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[博士论文] 顾永忠
妇产科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文分为以下几个章节进行探讨:
  第一章 胎盘植入中microRNA-125a,microRNA-29a/b/c和MCL1表达水平分析
  目的:
  1.检测并分析miR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入部分与自身邻近非植入组织中的表达是否存在差异。
  2.检测并分析植入和自身邻近非植入组织中MCL1基因mRNA水平的表达及差异,并分析MCL1与miR-125a和miR-29a/b/c表达相关性。
  3.探讨MCL1是否作为miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因在胎盘植入中发挥作用。
  方法:
  1.采用自身对照的配对设计,收集新鲜未经任何干预处理的母体面胎盘绒毛、类纤维蛋白层及基板层,植入部分还包括基板子宫肌层纤维。
  2.提取组织中总RNA,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链(RT-qPCR)反应检测胎盘植入部分及自身邻近非植入部分组织中miR-125a,miR-29a/b/c和MCL1的表达。
  3.应用载体(pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector,pmirGLO)构建野生型MCL1-miR-125a-pmirGLO质粒(WT-125)和野生型MCL1-miR-29a/b/c-pmirGLO质粒(WT-29)。突变野生型质粒中的种子区序列部分碱基成为突变型MCL1-miR-125a-pmirGLO质粒(MUT-125)和突变型MCL1-miR-29a/b/c-pmirGLO质粒(MUT-29)。用化学合成方法以miR-125a或miR-29a/b/c成熟核苷酸序列为模板分别合成microRNA模拟物,通过脂质体Lipofectamine3000将miR-125a模拟物与WT-125或者MUT-125共转染入293T细胞,将miR-29a/b/c与WT-29或者MUT-29共转染入293T细胞。
  4.双荧光素酶报告基因检测探讨MCL1与miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因关系。
  结果:
  1.MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入部分组织中的表达水平明显低于自身邻近非植入部分组织,对应的表达倍数分别是0.64;0.63;0.64;0.75(p=0.005;0.018;0.041;0.022)。
  2.MCL1基因的mRNA在胎盘植入部分组织中表达水平明显高于自身邻近非植入部分组织,表达倍数为1.32(p=0.039)。
  3.Pearson相关分析表明,胎盘植入组织中miR-125a和miR-29a/b/c的相对表达量与MCL1的相对表达量呈显著负相关性(Pearson correlation=-0.701,-0.543,-0.876,-0.767, p<0.05)。
  4.双荧光素酶报告基因检测(luciferase activity assays)证实MCL1是miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因(p=0.043,0.006,0.009,0.010)。
  结论:
  MiR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入组织较自身邻近非植入组织表达水平显著降低,相反MCL1 mRNA在胎盘植入部分组织中表达显著增高,两者在胎盘植入中的相对表达量呈明显的负相关性。双荧光素酶报告基因检测证实MCL1是miR-125a和miR-29a/b/c的靶基因,推测miR-125a,miR-29a/b/c通过调控靶基因MCL1表达参与胎盘植入发生。
  第二章 胎盘植入中microRNA-125a和microRNA-29a/b/c调控滋养细胞生物学行为的研究
  目的:
  1.体外转染滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞,进一步验证miR-125a和miR-29a/b/c对靶基因MCL1的负性调节作用。
  2.探讨miR-125a和miR-29a/b/c异常表达对滋养细胞凋亡生物学行为的影响。
  3.确定抗凋亡滋养细胞的类型,初步探讨miR-125a和miR-29a/b/c在胎盘植入中的病理作用机制。
  方法:
  1.以miR-125a和miR-29a/b/c成熟核苷酸序列为模板,用化学合成方法分别合成microRNA的模拟物(miR-125a mimic,miR-29a/b/c mimics),反义的microRNA抑制物(miR-125a inhibitor, miR-29a/b/c inhibitors)以及各自对应的阴性对照序列(negative control,NC,inhibitor negative control,INC)。通过脂质体Lipofectamine3000分别将模拟物、抑制物及各自对应的阴性对照序列转染滋养细胞系HTR-8/SVneo。
  2.应用RT-qPCR反应检测microRNAs转染后HTR-8/SVneo细胞中MCL1 mRNA水平表达量的变化。应用Western Blot方法检测转染后HTR-8/SVneo细胞中Mcl1蛋白水平表达量的变化。
  3.应用AnnexinⅤ/PI对转染后的HTR-8/SVneo细胞进行双染,应用流式细胞仪检测HTR-8/SVneo细胞凋亡率。
  4.对切除的子宫和胎盘组织进行组织病理切片,免疫组化染色病理组织切片定位Mcl1表达细胞类型,结合H&E染色观察细胞形态、数量。
  结果:
  1.转染HTR-8/SVneo细胞后,miR-125a和miR-29a/b/c模拟物转染组中MCL1 mRNA表达水平较阴性对照组明显下降,表达倍数为0.60,0.42,0.58,0.43(p=0.0497,0.002,0.008,0.013);模拟物转染组中MCL1的蛋白表达水平也明显降低。
  2.MiR-125a和miR-29a/b/c模拟物转染后,HTR-8/SVneo细胞凋亡率较阴性对照组呈现增长趋势。
  3.H&E染色和免疫组化染色病理切片均观察到种植部位中间型滋养细胞(ISIT)数量在植入部分基板子宫肌层纤维间隙明显增多,免疫组化染色显示MCL1主要在ISIT中表达。显微镜下发现,相比于非植入部分,植入部分中间型滋养细胞细胞迁移至深部肌层内血管壁内现象更常见。
  结论:
  MiR-125a或miR-29a/b/c的过表达可显著降低MCL1基因mRNA和蛋白的表达并促进HTR-8/SVneo细胞的凋亡。植入部分基板子宫肌层纤维间隙中主要表达MCL1的ISIT数量明显增多。以上结果提示植入胎盘组织中miR-125a和miR-29a/b/c对靶基因MCL1异常调控导致植入部分基板子宫肌层纤维间隙中ISIT数量明显增多进而参与胎盘植入的发生。
摘要:子宫内膜异位症(内异症)是指子宫内膜腺体和间质异位并种植于子宫腔以外的部位,是一种育龄妇女常见的、多因素影响的、雌激素依赖的、慢性良性疾病,全世界大约有7000万女性患病[1].盆腔疼痛是其主要临床症状之一,子宫内膜异位症相关疼痛作为一种身心疾病严重地影响着妇女的生理、心理和社会健康,社会经济负担严重.但其产生机制尚不清楚,目前的研究表明参与因素有炎症反应、雌激素、神经纤维损伤再生、中枢神经系统以及心理认知等,是一个非常复杂的过程.而了解子宫内膜异位症相关疼痛的产生机制可以为临床治疗提供重要的理论基础.
[硕士论文] 顾永忠
妇产科学 山东大学 2009(学位年度)
摘要:目的:初步探讨子宫内膜异位症相关神经纤维与疼痛症状的临床相关性,前瞻性研究腹腔镜手术切除子宫内膜异位症病灶缓解临床疼痛症状的效果。 材料方法:选取山东大学齐鲁医院2008年1月-2009年2月收治的欲行腹腔镜手术的患有慢性盆腔痛、痛经或者卵巢囊肿的患者77例,其中70例经组织病理学确诊为子宫内膜异位症。 采用标准的视觉模拟评分法(VAS)对所有患者在入院时和术后3个月分别进行疼痛评分,依据术前VAS评分,将患有腹膜型子宫内膜异位症的51例患者分为A、B两组:评分不小于3分者纳入A组,否则纳入B组。患有非腹膜型子宫内膜异位症的患者纳入C组,没有子宫内膜异位症者为D组。应用免疫组织化学染色神经纤维丝显示病灶中的神经纤维,试验结果率的比较采用x2检验或者Fisher确切概率法;而术后和术前VAS评分之间的比较采用Wilcoxon符号秩和检验。p<0.05为差异具有统计学意义。 结果:腹膜型子宫内膜异位症患者中,A组临床疼痛症状严重者的子宫内膜异位症相关神经纤维表达率明显高于B组临床疼痛症状轻微者(82.9%/30.0%);临床诉痛经、盆腔痛及其组合症状者,病灶中子宫内膜异位症相关神经纤维的表达率明显高于其他症状者(83.7%/20.0%);腹腔镜手术能明显缓解A组临床疼痛症状严重者(术前VAS中位值:7/术后VAS中位值:1.5)和C组非腹膜型子宫内膜异位症患者(术前VAS中位值:6/术后VAS中位值:1)的临床疼痛症状;术后痛经、盆腔痛及其组合症状(术前VAS中位值:6.5/术后VAS中位值:1)得到明显缓解。 结论:本研究提示子宫内膜异位症相关神经纤维在腹膜型子宫内膜异位症疼痛症状的发生发展中发挥重要作用,特别是痛经和盆腔痛组合症状的产生;腹腔镜手术切除病灶是缓解子宫内膜异位症相关疼痛症状的有效方法,特别是可以明显缓解痛经、盆腔痛及其组合症状。
摘要:多普勒脐动脉血流测定是估计胎儿-胎盘循环动力学改变的一种有效、无创的方法,通过测定收缩期最大血流速度与舒张末期血流速度的比值(S/D)、脉动指数、阻力指数等指标预测胎儿发育的健康状况及围产儿预后.胎儿舒张末期脐动脉血流缺失和返流波的出现是一个危险信号,预示可能在数天内胎死宫内,围产儿死亡率高达50%.脐动脉血流分析作为一项胎盘功能试验,用于正常孕妇筛查时,其敏感性较低,但在高危妊娠(妊娠高血压、胎儿生长受限、妊娠糖尿病等)中有明显价值,为临床诊断和治疗提供重要依据.
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