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山东大学
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[硕士论文] 雷雪明
病原生物学 山东大学 2009(学位年度)
摘要:目的: 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)严重威胁人类健康,是发达国家人口死亡的主要原因,在我国AS的发病率也呈逐年增高的趋势。血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)的损伤及功能障碍被认为是As形成的开始。内毒素是动脉粥样硬化的诱因之一。它是革兰阴性菌细胞壁外膜的结构成分之一,其化学本质为脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。不同种属的G—杆菌具有相同的LPS基本骨架,即由O特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A(lipid A)三部分组成,其中脂质A为其毒性中心。血管内皮细胞是内毒素以及众多细胞因子作用的主要靶细胞,脂多糖通常通过直接或间接两条途径作用于血管内皮,造成细胞的过强反应,细胞出现形态和功能改变。直接损伤是脂多糖通过促使单核细胞、中性粒细胞及T淋巴细胞等与血管内皮细胞相结合,通过释放蛋白酶及氧自由基直接损伤VEC。脂多糖亦可通过体液免疫反应间接损伤VEC,加速了AS的发生与发展。 原花青素(Proanthocyanidins,PC)是一类在植物中广泛存在的多酚化合物,是存在于植物体内的天然抗氧化物。原花青素具有多种生物活性、药理作用和临床疗效,如极强的抗氧化活性,清除氧自由基、抗非酶糖基化、内皮依赖性血管舒张活性、抗缺血再灌注损伤、抗炎、抗血小板聚集、免疫调节等。原花青素可对多种蛋白酶有强大的抑制作用,即可通过酶抑制活性保护血管。葡萄籽原花青素提取物(grape seed pmanthoeyanidin extract,GSPE)目前研究最多,其中原花青素含量可高达95%。 本实验在脂多糖刺激VEC中,加以原花青素的干预。检测原花青素能否抑制脂多糖引起的细胞凋亡,以及凋亡相关基因的表达变化。这可为开发干预内皮细胞炎症反应的抗As新药提供一条新思路。 方法: 1.人血管内皮细胞培养 培养人血管内皮细胞并鉴定,待细胞呈亚单层状态,按常规方法进行传代,取生长状态好的单层内皮细胞,进行实验。 2.实验分为四组: ①对照组:用含10%血清的DMEM培养基培养VEC细胞。 ②LPS组:含10%血清的培养基中加入LPS,使其浓度为含1ug/ml,培养VEC。 ③LPS+低浓度原花青素(PC)组:含10%血清的培养基中加入LPS和PC共同作用VEC细胞,LPS的最终浓度是1ug/ml,低浓度PC的最终浓度是10mg/ml,培养VEC。 ④LPS+高浓度原花青素(PC)组:含10%血清的培养基中加入LPS和PC共同作用VEC细胞,LPS的最终浓度是1ug/ml,高浓度PC的最终浓度是20mg/ml,培养VEC。 将上述处理的细胞,置37℃5%CO2孵箱,继续培养24h。 3.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测原花青素对脂多糖损伤的血管内皮细胞增殖活性的影响。用酶标仪测定每孔光密度值,测定波长为490nm,计算细胞增殖率。(细胞增殖率=(处理组OD值-空白组OD值)/空白组OD值×100%)。 4.用Annexin—v/PI法处理各组细胞,并使用流式细胞仪定量检测各组细胞的凋亡率。 5.用Trizol提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,应用实时荧光定量PCR检测Caspase3 mRNA的表达情况,通过测定循环阈值(Ct)显示Caspase3 mRNA的表达量,以β-action作为参照,基因表达的相对变化以RQ值表示。 6.用Trizol提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,应用实时荧光定量PCR检测BCL-2 mRNA、BAX mRNA的表达情况,通过测定循环阈值(Ct)显示BCL-2mRNA、BAX mRNA的表达量,以β—action作为参照,基因表达的相对变化以RQ值表示。 结果: 1.免疫组织化学证实人血管内皮细胞培养成功; 2.MTT的结果显示:脂多糖明显地减弱了血管内皮细胞的增殖活性,而再加入低,高两种浓度的原花青素干预后均可明显地增强血管内皮细胞增殖活性。 3.流式结果显示:脂多糖明显地减弱了血管内皮细胞的增殖活性,原花青素可以有效抑制脂多糖引起的内皮细胞的凋亡。 4.实时荧光定量PCR结果显示:LPS可引起Caspase—3 mRNA表达上调.而用不同浓度原花青素干预脂多糖处理组后细胞Caspase—3 mRNA的表达呈现降低趋势。 5.我们的研究显示:1ug/ml脂多糖刺激血管内皮细胞24h后,其Bcl—2 mRNA的表达明显降低,Bax mRNA的表达明显升高,Bcl—2/Bax比值明显下降,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。而在10mg/ml和20mg/ml两种不同浓度的原花青素干预脂多糖处理组后其Bcl—2 mRNA,Bax mRNA,Bcl—2/Bax比值的变化恰恰与LPS组的变化相反,与LPS组比较均有统计学意义(P<0.05)。 结论: 本研究表明,LPS通过调节线粒体凋亡通路上的关键蛋白Bcl—2和Bax表达,引起caspase—3表达上调,导致人血管内皮细胞凋亡。而原花青素干预后可反方向调节Bcl—2和Bax表达,引起Caspase—3表达下降,血管内皮细胞的凋亡率下降,对血管内皮具有保护作用。说明原花青素通过抑制内皮细胞的凋亡对内皮细胞具有保护作用,是抗AS的重要因素。
摘要:目的 探讨祛毒养心冲剂对病毒性心肌炎(VMC)的疗效及作用机制.方法 将60只小鼠随机分为正常对照组、病毒组、药物组,每组20只.后两组小鼠每只腹腔注射柯萨奇病毒(CVB3)液,正常对照组腹腔注射不含病毒的Eagle's液.药物组于接种病毒后24 h灌胃给予祛毒养心冲剂.21 d后,处死所有小鼠并取其心脏.进行心肌病理检查,采用实时荧光定量PCR法和免疫组化技术检测心肌组织中白细胞介素-6(IL-6)mRAN和蛋白的表达.结果 与病毒组相比,应用祛毒养心冲剂治疗后,小鼠心肌组织病变积分显著下降(P<0.05),心肌组织中IL-6的表达明显降低(P<0.05).结论 祛毒养心冲剂对VMC具有明显治疗作用,其作用机制是通过抑制IL-6在心脏中的表达而实现的....
摘要:目的 构建表达绿色荧光蛋白的巨细胞病毒Towne株,检测其活性,研究其在抗巨细胞病毒药物筛选中的应用价值.方法 将PHM673质粒扩增纯化,采用脂质体转染法转入原代培养的人胚肺成纤维细胞,感染人巨细胞病毒,获得重组病毒GFP-HCMV,采用空斑法纯化重组病毒,采用PCR法鉴定,获得携带绿色荧光蛋白的重组巨细胞病毒.用抗病毒药物更昔洛韦进行干预,检测重组病毒荧光表达强度与药物浓度的关系.结果 成功构建携带绿色荧光蛋白的重组巨细胞病毒,荧光病毒的活性与原始病毒的活性差异无统计学意义(P>0.05),生长繁殖并没有受到影响.重组病毒的荧光表达强度与抗巨细胞病毒药物更昔洛韦抑制病毒的效价有关.结论 该荧光病毒可以作为研究病毒致病机制和抗病毒药物筛选的新型工具....
摘要:目的 了解人巨细胞病毒(HCMV)感染对兔平滑肌细胞(SMC)凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)表达的影响,探讨HCMV在动脉粥样硬化(AS)发生发展中的可能作用机制.方法 采用RT-PCR、Western blotting等技术检测HCMV AD169株感染的兔SMC中LOX-1的表达.结果 HCMV感染兔SMC后,LOX-1表达明显升高(P<0.01).结论 HCMV可引起免SMC中LOX-1的表达上调,这可能是HCMV参与AS的机制之一....
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