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摘要:旨在构建牛生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因3'非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶载体,并确定miR-139与牛GHR基因的靶向关系.本研究采用生物信息学方法预测miR-139与牛GHR基因3'UTR的结合位点;人工合成牛GHR基因3'UTR及突变型片段并克隆至双荧光素酶载体psi-CHECK-2上,构建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3'UTR)及突变型(psiCHECK2-GHR-M 3'UTR)双荧光素酶报告质粒.将培养的Hela细胞分为4组,分别共转染miR-139mimic或阴性对照和psiCHECK2-GHR-W 3'UTR重组质粒或psiCHECK2-GHR-M 3'UTR重组质粒,然后用双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞中荧光素酶活性.之后培养奶牛乳腺上皮细胞,分别设对照组、阴性对照组、miR-139 mimic及miR-139 inhibitor组,对阴性对照组、miR-139 mimic组及miR-139 inhibitor组分别转染阴性对照、miR-139 mimic或miR-139 inhibitor,利用qPCR(Real-time quantitative PCR)进一步检测各组miR-139及GHR基因的mRNA表达.结果,通过双酶切试验证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-GHR-W 3'UTR和psiCHECK2-GHR-M 3'UTR;当野生型重组质粒psiCHECK2-GHR-W 3'UTR和miR-139 mimic共转染Hela细胞后,双荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其他处理组(P<0.05).qPCR进一步证实miR-139能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR基因mRNA的表达(P<0.05).本研究成功构建了牛野生型及突变型GHR基因3'UTR双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶试验及qPCR证实miR-139与牛GHR基因3'UTR存在靶向关系....
[硕士论文] 金连丰
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:每个miRNA都具有多个靶基因,因此对miRNA下游作用的靶基因进行寻找及功能研究仍是临床及科研的重要方向。而哺乳动物乳腺组织是动物体中少数的随着年龄、发情周期和繁殖状态而发生相应周期性变化器官之一。因此对人乳腺中miR-139-5p靶基因的鉴定及验证至关重要。
  研究发现miR-139与其靶基因共同作用可影响众多生物学功能,如蛋白定位、细胞周期调控以及抑制肿瘤侵袭等。众所周知,细胞周期的有序进行是生物体生长、发育及繁殖的基础,而细胞周期加快或阻滞会影响细胞增殖及迁移能力,进而至使肿瘤、癌症以及基因突变的发生。为充分研究miR-139-5p的作用和功能,其靶基因的挖掘和鉴定及初步的功能验证成为急需解决的问题。
  本研究将RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)与新一代测序技术相结合,以MCF-10A细胞系为研究对象,鉴定与验证miR-139-5p在乳腺上皮细胞中的靶基因。先运用针对目标蛋白Ago2的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化,对结合在复合物上的RNA进行测序分析,找出成对样品中的差异峰,进而确认miR-139-5p在MCF-10A中的靶基因,并对靶基因进行KEGG和GO分析;最后运用qPCR等技术对miR-139-5p的靶基因及miR-139-5p部分功能进行验证。这些结果将为miR-139-5p在人乳腺中的功能研究提供新的参考。
  研究结果如下:
  (1) RIP-seq测序数据处理及生物信息学分析:
  RIP-seq测序后我们将由Negative Control组与miR-139-5p mimic组获得的peak进行比较,得到差异基因484个,这些差异基因就是miR-139-5p在MCF-10A细胞中的靶基因,这些靶基因可能是乳腺发育或乳腺进化过程中重要的基因。利用KEGG对靶基因进行通路分析,我们得到204种Pathway,其中显著性通路有21条(P<0.05),涉及到120个靶基因;在GO分析中发现,显著性GO条目448个(P<0.05),主要涉及蛋白定位(proteinlocalization)、细胞周期调控(regulation of cell cycle)、细胞器组成(organdle part)、结合RNA(RNA binding)和结合核酸(nucleic acid binding)等;
  (2) miR-139-5p靶基因的验证
  选取的18个靶基因在mRNA水平被miR-139-5p显著下调,表明其表达受miR-139-5p调节。选择细胞周期信号通路对miR-139-5p的靶基因进行功能验证,表明miR-139-5p能显著抑制G1/S细胞周期转变,进而抑制细胞增殖,这种调节是信号通路中多个靶基因共同作用的结果。
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