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扬州大学
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北大核心 CSTPCD
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摘要:试验采用自然沉降法和纳氏试剂法,研究有窗式鸡舍内不同位置对温度、相对湿度、氨气浓度和细菌总数等环境指标的影响.结果表明:东西走向上,细菌总数存在显著差异,东部显著高于西部(P<0.05),其他各环境因子差异不明显(P<0.05);南北走向上,相对湿度和氨气浓度差异明显,南部显著高于北部(P<0.05),而温度和细菌总数差异不显著(P>0.05).另外,鸡舍内外环境之间也存在一定差异.研究结果表明,有窗式鸡舍内不同位置其环境指标有所不同,应该适当利用环境调控手段如通风、控温等,以创造出相对均衡一致的养殖环境....
摘要:为探究lncRNA在鸡生殖细胞中的调控作用,以如皋黄鸡受精蛋为试验材料,基于高通量测序筛选结果,利用RACE技术获取lncRNA-CEPT8序列全长,通过荧光定量检测和核质分离试验确定lncRNA-CEPT8的富集位置,并进行ORF开放阅读框预测及构建原核融合表达载体,提取蛋白质后利用Western blot技术检测lncRNA-CEPT8编码的小肽.结果 表明:lncRNA-CEPT8全长为1 248 bp,在鸡原始生殖细胞质中富集,具有大小为246 bp且编码81个氨基酸的ORF,Western blot检测结果表明lncRNA-CEPT8编码一条大小约为9 ku的小肽.这一研究为进一步探究lncRNA-CEPT8编码的小肽在鸡原始生殖细胞中的调控作用及其对生殖细胞的影响奠定了基础....
摘要:试验旨在探究不同注射部位和剂量对鸡胚孵化率及发育的影响,为鸡胚注射试验提供帮助和指导.以新鲜受精鸡蛋为材料,分别在鸡蛋的尖端、赤道面和钝端注射不同剂量的生理盐水,比较不同注射部位和剂量对种蛋孵化率的影响;分别在3个位置注射台盼蓝染液,观察记录鸡胚的发育情况.结果表明:不同注射部位对种蛋孵化率无显著性影响(P>0.05);种蛋孵化率随注射剂量的增加明显下降,注射100 μL剂量的种蛋孵化率明显高于其他剂量水平.不同注射位置和剂量的生理盐水对鸡胚发育的影响并不显著;台盼蓝注射后胚胎发育情况表明,在胚胎发育初期赤道面注射的扩散效果最好....
摘要:本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据.基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP (chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率.Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%.通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除....
摘要:本研究利用精原干细胞介导法体内转染重组载体pVITRO2-Mx-NA以生产抗病转基因鸡.采用睾丸注射法将脂质体包裹的线性化质粒通过随机打点注射入公鸡睾丸,采集25、50、60、70d后试验公鸡的精液,提取基因组DNA,采用常规PCR检测外源Mx-NA联合基因的整合;转染后60d采集阳性公鸡精液人工授精母鸡,采用PCR和Western blot方法检测后代血液中外源NA-Mx联合基因的表达情况.结果表明:PCR检测证实外源Mx-NA联合基因已在精子基因组中表达,精液PCR阳性率为33.33%(2/6),且能通过体外受精在后代中检测到,后代PCR检测的阳性率为31.43%(11/35),Western blot检测F1代阳性率为28.6%(10/35).以上结果证明外源Mx-NA基因能稳定整合到鸡的基因组中,表明睾丸注射法是一种操作简单、有效的制备抗病转基因鸡的方法....
摘要:试验旨在探讨睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的诱导作用效果.首先对睾酮的适宜诱导浓度进行筛选,再联合支持细胞和维甲酸(RA)对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.结果表明:单独使用睾酮诱导,未出现精原干细胞(SSCs)样细胞;睾酮与支持细胞联合诱导时,在第6天有少许类胚体出现,至第12天,有少量SSCs样细胞;睾酮联合支持细胞和RA诱导过程中,诱导第2天出现类胚体,诱导第12天后出现类SSCs样细胞.实时荧光定量PCR结果显示,睾酮+支持细胞组中,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势,Dazl、inte grinβ1、Stra8表达量持续上调;睾酮+支持细胞+RA共同诱导组中,各标记基因与ESCs向生殖细胞分化过程中各基因表达的趋势一致,并且Dazl的表达量明显高于对照组.睾酮单独诱导不能使ESCs向雄性生殖细胞分化,但有促进支持细胞和RA诱导效果的作用,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:为了深入研究鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向雄性生殖细胞分化过程,基于RNA-Seq基础,筛选出功能未知且差异极其显著的关键基因C1 EIP,PCR克隆得到其编码区全长序列409 bp,构建其真核表达载体pcDNA3.0-C1EIP和pEGFP-C1 EIP,实现C1EIP在真核细胞内的定位表达,并以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP后免疫小鼠制备抗血清.间接免疫荧光检测抗血清效价为1∶10,RT-PCR和Western blot证实C1EIP真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,为C1 EIP基因在ESCs向雄性生殖细胞分化过程中的功能研究奠定了基础....
摘要:为克隆如皋黄鸡Stra8基因的3'UTR,寻找靶向Stra8基因的microRNA(miRNA),以鸡精原干细胞的cDNA为模板,根据NCBI数据库Stra8的CDS序列设计引物,通过3'RACE技术克隆Stra8基因的3'UTR,并构建相应的荧光素酶表达载体和突变载体;利用生物学预测软件对靶向Stra8 3'UTR的miRNA进行预测,选择评分最高的miRNA进行慢病毒载体构建;以pRL-TK为内参,分别将miRNA与Stra8 3'UTR荧光素酶表达载体和突变载体共转染DF-1细胞,利用双荧光素酶基因报告系统对miRNA进行活性检测.结果表明,采用3'RACE技术成功克隆Stra8 基因的3'UTR;Targetscan生物在线软件预测到靶向Stra8基因的4个特异性较高的miRNA,并成功构建其相应的慢病毒载体;双荧光素酶活性检测结果显示,gga-miR-1a、gga-miR-31、gga-miR-218均可通过3'UTR序列抑制Stra8基因的表达,其中gga-miR-31抑制效果最佳.该结果可为后续深入探讨gga-miR-31介导调控的Stra8基因在雄性生殖细胞分化中的调控网络提供依据....
摘要:本研究旨在检测CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor)基因的组织表达特异性,克隆其编码区并构建重组载体转染DF-1 (D fibroblast-1,DF-1)细胞并制备多克隆抗体,为初步研究鸡(Gallus gallus) CREPT基因参与调控细胞周期的生物学功能提供理论依据.以鸡生殖嵴cDNA为模板扩增CREPT基因CDS区,并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析.将该基因与pcDNA3.1和pEGFP-N1载体相连获得重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT之后,转染鸡DF-1细胞,并采用基因免疫法制备CREPT基因多克隆抗体并检测效价,利用qRT-PCR检测过表达CREPT基因后DF-1细胞内相关基因的表达情况.生物信息学分析发现,鸡CREPT编码区序列总长978bp,编码325个氨基酸,该氨基酸序列中存在一个RPR结构域(regulation of nuclear pre-mRNA domain)和卷曲结构域;以原鸡(G.gallus)CDS序列为模板成功克隆的如皋黄鸡(G.domesticus)CREPT基因长978 bp,测序结果准确,与原鸡CDS序列一致,同源性100%;组织表达谱分析显示,CREPT在睾丸、卵巢和大脑中mRNA表达量较高(P<0.01),而在肠组织(P<0.01)、骨骼肌(P<0.05)和脾脏(P<0.05)中的mRNA表达量较低;成功构建重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT;转染融合表达载体pEGFP-CREPT后显示,CREPT表达于DF-1细胞质中;使用基因免疫法制备多克隆抗体血清,免疫荧光检测(immunogen fluorescent assay,IFA)检测显示,制备的多克隆抗体最佳效价为1:10,Western blot证实,pcDNA3.1-CREPT真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,qPCR检测结果表明,pcDNA3.1-CREPT载体能够在DF-1上过表达CREPT基因,并引起细胞周期调控相关基因p15RS(P 15 related gene on G 1/S progression)、转录因子4(transcription factor 4,TCF4)、细胞周期蛋白D1(cyclinDI)和β-链蛋白(b-catein)的表达变化.本研究成功克隆了鸡CREPT基因,并制备了具有特异性的多克隆抗体,该基因在DF-1细胞质中表达,CREPT基因的表达能下调pl5RS基因的表达(P<0.01),上调TCF4(P<0.05)、cyclinD1 (P<0.01)和b-catein (P<0.01)的表达,该研究结果为进一步研究鸡CREPT基因的生物学功能提供了理论依据....
[专利] 发明专利 CN201711034939.X
扬州大学 2018-03-09
摘要:本发明公开了一种分离鸡胚生殖嵴来源的原始生殖干细胞方法,属于生物技术领域,包括以下步骤:(1)无菌取出21‑24HH早期胚胎,使用PBS浸洗3次;(2)在解剖显微镜下去头尾,剥离出生殖嵴,获取早期生殖嵴组织,使用PBS浸洗3次;(3)加入预热的胰蛋白酶进行消化,室温消化5mins,消化时轻轻吹打使生殖嵴组织分散;(4)加入含有小牛血清的培养基终止消化,100目网筛过滤后300转离心5mins,弃上清后使用PGCs培养基进行重悬,重悬后进行差速贴壁培养,培养45mins后吸上清,连续差速贴壁培养3次后即可得到纯度较高的PGCs。本发明提取简便快速,旨在从早期生殖嵴(21‑24HH)中分离大量纯净且全能性高的PGCs,为PGCs的应用奠定基础。
[专利] 发明专利 CN201711031012.0
扬州大学 2018-02-23
摘要:本发明公开了一种外源物质导入鸡胚的方法,属于生物技术领域,具体包括如下步骤:(1)对孵育48‑58h的13‑17 HH早期胚蛋在无菌条件下开口,找到胚胎位置,剥去胚蛋外壳膜,露出胚胎血管;(2)将需要导入的外源物质注入到玻璃注射针中,通过显微注射仪注射到鸡胚血管中;(3)注射后加入青链霉素至注射部位,然后使用医用胶带封口。本发明旨在鸡胚早期(13‑17 HH)通过血管注射导入外源物质,为鸡胚注射的广泛应用奠定基础。本方法适用于鸡胚外源基因或细胞导入,转基因鸡和嵌合体制备,操作简便快速,外源物质导入效率高。
摘要:前言原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的始祖细胞,是精子和卵细胞的前体细胞,在动物胚胎的发育过程中起重要作用。而禽类中PGCs最早出现在上胚层,随着血循环系统的形成迁移进入了生殖嵴,并继续分化为精原干细胞(SpermatogonialStemcells,SSCs)及卵原细胞。在第28期(孵化132小时)时,PGCs大量位于生殖嵴之中,参与原始性腺的形成,此时对比两性间原始生殖细胞之间的差异研究对于揭示禽类性别分化和生殖细胞发生发育规律具有重要意义。
[专利] 发明专利 CN201910514421.9
扬州大学 2019-09-06
摘要:本发明涉及一种新型鸡CEF重编程为PGC的诱导体系的建立方法,属于生物技术领域。在分离的原代CEF中,慢病毒外源导入OCT4,SOX2,NANOG,LIN28重编程因子,连续培养21天后,利用SSEA‑1抗体进行iPSC细胞株鉴定,鉴定为阳性的细胞株进行更换为BMP4/BMP8b/EGF诱导体系,诱导成为iPGC。本发明解决了濒危品种鸡PGC获取的数量低的问题,实现了濒危鸡品种的种质资源保护和物种复原工作。
[专利] 发明专利 CN201910563547.5
扬州大学 2019-09-27
摘要:本发明涉及一种通过羽色结合分子遗传标记鉴别PGC移植后代鸡的鉴定方法,属于生物技术领域。为了解决PGC移植后代的鉴别问题,本发明采用后代鸡羽色和微卫星标记分析的方法成功对后代鸡的遗传来源进行鉴别。本发明适用于禽类的种质资源的保护和物种复原,本发明可行性强,鉴定准确,成本低。能够有效鉴别后代鸡的遗传组成,为基因编辑模型鸡生产提供技术支持。
[专利] 发明专利 CN201610252399.1
扬州大学 2016-08-10
摘要:本发明公开了一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA的分析方法,本方法首先从如皋黄鸡的新鲜受精蛋的胚盘、第19期(72h)的生殖脊和第18天的睾丸,分离出鸡ESCs、PGCs和SSCs,并根据CDH1基因设计特异性,以PCR扩增的方法进行性别鉴定,对运用抗体标记的ESCs、PGCs和SSCs进行分选,阳性细胞提取细胞总RNA,纯化后对RNA质量进行检测,检测合格后进行RNA‑Seq测序。将测序结果中筛选出组装RNA的转录本。分离鸡ESCs,PGCs和SSCs,提取总RNA,反转录为cDNA。对候选的lncRNA进行Trans和Cis靶基因的预测分析,并通过DAVID数据库查找其GO功能项,再通过GO分析注释其功能,对其进行功能分析。绘制关键lncRNA及其靶基因与相关信号通路之间的关系互作网络图。
[专利] 实用新型 CN201820385249.2
扬州大学 2018-11-27
摘要:本实用新型涉及一种简易的用于鸡胚显微注射的断针装置,属于生物技术领域。断针装置,包括电池组(1)、控制器(2)、马达(3)、砂轮(5),电池组(1)通过控制器(2)连接马达(3),马达(3)通过导线连接电池组(1),马达(3)通过联轴器(4)驱动连接砂轮(5)。本实用新型用于鸡胚显微注射针的断针,可以简便的根据需求对显微注射针进行断针,操作简便易行,结构合理简单,使用方便,成本低廉,易于推广应用。
摘要:前言Cas9介导的基因编辑工具已经广泛的用于人、小鼠、斑马鱼等物种,而且在植物上也有广泛的应用,但是该方法在家禽中的应用尚未见报道。自1997年以来,本实验室一直致力于鸡的胚胎发育和鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的调控机制研究,已经完成鸡雄性生殖细胞发育分化过程中的转录组测序筛选到参与鸡雄性生殖细胞生成的关键基因和信号通路。为了进一步验证这些关键基因和信号通路的功能,在家鸡中建立有效的体外基因编辑系统就显得尤为迫切和必要。
摘要:[目的]本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目基因的定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。[方法]基于NCBI 数据库提供的CDS 序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC,C2EIP)基因全长,并根据基因序列中APM 的位置设计特异性gRNA1,gRNA2 和gRNA3 并构建cas9/gRNA 载体;将设计好的cas9/gRNA 转染状态良好的DF-1,利用luciferase SSA 重组检测法、T7E1 酶切法以及TA 克隆测序法检测gRNA 在DF-1 细胞中基因的敲除效率。
摘要:[目的]本研究旨在探寻参与调控鸡雄性性原细胞分化的关键基因和信号通路,以期提高雄性生殖细胞的体外诱导生成效率。[方法]采用流式细胞分选法获得纯化的鸡胚胎干细胞(Embryonicstem cells,ESCs)、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(Spermatogonial Stem cells,SSCs),利用Microarray、RNA-seq 技术系统地分析了三种细胞的转录本差异,筛选出参与调控鸡雄性性原细胞分化的候选关键基因和信号通路;采用qRT-PCR 对上述结果进行验证。
摘要:本文旨在探索鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向精原干细胞(Spermatogonia stem cell,SSC)分化过程中关键lncRNA 及靶基因,并探究其作用机制,为ESC 体外向SSC 诱导分化体系提供新的依据。以RNA-Seq 技术对鸡ESC、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)和SSC进行测序与分析,筛选出显著性差异以及特异性表达的候选lncRNAs,以qRT-PCR 对候选lncRNAs在三种细胞中表达趋势变化进行验证,通过BLAST 和RNAplex 软件对候选lncRNAs 进行靶基因预测,同时以DAVID 数据库、WEGO 以及STRING 等在线软件进行功能和蛋白网络互作分析。
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