为芋螺毒素新药的研发和临床药物的工业化生产奠定坚实的基础。
摘要:蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶.在热带药用海洋生物芋螺的毒液中富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要.本研究主要采用凝胶过滤层析和制备型Rotofor液相等电聚焦电泳等多种方法,从海南产桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)毒管中分离纯化天然的PDI酶蛋白,经电泳和MALDI-TOF MS质谱鉴定分析确证获得了高纯度的桶形芋螺PDI酶,建立了天然芋螺PDI酶分离纯化的技术方法.以芋螺毒素线性肽K412为底物进行了PDI酶活性鉴定.结果表明,该分离纯化的PDI酶能够促进K412的氧化折叠.由于芋螺毒素的氧化折叠非常复杂,且氧化折叠后具有正确二硫键连接方式的芋螺毒素才具有各种药理活性,因此,本研究结果为后续PDI酶在种类繁多的芋螺毒素氧化折叠中的应用及其作用机制研究提供了重要的物质基础.
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