绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 1
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 1 条结果
[硕士论文] 陶文兵
分析化学 复旦大学 2010(学位年度)
摘要:环磷酸腺苷受体蛋白(cAMPreceptorprotein,CRP)是原核生物中一个典型的转录调控蛋白。结构研究表明CRP是一个由相同亚基组成的二聚体蛋白,每个亚基包含两个结构域:较大的cAMP结合结构域包含氨基酸残基1-137,主要由β折叠组成;较小的DNA结合结构域包含氨基酸残基138-209,主要由α螺旋组成。通过与受体分子cAMP结合,CRP发生构象变化,并与启动子DNA结合,激活RNA聚合酶,进而起始转录。利用转录组学和生物信息学技术研究发现,CRP能够直接调控200多个启动子的转录起始。CRP是目前研究的最多的转录调控蛋白之一,由于在其他几个重要功能蛋白家族中发现了极为相似的cAMP结合中心和DNA结合中心,CRP现已成为变构研究中一个十分重要的模型。目前,CRP-cAMP复合物、CRP-cAMP-DNA复合物、CRP-cAMP-DNA-RNAP复合物晶体结构均已获得。CRP-cAMP复合物的晶体结构显示,一个亚基处于“闭合”构象,表现为C端靠近C-螺旋的表面,另一个亚基处于“开口”构象,表现为C端远离C-螺旋的表面,且两个结构域间有一个大裂缝。但是,CRP-cAMP-DNA复合物的晶体结构显示,当结合DNA后,两个亚基均处于“闭合”构象,显示出高度的对称性。
  对CRP进行的大量生物化学、生物物理、分子动力学模拟等研究结果均推测,CRP结合cAMP引起微小的构象变化而得到活化:首先引起直接作用点的局部扰动,之后扩展到整个分子,产生整体的构象变化。最近解出并发表了被认为是最后一个解释cAMP诱导CRP构象变化机理的重要结构—apo-CRP,尽管对cAMP诱导CRP构象变化的机理的有了一些新的认识,但仍有诸多问题待解决。任何CRP及其相关复合物结构精度的提高,对解释cAMP诱导CRP构象变化的机理还有着广泛得意义。
  本论文以CRPD138L突变体和cAMP复合物的结构及构象变化机理为研究目标,通过结构生物学、生物化学和光谱等技术手段,得出以下几点结果:
  1.表达、提纯并结晶了CRPD138L突变体,并解析了结构。D138L-cAMP复合物的晶体结构分辨率达1.66A,是目前该蛋白中分辨率最高的结构;该蛋白结构已存入蛋白数据库(ProteinDataBank),编号为3KCC。
  2.高分辨率的D138L-cAMP复合物的结构首次显示,CRP结合了4个cAMP,其中两个是反式的,而另两个是顺式的。
  3.D138L-cAMP复合物中两个亚基均处于闭合构象,并显示出高度的对称性。
  4.比较D138L变体结合cAMP前后的结构,得知除了β-flap,D138L的N端未发生大的构象变化。相反,C端的取向、C-和D-螺旋的长度均发生了显著变化。
  5.比较D138L变体与野生型(wildtype,WT)CRP-cAMP复合物结构,最显著的差别在由β4、β5和loop3组成的β-flap。这些变化使铰链区域更具柔韧性,对于水解酶更灵敏。
  6.蛋白酶的水解反应和FT-IR光谱H-D交换实验结果表明,D138LCRP比WTCRP更具动态性,而这可能影响其识别特异的DNA序列。
  鉴于CRP中结合cAMP袋状结构的广泛性,我们对其组成部分loop3和loop4在结构域之间及亚基之间信号传递中所起的作用进行了研究。依据CRP和其他依赖于cAMP的蛋白的氨基酸序列的差异,构建了两个变体:Mutl(100p4中E78、G79间插入KGSKM五个氨基酸残基)和Mut2(从Mutlloop3中删去E54-G56三个氨基酸残基),结合一系列生物化学、生物物理的实验结果,得出以下结果:
  1.圆二色谱、FT-IR光谱检测三者结构的差异,结果显示这两个变体蛋白与野生型蛋白在二级及三级结构上没有任何可观察到的变化。
  2.荧光各向异性方法测定WTCRP及两个突变体与DNA的亲和力。结果显示loop4中KGSKM的插入,导致了cAMP存在时,CRP对DNA亲和力增大的效应,而两个变体与DNA的亲和力非常接近,说明loop4在变构信号传递过程中发挥了作用,并且参与了结构域间信号的传递。
  3.等温滴定量热技术测量三者与cAMP的亲和力。结果显示三者都有两个强的cAMP结合位点及一个弱的结合位点。Mutl的结合亲和力比WT小,但没有改变两个结合位点的协同性,说明loop4没有参与亚基间的信号传递,而Mut2的两个强结合位点有正向的协同作用,说明loop3参与了亚基间的信号传递。
  4.loop3和loop4的变化,改变了结合cAMP的行为,说明结合cAMP产生的变构信号传递的过程,很可能是两个亚基整体的重排所引起的。
  5.目前有关CRP被cAMP诱导的信号传递路径有两种推测,一种是信号通过铰链区域传递到DNA结合结构域,一种是蛋白整体的构象变化。我们的结果支持后一种推测。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

万方选题

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部