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[博士论文] 马文涛
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的肝再生是在损伤刺激下肝脏进行的代偿性生长。在这个过程中,肝脏中的固有免疫系统,尤其是Kupffer细胞和NK细胞具有非常重要的调节作用。近年来的研究表明,Kupffer细胞在肝脏损伤时释放的细胞因子TNF-α和IL-6能够激活肝实质细胞内的Stat3信号通路,从而促进肝实质细胞的增殖。此外,Kupffer细胞也能够通过激活肝脏前体细胞促进肝再生。在另一方面,NK细胞对肝再生具有很强的抑制作用。NK细胞分泌的IFN-γ通过活化肝实质细胞的Stat1并因此抑制Stat3信号通路,从而抑制肝实质细胞的增殖。近期的一项研究表明,NK细胞是肝再生过程中最为重要的IFN-γ来源;在小鼠肝再生过程中,NK细胞上的一种共抑制性受体TIGIT的缺失将引起NK细胞的过度活化,从而抑制肝再生的进行。
  PTEN是一种重要的肿瘤抑制蛋白。在多种类型肿瘤的发生过程中,Pten基因的突变都能被检测到。PTEN可以负向调节维持细胞存活及增殖的PI3K-Akt信号通路,从而抑制多种细胞的增殖。另外,PTEN对免疫细胞的活化同样具有重要的调节作用。一项有关小鼠腹腔巨噬细胞的研究表明,PTEN能够正向调控LPS诱导的TLR4信号通路的活化,进而影响巨噬细胞炎性细胞因子的分泌。除此之外,PTEN也能够通过抑制巨噬细胞M2型极化所需的一些重要基因从而调控腹腔巨噬细胞的极化和炎性细胞因子的分泌。但是,PTEN是否参与了肝再生过程的调控未见报道。
  我们认为,阐明肝脏中Kupffer细胞和NK细胞的相互作用对于研究肝再生的分子学机制具有重要的意义。为了更好地探究肝脏中Kupffer细胞和NK细胞对肝再生的影响,我们主要利用PTEN在髓系细胞中特异性缺失的LysMcre/+PTENf/f小鼠(PTENmKO小鼠)及对照鼠PTENf/f鼠展开研究。我们的研究结果如下:
  正常小鼠肝再生过程中Kupffer细胞的特征。
  我们发现,同以往的研究报道一致,使用氯磷酸盐脂质体清除小鼠肝脏Kupffer细胞后,小鼠肝再生的速度将明显减慢。由于我们使用的Kupffer细胞清除方法同样能清除腹腔里的巨噬细胞,为了排除腹腔巨噬细胞在肝再生中的影响,我们在使用氯磷酸盐脂质体处理小鼠之前对其进行了腹腔清洗处理,该结果同样表明Kupffer细胞的清除抑制了小鼠的肝再生。以上结果表明小鼠肝脏Kupffer细胞在正常的肝再生过程中具有不可或缺的作用。进一步,我们发现将正常小鼠进行2/3肝切除后,Kupffer细胞的数量与对照鼠相比并没有显著的变化,但是 Kupffer细胞内PTEN蛋白的水平有明显的上调,并且伴随着PTEN的上调,Kupffer细胞呈现出显著的M1型极化的特征,这可以通过Kupffer细胞下调CD206以及上调CD11c、MHC-Ⅱ和CD80的表达得以体现。
  髓系细胞PTEN缺失的小鼠肝再生速度明显加快。
  我们利用PTENmKO小鼠及PTENf/f对照鼠进行了进一步的研究。通过PCNA和Ki-67免疫组化染色表征的细胞增殖情况、HE染色显示的细胞有丝分裂指数以及肝脏重量与体重的百分比等分析,我们发现PTENmKO小鼠的肝再生速度比对照鼠明显加快。
  髓系细胞PTEN缺失小鼠的Kupffer细胞表现为M2型极化的特征,从而对NK细胞的活化能力降低。
  进一步的研究表明,PTENmKO小鼠的Kupffer细胞通过激活细胞内的Akt并抑制FoxO1信号通路,使其自身倾向于M2型的极化特征。此外,PTENmKO小鼠肝脏NK细胞的活化程度明显降低,这主要表现为IFN-γ分泌能力的降低以及活化相关分子表达水平的下降。进一步的实验结果表明,PTENmKO小鼠的Kupffer细胞降低了其表面与NK细胞活化相关的多种分子的表达,减少了其IL-12的分泌水平,这是这类小鼠肝脏NK细胞活化程度降低的主要原因。
  髓系细胞PTEN缺失小鼠的Kupffer细胞分泌生长因子的能力增强。
  在2/3 PHx后48 h时,荧光定量PCR分析结果显示,PTENmKO鼠的Kupffer细胞表达更高水平的pdgf, hgf以及osm。这些生长因子通常能活化其下游的Stat3信号通路。与之一致的是,PTENmKO鼠肝脏中Stat3的磷酸化水平明显升高。我们进一步证明了Kupffer细胞对肝实质细胞的这种直接的增殖促进作用,因为PTENmKO鼠Kupffer细胞来源的条件培养液具有更强的促进小鼠肝实质细胞系体外增殖的能力。
  综上所述,PTEN蛋白抑制了Kupffer细胞的M2极化,从而使其更容易活化NK细胞,抑制肝再生的过程。另外,PTEN也能抑制Kupffer细胞分泌多种生长因子。因此,Kupffer细胞中PTEN蛋白的总体作用便抑制了肝再生的进行。考虑到Kupffer细胞的强吞噬能力以及由此开发的Kupffer细胞靶向药物,我们的结果表明,对Kupffer细胞中PTEN表达的干预有望为临床上肝脏部分切除病人的肝脏功能恢复提供新的治疗靶点。
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