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摘要:[目的]研究模拟野外温度骤变和缓慢升降温驯化对优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因表达量、血淋巴海藻糖及总糖含量的影响以及三者间的相关性.[方法]通过高通量转录组数据筛选,从优雅蝈螽中克隆TPS基因cDNA全长.采取模拟野外温度骤变和缓慢升降温两种温度驯化策略,以热电偶温度计测得优雅蝈螽体温与环境温度最为接近的温度值作为最适温度,实时荧光定量PCR测定优雅蝈螽TPS表达,硫酸蒽酮法测定血淋巴海藻糖和总糖含量(以25℃最适温度作为对照).[结果]克隆得到的TPS基因命名为GgTPS(GenBank登录号:KU578006),全长3225 bp,包含2430 bp的开放阅读框,5′-非编码区(5′-untranslated region,5′-UTR)153 bp和3′-非编码区(3′-untranslated region,3′-UTR)642 bp.共编码809个氨基酸,预测的蛋白分子量(Mw)91.35 ku,理论等电点(pI)6.28.骤然降温阶段TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃最高,与最适温度25℃差异显著.海藻糖相对含量在0℃显著高于25℃.总糖相对含量在0℃和10℃显著高于25℃.骤然升温阶段,TPS相对表达量呈先降低后升高,再降低的变化趋势,40℃达到最高且与25℃差异显著.缓慢降温阶段TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃和20℃显著高于25℃;海藻糖含量表现出先降低后升高的变化趋势,0℃显著高于25℃,总糖含量在0℃、10℃和20℃与25℃差异显著.缓慢升温阶段TPS相对表达量先降低后升高,30℃和45℃显著低于25℃.海藻糖相对含量在40℃显著低于25℃.总糖相对含量呈先升高后降低的变化趋势,40℃和45℃显著高于25℃.不同温度驯化策略比较TPS相对表达量在15℃、40℃差异显著;海藻糖相对含量在40℃和45℃差异显著;总糖相对含量在10℃和20℃差异显著;体温在30℃差异显著.[结论]温度驯化能够提高昆虫的抗逆能力,昆虫体内TPS表达量和海藻糖合成量与其所处环境温度及作用时间密切相关.低、高温条件下TPS的表达和海藻糖的积累模式不同....
摘要:规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结....
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北大核心 CSTPCD CSCD
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摘要:Vasa基因属于DEAD-box家族,其功能主要是特定mRNA的翻译调控.在许多动物中,它都是生殖系细胞发育所必须,对生殖干细胞分化具有重要作用.为探究vasa基因在半变态类昆虫生殖系细胞发育中的作用,本研究首先从基于Illumina高通量测序平台测得的优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa成体转录组数据中筛选出一段长度为1215 bp的vasa基因片段,进而设计引物并利用RT-PCR和RACE技术获得其cDNA序列全长,最后利用生物信息学技术进行分析.结果显示:优雅蝈螽vasa基因的cDNA序列全长3359 bp,其中,5'端非编码区82bp,3'端非编码区1306 bp,开放阅读框1971 bp编码656个氨基酸,理论蛋白相对分子量(Mw) 72.3 kDa,等电点(pI) 5.48.通过与GenBank数据库中收录的其他VASA蛋白序列比对,发现优雅蝈螽VASA蛋白具有DEAD-box蛋白家族所共有的9个保守基序,AxTGoGKT (Ⅰ)、PTRELA (Ⅰa)、TPGR (Ⅰb)、DEAD(Ⅱ)、SAT(Ⅲ)、LVFVE(Ⅳ)、TDVuARGID(Ⅴ)、HRIGRTGR(Ⅵ)和GaccPoh1Q (Q),其中,GaccPohlQ (Q)的第3个氨基酸残基存在显著变化,建议将GaccPoh1Q(Q)修改为GaxcPoh1Q (Q).此外,优雅蝈螽VASA蛋白的N端还具有10个RG和2个RGG重复序列、起始及终止密码子附近的色氨酸(W)、C末端的7个氨基酸残基中有4个为酸性氨基酸残基(E),表明其具有ATP依赖的RNA解旋酶活性.基于氨基酸序列聚类结果显示:优雅蝈螽位于六足动物分枝末梢,与双斑蟋Gryllus bimaculatus的亲缘关系最近,这与二者的分类学地位相符.本研究表明基于短读长二代测序平台获得的转录组数据可以很好地服务于功能基因研究,所获得的优雅蝈螽vasa 基因cDNA全长对于进一步深入研究VASA蛋白在半变态类昆虫生殖系细胞发育研究具有重要意义....
摘要:海藻糖酶是一种二糖水解酶,催化海藻糖转换为葡萄糖,为昆虫包括发育、壳多糖合成及飞翔代谢在内的多种生理过程所必需.尽管某些昆虫的海藻糖酶基因已被鉴定,但优雅蝈螽的海藻糖酶编码序列尚未见报告.本研究采用RACE结合多重PCR技术,分离鉴定优雅蝈螽的水溶性海藻糖酶(GgTre1)和类膜结合型海藻糖酶(GgTre2-like)的全长编码序列(cDNA),包括携带不同长度3’-非翻译区(3'-UTR)的3个GgTre1 cDNA亚型(GenBank:No.KY400001-KY400003)和3个GgTre2-likecDNA亚型(GenBank:No.KY400004-KY400006).3个GgTre1 cDNA序列分别为2 107,2 021和1 914bp,具有相同长度的5’-UTR(33 bp),但3’-UTR长度不同,分别为322,248和129 bp.GgTre1-2 cDNA含1 740 bp,编码579个氨基酸残基组成的多肽链,分子量为67.29 kD;与之不同,根据cDNA演绎的GgTre1-1和GgTre1-3序列较GgTre1-2多4个氨基酸残基,多肽链的分子量为67.88 kD.3个GgTre2-like cDNA(GgTre2-like-1,-2和-3)序列全长分别为2 491,2 460和2 381 bp.5 '-UTR均为284 bp,3’-UTR分别为398,367和285 bp.GgTre2-like cDNA开阅读框为1 809 bp,编码602氨基酸残基组成的多肽链,分子量为67.88 kD.实时定量PCR,分析GgTre1和GgTre2-like基因在雌、雄个体(各20个)的组织特异性表达.结果显示,GgTre1在卵巢和附腺表达量最高;GgTre2-like主要在卵巢表达,在雄性肌肉和马氏管的表达量高于其他组织.上述结果表明,本研究从优雅蝈螽分离到3’-UTR长度不同的3个水溶性和3个类膜结合型海藻糖酶cDNA序列.结果还提示,GgTre1在各组织的表达差异较大,而GgTre2-like在各组织的表达相对稳定.不同长度3 '-UTR的GgTre1和GgTre2-like亚型的存在,以及不同长度的3'-UTR在翻译过程中的特殊作用,尚待今后研究证实....
[硕士论文] 骞蕾阳
细胞生物学 河北大学 2017(学位年度)
摘要:海藻糖是由两个D-吡喃葡萄糖以α1-α1糖苷键连接形成的非还原性二糖,在高温、寒冷、缺氧、干燥、脱水和营养匮乏等恶劣环境胁迫下,昆虫体内海藻糖能有效地稳定脱水酶,保护细胞膜和蛋白。本研究为海藻糖在提高昆虫抗逆性方面的研究提供理论基础。
  基于高通量转录组数据筛选,从优雅蝈螽中克隆TPS和Tre基因cDNA全长。旨在研究模拟野外温度骤变和缓慢升降温驯化对优雅蝈螽 Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶(TPS)基因表达量、血淋巴海藻糖和总糖含量的影响和三者间的相关性,以及海藻糖水解酶(Tre)基因组织特异性表达。采取模拟野外温度骤变和缓慢升降温两种温度驯化策略,以热电偶温度计测得优雅蝈螽体温与环境温度最为接近的温度值作为最适温度,实时荧光定量PCR测定优雅蝈螽TPS不同温度表达和Tre表达的组织特异性,硫酸蒽酮法测定血淋巴海藻糖和总糖含量(以25℃最适温度作为对照)。
  克隆得到一个TPS基因,一个水溶性海藻糖水解酶(Tre1)基因和一个类膜结合型海藻糖水解酶(Tre2-like)基因。TPS基因命名为GgTPS(GenBank登录号:KU578006),全长3225 bp,包含2430 bp的开放阅读框,5′-非编码区(5′-UTR)153 bp和3′-非编码区(3′-UTR)642 bp。共编码809个氨基酸,预测的蛋白分子量(Mw)91.35 ku,理论等电点(pI)6.28。两个Tre基因分别命名为GgTre1,GgTre2-like。分离到3个不同的GgTre1转录本(GenBank登录号:KY400001~KY400003),全长分别为2107,2021,1914 bp,5'-UTR33 bp,3'-UTR长度分别为322,248,129 bp。转录本1和转录本3编码区长度为1752 bp,编码583个氨基酸。蛋白分子量和等电点分别为67.88 ku和6.59。转录本2编码区长度1740 bp,编码579个氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为67.29 ku和6.34。得到3个不同的GgTre2-like转录本亚型( GenBank登录号:KY400004~KY400006),全长分别为2491,2460,2381 bp,5'-UTR284 bp,3'-UTR分别为398,367,285 bp。开放阅读框1809 bp,编码602氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为67.88 ku和6.59。
  骤然降温阶段 TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃最高,与最适温度25℃差异显著。海藻糖相对含量在0℃显著高于25℃。总糖相对含量在0℃和10℃显著高于25℃。骤然升温阶段,TPS相对表达量呈先降低后升高,再降低的变化趋势,40℃达到最高且与25℃差异显著。缓慢降温阶段 TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃和20℃显著高于25℃;海藻糖含量表现出先降低后升高的变化趋势,0℃显著高于25℃,总糖含量在0℃、10℃和20℃与25℃差异显著。缓慢升温阶段TPS相对表达量呈先降低后升高的变化趋势,但与25℃无显著差异。海藻糖相对含量在40℃显著低于25℃。总糖相对含量呈先升高后降低的变化趋势,40℃和45℃显著高于25℃。不同温度驯化策略比较TPS相对表达量在15℃、40℃差异显著。海藻糖相对含量在40℃和45℃差异显著。总糖相对含量在10℃和20℃差异显著。体温在30℃差异显著。GgTre1在雌性卵巢和雄性附腺表达量最高。GgTre2-like在卵巢中高表达,在雄性肌肉和马氏管高表达。
  实验结果表明,温度驯化能够提高昆虫的抗逆能力,昆虫体内TPS表达量和海藻糖合成量与其所处环境温度及作用时间密切相关。低、高温条件下TPS的表达和海藻糖的积累模式不同。基因组DNA序列表明2个GgTre基因3'-UTR逐渐增长由可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)引起。GgTre2-like较GgTre1有相对稳定的表达趋势。两个GgTre基因表达的组织特异性不同。
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