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[硕士论文] 马志强
生理学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:促肾上腺皮质激素释放激素CRF(Corticotropin-releasing factor,CRF or CRH)是HPA轴的核心应激调节肽,通过受体CRFR1和CRFR2发挥其功能。尿皮素UCN(Urocortin)为CRF基因家族新成员。低氧应激时,HPA轴激活,下丘脑分泌CRF,通过垂体ACTH细胞膜上的CRFR1受体促进其分泌促肾上腺皮质激素ACTH(Adreno-corticotropic hormone,ACTH),继而促进血浆皮质酮水平增加,从而调节动物一系列低氧反应。高原小哺乳动物长期生长在高原寒冷和低氧环境中,其中高原鼢鼠(Myospalax Baileyi)居住在高原3000-4500m的地下洞穴中,而甘肃鼢鼠(Myospalax Cansus)也是生活在地下,其海拔高度为800-1500m的地区,这几种动物都面临着不同程度的低氧和高CO2环境。
  我们实验室前期研究发现这几种高原动物HPA轴对低氧应激呈低反应性,为了深入阐述这几种高原小哺乳动物的高原环境适应机制,本研究采用分子生物学,细胞生物学,酶联免疫吸附实验等手段,获得如下结果:
  1.克隆甘肃鼢鼠的CRF、UCN和CRFR1编码区序列,并和高原鼢鼠相应的基因进行分析比较。甘肃鼢鼠CRF成熟肽序列与高原鼢鼠、大鼠、小鼠、根田鼠、北美草原田鼠及人类的完全一致;甘肃鼢鼠UCN成熟肽序列与高原鼢鼠、大鼠及小鼠的完全一致,但它们与人类相比,都有N末端,第2位和第4位的2个氨基酸不同(Asp2Asn,Pro4Ser);根田鼠与甘肃鼢鼠相比,N末端有第1、37和38位共3个氨基酸的不同(AsplAsn,Phe37Leu,Asp38His);甘肃鼢鼠CRFR1受体与高原鼢鼠的相似度最高,仅在第71位和第379位有2个氨基酸的不同(Leu71Phe,Arg379His),分别位于受体的胞外域和胞内域。甘肃鼢鼠CRFR1受体与人类相比有第3、4、23、29、62、65、71、114、117、132、218和379位共12个氨基酸的不同,这些位点差异在胞外域、跨膜区和胞内域都有分布。
  2.比较脑组织CRF、UCN及CRFR1mRNA表达变化。低氧(7000m,8h)应激显著上调实验室SD大鼠大脑前额叶皮层的CRF、UCN及CRFR1mRNA表达;甘肃鼢鼠大脑前额叶皮层CRF、Ucn和CRFR1mRNA表达水平高于高原鼢鼠。
  3.利用CHO细胞研究配体-受体结合后的第二信使cAMP和Ca2+浓度变化,分析不同受体及突变位点的差异。CRF孵育CHO细胞(转染了大鼠、高原鼢鼠、甘肃鼢鼠以及突变型甘肃鼢鼠CRFR1受体)20min,CRF诱导产生的cAMP呈剂量依赖性,其半数有效剂量EC50分别为:14.46,23.36,17.79和21.04nM。高原鼢鼠CRFR1受体(M.b-CRFR1)的EC50最高,其次是突变型甘肃鼢鼠受体的(mM.c-CRFR1),然后是野生型甘肃鼢鼠CRFR1受体(M.c-CRFR1),大鼠CRFR1受体(Rat-CRFR1)最低。
  4.应用生物信息学分析方法及ChIP-PCR实验探讨了CRFR1受体的启动子区的低氧下的转录机制,证明小鼠CRFR1受体启动子上分别存在5个AP-1和8个NF-kB结合位点。
  5.利用ELISA试剂金分析检测了暴露于高原环境(3860m)后的血清和唾液中的配体CRF的水平变化,其中急性高原反应(AMS)组,唾液及血清中CRF浓度均明显高于健康对照组人群,而高原脑水肿+肺水肿组又高于急性高原反应组。
  结果提示,GPCR受体-CRFR1基因编码区的位点突变可能是高原鼢鼠低氧低反应性的分子机制之一,高原动物可以通过多水平精细调节配体分泌,受体基因表达,以及不同的转录因子的结合等生理反应以适应极端环境。配体CRF水平的升高可能可以预警急性高原反应及其严重程度。
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