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[硕士论文] 顾小飞
生物工程 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:链霉菌 SH-62是一株具有良好生物活性的吸水链霉菌,对革兰氏阳性菌有很好的抗菌效果,对酵母以及多种植物病原真菌也有良好的拮抗作用。生物信息学分析发现链霉菌SH-62基因组中存在一个I型聚酮合酶(PKS)基因簇—gld基因簇,与Streptomyces autulyticus CGMCC0516中格尔德霉素生物合成基因簇(gdm)具有同源性。前期研究发现无论是在野生型链霉菌SH-62还是gld基因簇的异源表达菌株中均没有检测到格尔德霉素的产生,暗示着gld基因簇可能产生新的代谢产物。此外gld基因簇中存在4个gap,序列相似度很高,序列拼接困难。
  本研究首先通过特异性引物的PCR扩增以及构建阳性BAC质粒的亚克隆进行测序分析,成功填补了gld基因簇中剩余的4个gap区,获得了完整的gld基因簇序列信息。将完整的基因簇序列重新进行生物信息学分析,证实除了甲基转移酶的位置不同外,gld基因簇与格尔德霉素生物合成基因簇 gdm的组成和排布几乎完全相同。同时为了验证前期实验结果的正确性,还重新构建了gld基因簇的异源表达菌株,并且通过TLC和HPLC分析证实异源表达菌株确实能够产生新的代谢产物GD-上和GD-下。
  为了进一步验证两种异源表达产物与gld基因簇的相关性,尝试利用CRISPR/Cas9-CodA(sm)系统来敲除核心PKS基因gldAIII,已完成敲除质粒的构建,尚未筛选到正确的缺失突变菌株。同时利用λred介导的PCR-targeting技术构建了核心PKS基因gldAI的缺失突变菌株S.albus::pGXF001,发现该基因缺失后两种异源表达产物在TLC和HPLC检测中的相应信号消失,表明这两种物质确实由gld基因簇异源表达产生。通过LC-MS分析发现这两个物质的质荷比m/z分别为269.0797和285.0758,对应的分子式为C16H12O4和C16H12O5。
  
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