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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST SA
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摘要:制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176~217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持....
[硕士论文] 马琳琳
化学生物学 厦门大学 2012(学位年度)
摘要:Rab/Ypt/Sec4家族是RaS超家族中重要的一类小分子GTP酶,在调控细胞内膜泡运输途径方面发挥重要的作用。Rab39是Rab家族中的新发现的蛋白,包含两个亚型:Rab39A和Rab39B,两者分别定位于11号染色体和X染色体上,CDS序列具有较高的相似性。关于Rab39功能,目前还没有深入的研究报道。
   为了制备抗Rab39A抗体用于研究,分析了Rab39A氨基酸序列,选取Rab39A免疫原性强和特异性高的羧基端42个氨基酸(176-217aa)作为目的片段。通过PCR扩增Rab39A羧基端的42个氨基酸的DNA编码序列,构建了pGEX-4T-1-Rab39C42质粒。诱导表达、纯化获得GST-Rab39C42融合蛋白,免疫健康新西兰兔,制备了抗Rab39A的抗体。制备的抗体在免疫印迹中可以特异性地识别外源和内源的Rab39A,在免疫荧光中能够识别内源Rab39A。
   酵母双杂交是寻找与靶蛋白相互作用蛋白的一种非常有效的方法。为了研究Rab39A蛋白的功能,采用酵母双杂交的方法,以Rab39A作为诱饵蛋白,利用Gal4系统钓取文库中与Rab39A相互作用的蛋白。首先构建pGBKT7-Rab39A载体,将其转入AH109酵母菌。在检测其毒性和自激活能力后,与Y187文库菌进行杂交。最终通过DNA测序确定在文库中钓取的基因序列。在NCBI中进行Blast分析,获得克隆对应的蛋白信息。然后挑取感兴趣的基因重新转入Y187酵母菌中,与转入pGBKT7-Rab39A的AH109进行杂交,同时与pGBKT7 vector载体杂交作为对照,验证酵母双杂交结果。再通过免疫荧光和GST-pulldown实验进一步验证筛选出的蛋白与Rab39A的相互作用。
   结果:
   1.成功预测了Rab39A的特异性抗原表位,并制备了抗原。
   2.免疫新西兰兔,成功制备了抗Rab39A的特异性抗体,用于Western Blot和免疫荧光检测。
   3.通过酵母双杂交获得了一些与Rab39A相互作用的候选蛋白,为进一步研究提供了重要线索。
   4.通过酵母双杂交、免疫荧光和GST-pulldown实验发现Rab39A与AP4具有相互作用。
  
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