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摘要:目的 采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9对斑马鱼的精子相关抗原6(Spag6)基因进行编辑,建立Spag6基因敲除斑马鱼模型.方法 针对斑马鱼Spag6基因,利用生物信息学选取靶位点,构建向导RNA(gRNA)表达载体并体外转录,将gRNA和Cas9 mRNA混合物显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中,24~48 h提取基因组DNA,PCR扩增出目的片段,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定编辑效果.结果 取3个靶位点(S1、S2、S3)进行实验,选择gRNA浓度较高的S1和S3进行注射.限制性酶切及测序的结果显示S3已产生编辑效应.结论 通过CRISPR/Cas9系统成功地获得Spag6基因编辑的突变体,为进一步探讨斑马鱼Spag6基因的体内功能奠定了基础.
[硕士论文] 镇景开
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48kD转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。
  方法:(1)用Consite方法分析人SPA G16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织cDNA为模版,构建含有SPA G16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/pGL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pcDNA3和S-SOX5/pTarget)以及抑制其表达的siRNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/pGL3转染至BEAS-2B细胞,以pGL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pcDNA3转染至BEAS-2B细胞,以pcDNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L mRNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pcDNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPA G16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。
  结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48kDa的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16LmRNA的水平。SOX5RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。ChIP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPA G16L的表达。
  结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPA G16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。
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