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[博士论文] 韩利杰
内科学(血液病) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:背景及目的:异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是治疗恶性血液疾病等的重要手段,甚至被认为是治愈某些恶性血液疾病的唯一方法。移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是allo-HSCT后的主要并发症,也是当前制约allo-HSCT疗效的重要因素之一。多种因素影响了GVHD的发生发展,如:HLA配型、供者来源、干细胞来源、预处理方案、供受者年龄、性别等。除此外,近年一些研究表明肠道菌群与急性GVHD(acute GVHD,aGVHD)的发生发展密切相关。
  肠道菌群与机体免疫稳态密切相关,肠道菌群紊乱会改变上皮和粘膜通透性,打破免疫稳态,导致炎症性疾病的发生。在allo-HSCT动物模型显示:肠道厌氧菌(如梭状芽孢杆菌等)的代谢产物短链脂肪酸,可促进CD4+T细胞内乙酰化组蛋白的表达,进一步促进Foxp3的组蛋白乙酰化,介导调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)的组蛋白修饰作用,诱导免疫耐受,减轻aGVHD。此外,需氧菌(如致病性肠杆菌等)除了产生肠毒素破坏肠粘膜并抑制厌氧菌生长外,还可产生大量脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),LPS透过损伤的黏膜屏障进入血液循环并到达全身靶器官,激活T细胞,导致Th细胞分化失平衡,促进aGVHD发生。但是在人体内,肠道菌群影响T细胞免疫平衡的机制还不清楚。尤其是aGVHD发生前,肠道菌群对机体细胞免疫,Th细胞分化平衡等的影响,以及哪些菌群在aGVHD的发生发展中起关键作用都亟待进一步研究。基于以上科学问题,本研究目的是:探讨allo-HSCT后aGVHD和未发生aGVHD患者,在移植前和造血植入时肠道菌群、T细胞亚群的差异性;分析肠道菌群与机体免疫之间的关系;揭示肠道菌群在aGVHD的发生发展中作用及机理;为临床aGVHD预测及aGVHD防治提供新的思路和依据。
  方法:(1)临床样本收集:2015年1月至2016年12月在本院接受allo-HSCT的受者,分别收集病人预处理前、造血植入时(造血植入后第3-4天)粪便1g左右及外周血4-5ml。基于移植后100内aGVHD发生情况分为二组:aGVHD组(Ⅱ-ⅣaGVHD);non-aGVHD组(0-ⅠaGVHD)。
  (2)肠道菌群检测:利用HiPure Stool DNA Kit试剂盒提取菌群基因组DNA,用荧光定量方法检测样品浓度,使用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定样品完整性。对提取的基因组DNA进行PCR扩增,构建菌群文库,使用Agilent2100Bioanalyzer对菌群文库质控;利用HiSeq2500测序仪对PCR扩增产物的16s rRNA V3-V4可变区进行测序,通过SILVA数据库将所测序列进行序列比对,并经多样性指数、LEfSe(Linear discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe)分析等方法对各组微生物种类进行多样性和分类学的比较,以期发现aGVHD患者肠道菌群的差异性改变。
  (3)T细胞亚群的检测:采用流式细胞术检测外周血T细胞亚群(Treg、Th17、Th1)的比例,CD4+T细胞内乙酰化组蛋白H3(ace-H3)和ace-H4表达水平(中位荧光强度(median fluorescence intensity,MFI))。
  (4)细胞因子的检测:采用液相芯片技术检测血浆细胞因子----白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10、IL-17A及干扰素(interferon,IFN)-γ表达水平。
  (5)相关性分析:采用Spearman相关分析,分析肠道菌群与T细胞亚群、CD4+T细胞内乙酰化组蛋白水平的相关关系。
  (6)对aGVHD的预测:基于移植后患者肠道菌群特征,通过ROC(receiver operator characteristic,ROC)曲线下面积(AUC)评估菌群对aGVHD的预测价值。对AUC≥0.65的菌群,通过菌群累计积分再对aGVHD预测,并分析菌群积分与aGVHD分级的相关性。
  结果:(1)二组病人临床与移植特征:在81例纳入本研究的患者中,移植后32例患者发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD、49例患者发生Ⅰ度aGVHD或没有发生aGVHD。两组病人除了aGVHD组有更多病人接受强化预处理,临床特征无明显差异。
  (2)二组抗菌药物应用:在造血植入前,aGVHD组较non-aGVHD组有更多病人接受β-内酰胺类抗菌药(预处理开始至植入前,连用3天或以上)。
  (3)预处理前二组菌群:预处理前二组病人的菌群多样性无显著差异。菌群结构方面,在门、纲、目、科、属水平均没有显著差异。
  (4)造血植入时二组菌群差异:造血植入时aGVHD组菌群多样性低于non-aGVHD组。在菌群结构方面,从纲水平看,梭菌纲(Clostridia)的丰度在aGVHD组少于non-aGVHD组,而γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)在aGVHD组多于non-aGVHD组。在科水平,Lachnospiraceae、Ruminococcaceae等的丰度在aGVHD组少于non-aGVHD组,而Enterobacteriaceae在aGVHD组多于non-aGVHD组。
  (5)抗菌药物及预处理对肠道菌群的影响:β-内酰胺类抗菌药物和万古霉素均导致菌群多样性降低。同时β-内酰胺类药物会导致Lachnospiraceae丰度降低;万古霉素则导致Enterobacteriaceae丰度升高。其次,强化预处理较标准预处理会导致菌群多样性降低,以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceaee丰度降低。没有发现其他因素对菌群的显著影响。
  (6)aGVHD的危险因素:Cox回归模型分析显示,β-内酰胺类抗菌药物应用和移植后低菌群多样性是aGVHD的独立危险因素。而患者年龄、供者类型、万古霉索(静脉)等不是aGVHD的独立危险因素。
  (7)植入时二组T细胞亚群及细胞因子水平:造血植入时aGVHD组外周血Treg细胞占CD4+细胞比例低于non-aGVHD组。而aGVHD组Th17细胞比例高于non-aGVHD组。Th1细胞比例没有显著差异。血浆中细胞因子IL-17A水平在aGVHD组高于non-aGVHD组,而IL-4、IL-10、IFN-γ表达水平没有显著差异。
  (8)CD4+T细胞内乙酰化组蛋白水平与T细胞亚群的关系:aGVHD组CD4+T细胞内ace-H3的MFI水平低于non-aGVHD组。ace-H4的MFI水平二组没有显著差异。ace-H3的MFI水平与Treg/Th17细胞数比值正相关。没有发现ace-H4与Treg/Th17有相关性。
  (9)肠道菌群与免疫的关系:Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Enterobacteriaceae的丰度与Treg/Th17细胞数比值分别呈正相关、正相关和负相关。Lachnospiraceae、Ruminococcaceae的丰度与CD4+T细胞内ace-H3的MFI水平呈正相关。
  (10)肠道菌群对aGVHD的预测价值:在探索肠道菌群对aGVHD的预测价值时发现,四种菌科的丰度----Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae能预测aGVHD的发生。这四种菌群累计积分后预测Ⅱ-Ⅳ和Ⅲ-ⅣaGVHD的ROC曲线下面积分别为0.73和0.85。而且,四种菌群的积分与aGVHD的分级密切相关(r=0.560,P<0.001)。
  结论:(1)在allo-HSCT后造血植入时,肠道菌群多样性和菌群结构都与aGVHD的发生密切相关,而特定菌群的变化与抗菌药物应用和预处理损伤有关。
  (2)allo-HSCT后,肠道菌群与外周Treg/Th17细胞免疫平衡以及CD4+T细胞内的ace-H3水平密切相关,可能影响Treg/Th17的免疫平衡及aGVHD发生发展。
  (3)allo-HSCT后造血植入时肠道菌群组合积分不仅能够预测aGVHD的发生,而且能够预测aGVHD严重程度。
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