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[硕士论文] 马泽旭
化学生物学 厦门大学 2012(学位年度)
摘要:[背景]
   Rab/Ypt/Sec4家族是RasGTP酶超家族中最大的一个分支蛋白家族。其在调控细胞生长、运动、凋亡、细胞内蛋白质运输等方面起着重要作用。目前已经发现了超过70种Rab以及Rab-like蛋白。已经研究过功能的有36种Rab蛋白。本文研究的hRab29蛋白还未被研究过。
   [目的]
   明确Rab29蛋白在细胞中的亚细胞结构定位;确定Rab29分子在各个组织中的表达差异;制备和检测Rab29蛋白的多克隆抗体。
   [方法]
   1.运用分子克隆技术构建融合不同蛋白标签的Rab29野生型及突变型质粒。如GFP-Rab29WT、pDmyc-Rab29WT、pDmyc-Rab29T21N、pDmyc-Rab29Q67L、GST-Rab29WT-羧基端。
   2.利用质粒转染技术和免疫荧光技术确定Rab29蛋白的定位。
   3.通过聚合酶链式反应(PCR)技术以及利用人不同组织cDNA文库,对Rab29进行表达差异分析。
   4.运用GST-beads提取纯化Rab29抗原蛋白;利用抗原免疫家兔,制备Rab29抗体。
   5.运用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、免疫印迹技术、免疫荧光技术对制备抗体进行检测。
   [结果]
   1.构建的各个融合标签Rab29质粒测序正确。
   2.Rab29在所检测的各个组织中均有表达,其中在肝、胰、肾三种组织中表达量较高。
   3.Rab29蛋白与高尔基体标记蛋白TGN46、TGN38、GSl5、MANⅡ、GM130有良好的共定位。与其他细胞器诸如早期内体、晚期内体、溶酶体的标记蛋白EEA1、LBPA、LAMP1没有共定位。
   4.正确表达了抗原GST-Rab29WT-羧基端蛋白并成功免疫新西兰大白兔;获得约100mL抗体血清。
   5.成功检测Rab29抗体的特异性。
   [结论]
   1.Rab29分子在机体各组织有普适表达。在肝、胰、肾三种组织中表达量较高。
   2.Rab29定位于细胞中高尔基体中间膜囊和反面高尔基体片层结构。
   3.成功制备了Rab29蛋白抗体,该抗体可特异检测到外源以及细胞内源Rab29蛋白。
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